Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidige æren av Monospecific og blandet DFS70 mønstre under ANA Screening med en roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substrat

Published: January 17, 2018 doi: 10.3791/56722
Automatic Translation
1, 1
1Research & Development, Immco Diagnostics, A Trinity Biotech Company

Summary

DFS70 autoantistoffer etterligner felles sykdomsassosierte antinuclear antistoff mønstre gjør nøyaktig tolkning utfordrende ved konvensjonelle HEp-2 underlag. Protokollen beskriver fordelene med romanen utviklet HEp-2 substrat over konvensjonelle HEp-2 i ANA screening og skille DFS70 mønstre med høy visshet i både monospecific og mixed ANA positive tilfeller.

Abstract

Systemisk autoimmun bindevev lidelser er preget av sirkulerende antinuclear antistoffer (ANA). Selv om det finnes flere teknologier for ANA screening, fortsatt indirekte immunofluorescence (IIF) bruker Human epithelial celler-2 (HEp-2) substrat primære og anbefalte metoden på grunn av sin overlegne følsomhet. HEp-2 underlag kan oppdage en rekke mønstre som følge av autoantibody binding til ulike protein og nukleinsyre autoantigens distribueres gjennom kjernen og cytoplasm i cellene. Yrende monospecific og blandede mønstre som følge av positive reaksjoner på HEp-2 substrat også komplisere tolkningen og nøyaktigheten av rapportering. Et konkret eksempel som nylig har mottatt stor oppmerksomhet er tett fine flekkete 70 (DFS70) mønsteret som følge av autoantistoffer som spesifikt bindes til et protein som kalles linsen epitel avledet vekstfaktor (LEDGF). Mangelen på klare tilknytning til en bestemt systemisk autoimmun sykdom og høy utbredelse sunn bestander har gjort nøyaktig tolkning av DFS70 mønster viktig. Nøyaktig æren av DFS70 mønster fra sykdomsassosierte mønstre ved hjelp av konvensjonelle HEp-2 underlaget er utfordrende. Dessuten hyppig samtidig forekomst av DFS70 mønster sammen med sykdomsassosierte mønstre som homogen, flekkete og blandet homogen flekkete mønstre komplisere IIF tolkningen. Målet med denne utredningen er å demonstrere nytten av en roman konstruert HEp-2 IIF substrat som beholder alle fordelene med konvensjonelle HEp-2 substrat samtidig gi muligheten til å skille DFS70 mønster med høy visshet i både monospecific og blandet ANA positive eksempler. Nye underlaget er ytterligere kunne avsløre sykdomsassosierte ANA mønstre tidligere skjult av DFS70 mønster.

Introduction

ANAs er et kjennetegn på autoimmune mediert systemisk bindevev sykdommer1. Flere metoder er ansatt screening og bekreftelse av ANAs. IIF teknikken bruker HEp-2 underlaget er de mest brukte og ofte anbefalt metode for screening ANAs1,2. Til tross for fremskritt i solid fase diagnostiske analysen metoder som enzym koblede immunosorbent analysen (ELISA), enzymimmunanalysen (EIA), chemiluminescence immunanalyse (CLIA) og perle-baserte multiplex analyser er IIF av HEp-2 den mest utbredte Screeningen metoden pga diagnostiske nytten og kostnadene effektivitet1,2,3. Ovennevnte analysen teknologiene stole på et begrenset antall renset innfødt eller rekombinant autoantigens mens HEp-2 celle monolayer forberedelser på glass lysbilde brønner presentere et bredt utvalg av autoantigens i sin naturlige form, fordelt over den kjernen og cytoplasma, som reagerer med autoantistoffer fra pasienten sera eller positiv kontroller, noe som resulterer i en rekke mønstre som er knyttet til ulike autoimmune tilstander. Disse mønstrene er klassifisert i kjernefysiske cytoplasmatiske og mitotisk mønstre basert på plasseringen av antigen i cellene. Hvert mønster og tilhørende antigen/antigener og sykdomstilstander er også preget4. I metoden IIF er pasienten og kontroll-sera ruges på glass lysbilde brønner som presenterer en monolayer kultur HEp-2 celler passende fast å bevare en rekke autoantigens i deres naturlige konfigurasjon. Autoantistoffer i pasienten sera eller positiv kontroller kan bindes til autoantigens presentert av HEp-2 celler på underlaget (objektglass godt) under inkubasjon. Innlegg ved ubundet antistoffer er vasket og bundet antistoffer IgG klassen registreres med fluorescein/fluorescein isothiocyanate (FITC) konjugert anti-human IgG reagens. Ubundet rapportert-konjugert vasket bort og glass coverslips er montert på lysbildene ved hjelp av en montering medium som bevarer reaksjonene og forenkler observasjon under fluorescerende mikroskop. Reaksjoner er observert under fluorescens mikroskop utstyrt med passende eksitasjon-utslipp filter kombinasjon som er konfigurert som reporter brukes (FITC reporter, diagnostiske mikroskop vanligvis bruker filtre med eksitasjon rekke 467 -498 nm og en utslipp rekke 513-556 nm). Tilstedeværelsen av ANA er demonstrert ved en lyse grønne fluorescens spesifikke strukturer i cellene. I motsetning til automatiserte analysen plattformer bruker IIF metodikk møysommelige prosessen med føljetong fortynne sera og visuelle positiv fastsettelse av flekker mønstre som krever betydelig kompetanse5,6. Til tross for disse begrensningene IIF av HEp-2 er de mest brukte og anbefalt metode for screening av ANAs på grunn av standardiseringen innsatsen mot mønster tolkning og nomenklatur av internasjonal konsensus på ANA mønstre (ICAP) komiteen, økt tilgjengelighet av automatiseringsløsninger for IIF lysbildet behandling og resultatet tolkning3.

