Summary
Mild intrauterine hypoperfusion ble produsert av arterien stenose med metall microcoils pakket rundt livmor og eggstokkreft arteries i rotter på embryonale dag 17. Denne prosedyren produsert prenatal hypoperfusion og intrauterine vekst begrensning.
Abstract
Intrauterine hypoperfusion/iskemi er en av hovedårsakene til intrauterine/fetal vekst begrensning, tidlig fødsel og lav fødselsvekt. De fleste studier av dette fenomenet er utført i enten modeller med alvorlige intrauterine iskemi eller modeller med gradient grad av intrauterin hypoperfusion. Ingen studie har utført i en modell på uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). To modeller er brukt for studier av MIUH: en modell basert på Sutur ligation av hver side av arteriell arkaden dannet med livmor og eggstokkreft arteriene, og en forbigående modell basert på klipping bilaterale ovarian arteriene og aorta har patency. De to gnager modellene av MIUH har noen begrensninger, f.eks ikke alle fostre er utsatt for MIUH, avhengig av posisjonen i livmor horn. I MIUH modellen, er alle fostre utsatt for et tilsvarende nivå for intrauterine hypoperfusion. MIUH ble oppnådd av mild stenose i alle fire arterier fôring livmoren, dvs. bilaterale livmor og eggstokkreft arteriene.
Arterial stenose ble indusert av metall microcoils pakket rundt fôring arteriene. Produserer arteriell stenose med microcoils tillatt oss å kontrollere, optimalisere og reprodusere redusert blodstrøm med lite Inter dyr variasjon og en lav dødelighet, dermed muliggjør nøyaktig vurdering. Når microcoils med en diameter på 0,24 ble brukt, blodstrømmen i både morkaken og Foster var mildt redusert (ca 30% fra før stenose nivå i morkaken). Avkom av vår MIUH modell tydelig viser varige endringer i nevrologiske, nevroanatomi og atferdsmessige testresultater.
Introduction
Spedbarn med intrauterine vekst restriksjonskoder (IUGR) (også kjent som fetal vekst begrensning) (fødselen vekt < 10th persentil for svangerskapsdiabetes alder), tidlig fødsel (født på < 37 uker av svangerskapet) og/eller lav fødselen vekt (< 2500 g) konto for nesten 10% av alle nyfødte 2,3. Mange av disse spedbarn presenterer nevrologiske problemer som cerebral parese og utviklingsforstyrrelser (f.eks oppmerksomhet-underskudd/hyperaktivitet (ADHD) og læring lidelser) 3,4,5. Disse betingelsene har likheter og forskjeller i etiologien og resultater. Etiologien for IUGR er multifaktoriell placental insuffisiens tilknyttet intrauterine hypoperfusion anses å være den vanligste årsaken i ikke-uregelrett fostre 7. Etiologien for premature er multifaktoriell også, og chorioamnionitis er de hyppigste årsak 8.
Påvirkning av mild intrauterine hypoperfusion (MIUH) på å utvikle hjernen er uklart. Foreløpig innebære tilgjengelig dyr modeller av intrauterin hypoperfusion/iskemi hovedsakelig alvorlig hypoperfusion eller gradient grad av hypoperfusion med eller uten reperfusion 9,10,11. I kliniske innstillinger, men anses tilfeller av MIUH å være langt oftere enn de som involverer slike alvorlige forhold. Tilgjengelige modeller av MIUH er en gnager modell som involverer Sutur ligation av enten i livmor eller ovarian arterien og en gnager modell som involverer klipping bilaterale ovarian arteriene og aorta har patency 12,13, 14,15,16,17. En av ulempene med disse modellene er omfattende mellom fosteret variasjon, mellom fostre med dyp hypoperfusion fostre nesten intakt perfusjon, avhengig av plasseringen av fosteret innenfor arterielle arkaden av den livmor og ovarian arterier. En annen ulempe av disse modellene er deres manglende evne til å skille plasseringen av hver fosteret etter fødselen; Derfor kan ikke forskere skille alvorlighetsgraden av intrauterin hypoperfusion oppleves av en individuell valp etter fødselen.
