Summary
DFS70 autoantikroppar härma gemensamma sjukdomsassocierade antinukleära antikroppar mönster att göra korrekta tolkning utmanande när du använder konventionella HEp-2-substrat. Protokollet beskrivs fördelarna med romanen bakåtkompilerade HEp-2 substrat jämfört med konventionella HEp-2 i ANA screening och särskiljande DFS70 mönster med högt förtroende i både monospecifikt och blandade ANA positiva fall.
Abstract
Systemiska autoimmuna bindvävssjukdomar kännetecknas av cirkulerande antinukleära antikroppar (ANA). Även om det finns flera tekniker för ANA screening, förblir indirekt immunofluorescens (IIF) använder mänskliga epiteliala celler-2 (HEp-2) substrat den primära och rekommenderade metoden på grund av dess överlägsen känslighet. HEp-2 substrat kan upptäcka en mängd mönster som härrör från autoantikropp bindning till olika proteiner och nukleinsyra autoantigener fördelade över kärnan och cytoplasman i celler. Den stora mångfalden av monospecifikt och blandade mönster följd av positiva reaktioner på HEp-2 substrat också komplicera tolkningen och noggrannhet av rapportering. Ett konkret exempel som nyligen fått största uppmärksamhet är täta fina spräckliga 70 (DFS70) mönster som följer av autoantikroppar som specifikt binder till ett protein som kallas linsen epitel härrör tillväxtfaktor (LEDGF). Brist på tydlig association med specifika systemisk autoimmun sjukdom och hög prevalens i friska populationer har gjort korrekt tolkning av DFS70 mönster viktig. Korrekt skillnaden av DFS70 mönster från sjukdomsassocierade mönster med hjälp av konventionella HEp-2 substrat är utmanande. Dessutom ofta samtidig förekomst av DFS70 mönster tillsammans med sjukdomsassocierade mönster som homogen, spräckliga och blandade homogen-spräcklig mönster komplicera IIF tolkningen. Syftet med denna uppsats är att påvisa nyttan av en roman konstruerad HEp-2 IIF substrat som behåller alla fördelar av konventionella HEp-2 substrat samtidigt samtidigt som förmågan att särskilja DFS70 mönster med högt förtroende i både monospecifikt och blandade ANA positiva exempel. Nya substrat är ytterligare kunna avslöja sjukdomsassocierade ANA mönster tidigare dold av DFS70 mönster.
Introduction
ANAs är kännetecknande för autoimmuna medierad systemisk bindväv sjukdomar1. Flera metoder används för screening och bekräftelse av ANAs. IIF teknik med HEp-2 substratet förblir den mest utbredda och ofta rekommenderad metod för screening ANAs1,2. Trots framsteg i fast fas diagnostiska test metoder såsom enzym länkade immunosorbent assay (ELISA), enzymimmunoanalys (EIA), chemiluminescence immunoassay (CLIA) och pärla-baserade multiplex analyser är IIF av HEp-2 den vanligaste screeningen metoden på grund av dess diagnostiska nyttan och kostnaden effektivitet1,2,3. Ovannämnda analys teknik är beroende av en begränsad uppsättning renat native eller rekombinant autoantigener HEp-2 celler enskiktslager förberedelserna på glas bild brunnar för närvarande en omfattande mängd autoantigener i sin naturliga form, fördelad över kärnan och cytoplasman, som reagerar med autoantikroppar från patientsera eller positiva kontroller, vilket resulterar i en mängd mönster som är associerade med olika autoimmuna sjukdomar. Dessa mönster är indelade i kärn, cytoplasmiska och mitotiskt mönster baserat på platsen för antigenet i cellerna. Varje mönster och associerade antigen/antigener och sjukdomstillstånd är väl karakteriserade4. I metoden IIF inkuberas patient- och kontrollsera på glas bild brunnar som presenterar en enskiktslager kultur av HEp-2 celler passande fast att bevara en mängd autoantigener i deras naturliga konfiguration. Autoantikroppar i patientsera eller positiva kontroller tillåts att binda till den autoantigener som presenteras av HEp-2 celler på substratet (glasskiva är väl) under inkubation. Efter inkubation, obundna antikroppar är tvättas bort och bundna antikroppar av IgG klass upptäcks