Blant mange mønstre oppdaget av metoden HEp-2 IIF autoantistoffer målretting psip1 gene produktet (også referert til som LEDGF/p75/DFS70), har fått betydelig interesse de siste årene for flere grunner4,5 ,,6,,7,,8,,9,,10. DFS70 autoantistoffer finnes i høy titers i sunn kontroller, og studier har så langt ikke å demonstrere en distinkt klinisk forening for tilstedeværelse av DFS70 autoantistoffer7,8,9 ,10,11,12,13. Antallet rapporterte positive resultater for DFS70 autoantistoffer i ulike sykdom stater og sunn kohorter store variasjoner mellom studier6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,,24,,25,,26,,27,,28. Monospecific DFS70 mønsteret er godt differensiert fra en homogen eller flekkete mønster men tolkning av blandet homogen flekkete mønstre og anti-DFS70 antistoffer co oppstår med andre ANAs er utfordrende selv for ekspert lesere. Den nåværende generasjonen av IIF screening metoder og DFS70 bestemte solid fase analyser er ikke i stand til å skille en monospecific DFS70 reaksjonen fra blandede mønstre (figur 1A, gul skyggelagt av algoritmen). Feiltolkning av DFS70 mønster som homogen, flekkete, blandet mønster, eller omvendt, kan ha alvorlige konsekvenser på pasientomsorgen. Gjeldende brukte protokollen er som følger: kliniske laboratorier benytte en rekke solide fase bekreftende tester for sykdomsassosierte ANAs og/eller en immunoadsorption-metode for DFS70/LEDGF når tett fine flekkete (AC-2) mønster er mistenkt (figur 1a)4,5.

Målet med denne protokollen er å demonstrere nytten av en roman konstruert HEp-2 IIF substrat (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), vil bli referert til som HEp-2 ELITE) som beholder alle fordelene med konvensjonelle HEp-2 for screening ANAs samtidig skille DFS70 mønster med høy visshet i både monospecific og mixed ANA positive tilfeller (figur 1B, gul skyggelagt av algoritmen)5. HEp-2 ELITE substrat består av en omtrentlig blanding av uforandret konvensjonelle HEp-2 celler og utviklet celler uten LEDGF/p75/DFS70 antigen i 1:9 ratio5. IIF prosedyren for HEp-2 ELITE er identisk med metoden for konvensjonelle HEp-2. Den unike konfigurasjonen av HEp-2 ELITE underlaget ikke bare beholder alle fordelene med konvensjonelle HEp2, men kan skille homogen, flekkete og blandet reaksjonsmønstre fra DFS70 mønster på første screening eller testing av en prøve (figur 1B )5. Pasienten sera å være reagert på lysbilder med HEp-2 IIF underlaget må fortynnes 1:40 screening fortynning eller som enkelt laboratorium kriteriet. En spesifikk reaksjon på 1:40 eller høyere titer anses positiv.