Vi har utviklet en rotte modell av MIUH som involverer flere arterien stenose 1. Innpakning metall mikro-spoler med en diameter på 0,24 mm rundt ovarian og livmor arteriene fører stenose, men ikke obstruksjon, av blodkar (figur 1). Bruk disse microcoils ved de proksimale delene av alle blodårene forsyne livmoren, dvs. bilaterale livmor og eggstokkreft arteriene, på embryonale dag 17 (tilsvarer embryonale uker 20-25 mennesker 18) induserer en betydelig, men mild nedgang i blodtilførsel til placentas og fostre. Fellingene i blodstrømmen etter CoILer brukes på alle fire arteries mater livmoren er stort sett identiske for hver morkaken og fosteret. Dødelighet fosteret er mindre enn 20%. Valpene er født via spontan arbeid 1-2 dager tidligere (embryonale dag 21-22) enn normalt. Nært alle pups er født viser betydelig lav fødselen vekt 1. Grå og hvit sak er minket uten åpenbare vev skade 1. Pups presenterer forsinket oppkjøpet av nyfødte reflekser, muskelsvakhet og endret spontan aktivitet 1. Denne modellen etterligner kliniske tegn og symptomer av barn født for tidlig eller IUGR; barn født premature utstillingen redusert grå og hvit substans volum med eller uten hvit substans skade 6, nåværende forsinket milepæler nevrologisk utvikling, og kan presentere atferdsproblemer som for eksempel ADHD 3,5; barn med IUGR utstilling minimal nevroanatomi endringer, og har en økt risiko for nedsatt nevrologisk utvikling som motoriske og kognitive forsinkelse 4,7. Tidlig fødsel og IUGR er ulike forhold, men de to forholdene deler grunnleggende mekanisme, dvs. fornærmelser til umodne hjernen før hele gestasjonsalder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i henhold til protokoller godkjent av eksperimentelle Animal Care og bruk komiteen av nasjonale Cerebral og Kretsløpssystem Center, Suita, Japan.
1. klargjør følgende dyr og materialer for MIUH kirurgi
- Forberede tidsbestemt gravid Sprague-Dawley rotter på svangerskapsdiabetes dag 17, dvs. embryonale dag 17 (E17). Demninger gjennomsnittlige kroppen vekt er 307.0 ± 40.7 g (mener ± SD, n = 9).
- Forberede metall microcoils; Indre diameter 0,24 mm, laget av gull-belagt stål.
- Forberede alle materialer som tabellen for materiale.
2. Forbered for MIUH kirurgi
- Varm en varmeputen på 37 ° C for rotte plassering
- Plass en steril bleie på oppvarming pad
- Varm sterilt saltvann i 37 ° C i et vannbad
3. Utfør MIUH kirurgi
- Utføre kirurgiske prosedyrer under sterilt tilstand. Sterilisere spoler, pinsett, nål med 70% etanol før bruk. Bruk sterilt hansker, og noen ganger desinfisere ved å bruke etanol spray.
- Sett rotta i boksen anestesi induksjon. Innføre 4% isoflurane i boksen (ca 5 min).
- Plass rotta på en steril bleie på varmeputen i supine posisjon når dyret er grundig anesthetized i boksen Innledning. Sjekk for dybdeskarphet anestesi for svar på tå knipe. Opprettholde 1.5-2.0% isoflurane med en nesen kjegle.
- Bruk depilatory skum på magen fra navlen til regionen i bekken buen. Etter flere minutter, tørke av depilatory skum med et papirhåndkle. En barbermaskin kan brukes som en erstatning for depilatory skum.
- Bruke gasbind dynket i jod desinfeksjonsmiddel til depilated regionen i huden.
- Plass en kirurgisk drapere med en rund åpning å dekke magen enn området i kirurgiske snitt. Flere biter av gasbind kan brukes som erstatning for drapere.
- Bruke en kirurgisk skalpell, lage en snitt ca 2,5 cm lang på nedre del av magen fra øvre kant av skambenet rett opp mot navlen. Deretter gjør en snitt gjennom muskel laget under.
- Plasser flere biter av sterilt gasbind rundt åpningen av drapere, og våt gasbind med varmet saltvann.
- Trykk begge lateral magen forsiktig, slik at en del av livmor horn framgår i snitt.
- Desinfiser kirurgens hender med 70% etanol.
- Trekk forsiktig hele livmor Hornet fra bukhulen manuelt uten å bruke tang. Bruke kirurgisk tang er ikke tilrådelig, lett skade den skjøre livmor, fostre og blodkar ved å komprimere dem sterkt og ujevnt.
- Plass livmor horn på våt gasbind.
- Utføre samme fremgangsmåte for andre livmor Hornet.
- Telle antall fostre.
- Bruke varmet saline ofte for å holde livmoren varmt og fuktig hele operasjonen.
- Endre bleie når den har absorbert for mye saltvann. For å opprettholde stabilitet, gjenta desinfeksjon hansker med 70% etanol og tips av instrumentet med jod. Ikke-sterilt fingrene fra sterilt tips av instrumentet er avgjørende.
