Summary
Mild intrauterin hypoperfusion blev produceret af arterie stenose med metal microcoils svøbt omkring de uterus og æggestokkene arterier i rotter på embryonale dag 17. Denne procedure produceret prænatal hypoperfusion og intrauterin vækst begrænsning.
Abstract
Intrauterin hypoperfusion/iskæmi er en af de største årsager til intrauterin/føtal vækst begrænsning, præterm fødsel og lav fødselsvægt. De fleste undersøgelser af dette fænomen er blevet udført i enten modeller med alvorlig intrauterin iskæmi eller modeller med gradient graden af intrauterin hypoperfusion. Ingen undersøgelse er blevet udført i en model på ensartet mild intrauterin hypoperfusion (MIUH). To modeller er blevet brugt til undersøgelser af MIUH: en model baseret på sutur ligatur af begge sider af den arterielle arkade dannet med uterus og æggestokkene arterier, og en forbigående model baseret på klipning bilaterale æggestokkene arterier og aorta med passage. Disse to gnavere modeller af MIUH har nogle begrænsninger, f.eks., ikke alle fostre er udsat for MIUH, afhængigt af deres placering i den uterine horn. I vores MIUH model, er alle fostre udsat for et sammenligneligt niveau for intrauterin hypoperfusion. MIUH blev opnået ved mild stenose af alle fire arterier fodring livmoderen, dvs, de bilaterale uterus og æggestokkene arterier.
Arteriel stenose er fremkaldt ved metal microcoils svøbt omkring fodring arterierne. Producerer arteriel stenose med microcoils tillod os at styre og optimere reproducere nedsat blodgennemstrømning med meget lidt mellem dyrs variabilitet og en lav dødelighed, således at nøjagtig evaluering. Når microcoils med en indre diameter på 0,24 mm blev brugt, blodtilførslen i moderkagen og fosteret var mildt faldt (ca. 30% af niveauet før stenose i moderkagen). Afkom af vores MIUH model viser klart varige ændringer i neurologiske, neuroanatomical og adfærdsmæssige testresultater.
Introduction
Spædbørn med intrauterin vækst begrænsning (IUGR) (også kendt som fostrets vækst begrænsning) (fødsel vægt < 10th percentilen for gestationsalder), præmature fødsel (født på < 37 uger af drægtigheden), og/eller lav fødsel vægt (< 2500 g) konto for næsten 10% af alle nyfødte 2,3. Mange af disse spædbørn præsentere med neurologiske problemer såsom cerebral parese og udviklingsmæssige forstyrrelser (fx, attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) og læring lidelser) 3,4,5. Disse betingelser har ligheder og forskelle i deres ætiologi og resultater. Ætiologien af IUGR er multifaktoriel, og placenta insufficiens forbundet med intrauterin hypoperfusion anses for at være den mest almindelige årsag i ikke-anomale fostre 7. Ætiologien af præmature er multifaktoriel så godt, og chorioamnionitis er den hyppigste årsag 8.
Mild intrauterin hypoperfusion (MIUH) indflydelse på udvikle hjernen er uklart. I øjeblikket involverer tilgængelige dyremodeller for intrauterin hypoperfusion/iskæmi primært enten svær hypoperfusion eller gradient graden af hypoperfusion med eller uden reperfusion 9,10,11. I kliniske indstillinger, men anses tilfælde af MIUH for at være langt hyppigere end dem, der involverer sådanne alvorlige forhold. De aktuelt tilgængelige modeller af MIUH er en gnaver model med sutur ligatur af enten i livmoderen eller æggestokkene arterie og en gnaver model med klipning bilaterale æggestokkene arterier og aorta med passage 12,13, 14,15,16,17. En af ulemperne ved disse modeller er den omfattende Inter fosteret variabilitet, lige fra fostre med dyb hypoperfusion til fostre med næsten intakt perfusion, afhængigt af fosteret i den arterielle arkade af den uterine position og æggestokkene arterier. En anden ulempe ved disse modeller er deres manglende evne til at skelne placeringen af hver fosteret efter fødslen; Derfor kan ikke forskere skelne sværhedsgraden af intrauterin hypoperfusion opleves af en enkelt hvalp efter sin fødsel.