I denne studien, positiv sera for homogen, flekkete, centromere, nucleolar, cytoplasmatiske reticular/AMA og DFS70 mønstre som produserte et middels positivt signal (i forhold til negative kontroll og positiv ANA kontroll av kit) på screening fortynning av 1:40 ble valgt for å simulere mono-spesifikke og blandet mønstrene på HEp-2 underlag (konvensjonell og HEp-2). 1:40 utvannet DFS70 positive sera ble blandet med 1:40 fortynninger av enkelte sykdomsassosierte ANA mønster kontroller (homogen, flekkete, centromere, nucleolar, eller cytoplasmatiske reticular-AMA) i forskjellige forhold (kontroll: DFS70 i 100:0, 80:20, 50/50, 20:80 og 0:100) og evalueres på konvensjonelle og HEp-2 ELITE underlag IIF-standardprosedyre som beskrevet nedenfor.

Protocol

Protokollen følger retningslinjene i Trinity Biotech institusjonelle menneskelige forskning etikk.

1. sample og substratet

  1. Tillate poser som inneholder substrat lysbilder (glass lysbilder med 12 brønner på hvert lysbilde som inneholder HEp2 eller HEp-2 + HEp2 KO celle blanding) å equilibrate til romtemperatur for optimal ytelse og hindre kondensering av fuktighet på lysbildet overflaten før den tillegg av prøven. Dette bør ta ca mellom 10-15 min.
  2. Når equilibrated til romtemperatur, nøye fjerne substrat lysbildene ved hjelp av fingrene uten dem berører sidene av poseen.
  3. Merk lysbildene og plassere dem i en inkubasjon kammer (ved romtemperatur) foret med papir håndkle fuktet med vann for å hindre tørking av lysbilder under prøven og konjugat inkubasjon.
    Merk: Ikke-spesifikk flekker kan skyldes tørre brønner; våtserviett inne i inkubasjon kammeret gir fuktighet og hindrer godt tørrhet.

2. tillegg av kontroller og prøver

  1. Dispensere ca 50 µL av negativ/positiv kontroller, kombinasjoner av DFS70-ANA positiv sera som beskrevet i denne studien, eller pasienten serumprøver på individuelle brønner.
  2. Dispensere kontrollen(e) og prøver i hver brønn på lysbildet.
  3. For å hindre godt kryssforurensning, unngå overfylling brønnene. Mens ikke overfylling brønner, sikre fullstendig dekning av godt overflaten og unngå luftbobler.
    Merk: Anbefalt volumet er 50 µL per trinn 2.1.
  4. Sett lokket på inkubasjon kammeret og ruge lysbilder for 30 min ved romtemperatur. Hvis det er noen ANA stede i serum til pasienten, vil det binde til cellene stede i hver brønn under denne inkubasjonstid.
  5. Når inkubasjonstiden er over, kan du fjerne lysbildet fra inkubasjon kammeret. Hold lysbildet i kategorien enden og skyll forsiktig med ca 10 mL fosfat-bufret saltvann (PBS) vaskebuffer i settet, bruker en pipette eller i et beaker fylt med PBS for 10-15 s. overføre lysbildet umiddelbart til en Coplin krukke med PBS vaskebuffer og vask ( suge) 10 min. Gjenta prosessen med alle gjenværende lysbilder.
    Merk: Når plassere flere lysbilder i en Coplin krukke, sikre at cellen siden av lysbildet ikke får kontakt med et annet lysbilde, som dette vil resultere i skade cellene overholdt på av objektglass.

