Summary
轻度宫内灌注是由动脉狭窄, 金属弹簧包裹周围的子宫和卵巢动脉在大鼠胚胎日17。这一程序产生了产前灌注和宫内生长的限制。
Abstract
宫内灌注/缺血是宫内/胎儿生长受限、早产和低出生体重的主要原因之一。这一现象的大多数研究都是在严重的宫内缺血模型中进行的, 或者是子宫灌注的梯度度模型。未对均匀轻度宫内灌注 (MIUH) 模型进行研究。两个模型已用于研究 MIUH: 一个模型的基础上, 两侧的动脉拱廊形成的子宫和卵巢动脉, 和一个瞬态模型的基础上修剪双侧卵巢动脉和主动脉有通畅。这两个啮齿动物模型的 MIUH 有一定的局限性, 例如, 不是所有的胎儿都受到 MIUH, 取决于他们在子宫角的位置。在我们的 MIUH 模型中, 所有胎儿的宫内灌注。MIUH 是通过轻度狭窄的所有四动脉喂养子宫, 即, 双侧子宫和卵巢动脉。
动脉狭窄是由金属弹簧包裹在喂养动脉周围。产生动脉狭窄与弹簧允许我们控制, 优化和繁殖减少血流量, 很少 inter-animal 变异性和低死亡率, 从而使准确的评价。当使用内径为0.24 毫米的弹簧时, 胎盘和胎儿的血流轻度减少 (约30% 来自胎盘的 pre-stenosis 水平)。我们的 MIUH 模型的后代清楚地显示了神经、神经和行为测试结果的长期变化。
Introduction
胎儿宫内生长受限 (IUGR) (也称为胎生长限制) (出生体重 < 10th百分比为孕龄), 早产 (出生在 < 37 周妊娠), 和/或低出生体重 (< 2500 g) 的帐户新生儿的近 10% 2,3。许多这些婴儿存在神经问题, 如脑瘫和发育障碍 (如, 注意力缺陷/多动障碍 (ADHD) 和学习障碍) 3,4,5。这些条件在其病因和结局上有相同和不同之处。IUGR 的病因是多因素, 胎盘不足与宫内灌注被认为是最常见的原因, non-anomalous 胎儿7。早产的病因也多为多因素, 而炎是最常见的原因8。
轻度宫内灌注 (MIUH) 对大脑发育的影响尚不清楚。目前可用的动物模型宫内灌注/缺血主要涉及严重灌注或梯度程度的灌注有或没有再灌注9,10,11。然而, 在临床环境中, MIUH 的病例被认为比涉及这种严重疾病的情况更为频繁。目前可用的 MIUH 模型是一种啮齿类动物模型, 涉及子宫或卵巢动脉的缝合结扎, 以及一种涉及将双侧卵巢动脉和主动脉夹紧的啮齿动物模型, 其有通畅12,13, 14、15、16、17。这些模型的缺点之一是广泛的 inter-fetus 变异性, 从胎儿与深刻的灌注到胎儿与几乎完整的灌注, 取决于胎儿的位置在子宫动脉拱廊和卵巢动脉。这些模型的另一个缺点是他们无法区分出生后每个胎儿的位置;因此, 研究人员不能区分出生后个体小狗所经历的宫内灌注的严重性。
我们已经开发了一个大鼠模型的 MIUH 涉及多动脉狭窄1。环绕在卵巢和子宫动脉周围的直径0.24 毫米的金属微线圈会导致血管狭窄, 但不会阻塞 (图 1)。应用这些弹簧在所有供子宫的动脉的近端, 即双侧子宫和卵巢动脉, 在胚胎日 17 (相当于胚胎周20-25 在人类18) 引起显著但轻度的减少血液流向胎盘和胎儿线圈后血流的减少被应用到所有四个供子宫的动脉在每个胎盘和胎儿中基本上是相同的。胎儿死亡率低于20%。幼崽是通过自发分娩1-2 天前 (胚胎日 21-22) 比正常出生。几乎所有的幼崽出生都显着低出生体重1。灰色和白色物质体积减少, 没有明显的组织损伤1。幼崽出现延迟获得新生儿反应, 肌肉无力, 并改变自发活动1。该模型模仿早产或 IUGR 的儿童的临床症状和体征;儿童出生早产儿表现为灰质和白质体积减少或无白质损伤6, 目前神经发育延迟的里程碑, 并可能出现行为问题, 如 ADHD 的3,5;儿童与 IUGR 表现出最小的神经的变化, 并有增加的风险, 神经发育障碍, 如马达和认知延迟4,7。早产和 IUGR 是不同的条件, 但这两种情况具有基本的机制, 即在足月孕龄前对未成熟的大脑进行侮辱。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有的实验都是按照日本吹国家脑和心血管中心实验动物保育和使用委员会批准的协议进行的。