- Identifisere den proksimale delen av viktigste arkaden av eggstokkene og livmor arteriene under en stereomicroscope.
Merk: Det er viktig å skille viktigste arkaden fra greinene til placentas. Merk at kirurgisk operasjon kan være enklere når livmor hornet er venda. Noen ganger er bruker en coil veldig proksimale delen av arkade vanskelig, fordi det ligger dypt i bukhulen og arteries til morkaken er svært nær den øvre del av arkade. I dette tilfellet kan en coil brukes til en del av arkade etter første gren gafler av. - Skille arterien fra vein kjører parallelt med det med tang og gjøre avstanden mellom dem.
- Legg et stykke streng (silke Sutur 4.0, 5 cm lange) under arterien.
- Løft opp begge ender av strengen med tang arterien løftet og atskilt fra skjøre venen.
- Holde kanten av microcoil med fine tang i derimot, plassere en microcoil ved siden av løftet arterien (figur 2.1).
- Rotere arteria løftet ved hjelp av strengen rundt microcoil for å bryte microcoil rundt arterien. Det er lettere å rotere arteria rundt spolen enn å rotere spolen rundt arteria (figur 2.2).
- Etter roterende arterien endre 3 eller 4 svinger (spoler har 5 svinger), området der spolen holdes på den andre kanten. Holde kanten av spolen som har blitt pakket rundt arterien med tang. Endre området der strengen heiser arterien til den andre siden av coil. Rotere arteria rundt spolen slik at CoILen helt (5 slår) brytes arteria (figur 2.3, 2.4).
- Fjern hyssing.
- Utføre samme fremgangsmåte for andre tre arteriene.
- Merk at ofte bruke varmet saline til livmoren er avgjørende; ellers dødelighet av fostre øker og nedkjøling kan være neuroprotective.
- Forsiktig tilbake til livmor horn i bukhulen. Løfte en kant av bukveggen innsnitt med tang kan gjøre denne fremgangsmåten enklere.
- Stich abdominal muskler, og deretter stich abdominal huden med Sutur (silke Sutur 4.0). Tie suture etter hver stich, dvs avbrutt enkelt suturer.
- Bruke gasbind dynket i jod desinfeksjonsmiddel på og rundt kirurgisk innsnitt.
- Administrere den smertestillende har meloksikam på 0,5 mg/kg kroppsvekt subcutaneously.
- Tillate 30 min av utvinning i varmet bur. Sjekk dyr hvis fullt våken og beveger seg rundt buret, gå tilbake til hjem buret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter at microcoils til alle arteries mater livmoren, dvs. bilaterale livmor og eggstokkreft arteriene, er alle fostre utsatt for sammenlignbare nivåer av hypoperfusion. Anvendelsen av microcoils med en diameter på 0,24 fører til mild stenose i disse arteriene, og dermed forårsaker en mild reduksjon i blodstrømmen til placentas og fostre (Figur 3, ca. 30% fra før stenose nivå i morkaken, se Referanse 1 for detaljer). Valpene født fra demningen demonstrere IUGR (tabell 1).
Demninger synes å være hypoactive i løpet av noen dager etter operasjonen. Annet enn det, demninger ikke presentere noen merkbar komplikasjoner, og fullt igjen i en uke etter operasjonen. Demninger kan leve lenge etter levering (dødelighet er 0% for observasjon periode), og sykepleier pups. Spoler forblir på samme sted.
Tabell 1. Kropp vekt ved fødselen (Postnatal dag 0, P0) og på dag tilsvarende embryonale dag 29 (E29), som var P6-8. Pups inne ingen-kirurgi kontrollgruppen ble født på E23, mens de i gruppen humbug-kirurgi var født 1 dag tidligere (E22); i gruppen mild intrauterine hypoperfusion (MIUH) ble født 1-2 dager tidligere (E21-22) via spontan arbeidskraft. Derfor var E29 ekvivalenter P6 til P8 avhengig av det pup svangerskapsdiabetes periode. (n = 8-14 i hver gruppe for hver sex og hvert punkt) *P < 0,01 vs en nei-operasjon kontroll gruppe samt en humbug-kirurgi gruppe. Enveis ANOVA, etterfulgt av en Tukey-Kramer test.