Vi har udviklet en rotte model af MIUH involverer flere arterie stenose 1. Indpakning metal mikro-spoler med en indre diameter på 0,24 mm omkring æggestokkene og uterin arterierne forårsager stenose, men ikke tilstopning af blodkar (figur 1). Gælder disse microcoils på de proksimale dele af alle arterierne leverer livmoderen, dvs, de bilaterale uterus og æggestokkene arterier, embryonale dag 17 (svarende til embryonale uger 20-25 i mennesker 18) inducerer en betydelig, men mild nedgang i blodtilførslen til placenta og fostre. Fald i blodgennemstrømningen efter bredbånd anvendes til alle fire arterier fodring livmoderen er stort set de samme på tværs af hver moderkagen og fosteret. Fosteret dødeligheden er mindre end 20%. Hvalpene er født via spontane labor 1-2 dage tidligere (embryonale dag 21-22) end normalt. Næsten alle hvalpe er født udstiller betydeligt lav fødselsvægt vægte 1. Grå og hvid sag diskenheder er faldet uden indlysende væv skade 1. Pups præsentere med forsinket erhvervelse af nyfødte reflekser, muskelsvaghed og ændrede spontan aktivitet 1. Denne model efterligner de kliniske tegn og symptomer på børn født for tidligt eller med IUGR; børn født præterm udstille reduceret grå og hvid substans volumen med eller uden hvide substans skade 6, nuværende forsinkede milepæle af neurologiske udvikling, og kan præsentere adfærdsmæssige problemer ADHD 3,5; børn med IUGR udstille minimale neuroanatomical ændringer, og har en øget risiko for nedsat neurologiske udvikling som motoriske og kognitive forsinkelse 4,7. Præterm fødsel og IUGR er forskellige betingelser, men de to betingelser deler den grundlæggende mekanisme, dvs fornærmelser til umodne hjerner før fuldbårne gestationsalder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt eksperimenterende Animal Care og brug Udvalget af de nationale Cerebral og Cardiovascular Center, Suita, Japan.
1. Forbered følgende dyr og materialer til MIUH kirurgi
- Forberede timet gravid Sprague-Dawley rotter på svangerskabsuge dag 17, dvs, embryonale dag 17 (E17). Dæmninger gennemsnitlige krop vægte er 307.0 ± 40.7 g (betyde ± SD, n = 9).
- Forberede metal microcoils; indre diameter 0,24 mm, fremstillet af guld-belagt stål.
- Forberede alle materialer pr. tabel materialer.
2. forberede MIUH kirurgi
- Varm en varmepude ved 37 ° C i rotte placering
- Placer en steril ble på den hede afrivningsblok
- Varm sterilt saltvand ved 37 ° C i et vandbad
3. udføre MIUH kirurgi
- Udføre kirurgiske procedurer under steril tilstand. Sterilisere spoler, pincet, nål med 70% ethanol før brug. Bruge sterile handsker, og lejlighedsvis desinficere ved at anvende ethanol spray.
- Placere rotten i boksen anæstesi induktion. Indføre 4% isofluran i boksen (ca. 5 min.).
- Placere rotten på en steril ble på den hede afrivningsblok i en liggende stilling, efter at dyret er grundigt bedøvede i boksen induktion. Tjek for dybde af anæstesi ved manglen på en reaktion på en tå knivspids. Vedligeholde 1,5-2,0% isofluran med en næse kegle.
- Påfør depilatory skum på maven fra navlen ned til bækken arch-regionen. Efter flere minutter, aftørre den depilatory skum med et stykke køkkenrulle. En barbermaskine kan bruges som en erstatning for det depilatory skum.
- Anvende gaze vædet i desinficerende jodopløsning til regionen skrabet af huden.