1. 为 MIUH 手术准备下列动物和材料
- 在妊娠日 17, 即胚胎日 17 (E17), 准备定时妊娠大鼠。水坝的平均身体重量是307.0 ± 40.7 g (平均± SD, n = 9)。
- 准备金属弹簧;内径0.24 毫米, 由金涂层钢制成。
- 根据材料表准备所有材料。
2. 准备 MIUH 手术
- 在37° c 的大鼠安置处加热热垫
- 在暖气垫上放一个无菌尿布
- 温水浴37° c 温无菌盐水
3. 进行 MIUH 手术
- 在无菌状态下进行手术。使用前用70% 乙醇消毒线圈、镊子、针。使用无菌手套, 偶尔用乙醇喷雾消毒。
- 把老鼠放在麻醉感应箱里将4% 异氟醚引入箱内 (约5分钟)。
- 在感应箱内彻底麻醉动物后, 将老鼠放在加热垫上的无菌尿布上, 放在仰卧位。检查深度的麻醉, 缺乏对脚趾捏的反应。用鼻锥维持 1.5-2.0% 的异氟醚。
- 应用脱毛泡沫到腹部从肚脐向下到区域的骨盆拱。几分钟后, 用纸巾擦拭脱毛泡沫。剃须刀可用作脱毛泡沫的替代品。
- 将纱布浸泡在碘消毒剂溶液中, 脱毛皮肤区域。
- 在手术切口的区域以外放置一个圆形开口覆盖腹部的外科手术。几块纱布可以用来代替褶皱。
- 使用外科手术刀, 使切口大约2.5 厘米长在下腹部从耻骨的上部边缘直接地往肚脐。然后, 通过下面的肌肉层进行切口。
- 在褶皱的开口周围放置几片无菌纱布, 用温热的盐水浸湿纱布。
- 轻轻推腹两侧, 使子宫角部分从切口中脱出。
- 用70% 的乙醇消毒外科医生的手。
- 在不使用镊子的情况下, 手动从腹腔轻轻拉出整个子宫角。使用手术钳是不可取的, 因为他们可能很容易破坏脆弱的子宫, 胎儿和血管通过压缩他们强烈和不均匀。
- 将子宫角放在湿纱布上。
- 为其他子宫角执行相同的程序。
- 计算胎儿的数量。
- 经常使用温盐水, 使子宫在整个手术过程中保持温暖和湿润。
- 换尿布时, 它已经吸收了太多的盐水。为了保持稳定, 重复消毒手套与70% 乙醇和仪器的提示与碘。保持消毒手指远离仪器的无菌提示是至关重要的。
- 在显微镜下确定卵巢和子宫动脉主拱廊的下部。
注意: 重要的是要区分主拱廊从分支到胎盘。请注意, 当子宫角翻转时, 手术操作可能更容易。偶尔地, 在拱廊的极近的部分应用线圈是困难的, 因为它位于深在腹腔之内, 并且动脉到胎盘是非常接近的近的部分拱廊。在这种情况下, 一个线圈可以应用到一个部分的拱廊后的第一个分支叉。 - 将动脉从与它平行的静脉中分离出来, 并在它们之间制造空间。
- 在动脉下面放置一根绳子 (丝缝 4.0, 5 厘米长)。
- 用镊子把绳子的两端抬起, 使动脉从脆弱的静脉中分离出来。
- 另一方面, 用细钳夹住圈的边缘, 在提升的动脉旁放置一个圈 (图 2. 1)。
- 用圈周围的绳子把圈绕到动脉周围来旋转抬起的动脉。在线圈周围旋转动脉比旋转动脉周围的线圈更容易 (图 2. 2)。
- 在旋转动脉3或4匝 (线圈有5匝) 后, 改变线圈被保持到另一边缘的位置。抓住缠绕在动脉上的线圈的边缘, 用镊子夹住。改变的网站的字符串升降机的动脉到另一侧的线圈。围绕线圈旋转动脉, 使线圈完全 (5 匝) 包裹动脉 (图 2. 3, 2.4)。
- 删除字符串。
- 对其他三动脉进行同样的手术。
- 注意, 经常使用温盐水到子宫是至关重要的;否则, 胎儿的死亡率会增加, 体温过低可能是神经保护。
- 将子宫角轻轻地放回腹腔。用镊子提起腹壁切口的边缘可以使这个过程更容易。
- 施蒂希腹肌, 再施蒂希腹皮缝合 (丝缝 4.0)。在每施蒂希后缝合缝线, 即间断的单缝合线。
- 在外科手术切口上和周围涂抹碘消毒液浸泡纱布。
- 在0.5 毫克/千克体重的皮下施行镇痛昔。