med fluorescein/fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugerade anti-humant IgG reagens. Obundna rapporterade-conjugate tvättas bort och glas coverslips är monterade ovanpå bilderna med hjälp av en monteringsmedium som bevarar reaktionerna och underlättar observation under en fluorescerande Mikroskop. Reaktioner observeras under en fluorescens Mikroskop utrustad med lämpliga excitation-utsläpp filter kombination som har konfigurerats enligt reportern används (för FITC reporter, diagnostiska Mikroskop vanligtvis använder filter med excitation utbud av 467 -498 nm och en utsläpp rad 513-556 nm). Förekomsten av ANA framgår av en ljust grön fluorescens av särskilda strukturer i cellerna. Till skillnad från automatiserad analys plattformar bygger IIF metodik på den mödosamma processen med seriell späda sera och visuella positiva fastställandet av färgning mönster som kräver betydande expertis5,6. Trots dessa begränsningar, IIF av HEp-2 förblir den mest använda och rekommenderad metod för screening av ANAs på grund av standardisering ansträngningarna för mönster tolkning och nomenklatur av det internationella samförståndet på ANA mönster (ICAP) kommittén, ökad tillgänglighet av automationslösningar för IIF slide bearbetning och resultatet tolkning3.
Bland många mönster identifieras av metoden HEp-2 IIF, autoantikroppar riktade psip1 genprodukten (också kallad LEDGF/p75/DFS70), vunnit stort intresse under de senaste åren för flera skäl4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 autoantikroppar förekommer i höga titrar i friska kontroller och studier hittills har misslyckats med att demonstrera en distinkt kliniska sammanslutning för förekomst av DFS70 autoantikroppar7,8,9 ,10,11,12,13. Andelen rapporterade positiva resultat för DFS70 autoantikroppar i olika sjukdomstillstånd och friska kohorter varierat mycket mellan studier6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Monospecifikt DFS70 mönstret är väl differentierad från en homogen eller spräckliga mönster men tolkning av blandade homogen-spräcklig mönster och anti-DFS70 antikroppar samarbete förekommer med andra ANAs är utmanande även för expert läsare. Den nuvarande generationen av IIF screening metoder och DFS70 särskilda fast fas analyser klarar inte av att skilja en monospecifikt DFS70 reaktion från blandade mönster (figur 1A, gula skuggade området av algoritmen). Feltolkning av DFS70 mönster som homogen, spräckliga, eller blandade mönster, eller vice versa, kan få allvarliga konsekvenser på patientvård. Det nuvarande vanliga protokollet är följande: de kliniska labs anställer ett antal fasta fasen kontrollprov för sjukdomsassocierade ANAs eller en immunoadsorption metod för DFS70/LEDGF när tät fin spräcklig (AC-2) mönster misstänks (figur 1a)4,5.
Målet med detta protokoll är att påvisa nyttan av en roman konstruerad HEp-2 IIF substrat (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), kommer att kallas till HEp-2 ELITE) som behåller alla fördelar med konventionella HEp-2 för screening ANAs samtidigt särskilja DFS70 mönster med högt förtroende i både monospecifikt och blandade ANA positiva fall (figur 1B, gula skuggade området av algoritmen)5. HEp-2 ELITE substrat består av en ungefärlig blandning av oförändrade konventionella HEp-2 celler och bearbetade celler saknar LEDGF/p75/DFS70 antigen i 1:9 baserat på5. Förfarandet IIF på HEp-2 ELITE är identisk med den konventionella HEp-2-metoden. Den unika konfigurationen av HEp-2 ELITE substrat inte bara behåller alla fördelar med konventionella HEp2 men kan skilja homogena, spräckliga och blandade reaktionsmönstren från DFS70 mönster på den inledande screeningen eller testning av ett prov (figur 1B )5. Patientsera vara reagerat på bilder med HEp-2 IIF substrat bör vara utspädd 1:40 med screening utspädning eller enligt kriteriet enskilt laboratorium. En specifik reaktion på 1:40 eller högre titer anses positivt.