3. tillegg av fluorescerende konjugert

  1. Fjerne bare ett lysbilde om gangen fra Coplin glasset. For å fjerne overflødig PBS vaske bufferen fra lysbildet, forsiktig trykk eller blot lysbildet på tørkepapir. Hver pakke leveres med FITC merket anti-IgG fluorescerende konjugert. På hver brønn, forsiktig gjelde 1 dråpe (ca 50 µL) av den angitte konjugert.
  2. Inkuber lysbildene i lukket flekker inkubasjon kammeret i 30 min.
    Merk: Bruk av Fc spesifikke IgG konjugert anbefales. Hvis det er noen ANA stede i serum til pasienten, vil finne komplekskonjugerte binde til cellene stede i hver brønn under denne inkubasjonstiden, som resulterer i den bestemte fluorescensen cellene i brønnene. Finne komplekskonjugerte er følsomme for lys. Lukket inkubasjon kammeret vil bidra til å forhindre lys innblanding konjugat reaksjonen av cellene i hver brønn.
  3. Når inkubasjonstiden er over, kan du fjerne lysbildet fra inkubasjon kammeret. Hold lysbildet i kategorien slutten og skyll forsiktig med ca 10 mL PBS vaskebuffer finnes i settet, bruker en pipette eller i et beaker fylt med PBS. Overføre lysbildet umiddelbart inn i en Coplin krukke med PBS vaskebuffer og vask (suge) for 10 min. Gjenta prosessen med alle gjenværende lysbilder.
    Merk: Når plassere flere lysbilder i en Coplin krukke, sikre at cellen siden av lysbildet ikke får kontakt med et annet lysbilde, som dette vil resultere i skade cellene overholdt på av objektglass.
  4. Plasser coverslips i settet på et tørt papirhåndkle. Montering media tilbys med kit. Den nederste kanten av dekkglassvæske, bruke mellom 3-4 dråper montering media i en linje.
  5. Ta ut ett lysbilde om gangen fra Coplin glasset som inneholder vaskebuffer. For å fjerne de overskytende vaskebuffer, forsiktig trykk eller blot lysbildet på tørkepapir.
  6. Lavere lysbildet forsiktig på dekkglassvæske ved å plassere den nedre kanten av lysbildet til kanten av dekkglassvæske. Dette tillater montering media finnes på den nedre kanten dekkglassvæske å strømme til den øverste kanten av lysbildet og reduserer dannelsen av luftbobler, som kan forstyrre lesingen av hver godt av et lysbilde.
    Merk: Minimal trykk skal brukes til å montere dekke lysbildet på lysbildet. Noen høyt trykk kan forårsake sideveis bevegelse av cover papirlapper. Dette kan skade monolayer utarbeidelse av celler og resultatet i forvrengning.
  7. Lagre lysbilder i mørket på 2-8 ° C. Undersøke lysbildene så snart de er montert, eller innenfor 48 timer.
    Merk: Lengre lagring kan føre til forverring av mønster og fluorescerende signal.

4. identifisering av Positive og Negative resultater

  1. Vis lysbildene med fluorescerende mikroskop med en FITC filter, i et mørkt rom.
  2. Undersøke til bestemte lyse grønne fluorescens under fluorescens mikroskop ved en forstørrelse av 200 X eller større for å gjøre den endelige tolkningen om positivitet og mønster. Observere de positive og negative kontrollene.
    Merk: Positiv kontrollen viser lyse grønne fluorescens i kjernen (figur 2A, Homogeneous). Kontrollen negative viser ingen bestemt grønne fluorescens under fluorescens mikroskop.
  3. Registrere positive/negative resultatet for hver brønn og inkluderer ANA mønsteret positive tilfeller.

Representative Results

HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat beholder klassisk ANA mønstre og forenkler klart skille DFS70 mønster:

Konvensjonelle og utviklet celler på HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat er identiske, bevare alle autoantigens unntatt LEDGF/p75. Kontrollen negative fra settet etablerer grunnlinjen fluorescerende signalet. Positiv kontroller for homogen, flekkete, centromere, nucleolar og mitokondrie mønstre på HEp-2 ELITE produsere et mønster som er identisk med forventet mønstre på konvensjonelle HEp-2 IIF substrat (figur 2A). Mønstrene for referansen har blitt beskrevet i detalj med hvert mønster antigen og sykdom association tidligere4,29. En kort beskrivelse av mønstre i figur 2A er gitt i tabell 1.

DFS70 mønster på HEp-2 ELITE:

Cirka 10% av cellene i hver også vise et tett fine flekkete mønster (ICAP tildelt nomenklatur: AC-2) som kan observeres på interphase kjernen, og chromatin tilknyttet flekker er sett på mitotisk kjerner (figur 2B). På en vanlig HEp-2 underlaget, vil alle cellene ha dette mønsteret når reagerte med en DFS70 positiv prøve. De resterende ~ 90% av HEp-2 celler har psip1 genet koding LEDGF antigen slått ut, og derfor vil ikke gi et signal eller mønsteret reagerte med en monospecific DFS70 positive serum (figur 2B). Hvis 10% av HEp-2 cellene har lysere fluorescens tilsvarer DFS70 mønster og resten av celler finnes flere mønstre (f.eks fint flekkete eller nucleolar), angir tilstedeværelsen av blandede mønstre. Nærmere undersøkelse av slike mønstre er avgjørende å bekrefte alle autoantibody særegenheter som finnes i tillegg til DFS70 oppskriften. For å demonstrere evnen HEp-2 ELITE underlaget, et panel av sera prøver ble opprettet med ulike konsentrasjoner av DFS70 og ANA positiv kontroll sera og testet på både konvensjonell og HEp-2 ELITE underlag med en standard IIF protokollen (Figur 3 , 4 figur, figur 5, figur 6, figur 7).