- Placer en kirurgisk drapere med en rund åbning til at dække maven end område af de kirurgiske indsnit. Flere stykker gaze kan bruges som en erstatning for drapere.
- Ved hjælp af en kirurgisk skalpel, gøre et snit ca 2,5 cm lange på den nedre del af maven fra den øverste kant af skambenet lige op mod navlen. Derefter foretage et snit gennem muskel lag nedenunder.
- Placer flere stykker af steril gaze rundt om åbningen af drapere, og våde gaze med opvarmet saltvand.
- Skubbe begge laterale sider af maven blidt, således at en del af uterin horn opstår fra indsnittet.
- Desinficere kirurgens hænder med 70% ethanol.
- Forsigtigt trække den hele uterin horn fra bughulen manuelt uden at bruge pincet. Ved hjælp af kirurgiske pincet er ikke tilrådeligt, da de kan nemt beskadige skrøbelige livmoderen, fostre og blodkar ved at komprimere dem kraftigt og ujævnt.
- Placer den uterine horn på den våde gaze.
- Udføre den samme procedure for andre uterine horn.
- Tæl antallet af fostre.
- Anvende varmede saltvand hyppigt for at holde livmoderen varm og våd under hele operationen.
- Ændre bleen, når det har absorberet for meget saltvand. For at opretholde stabiliteten, Gentag desinfektion handsker med 70% ethanol og tips af instrument med jod. At holde ikke-sterile fingrene væk fra de sterile tips af instrumentet er afgørende.
- Identificere den proksimale del af de vigtigste arkade af æggestokkene og uterin arterierne under et stereomikroskop.
Bemærk: Det er afgørende at skelne mellem de vigtigste arkade fra grene til placenta. Bemærk at den kirurgiske operation kan være lettere, når den uterine horn er vendt. Lejlighedsvis, er anvender en spole på den meget proksimale del af arkaden vanskeligt, fordi det er placeret dybt inde i bughulen og arterier til moderkagen er meget tæt på den proksimale del af arkaden. I dette tilfælde kan en spole anvendes på en del af arkadespil efter de første gren gafler. - Adskille arterie fra vene løber parallelt til det med pincet og gøre plads mellem dem.
- Placer et stykke snor (silke sutur 4.0, 5 cm lang) nedenunder arterie.
- Løft begge ender af strengen med pincet, således at arterien er ophævet og adskilt fra den skrøbelige vene.
- Holder kanten af microcoil med fine pincet i anden hånden, placere en microcoil ved siden af den løftede arterie (figur 2.1).
- Rotere den løftede arterie ved hjælp af snor rundt om microcoil til wrap microcoil omkring arterie. Det er lettere at rotere arterie omkring spolen end at dreje spolen omkring arterie (figur 2.2).
- Efter roterende arterie ændre 3 eller 4 omgange (bredbånd har 5 omgange), stedet hvor spolen er afholdt til anden kanten. Hold kanten af spolen, der er blevet pakket omkring arterie med pincet. Ændre det websted, hvor strengen elevatorer arterie til anden siden af spolen. Rotere arterie omkring spolen så spolen helt (5 viser) ombryder arterie (figur 2.3, 2.4).
- Fjerne strengen.
- Udføre den samme procedure for de andre tre arterier.
- Bemærk at ofte anvende varmede saltvand til livmoderen er afgørende; ellers, dødeligheden af fostrene øger, og hypotermi muligvis neuroprotektive.
- Forsigtigt returnere den uterine horn ind i bughulen. Løft en kant af bugvæggen snit med pincet kan gøre denne procedure lettere.
- Stich den mavemuskel, og derefter stich abdominal huden med sutur (silke sutur 4.0). Binde sutur efter hver stich, dvs afbrudt enkelt suturer.
- Anvende gaze vædet i desinficerende jodopløsning på og omkring den kirurgiske indsnit.
- Administrere den analgetiske meloxicam på 0,5 mg/kg legemsvægt subkutant.