I denna studie, positiva sera för homogena, spräckliga, centromer, nukleolära, cytoplasmiska retikulära/AMA och DFS70 mönster som producerade en medellång positiv signal (i förhållande till den negativa kontrollen och positiv ANA kontroll som tillhandahålls av satsen) vid screening utspädning av 1:40 valdes för att simulera de mono-specifika och blandade mönster på HEp-2 substrat (konventionella och HEp-2 ELITE). 1:40 utspädda DFS70 positiva sera blandades med 1:40 utspädningar av enskilda sjukdomsassocierade ANA mönster kontroller (homogen, spräckliga, centromer, nukleolära, eller cytoplasmisk retikulära-AMA) i olika proportioner (kontroll: DFS70 i 100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 och 0:100) och utvärderas på konventionella och HEp-2 ELITE substrat efter standard IIF förfarande som beskrivs nedan.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna i Trinity Biotech institutionella mänskliga forskningsetisk kommitté.
1. prov och substrat förberedelse
- Tillåta påsar som innehåller substrat diabilder (glas glasen med 12 brunnar på varje bild som innehåller antingen HEp2 eller HEp-2 + HEp2 KO cell blandning) att temperera vid rumstemperatur för optimal prestanda och förhindra kondens av fukt på bild yta före den tillägg av provet. Detta bör ta ungefär mellan 10-15 min.
- En gång återta rumstemperatur, ta försiktigt bort de substrat diabilder med fingrarna utan dem vidrör sidorna av påsen.
- Märka bilder och placera dem i en inkubation kammare (i rumstemperatur) kantad med pappershanddukar fuktade med vatten för att förhindra uttorkning av bilder under provet och konjugat inkubation.
Obs: Icke-specifik färgning kan resultera från torra brunnar; en våt pappershandduk inne i inkubation kammaren ger fuktighet och förhindrar väl torrhet.
2. tillägg av kontroller och prover
- Fördela ca 50 µL av de negativa/positiva kontrollerna, kombinationer av DFS70-ANA positiva sera som beskrivs i denna studie, eller patientens serumprover på individuella utstryksglas brunnar.
- Fördela kontrollgruppen (kontrollgrupperna) och prover i varje brunn i bilden.
- För att förhindra väl korskontaminering, Undvik brunnarna. Samtidigt inte överfyllning brunnar, säkerställa fullständig täckning av väl yta och undvika luftbubblor.
Obs: Den rekommenderade volymen är 50 µL per steg 2.1. - Placera locket på inkubation kammaren och odling av objektglas för 30 min i rumstemperatur. Om det finns någon ANA förekommer i serum hos patienten, kommer det att binda till cellerna som är närvarande i varje brunn under denna inkubationstid.
- När inkubationstiden är över, ta bort bilden från inkubation kammaren. Håll bilden fliken slutet och skölj försiktigt med cirka 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tvättbuffert i kit, med pipett eller i en bägare fylld med PBS för 10-15 s. överför bilden omedelbart i en Coplin burk med PBS tvättbuffert och tvätta ( Blötlägg) i 10 min. Upprepa processen med alla återstående bilder.
Obs: När placera flera bilder i en Coplin-burk, se till att den cell sidan av bilden inte kontakta en annan bild, eftersom detta kommer att resultera i skada cellerna följs på en glasskiva.
3. tillägg av fluorescerande konjugat
- Ta bort endast en bild i taget från Coplin burken. Ta bort överflödigt PBS tvättbuffert från bilden, försiktigt tryck eller blot bilden på hushållspapper. Varje kit är försedd med FITC märkt anti-humant IgG fluorescerande konjugat. Vidare till varje brunn, försiktigt Applicera 1 droppe (cirka 50 µL) av medföljande konjugatet.
- Inkubera bilder i slutna färgning inkubation kammaren i 30 min.
Obs: Rekommenderas användning av Fc specifika IgG konjugat. Om det finns någon ANA förekommer i serum hos patienten, binds konjugatet till cellerna som är närvarande i varje brunn under denna inkubationstid, vilket resulterar i den specifika fluorescensen av cellerna som finns i brunnarna. Konjugatet är känslig för ljus. Stängda inkubation kammaren hjälper till att förhindra lätta störningar med konjugat reaktionen av cellerna som finns i varje brunn. - När inkubationstiden är över, ta bort bilden från inkubation kammaren. Håll bilden på fliken avsluta och skölj försiktigt med cirka 10 mL PBS tvättbuffert i kit med pipett eller i en bägare fylld med PBS. Över bilden omedelbart till en Coplin burk med PBS tvättbuffert och tvätta (blöt) för 10 min. Upprepa proceduren med alla återstående bilder.