- 允许30分钟的恢复在温暖的笼子里。检查动物是否完全清醒, 并在笼子周围移动, 回到家里的笼子。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在将弹簧应用于所有供子宫的动脉, 即双侧子宫和卵巢动脉后, 所有胎儿都受到了类似的灌注。内直径为0.24 毫米的弹簧的应用导致了这些动脉的轻度狭窄, 从而导致胎盘和胎儿的血流轻度减少 (图 3; 大约30% 从胎盘的 pre-stenosis 水平, 看见参考1的详细信息)。从大坝出生的幼崽演示 IUGR (表 1)。
在手术后的几天里, 大坝似乎 hypoactive 了。此外, 大坝没有出现任何明显的并发症, 并在手术后一周内完全恢复。水坝在交付以后能长期居住 (死亡率是0% 为观察期间) 和对幼崽。线圈保持在同一个地方。
表1。出生时的体重 (产后日 0, P0), 并在当天相当于胚胎日 29 (E29), 这是 P6-8.no-surgery 对照组的幼崽出生于 E23, 而假手术组的小鼠则在1天前出生 (E22);那些在轻度宫内灌注 (MIUH) 组出生1-2 天前 (E21-22) 通过自发分娩。因此, 根据幼崽的妊娠期, E29 当量被 P6 到 P8。(n = 8-14 在每个组中, 对于每个性别和每个时间点) *P < 0.01 与 no-surgery 对照组以及假手术组。单向方差分析, 其次是 Tukey-克莱默测试。
图1。子宫解剖动脉系统的图式.四弹簧在两侧的卵巢和子宫动脉上游的动脉上安装。虚线箭头指示动脉血流的方向。此图已从我们以前的出版物1中修改过。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。卷的应用的例证到动脉.1. 用绳子抬起动脉。在动脉旁放置一个圈。2. 通过旋转圈周围的动脉, 圈被包裹在动脉周围。3. 旋转动脉3或4圈后 (线圈有5匝), 将线圈的位置改为另一边缘。用钳子把线圈的边缘和动脉结合起来。改变的网站, 其中字符串升降机的动脉到另一侧的线圈。4. 围绕线圈旋转动脉, 使线圈完全 (5 匝) 包裹动脉。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。用激光散斑产生的子宫的代表图像血1.这张图显示了左子宫角的血流减少, 但在左侧卵巢和子宫动脉内进行线圈狭窄后, 没有正确的血液流动。*: 在卵巢和子宫动脉拱廊中, 线圈狭窄的位置;上星号对应于卵巢动脉的下部, 下部对应于子宫动脉的近端部分。虚线表示在左子宫角的卵巢和子宫动脉拱廊。红颜色表示更多的血流, 而蓝的颜色则表明血流较少。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
两个子宫角的卵巢和子宫动脉的圈狭窄在所有胎盘和胎儿中产生一致和可再生的宫内灌注。灌注的水平可以通过使用不同内径的弹簧进行修改。大鼠幼崽出生于一个大坝上, 其中动脉狭窄已执行与弹簧0.24 毫米内直径显示 IUGR 和早产 (详见参考 1)。幼崽表现出神经和行为改变, 类似于早产儿所观察到的体征和症状。这些神经的改变包括心室扩大, 皮质和胼胝体变薄, 脑重量减少, 但没有明显的细胞丢失或囊性病变1。观察到的行为改变包括延迟的新生儿反射、肌肉强度的降低和自发活动的改变1。
为了研究宫内缺血, 以短时间再灌注为基础的严重缺血动物模型经常使用10,11。当从卵巢和子宫动脉形成的动脉拱廊的两端被修剪阻断时, 子宫角的血液供应 (包括胎盘和胎儿) 完全停止。因此, 修剪的时间必须短, 否则胎儿就会死亡。然而, 在临床环境中, 我们推测, 长时间的轻度灌注可能会更频繁地被遇到, 而不是突然的对子宫的血流阻断, 并在一小时内完全恢复。
涉及子宫动脉拱廊一侧或两侧的缝合结扎的啮齿动物模型, 以及那些在双侧卵巢动脉和主动脉之间留下一些内间隙的人, 是仅有的轻度延长的模型。宫内灌注13,14,16,19,20。这些结扎和修剪模型的重现性很低, 即只有少数几个胎儿存活下来, 并遭受灌注。当卵巢动脉的血流被缝合结扎时, 最靠近卵巢的胎儿, 即子宫角的顶端, 会受到严重的缺血, 而靠近宫颈和阴道的胎儿则受到血液供应的最小或不减少12。