- Mulighed for 30 min opsving i en opvarmet bur. Check dyr hvis fuldt vågen og bevæger sig rundt i buret, vende tilbage til hjem bur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter anvender microcoils til alle af arterierne fodring livmoderen, dvs, de bilaterale uterus og æggestokkene arterier, udsættes alle fostre for sammenlignelige niveauer af hypoperfusion. Anvendelse af microcoils med en indre diameter på 0,24 mm forårsager mild stenose af de arterier, dermed forårsager en mild fald i blodtilførslen til placenta og fostre (figur 3, ca 30% af niveauet før stenose i moderkagen, se henvisning 1 for detaljer). Hvalpe født fra dæmningen demonstrere IUGR (tabel 1).
Dæmninger synes at være hypoaktiv i løbet af et par dage efter operationen. Bortset fra at, dæmningerne ikke præsentere nogen mærkbar komplikationer, og fuldstændig genoprettet i en uge efter operationen. Dæmninger er i stand til at leve i lang tid efter leveringen (dødelighed er 0% for observation periode), og at sygeplejerske unger. Spolerne forblive på samme sted.
Tabel 1. Body vægt ved fødslen (Postnatal dag 0, P0) og på den dag svarer til embryonale dag 29 (E29), som blev P6-8. Unger i no-kirurgi kontrolgruppen var født på E23, hvorimod dem i gruppen sham-kirurgi blev født 1 dag tidligere (E22); dem i gruppen mild intrauterin hypoperfusion (MIUH) blev født 1-2 dage tidligere (E21-22) via spontane arbejdskraft. Derfor blev E29 ækvivalenter P6 til P8 afhængigt af den pup svangerskabsperioden. (n = 8-14 i hver gruppe, for hvert køn og hvert tidspunkt) *P < 0,01 vs en no-kirurgi kontrol gruppe samt en sham-kirurgi gruppe. En-vejs ANOVA, efterfulgt af en Tukey-Kramer test.
Figur 1. Skemaet for den anatomiske arterielle system i livmoderen. Fire microcoils blev installeret i nærheden af arterierne opstrøms af bilaterale æggestokkene og uterin arterierne. De stiplede pile angiver retningen af arterielt blod flow. Dette tal er blevet ændret fra ene i vores tidligere publikation 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Illustration af anvendelsen af en spole til en arterie. 1. løft op arterie med en streng. Sted en microcoil ved siden af arterien. 2. ved at dreje arterie omkring microcoil, er microcoil pakket omkring arterie. 3. efter roterende arterie ændre 3 eller 4 omgange (spolen har 5 omgange), stedet hvor spolen er afholdt til anden kanten. Hold kanten af spolen med arterie ved hjælp af pincet. Ændre det websted, hvor strengen elevatorer arterie til anden siden af spolen. 4. Drej arterie omkring spolen så spolen helt (5 viser) ombryder arterie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Et repræsentativt billede af en livmoder produceret med laser speckle flowmetry1. Dette billede viser nedsat blodgennemstrømning i det venstre uterine horn, men ikke ret, efter coil stenose blev udført i de venstre ovarie og uterin arterierne. *: placeringer af coil stenose i arkade af æggestokkene og uterin arterierne; øverste stjerne svarer til den proksimale del af æggestokkene arterie, og lavere svarer til den proksimale del af uterine arterie. Stiplede linje angiver arkade af æggestokke og livmoder arterierne i den venstre uterin horn. Rødlig farve indikerer mere blodgennemstrømning, blålig farve viser mindre blodgennemstrømning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microcoil stenose af både æggestokke og livmoder arterier i begge uterin horn producerer konsekvent og reproducerbar intrauterin hypoperfusion i alle placenta og fostre. Niveau af hypoperfusion kan ændres ved hjælp af microcoils med forskellige indvendige diameter. Rotte hvalpe født fra en dam, som arterie stenose har været udført med microcoils 0,24 mm indre diameter demonstrere IUGR og for tidlig fødsel (Se reference 1 for detaljer). Hvalpene udstiller neuroanatomical og adfærdsmæssige ændringer, der ligner de tegn og symptomer observeret hos præmature børn. Disse neuroanatomical ændringer omfatter ventrikulær udvidelsen, udtynding af cortex og corpus callosum, og faldt hjernen vægt men ingen indlysende celletab eller cystisk læsioner 1. De adfærdsmæssige forandringer observerede omfatter en forsinket neonatal refleks, nedsat muskelstyrke og ændret spontan aktivitet 1.