Figur 1. Skjemaet for anatomiske arterielle systemet i livmoren. Fire microcoils ble installert rundt arteriene oppstrøms av bilaterale ovarian og livmor arteriene. Prikket pilene viser retningen arteriell blod flyte. Dette tallet har blitt endret fra i vår forrige publikasjonen 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Illustrasjon av en coil til en arterie. 1. Løft arteria med en streng. Plass en microcoil ved siden av arterien. 2. ved å rotere arteria rundt microcoil, er microcoil pakket rundt arterien. 3. etter roterende arterien endre 3 eller 4 svinger (spolen har 5 svinger), området der spolen holdes på den andre kanten. Holde kanten av spolen med arteria ved hjelp av pinsett. Endre området der strengen heiser arterien til den andre siden av spolen. 4. Roter arteria rundt spolen slik at CoILen helt (5 slår) brytes arterien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Et representativt bilde av en livmor produsert med laser speckle flowmetry1. Dette bildet viser redusert blodstrøm i venstre livmor Hornet men ikke rett etter coil stenose ble utført i venstre ovarian og livmor arteriene. *: plasseringen av coil stenose i arkaden av eggstokkene og livmor arteriene; øvre stjerne tilsvarer den proksimale delen av eggstokkene arterien og nederste tilsvarer den proksimale delen av livmor arterien. Prikket linje angir arkaden av eggstokkene og livmor arteries i venstre livmor horn. Rødaktig farge angir mer blodstrøm, mens blåaktig farge indikerer mindre blodstrøm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microcoil stenose i både eggstokkene og livmor arteries i både livmor horn gir konsekvent og reproduserbar intrauterine hypoperfusion i alle placentas og fostre. Nivået av hypoperfusion kan endres ved hjelp av microcoils med ulike indre diameter. Rotte unger født fra en demning som arterien stenose er utført med microcoils 0,24 mm indre diameter viser IUGR og prematur fødsel (se referanse 1 for detaljer). Valpene utstilling nevroanatomi og atferdsmessige endringer som ligner tegn og symptomer i premature barn. Disse nevroanatomi endringer omfatter ventrikkel utvidelse, fortynning av bark og corpus callosum, og redusert hjernen vekt men ingen åpenbare celle tap eller cystisk lesjoner 1. De atferdsmessige endringene observert inkluderer en forsinket neonatal refleks, redusert muskelstyrke og endret spontan aktivitet 1.
For å studere intrauterine iskemi, er dyremodeller basert på alvorlige iskemi over en kort varighet med reperfusion brukte 10,11. Når begge ender av arterien arkaden dannet fra eggstokkene og livmor arteriene blokkeres av klipping, stanses helt blodtilførselen til livmor Hornet (inkludert placentas og fostre). Derfor varigheten av klipping må være kort, eller fostre vil dø. I en klinisk setting, men spekulere vi at langvarig mild hypoperfusion kan oppstå oftere i stedet for brå blokade av blodstrømmen til livmoren og dens fullstendig gjenoppretting innen en time.
Gnager modeller som involverer Sutur ligation av en eller begge side(s) av arkaden av livmor arterien og omfatter klipping som forlater indre plass mellom bilaterale ovarian arteriene og aorta er bare tilgjengelige modeller av mild langvarig intrauterine hypoperfusion 13,14,16,19,20. Disse ligatur og klipping modeller har lav reproduserbarhet, dvs, bare noen få fostre overleve og lider hypoperfusion. Når blodstrømmen på ovarian arterien er blokkert av Sutur hemorroider, fostre ligger nærmest til eggstokkene, dvs øverst til livmor horn, er utsatt for dyp iskemi, mens fostre ligger nærmere livmorhalsen og skjeden er utsatt for minimal eller ingen reduksjoner i blod levere 12.
Det er tre viktige trinn i protokollen. Det er viktig å identifisere den proksimale delen av viktigste arkaden av eggstokkene og livmor arteriene. Den viktigste arterielle arcade har mange grener til placentas. Noen av disse gren arterier er store i diameter, og noen ganger er nesten like stor som hovedpulsåren. Derfor kan skille hovedpulsåren blant flere andre forgrening arterier være forvirrende. Merk at den viktigste arterielle arcade ikke er store i diameter. Vein kjører ved arkaden er flere ganger større i diameter enn arterien. Arterier kan bli enda smalere, på grunn av innsnevring svar til kirurgisk stimulering. Skille arterien fra vein kjører sammen med den er en delikat oppgave. Adventitia av arterien er i nær kontakt med venen gjennom det meste av arkade. Vær oppmerksom på at venen blør lett når rørt av tang. Holde livmoren varmt og fuktig er avgjørende; ellers dammen og fostre kan lide av stress og dehydrering, og mange fostre kan gå tapt før levering. Begrensning av denne CoILen stenose modell teknikken er den lenge kirurgisk kreves. En periode på ca 60 min kreves for å fullføre operasjonen ved å bruke fire spoler. Denne lenge kirurgisk varigheten kan forårsake ekstra stress til fostre og demningen.