协议中有三关键步骤。确定卵巢和子宫动脉主拱廊的下部是必不可少的。主动脉拱廊有许多分支到胎盘。有些分支动脉直径较大, 有时几乎和主动脉一样大。因此, 区分主动脉与其他几个分支动脉可能是混淆。注意主动脉拱廊的直径不大。在拱廊旁边奔跑的静脉比动脉直径大几倍。动脉可能会变得更窄, 因为在手术刺激的反应收缩。将动脉与静脉分离是一项微妙的任务。在大多数的拱廊中, 动脉的膜与静脉紧密接触。注意, 当用镊子触摸时, 静脉容易流血。保持子宫温暖和湿润是至关重要的;否则, 大坝和胎儿可能会受到压力和脱水, 许多胎儿可能会在分娩前丢失。该线圈狭窄模型技术的局限性是需要长的手术时间。需要大约60分钟的时间来完成手术, 应用四线圈。这种长时间的手术时间可能会给胎儿和水坝造成额外的压力。
我们认为, 本文所提出的模型是最具临床相关性和可再生性的 MIUH 模型。该模型可以评估 MIUH 对 IUGR 的时间和纵向影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了2013财政年度在 jsp 和 CNRS, jsp KAKENHI 授予数字 26860858, 和 Narishige 神经科学研究基金会的研究交流计划的支持。我们感谢 Drs 子和京子盐谷进行了有益的讨论。我们感谢玛丽 Furuta, 睦坂, 律希, 和 Dr. Emi 田中的优秀技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | |||
| Isoflurane anesthesia machine | |||
| Anesthesia induction box | |||
| Heating pad | |||
| Diaper 30x40 cm | |||
| Depilatory foam or shaver | |||
| Iodine disinfectant solution | |||
| Gauze 10x20 cm | |||
| Surgical drape 45x45 cm with a round opening 5 cm in diameter | |||
| Spray bottle with ethanol for disinfection | |||
| Cotton swab | |||
| Forceps with large blunt tips | |||
| Forceps with angled fine tips | |||
| Scissors | |||
| Surgical scalpel, blade size is 27mm long (no.10, Axel, AS ONE Corporation, Osaka, Japan) | |||
| Surgical suture needle | |||
| Metal microcoils; inner diameter 0.24 mm, made from gold-coated steel (SAMINI Co. Ltd., Shizuoka, Japan) | |||
| Silk suture 4-0 | |||
| Sterile saline (0.9% sodium chloride) | |||
| Heating water bath | |||
| Plastic syringes (50ml) and needles (18G) |
References
- Ohshima, M., et al. Mild intrauterine hypoperfusion reproduces neurodevelopmental disorders observed in prematurity. Sci Rep. 6, 39377 (2016).