For at studere intrauterin iskæmi, er animalske modeller baseret på svær iskæmi over en kort varighed med reperfusion hyppigt anvendte 10,11. Når begge ender af arterie arkade dannet af æggestokkene og uterin arterierne er blokeret af klipning, er blodforsyningen til uterin horn (herunder placenta og fostre) helt stoppet. Derfor, varigheden af klipning skal være korte, eller fostrene vil dø. I en klinisk indstilling, men spekulere vi at langvarig mild hypoperfusion må oftere mødt frem for pludselige blokade af blodtilførslen til livmoderen og dens fuldstændig genopretning inden for en time.
Gnavere modeller med sutur ligatur af én eller begge kørebanen af arkade af den uterine arterie og dem, der involverer klipning, der forlader nogle indre rum mellem de bilaterale æggestokkene arterier og aorta har været de eneste tilgængelige modeller af mild forlænget intrauterin hypoperfusion 13,14,16,19,20. Disse ligatur og klipning modeller har lav reproducerbarhed, dvs., kun et par fostre overleve og lider af hypoperfusion. Når blodtilførslen til æggestokkene arterie blokeres af sutur ligatur, fostrene ligger tættest til æggestokkene, dvs, på toppen af den uterine horn, er udsat for dyb iskæmi, der henviser til, at fostrene ligger tættere til cervix og vagina er udsat for minimal eller ingen falder i blodet leverer 12.
Der er tre vigtige trin i protokollen. At identificere den proksimale del af de vigtigste arkade af æggestokke og livmoder arterier er afgørende. De vigtigste arteriel arcade har talrige grene til placenta. Nogle af disse filialen arterier er store i diameter, og lejlighedsvis er næsten så store som hovedfærdselsåre. Derfor kan skelne hovedfærdselsåre blandt flere andre forgrening arterier være forvirrende. Bemærk, at den vigtigste arteriel arkade ikke er stor i diameter. Venen kører ved siden af Arcaden er flere gange større i diameter end arterie. Arterier kan blive endnu smallere, på grund af konstriktion svar på kirurgisk stimulation. Adskille arterie fra venen kører sideløbende med det er en delikat opgave. Adventitia af arterie er i tæt kontakt med vene overalt i de fleste af arkaden. Vær opmærksom på at venen let bløder ved berøring af pincet. Holder livmoderen, varm og våd er kritisk. ellers, dam og fostre kan lider af stress og dehydrering, og mange fostre kan gå tabt før levering. Begrænsning af denne coil stenose model teknik er længe kirurgisk varighed påkrævet. En periode på ca. 60 min. er kræves for at fuldføre operationen ved at anvende fire spoler. Denne lange kirurgisk varighed kan forårsage yderligere stress til fostrene og dæmningen.