Obs: När placera flera bilder i en Coplin-burk, se till att den cell sidan av bilden inte kontakta en annan bild, eftersom detta kommer att resultera i skada cellerna följs på en glasskiva. - Placera den coverslips som tillhandahålls i kit på en torr pappershandduk. Montering media medföljer kitet. Till den nedre kanten av täckglaset, gäller mellan 3-4 droppar av montering media i en linje.
- Ta ut en bild i taget från Coplin burken som innehåller tvättbuffert. Ta bort överflödigt tvättbuffert genom försiktigt tryck eller blot bilden på hushållspapper.
- Sänka bilden försiktigt vidare till täckglaset genom att placera den nedre kanten av bilden till kanten av täckglaset. Detta tillåter montering media närvarande på det lägre kanten täckglaset att flöda till den övre kanten av bilden, och minimerar bildandet av luftbubblor, som kan störa läsningen av varje väl av en bild.
Obs: Minimal tryck bör användas för att montera luckan bilden vidare till bilden. Något övertryck kan orsaka laterala rörelse av täckglas. Detta kan skada enskiktslager utarbetandet av cellerna och resultatet i distorsion. - Lagra bilder i mörker vid 2-8 ° C. Granska bilderna så snart de är monterade eller inom 48 h.
Obs: Längre lagring kan leda till försämring av mönstret och fluorescerande signal.
4. identifiering av positiva och negativa resultat
- Visa bilderna med fluorescerande Mikroskop med en FITC filter, ligger i ett mörkt rum.
- Undersöka efter specifika grön fluorescens i fluorescens Mikroskop vid förstoring 200 X eller senare för att göra den slutliga tolkningen angående positivitet och mönster. Iaktta de positiva och negativa kontrollerna.
Obs: Den positiva kontrollen visas ljusa grön fluorescens i kärnan (figur 2A, homogen). Den negativa kontrollen visar inga specifika grön fluorescens i fluorescens Mikroskop. - Spela in positiva/negativa resultatet för varje brunn och inkludera ANA mönstret för positiva fall.
Representative Results
HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat bevarar klassiska ANA mönster och underlättar tydlig åtskillnad av DFS70 mönster:
Konventionella och konstruerade cellerna på HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat är identiska, bevara alla autoantigener utom den LEDGF/p75. Den negativa kontrollen som tillhandahålls av kit upprättar baslinjen fluorescerande signalen. Positiva kontroller för homogena, spräckliga, centromer, nukleära och mitokondrie mönster på HEp-2 ELITE producera ett mönster som är identisk med förväntade mönster på konventionella HEp-2 IIF substrat (figur 2A). Dessa referens-mönster har beskrivits i detalj tillsammans med varje mönster antigen och sjukdom föreningen tidigare4,29. I tabell 1finns en kort beskrivning av mönster observerats i figur 2A .
DFS70 mönster på HEp-2 ELITE:
Cirka 10% av cellerna i varje väl visa en tät fint spräckliga mönster (ICAP tilldelade nomenklaturen: AC-2) som kan observeras på interphase kärnan och kromatin associerade färgning syns på mitotiska atomkärnor (figur 2B). På en konventionell HEp-2-substrat har alla celler detta mönster när reagerade med en DFS70 positivt prov. De återstående ~ 90% av HEp-2 celler har den psip1 -gen som kodar LEDGF antigen utslagen och därför inte kommer att producera en signal eller mönster när reagerade med en monospecifikt DFS70 positivt serum (figur 2B). Om 10% HEp-2 celler har ljusare fluorescens motsvarande DFS70 mönster och resten av celler närvarande ytterligare mönster (t.ex. böter fläckig eller nukleolära), sedan indikerar detta närvaron av blandade mönster. Närmare granskning av sådana mönster är viktigt att bekräfta alla autoantikropp särdrag som finns förutom DFS70 mönstret. För att demonstrera förmågan att HEp-2 ELITE substratet, en panel av sera prover skapades med olika koncentrationer av DFS70 och ANA positiva kontrollsera och testade på både konventionella och HEp-2 ELITE substrat med en standard IIF protokoll (figur 3 , Figur 4, figur 5, figur 6, figur 7).