- Specified Report on Vital Statistics in FY2010, Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan. , Available from: http://www.mhlw.go.jp/english/database/db-hw/FY2010/live_births.html (2010).
- Anderson, P., Doyle, L. W., Victorian Infant Collaborative Study, G. Neurobehavioral outcomes of school-age children born extremely low birth weight or very preterm in the 1990s. JAMA. 289 (24), 3264-3272 (2003).
- Levine, T. A., et al. Early childhood neurodevelopment after intrauterine growth restriction: a systematic review. Pediatrics. 135 (1), 126-141 (2015).
- Sucksdorff, M., et al. Preterm Birth and Poor Fetal Growth as Risk Factors of Attention-Deficit/ Hyperactivity Disorder. Pediatrics. 136 (3), e599-e608 (2015).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. Lancet Neurol. 8 (1), 110-124 (2009).
- Nardozza, L. M., et al. Fetal growth restriction: current knowledge. Arch Gynecol Obstet. 295 (5), 1061-1077 (2017).
- Chang, E. Preterm birth and the role of neuroprotection. Bmj. 350, g6661 (2015).
- Coq, J. O., Delcour, M., Massicotte, V. S., Baud, O., Barbe, M. F. Prenatal ischemia deteriorates white matter, brain organization, and function: implications for prematurity and cerebral palsy. Dev Med Child Neurol. 58, Suppl 4. 7-11 (2016).
- Jantzie, L. L., Corbett, C. J., Firl, D. J., Robinson, S. Postnatal Erythropoietin Mitigates Impaired Cerebral Cortical Development Following Subplate Loss from Prenatal Hypoxia-Ischemia. Cereb Cortex. 25 (9), 2683-2695 (2015).
- Kubo, K. I., et al. Association of impaired neuronal migration with cognitive deficits in extremely preterm infants. JCI Insight. 2 (10), (2017).
- Delcour, M., et al. Mild musculoskeletal and locomotor alterations in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Int J Dev Neurosci. 29 (6), 593-607 (2011).
- Gilbert, J. S., Babcock, S. A., Granger, J. P. Hypertension produced by reduced uterine perfusion in pregnant rats is associated with increased soluble fms-like tyrosine kinase-1 expression. Hypertension. 50 (6), 1142-1147 (2007).
- Granger, J. P., et al. Reduced uterine perfusion pressure (RUPP) model for studying cardiovascular-renal dysfunction in response to placental ischemia. Methods Mol Med. 122, 383-392 (2006).
- Mazur, M., Miller, R. H., Robinson, S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic-ischemic injury. J Neurosurg Pediatr. 6 (3), 206-221 (2010).
- Olivier, P., Baud, O., Evrard, P., Gressens, P., Verney, C. Prenatal ischemia and white matter damage in rats. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (11), 998-1006 (2005).
- Robinson, S., et al. Developmental changes induced by graded prenatal systemic hypoxic-ischemic insults in rats. Neurobiol Dis. 18 (3), 568-581 (2005).
- Rice, D., Barone, S. Jr Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: evidence from humans and animal models. Environ Health Perspect. 108, Suppl 3. 511-533 (2000).
- Basilious, A., Yager, J., Fehlings, M. G. Neurological outcomes of animal models of uterine artery ligation and relevance to human intrauterine growth restriction: a systematic review. Dev Med Child Neurol. 57 (5), 420-430 (2015).
- Delcour, M., et al. Neuroanatomical, sensorimotor and cognitive deficits in adult rats with white matter injury following prenatal ischemia. Brain Pathol. 22 (1), 1-16 (2012).