Tolkning av DFS70 Monospecific og blandede reaksjoner på konvensjonelle og HEp-2 ELITE underlag:

For hver bestemt sykdomsassosierte ANA mønster (finne 3, 4 figur, figur 5, figur 6, figur 7), en monospecific ANA mønster venstre mest kolonne og en monospecific DFS70 mønster høyre de fleste kolonne kan observeres. De tre kolonnene i midten representerer ulike prosenter av sykdomsassosierte og DFS70 mønster positiv kontroller. Den resulterende blandede mønsteret er utfordrende for å skjelne på konvensjonelle HEp-2 substrat (Figur 3, Figur 4, figur 5, figur 6, figur 7, øverste rad). Men med romanen Hep-2 ELITE underlaget, i de fleste av eksemplene, er forskjellen i intensiteter uforandret og utviklet celler tydelig som ikke bare bekrefter tilstedeværelsen av DFS70 autoantistoffer (når lysere mindre lys celler er 1:9), men også avslører en sekundær ANA-mønster. Ved homogen-DFS70 eller flekkete-DFS70 blandede reaksjoner, er det umulig å trygt forutsi det korrekte mønsteret som fører til laboratorier velger for å kjøre en rekke ekstra analyser (figur 1A). Blandet reaksjoner, mistenker DFS70 positivitet er svært utfordrende (figur 5, figur 6) centromere-DFS70 og nucleolar-DFS70. Med nucleolar og cytoplasmatiske reticular/AMA reaksjoner er DFS70 mønsteret ikke dominerende til sera forholdet når 50%. I alle eksemplene, HEp-2 ELITE underlaget kan presentere DFS70 mønsteret og den underliggende sekundære mønsteret over et bredere spekter av intensitet nivåer og dermed muliggjør en mer nøyaktig ANA tolkning.

Å nøye observere blandede mønstre, resultater for ulike 50/50 kombinasjoner av ANA og DFS70 positive kontroller var forstørret (Figur 8) for både tradisjonell og HEp-2 ELITE underlag. Det oppfordres til å observere både interphase og mitotisk flekker for alle ANA mønstre inkludert DFS70 på HEp-2 underlag for å forbedre tolkning og nøyaktigheten av rapporterte mønsteret. Men for blandede mønstre kanskje differensial mønsteret presentert ved å dele celle kjerner ikke tilstrekkelig til å forenkle nøyaktig tolkning. Røde piler (Figur 8) Angi mitotisk kjerner i både konvensjonell og utviklet celle. Det kan observeres som blandet DFS70 reaksjoner på dele celler ikke overholder med de etablerte regler for tolkning av sykdomsassosierte ANA mønstre. Gul og blå piler indikerer uforandret og utvikling (DFS70 KO) HEp-2 celle kjerner, henholdsvis. I alle kombinasjonene (Figur 8), en klar intensitet forskjellen mellom uforandret celle kjernefysiske flekker (~ 10%) og utviklet celle kjernefysiske (~ 90%) mønster i det samme mikroskopiske synsfeltet er observert, som gjør at samtidige screening og bekreftelse av DFS70 mønster.