Vi mener, at den model, præsenteret i dette papir er mest klinisk relevante og reproducerbare model af MIUH. Denne model giver mulighed for vurdering af den tidsmæssige og langsgående virkninger af MIUH på IUGR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af FY 2013 Research Exchange Program mellem JSP'ER, CNRS, JSP'ER KAKENHI tilskud antal 26860858 og Narishige Neuroscience Research Foundation. Vi takker Drs. Mariko Harada-Shiba og Kyoko Shioya for nyttige diskussioner. Vi takker Mari Furuta, Mutsumi Sakamoto, Ritsuko Maki og Dr. Emi Tanaka for fremragende teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | |||
| Isoflurane anesthesia machine | |||
| Anesthesia induction box | |||
| Heating pad | |||
| Diaper 30x40 cm | |||
| Depilatory foam or shaver | |||
| Iodine disinfectant solution | |||
| Gauze 10x20 cm | |||
| Surgical drape 45x45 cm with a round opening 5 cm in diameter | |||
| Spray bottle with ethanol for disinfection | |||
| Cotton swab | |||
| Forceps with large blunt tips | |||
| Forceps with angled fine tips | |||
| Scissors | |||
| Surgical scalpel, blade size is 27mm long (no.10, Axel, AS ONE Corporation, Osaka, Japan) | |||
| Surgical suture needle | |||
| Metal microcoils; inner diameter 0.24 mm, made from gold-coated steel (SAMINI Co. Ltd., Shizuoka, Japan) | |||
| Silk suture 4-0 | |||
| Sterile saline (0.9% sodium chloride) | |||
| Heating water bath | |||
| Plastic syringes (50ml) and needles (18G) |
References
- Ohshima, M., et al. Mild intrauterine hypoperfusion reproduces neurodevelopmental disorders observed in prematurity. Sci Rep. 6, 39377 (2016).
- Specified Report on Vital Statistics in FY2010, Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. , Available from: http://www.mhlw.go.jp/english/database/db-hw/FY2010/live_births.html (2010).
- Anderson, P., Doyle, L. W., Victorian Infant Collaborative Study, G. Neurobehavioral outcomes of school-age children born extremely low birth weight or very preterm in the 1990s. JAMA. 289 (24), 3264-3272 (2003).
- Levine, T. A., et al. Early childhood neurodevelopment after intrauterine growth restriction: a systematic review. Pediatrics. 135 (1), 126-141 (2015).
- Sucksdorff, M., et al. Preterm Birth and Poor Fetal Growth as Risk Factors of Attention-Deficit/ Hyperactivity Disorder. Pediatrics. 136 (3), e599-e608 (2015).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. Lancet Neurol. 8 (1), 110-124 (2009).
- Nardozza, L. M., et al. Fetal growth restriction: current knowledge. Arch Gynecol Obstet. 295 (5), 1061-1077 (2017).
- Chang, E. Preterm birth and the role of neuroprotection. Bmj. 350, g6661 (2015).
- Coq, J. O., Delcour, M., Massicotte, V. S., Baud, O., Barbe, M. F. Prenatal ischemia deteriorates white matter, brain organization, and function: implications for prematurity and cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 58, Suppl 4. 7-11 (2016).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia-Ischemia. Cereb Cortex. 25 (9), 2683-2695 (2015).
- Kubo, K. I., et al. Association of impaired neuronal migration with cognitive deficits in extremely preterm infants. JCI Insight. 2 (10), (2017).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Int J Dev Neurosci. 29 (6), 593-607 (2011).
- Gilbert, J. S., Babcock, S. A., Granger, J. P. Hypertension produced by reduced uterine perfusion in pregnant rats is associated with increased soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression. Hypertension. 50 (6), 1142-1147 (2007).
- Granger, J. P., et al. Reduced uterine perfusion pressure (RUPP) model for studying cardiovascular-renal dysfunction in response to placental ischemia. Methods Mol Med. 122, 383-392 (2006).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic-ischemic injury. J Neurosurg Pediatr. 6 (3), 206-221 (2010).
- Olivier, P., Baud, O., Evrard, P., Gressens, P., Verney, C. Prenatal ischemia and white matter damage in rats. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (11), 998-1006 (2005).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic-ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18 (3), 568-581 (2005).
- Rice, D., Barone, S. Jr Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ Health Perspect. 108, Suppl 3. 511-533 (2000).
- Basilious, A., Yager, J., Fehlings, M. G. Neurological outcomes of animal models of uterine artery ligation and relevance to human intrauterine growth restriction: a systematic review. Dev Med Child Neurol. 57 (5), 420-430 (2015).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical, sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22 (1), 1-16 (2012).