Tolkning av DFS70 monospecifikt och blandade reaktioner på konventionella och HEp-2 ELITE substrat:
För varje specifikt sjukdomsassocierade ANA mönster (bild 3, bild 4, figur 5, figur 6, figur 7), en monospecifikt ANA mönster vänster mest kolumn och en monospecifikt DFS70 mönster på höger de flesta kolumn kan observeras. De tre kolumnerna i mitten representerar olika nyckeltal av sjukdomsassocierade och DFS70 mönster positiva kontroller. De resulterande blandade mönsterna är utmanande för att urskilja på konventionella HEp-2-substrat (figur 3, bild 4, bild 5, figur 6, figur 7, översta raden). Men med romanen Hep-2 ELITE underlaget, i de flesta av proverna, är skillnaden i intensitet mellan oförändrad och modifierade celler distinkt som inte bara bekräftar närvaron av DFS70 autoantikroppar (när förhållandet mellan ljusare till mindre ljusa celler är 1:9) men avslöjar också en sekundär ANA-mönster. När det gäller homogena-DFS70 eller spräcklig-DFS70 blandade reaktioner, är det omöjligt att tryggt förutsäga rätt mönster vilket leder till labben väljer för att köra ett antal ytterligare analyser (figur 1A). När det gäller centromer-DFS70 och nukleolära-DFS70 blandade reaktioner, misstänka DFS70 positivitet är mycket utmanande (figur 5, figur 6). Med nukleolära och cytoplasmiska retikulära/AMA reaktioner är DFS70 mönstret inte dominerande tills förhållandet sera når 50%. I alla exemplen, HEp-2 ELITE substratet kan presentera det DFS70 mönstret och underliggande sekundära mönstret över ett bredare utbud av intensitet nivåer och därmed underlättar en noggrannare ANA tolkning.
Att noga iaktta de blanda mönsterna, resultat för olika 50: 50 kombinationer av ANA och DFS70 positiva kontrollerna var förstorad (figur 8) för både konventionella och HEp-2 ELITE substrat. Det uppmuntras att iaktta både interphase och mitotiska färgning för alla ANA mönster inklusive DFS70 på HEp-2 substrat för att förbättra tolkning och noggrannhet av rapporterade mönster. För blandade mönster, kan mönstret differential fram genom att dividera cellkärna dock inte tillräcklig för att underlätta korrekt tolkning. Röda pilar (figur 8) visar den mitotiska kärnan i både konventionell och konstruerade cell. Det kan observeras som blandat DFS70 reaktioner på delande celler inte överensstämmer med den etablerade uppsättningen regler för tolkning av sjukdomsassocierade ANA mönster. Gul och blå pilar visar oförändrad och konstruerade (DFS70 KO) HEp-2 cellkärna, respektive. I alla kombinationer (figur 8), en tydlig intensitet skillnaden mellan omodifierade cell nuclear färgning (~ 10%) och konstruerade cell nuclear (~ 90%) mönster i samma mikroskopiska synfältet observeras, vilket möjliggör samtidig screening och bekräftelse av DFS70 mönster.