Figure 1
Figur 1: ANA screening algoritmer som bruker konvensjonelle HEp-2 og HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF metoder. (A) skjematisk unravels i mangel av konvensjonelle HEp-2 IIF identifisere monospecific og blandet DFS70 positive mønstre på screening scenen (gul skyggelagt) og dens manglende evne til å utelukke en sekundær sykdomsassosierte ANA mønster som kan bli skjult av DFS70 mønster. Videre, den nåværende generasjonen av DFS70 bestemte solid fase bekreftende analyser ikke kan bekrefte monospecific DFS70 positivitet som fører til ytterligere bekreftende testing for ANAs. (B) skjematisk avslører egenskapene til HEp-2 ELITE for screening av ANAs, samtidig forskjellsbehandling av monospecific og blandet DFS70 reaksjoner, og eliminerer behovet for solid fasen DFS70 bekreftelse søk. Algoritmen bruker HEp-2 ELITE betydelig forenkler ANA screening og reduserer antall bekreftelse analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Classic ANA og DFS70 mønster på HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat. (A) HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat bevarer klassiske ANA mønstre. Klassisk homogen reaksjon og DFS70 positive reaksjoner ble produsert med positiv kontrollene fra settet. Andre reaksjoner ble produsert tidligere etablert positiv kontrollsera i flekkete, centromere, nucleolar og cytoplasmatiske reticular/AMA reaksjoner5. (B) HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat gir både konvensjonell og utviklet celler, som muliggjør enkel æren av DFS70 mønster. Skjematisk viser den resulterende DFS70 monospecific reaksjonen flekker mønster på interphase og dele celle kjerner for både tradisjonell og utvikling (DFS70-KO) celler. Foretatt HEp-2-celler er blottet for LEDGF/p75/DFS70 antigen som gjør samtidige påvisning av sekundær mønstre som er vanligvis skjult av DFS70 autoantibody reaksjon på konvensjonelle HEp-2 underlag. Piler (gul) viser eksempler på mitotisk celle kjerner. Skala stolper representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: DFS70 og homogen sera sammen. DFS70 monospecific sera ble kombinert med en positiv homogen mønster kontroll i forskjellige forhold (100:0, 80:20, 50/50, 20:80 og 0:100) og testet på konvensjonelle og utvikling (DFS70-KO) HEp-2 underlag. Skala stolper representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: DFS70 og flekkete sera sammen. DFS70 monospecific sera ble kombinert med en positiv flekkete mønster kontroll i forskjellige forhold (100:0, 80:20, 50/50, 20:80 og 0:100) og testet på konvensjonelle og utvikling (DFS70-KO) HEp-2 underlag. Skala stolper representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: DFS70 og centromere sera sammen. DFS 70 monospecific sera ble kombinert med en positiv centromere mønster kontroll i forskjellige forhold (100:0, 80:20, 50/50, 20:80 og 0:100) og testet på konvensjonelle og utvikling (DFS70-KO) HEp-2 underlag. Skala stolper representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: DFS70 og nucleolar sera sammen. DFS 70 monospecific sera ble kombinert med en positiv nucleolar mønster kontroll i forskjellige forhold (100:0, 80:20, 50/50, 20:80 og 0:100) og testet på konvensjonelle og utvikling (DFS70-KO) HEp-2 underlag. Skala stolper representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: DFS70 og cytoplasmatiske reticular/AMA sera sammen. DFS70 monospecific sera ble kombinert med en positiv mitokondrie mønster kontroll i forskjellige forhold (100:0, 80:20, 50/50, 20:80 og 0:100) og testet på konvensjonelle og utvikling (DFS70-KO) HEp-2 underlag. Skala stolper representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: blandet mønstre (50/50 ratio) produsert på konvensjonelle og HEp-2 ELITE underlag. Forskjeller mellom de to underlag er avslørt. Røde piler indikerer mitotisk kjerner i både konvensjonell og utviklet celler i begge underlag. For disse kombinasjonene er differensial mønsteret presentert ved å dele celle kjerner på konvensjonelle HEp-2 substrat ikke tilstrekkelig for nøyaktig tolkning av blandede mønstre. Det kan være observert at blandet DFS70 reaksjoner på dele celler kan forurolige det etablert settet med regler for tolkning av sykdomsassosierte ANA mønstre. Gul og blå piler indikerer uforandret og utvikling (DFS70 KO) HEp-2 celle kjerner, henholdsvis. Resultatene for alle kombinasjonene som testet på utvikling underlaget: en klar intensitet forskjell mellom interphase kjernefysiske mønsteret tilhører uendret celler (~ 10%) og utviklet celler (~ 90%) ble observert, som aktiveres samtidig gjenkjenning og bekreftelsen av DFS70 mønster. Skala stolper representerer 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ANA mønster Beskrivelse
Homogen Hele kjernen fluoresces jevnt med en diffus flekker mønster.
Flekkete Diskret, grov fine flekker av fluoresce gjennom kjernen.  Fin flekkete og grov flekkete mønstre har vært beskrevet.
Nucleolar Nucleoli flekker som flere faste eller flekkete organer i kjernen. Undertypene har blitt beskrevet tidligere.
Centromere Store flekker begrenset antall. Reaktiv antigen segregerer med kondensert kromosomer i cellene gjennomgår mitose.
Cytoplasmatiske reticular/AMA Cytoplasm vises detaljert med positiv farging av mitokondrier.
DFS70 •Conventional HEp-2 celler: et tett fine flekkete mønster er observert på interphase kjernen og chromatin tilknyttet flekker er sett på mitotisk kjerner.
•Engineered DFS70 KO celler: Anti-DFS70 antistoffer produsere negative flekker
HEp-2 Elite / DFS70 KO har konvensjonelle og utvikling (DFS70 KO) celler i ca 1:9-forhold. Konvensjonelle celler produserer typisk DFS70 mønster og utvikling cellene produsere en negativ mønster når reagerte med en DFS70 monospecific/isolert positive reaksjoner.