Vi tror at modellen presentert i dette papiret er mest klinisk relevant og reproduserbar modell av MIUH. Denne modellen tillater for vurdering av timelige og langsgående virkningen av MIUH på IUGR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av FY 2013 forskning utvekslingsprogram mellom JSP og CNRS, JSP KAKENHI Grant antall 26860858 og Narishige nevrovitenskap Research Foundation. Vi takker Dr. Mariko Harada-Shiba og Kyoko Shioya for nyttig diskusjoner. Vi takker Mari Furuta, Mutsumi Sakamoto, Ritsuko Maki og Dr. Emi Tanaka for utmerket kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | |||
| Isoflurane anesthesia machine | |||
| Anesthesia induction box | |||
| Heating pad | |||
| Diaper 30x40 cm | |||
| Depilatory foam or shaver | |||
| Iodine disinfectant solution | |||
| Gauze 10x20 cm | |||
| Surgical drape 45x45 cm with a round opening 5 cm in diameter | |||
| Spray bottle with ethanol for disinfection | |||
| Cotton swab | |||
| Forceps with large blunt tips | |||
| Forceps with angled fine tips | |||
| Scissors | |||
| Surgical scalpel, blade size is 27mm long (no.10, Axel, AS ONE Corporation, Osaka, Japan) | |||
| Surgical suture needle | |||
| Metal microcoils; inner diameter 0.24 mm, made from gold-coated steel (SAMINI Co. Ltd., Shizuoka, Japan) | |||
| Silk suture 4-0 | |||
| Sterile saline (0.9% sodium chloride) | |||
| Heating water bath | |||
| Plastic syringes (50ml) and needles (18G) |
References
- Ohshima, M., et al. Mild intrauterine hypoperfusion reproduces neurodevelopmental disorders observed in prematurity. Sci Rep. 6, 39377 (2016).
- Specified Report on Vital Statistics in FY2010, Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. , Available from: http://www.mhlw.go.jp/english/database/db-hw/FY2010/live_births.html (2010).
- Anderson, P., Doyle, L. W., Victorian Infant Collaborative Study, G. Neurobehavioral outcomes of school-age children born extremely low birth weight or very preterm in the 1990s. JAMA. 289 (24), 3264-3272 (2003).
- Levine, T. A., et al. Early childhood neurodevelopment after intrauterine growth restriction: a systematic review. Pediatrics. 135 (1), 126-141 (2015).
- Sucksdorff, M., et al. Preterm Birth and Poor Fetal Growth as Risk Factors of Attention-Deficit/ Hyperactivity Disorder. Pediatrics. 136 (3), e599-e608 (2015).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. Lancet Neurol. 8 (1), 110-124 (2009).
- Nardozza, L. M., et al. Fetal growth restriction: current knowledge. Arch Gynecol Obstet. 295 (5), 1061-1077 (2017).
- Chang, E. Preterm birth and the role of neuroprotection. Bmj. 350, g6661 (2015).
- Coq, J. O., Delcour, M., Massicotte, V. S., Baud, O., Barbe, M. F. Prenatal ischemia deteriorates white matter, brain organization, and function: implications for prematurity and cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 58, Suppl 4. 7-11 (2016).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia-Ischemia. Cereb Cortex. 25 (9), 2683-2695 (2015).
- Kubo, K. I., et al. Association of impaired neuronal migration with cognitive deficits in extremely preterm infants. JCI Insight. 2 (10), (2017).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Int J Dev Neurosci. 29 (6), 593-607 (2011).
- Gilbert, J. S., Babcock, S. A., Granger, J. P. Hypertension produced by reduced uterine perfusion in pregnant rats is associated with increased soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression. Hypertension. 50 (6), 1142-1147 (2007).
- Granger, J. P., et al. Reduced uterine perfusion pressure (RUPP) model for studying cardiovascular-renal dysfunction in response to placental ischemia. Methods Mol Med. 122, 383-392 (2006).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic-ischemic injury. J Neurosurg Pediatr. 6 (3), 206-221 (2010).
- Olivier, P., Baud, O., Evrard, P., Gressens, P., Verney, C. Prenatal ischemia and white matter damage in rats. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (11), 998-1006 (2005).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic-ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18 (3), 568-581 (2005).
- Rice, D., Barone, S. Jr Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ Health Perspect. 108, Suppl 3. 511-533 (2000).
- Basilious, A., Yager, J., Fehlings, M. G. Neurological outcomes of animal models of uterine artery ligation and relevance to human intrauterine growth restriction: a systematic review. Dev Med Child Neurol. 57 (5), 420-430 (2015).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical, sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22 (1), 1-16 (2012).