Figur 1: ANA screening algoritmer med konventionella metoder för HEp-2 och HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. (A) Schematisk River upp bristen på konventionella HEp-2 OOM att identifiera monospecifikt och blandade DFS70 positiva mönster i screening skede (gula skuggade området) och dess oförmåga att utesluta en sekundär sjukdomsassocierade ANA mönster som kan döljas av DFS70 mönster. «««Vidare, den nuvarande generationen av DFS70 specifika fast fas bekräftande analyser inte kan bekräfta monospecifikt DFS70 positivitet vilket leder till ytterligare bekräftande tester för ANAs. (B) Schematisk avslöjar funktionerna i HEp-2 ELITE för screening av ANAs, samtidiga skillnaden av monospecifikt och blandade DFS70 reaktioner, och eliminerar behovet av fast fas DFS70 bekräftelse analyser. Algoritm som använder HEp-2 ELITE avsevärt förenklar ANA screening och minskar antalet krävs för bekräftelse analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: klassiska ANA och DFS70 mönster på HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat. (A) HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat bevarar klassiska ANA mönster. Klassiska homogen reaktion och DFS70 positiva reaktioner producerades med hjälp av positiva kontrollerna som tillhandahålls av satsen. Andra reaktioner producerades med tidigare etablerade positiva kontrollsera för spräckliga, centromer, nukleolära och cytoplasmiska retikulära/AMA reaktioner5. (B) HEp-2 ELITE/DFS70 KO substrat ger både konventionella och konstruerade celler, vilket underlättar lätt skillnaden av DFS70 mönster. Schematiska visar den resulterande DFS70 monospecific reaktionen färgningsmönster på interphase och dividera cellkärnor för både konventionella och konstruerade (DFS70-KO) celler. Bearbetade HEp-2 celler saknar LEDGF/p75/DFS70 antigen som möjliggör samtidiga detektion av sekundära mönster som vanligtvis är dolda av DFS70 autoantikropp reaktion på konventionella HEp-2 substrat. Pilar (gul) visar exempel på mitotiska cellkärnor. Skala staplarna representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: DFS70 och homogen sera i kombination. DFS70 monospecifikt sera var kombinerat med en positiv homogent mönster i olika nyckeltal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 och 0:100) och testade på konventionella och konstruerade (DFS70-KO) HEp-2 substrat. Skala staplarna representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: DFS70 och spräckliga sera i kombination. DFS70 monospecifikt sera var kombinerat med en positiv spräckliga mönster i olika nyckeltal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 och 0:100) och testade på konventionella och konstruerade (DFS70-KO) HEp-2 substrat. Skala staplarna representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: DFS70 och centromer sera i kombination. DFS-70 monospecifikt sera var kombinerat med en positiv centromer mönster i olika nyckeltal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 och 0:100) och testade på konventionella och konstruerade (DFS70-KO) HEp-2 substrat. Skala staplarna representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: DFS70 och nukleolära sera i kombination. DFS-70 monospecifikt sera var kombinerat med en positiv nukleolära mönster i olika nyckeltal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 och 0:100) och testade på konventionella och konstruerade (DFS70-KO) HEp-2 substrat. Skala staplarna representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: DFS70 och cytoplasmiska retikulära/AMA sera i kombination. DFS70 monospecifikt sera var kombinerat med en positiv mitokondriell mönster i olika nyckeltal (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 och 0:100) och testade på konventionella och konstruerade (DFS70-KO) HEp-2 substrat. Skala staplarna representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 8: blandade mönster (50: 50 ratio) produceras på konventionella och HEp-2 ELITE substrat. Skillnaderna mellan de två substratesna avslöjas. Röda pilarna visar den mitotiska kärnan i både konventionell och konstruerade cellerna på båda substrat. Dessa kombinationer är differentiell mönstret fram genom att dividera cellkärna på konventionella HEp-2 substrat inte tillräcklig för korrekt tolkning av blandade mönster. Det kan noteras att blandade DFS70 reaktioner på delande celler kan störa den etablerade uppsättningen regler för tolkning av sjukdomsassocierade ANA mönster. Gul och blå pilar visar oförändrad och konstruerade (DFS70 KO) HEp-2 cellkärna, respektive. Resultaten för alla kombinationer testade på bakåtkompilerade substratet: en tydlig intensitet skillnad mellan interphase nukleära mönstret tillhör omodifierade celler (~ 10%) och bearbetade celler (~ 90%) observerades, vilket möjliggjorde samtidiga påvisande och bekräftelse av DFS70 mönster. Skala staplarna representerar 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| ANA mönster | Beskrivning | |
| Homogen | Hela kärnan fluorescerar i jämnt med en diffus färgning mönster. | |
| Spräcklig | Diskret, grovt till fina prickar av fluorescerar i hela kärnan. Fina spräckliga och grova spräckliga mönster har beskrivits. | |
| Nukleolära | Nukleolerna fläcken som flera fasta eller spräckliga organ inom kärnan. Subtyper har beskrivits tidigare. | |
| Centromer | Stora prickar av ändligt antal. Reaktiva antigen segregerar med kondenserade kromosomer i cellerna genomgår Mitos. | |
| Cytoplasmiska retikulära/AMA | Cytoplasman visas granulat med positiv färgning av mitokondrierna. | |
| DFS70 | •Conventional HEp-2 celler: en tät fint spräckliga mönster observeras på interphase kärnan och kromatin associerade färgning syns på mitotiska atomkärnor. | |
| •Engineered DFS70 KO celler: Anti-DFS70 antikroppar producera negativa färgning | ||
| HEp-2 Elite / DFS70 KO har konventionella och konstruerade (DFS70 KO) celler i cirka 1:9-förhållande. Konventionella celler producera typiska DFS70 mönster och bearbetade celler producera ett negativt mönster när reagerade med en DFS70 monospecifikt/isolerade positiva reaktioner. | ||
Tabell 1: Beskrivning av ANA mönster.
Discussion
Autoantikroppar mot kärnkraft och cytoplasmatiska antigen är mycket utbrett i systemiska autoimmuna sjukdomar. Även om ingen enskild analys ger bästa möjliga känslighet och specificitet, betraktas IIF av HEp-2 allmänt som en mycket känslig och kostnadseffektiv metod för systemiska autoimmuna sjukdomar2,3,4 . Trots förekomsten av IIF protokoll för mer än 50 år är noggrannhet IIF assay starkt beroende av skicklighet av teknikern, försiktig körning av de enskilda stegen i protokollet och korrekt tolkning av resultat med hjälp av en välskött fluorescens Mikroskop. Diagnos av systemisk autoimmun sjukdom bör inte grundas på resultaten av en enda serologiska test såsom IIF av HEp-2.
Beredning av reagens med hög kvalitet vatten (destillerat/avjoniserat), användning av standardiserade Paketkomponenter (diabilder med HEp-2 celler enskiktslager, prov spädningsmedel, positiva och negativa kontroller, pre utspädda optimerad FITC-konjugat och monteringsmedium) ha en positiv inverkan på resultaten. Hoppa över tillsättning av kontroller eller prover på brunnar kan uppmuntra falskt negativa tolkningar. Torkning av bilder när som helst efter tillägg av provet eller kontroll kan resultera i artefaktiska falska positiva reaktioner och/eller felaktig mönster. För mycket tvättbuffert vänster på bild eller torkning av bild wells innan dispens av monteringsmedium kan resultera i artefakter. Lägga till otillräcklig mängd av montering medium eller genererar bubblor på bild ytan innan du placera ett täckglas kan leda till reaktioner som ser suddiga eller ur fokus när observerats under mikroskopet. Monterade diabilder skall förvaras vid 2-8 ° C och analyseras inom fönstret Rekommenderad tid att minimera falska negativa eller artefaktiska resultat.
Med välskötta epi-fluorescerande Mikroskop som inrymmer en lämplig LED/Hg/Xenon ljus källa och rent optiska komponenter inklusive excitation och utsläpp filter som inte är skadade är avgörande för att få korrekta IIF resultat. Slutanvändaren utbildning för diskriminerande positiv/negativ reaktion stödnivåer och tolkning av mönster är kritisk. HEp-2 IIF analyser är känsliga för brist på standardisering i förfaranden, Mikroskop konfiguration, och slutanvändaren utbildning eller skicklighet. Samförstånd nomenklaturen och representant mönster och exempel på bilder som förvärvas med hjälp av olika tillverkare görs tillgängliga genom ICAP (< www.ANApatterns.org>) för utbildningsändamål4. Ett HEp-2 celler mönster klassificering träd som tillhandahålls av ICAP för olika nukleära, cytoplasmiska och mitotiskt mönster är en värdefull resurs att lära de subtila skillnaderna mellan olika mönster som kan likna den otränade ögon4. En av de främsta exemplen på ett utmanande mönster är den DFS70 som också saknar en tydlig association med en autoimmun sjukdom, och som diskuterats i tidigare avsnitt detta mönster är mycket utbrett i friska populationer5.
Beroende på studien, förekomsten av anti-DFS70 autoantikroppar variera mellan friska kohorter, ANA screening populationer och ANA positiva individer utan tecken på systemisk autoimmun sjukdom9,16,20 ,30,31. DFS70 autoantikroppar har rapporterats förekomma i isolering samt med andra sjukdomsassocierade ANA mönster. Isolerade eller monospecifikt DFS70 mönster rapporteras i 2-22% av friska kontroller men i mindre än 1% av fallen med autoimmun reumatisk sjukdom32. Baserat på dessa trender, föreslogs DFS70 mono-positiva mönster som ett kriterium för att utesluta i autoimmuna reumatiska sjukdomar av ICAP kommittén3,31,32. ICAP kommittén, för att främja harmonisering av autoantikroppar test nomenklaturen och tolkning av resultaten HEp-2 IIF, rekommenderar rapportering DFS70 positivitet när rapportering ANA screening resultat4.
Innan dom ut en systemisk autoimmun sjukdom utifrån DFS70 mono-positivitet, är det viktigt att se över nuvarande metoder för screening och bekräftelse (särskilt de specifikt för DFS70). Avtalet mellan DFS70 positivitet av HEp-2 OOM och fast fas bekräftande analyser nämligen ELISA, CLIA och linje immunoassay/dot blot metoder) varierade kraftigt mellan olika studier13,22,25,33 . IIF tolkning och bekräftande analys parametrar som bidrar till denna oenighet har diskuterats tidigare5,13,34. En nyligen föreslagna immunoadsorption strategi för anti-DFS70 antikropp bekräftelse tar upp några av bristerna i nuvarande fasta fasen analyser (för DFS70) men kräver labben att utföra ytterligare ett steg i IIF förfarande på misstänkta prover, som ökar den kostnad och turnaround tid för rapportering av resultat13. Detta ytterligare steg krävs inte när HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler används för rutin ANA screening. Detta minskar den totala kostnaden och dessutom finns det ingen påverkan på handläggningstid som DFS70 mönster är skönjas i den inledande bedömning steg27. En ytterligare nackdel med att använda konventionell HEp-2 IIF metod är att det är svårt att skilja DFS70 mönster samarbete förekommer med andra ANA mönster vid screening scenen. Denna nackdel är dock att övervinna genom användning av HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler27.
Jämförande utvärdering av konventionella HEp-2 och den nya konstruerade HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) med ANA positiva kontroller och deras kombinationer med en mono-positiva DFS70 kontroll, påvisa nyttan av nya substratets förmåga att samtidigt skärm för ANAs och bekräfta DFS70 mönster (figur 1). IIF protokollet för den nya substraten är identisk med den konventionella HEp-2 IIF-metoden. Tolkning systemet för alla sjukdomsassocierade ANA mönster är identiska med undantag för DFS70 mönstret (tabell 1). Tolkning av både mono-positiv och blandade DFS70 mönster var relativt lättare med den nya metoden och det garanterar inte ytterligare analyser (figur 1B). Genomförandet av denna nya metod i kliniska lab förenklar den utmaning som är associerad med tolkningen av DFS70 mönster och förbättrar den totala noggrannheten av ANA screening av ytterligare avslöjar sjukdomsassocierade ANA mönster tidigare dold av DFS70 (blandade mönster).
Disclosures
Författarna Kishore Malyavantham och Lakshmanan Suresh är anställda av Trinity Biotech, USA.
Acknowledgments
Vi tackar Andrew Zenger för att utföra de IIF experiment och samla in bilder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
| ANA positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
| DFS70 antibody positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
| Negative control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
| Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
| Buffer diluent for serum | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
| Mounting medium | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
| Coverslips | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
| ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1103, 1103-240 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials used in the study but not provided by the kits | |||
| Diagnostic fluorescent microscope | Nikon Eclipse 50i | Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1 | |
| Incubation chamber | Trinity Biotech | provided for customers (no catalog #) | |
| Coplin jar | n/a | General labware | |
| Paper towels | n/a | General lab supplies | |
| distilled/deionized water | n/a | General lab supplies |
References
- American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011).
- Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
- Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
- Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412 (2015).
- Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).
- Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
- Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
- Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
- Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
- Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
- Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
- Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
- Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
- Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
- Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
- Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
- Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).
- Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
- Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
- Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
- Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).
- Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).
- Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
- Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
- Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
- Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
- Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
- Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
- Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
- Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).
- Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
- Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
- Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759 (2013).
- Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).