Tabell 1: beskrivelse av ANA mønstre.

Discussion

Autoantistoffer mot kjernefysiske og cytoplasmatiske antigener er svært utbredt i systemisk autoimmune sykdommer. Selv om ingen enkelt analysen gir best mulig sensitivitet og spesifisitet, er IIF av HEp-2 ansett som en svært følsom og kostnadseffektiv screening metode for systemisk autoimmune sykdommer2,3,4 . Til tross for utbredelsen av IIF protokoll for mer enn 50 år er nøyaktigheten av IIF analysen svært avhengig av dyktighet av teknikeren, forsiktig gjennomføring av de individuelle trinnene av protokollen, og nøyaktig tolkning av resultater bruker en godt vedlikeholdt fluorescens mikroskop. Diagnostisering av systemisk autoimmun sykdom bør ikke være basert på resultatene av en enkelt serologisk test som IIF av HEp-2.

Rekonstituering reagenser bruker høykvalitets vann (destillert/vaskebuffer), bruk av standardiserte kit komponenter (lysbilder med HEp-2 celle monolayers, prøve fortynningsmiddel, positive og negative kontroller, pre utvannet optimalisert FITC-konjugert og montering medium) ha en positiv innvirkning på resultatene. Hoppe tillegg kontroller eller eksempler på brønner kan oppfordre falske negative tolkninger. Tørking av lysbilder når som helst etter tillegg av prøve eller kontroll kan resultere i artifactual false positiv reaksjonene og upassende mønstre. For mye vaskebuffer igjen på lysbildet eller tørking av lysbildet før dispensasjon av montering medium kan føre gjenstander. Legge utilstrekkelig antall montering medium eller generere bobler på lysbildet overflaten før plassere en dekkglassvæske kan medføre reaksjoner som uklare og ute av fokus når observert under mikroskopet. Montert lysbilder må lagres på 2-8 ° C og analyseres i vinduet anbefalte tid å minimere falske negative eller artifactual resultater.

Bruke et velholdt epi-fluorescerende mikroskop som huser en passende LED/Hg/Xenon lyskilde og rent optisk komponenter inkludert eksitasjon og utslipp filtre som ikke er skadet er avgjørende for å oppnå nøyaktig IIF resultater. Opplæring for kresne positive/negative reaksjonen intensitet og tolkning av mønstre er avgjørende. HEp-2 IIF analyser er sårbare for mangelen på standardisering i prosedyrer, konfigurasjon av mikroskopet og sluttbrukeropplæring eller dyktighet. Konsensus nomenklatur og representant mønstrene og eksempler på bilder anskaffes ved hjelp av forskjellige produsenter er gjort tilgjengelig av ICAP (< www.ANApatterns.org>) for pedagogiske formål4. En HEp-2 celle mønster klassifisering treet fra ICAP for ulike kjernefysiske cytoplasmatiske og mitotisk mønstre er en verdifull ressurs for å lære små forskjeller mellom ulike mønstre som kan ligne til utrente øyne4. En av de viktigste eksemplene på et utfordrende mønster er DFS70 som også mangler en distinkt forening med en autoimmun betingelse som beskrevet i forrige avsnitt dette mønsteret er svært utbredt i sunn bestander5.

Avhengig av studien, utbredelsen av anti-DFS70 autoantistoffer varierer mellom sunn kohorter, ANA screening bestander og ANA positive individer uten bevis systemisk autoimmun sykdom9,16,20 ,30,31. DFS70 autoantistoffer er rapportert oppstår isolert og med andre sykdomsassosierte ANA mønstre. Isolert eller monospecific DFS70 mønster er rapportert i 2-22% av sunn kontroller, men i mindre enn 1% av tilfellene med autoimmune revmatiske sykdommer32. Basert på disse trendene, ble DFS70 mono-positive mønsteret foreslått som et kriterium utelate i autoimmune revmatiske sykdommer av ICAP komiteen3,31,32. ICAP komiteen, etablert for å fremme harmonisering av autoantibody test nomenklatur og tolkning av HEp-2 IIF resultatene, anbefaler rapportering DFS70 positivitet ved rapportering av ANA screening resultater4.

Før utelukker en systemisk autoimmun sykdom basert på DFS70 mono-positivitet, er det viktig å undersøke tilstanden til gjeldende screening og bekreftelse metoder (spesielt de spesifikt for DFS70). Avtale mellom DFS70 positivitet HEp-2 IIF og solid fase bekreftende analyser nemlig ELISA, CLIA og linje immunanalyse/dot blot metoder) store variasjoner mellom ulike studier13,22,25,33 . IIF tolkning og bekreftende analysen parametere som bidrar til uenigheten har vært diskutert tidligere5,13,34. En nylig foreslåtte immunoadsorption tilnærming til anti-DFS70 antistoff bekreftelse løser noen av gjeldende solid fase analyser (for DFS70), men krever labs for å utføre et ekstra trinn i IIF fremgangsmåte mistenkt prøver, som øker tiden pris og behandlingstid for rapportering resultater13. Dette ekstra trinnet er ikke nødvendig når HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler brukes for rutine ANA screening. Dette reduserer den totale kostnaden og videre er det ingen innvirkning på behandlingstid som DFS70 mønster er fanges i første screening trinn27. En ytterligere ulempe med å bruke konvensjonelle HEp-2 IIF-metoden er ikke skille DFS70 mønster co oppstår med andre ANA mønstre på screening scenen. Denne ulempen er imidlertid overvunnet ved bruk av HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler27.

Sammenlignende evaluering av konvensjonelle HEp-2 og den nye utviklede HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) med ANA positiv kontroller og kombinasjoner med en mono-positive DFS70 kontroll, viser verktøyet av nye underlagets samtidig skjerm for ANAs og Bekreft DFS70 mønster (figur 1). IIF protokollen for nye underlaget er identisk med det tradisjonelle HEp-2 IIF-metoden. Tolkning er for alle sykdomsassosierte ANA mønstre identiske unntatt DFS70 mønsteret (tabell 1). Tolkning av både mono-positive og blandet DFS70 mønstre var relativt enklere å bruke den nye metoden og det garanterer ikke ytterligere analyser (figur 1B). Gjennomføringen av denne ny metoden inne klinisk lab forenkler utfordringen knyttet til tolkning av DFS70 mønster og forbedrer generell nøyaktighet for ANA screening av ytterligere avslørende sykdomsassosierte ANA mønstre tidligere skjult av DFS70 (blandet mønstre).

Disclosures

Forfatterne Kishore Malyavantham og Lakshmanan Suresh er ansatte i Trinity Biotech, USA.

Acknowledgments

Vi takker Andrew Zenger for utføre IIF eksperimenter og samle bilder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
ANA positive control Trinity Biotech  part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
DFS70 antibody positive control Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Negative control Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Buffer diluent for serum Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Phosphate buffered saline (PBS) Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mounting medium Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips  Trinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch Trinity Biotech part of kit# 1103, 1103-240
Name Company Catalog Number Comments
Materials used in the study but not provided by the kits
Diagnostic fluorescent microscope Nikon Eclipse 50i Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1
Incubation chamber Trinity Biotech provided for customers (no catalog #)
Coplin jar n/a General labware
Paper towels n/a General lab supplies
distilled/deionized water n/a General lab supplies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011).
  2. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  3. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  4. Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412 (2015).
  5. Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).
  6. Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
  7. Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
  8. Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
  9. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  10. Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
  11. Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
  12. Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
  13. Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
  14. Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
  15. Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
  16. Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
  17. Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).
  18. Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
  19. Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
  20. Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  21. Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).
  22. Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).
  23. Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  24. Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
  25. Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
  26. Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
  27. Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
  28. Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
  29. Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
  30. Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).
  31. Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
  32. Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
  33. Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759 (2013).
  34. Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).

Tags

Immunologi problemet 131 tett fine flekkete 70 linse epitel-avledet vekst faktor antinuclear antistoffer menneskelige epithelial celler-2 indirekte immunofluorescence homogen flekkete
Samtidige æren av Monospecific og blandet DFS70 mønstre under ANA Screening med en roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout substrat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malyavantham, K. S., Suresh, L.… More

Malyavantham, K. S., Suresh, L. Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate. J. Vis. Exp. (131), e56722, doi:10.3791/56722 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter