Summary
軽度子宮内血流の低下は、17 日ラットの子宮および卵巣動脈を包んだ金属マイクロ コイルを動脈狭窄によって製作されました。この手順は、出生前の低灌流と子宮内胎児発育制限を生産しました。
Abstract
子宮内の血流の低下/虚血は子宮内/胎児の成長阻害、早産、低出生体重の主要な原因の一つです。重度の子宮内の虚血のいずれかのモデルまたは子宮内低灌流のグラデーションの明度を持つモデルではこの現象のほとんどの研究を行った。制服軽度子宮内低灌流 (MIUH) のモデルの研究が行われていません。2 つのモデルは、MIUH の研究に使用されている: 子宮および卵巣動脈と動脈アーケードのいずれかの側の縫合結紮に基づくモデルを形成し、両側卵巣動脈と大動脈の開存性を持つクリップに基づく非定常モデル。これら 2 つの齧歯動物モデル MIUH いくつかの制限があります、すべての胎児が子宮角の位置によって MIUH にさらされるなど。MIUH モデルでは、すべての胎児が子宮内低灌流の対等なレベルにさらされます。MIUH は、すべて 4 動脈、子宮をすなわち、餌両側子宮および卵巣動脈の狭窄によって達成されました。
栄養動脈を包んだ金属マイクロ コイルによる動脈の狭窄。マイクロ コイルを制御、最適化、および非常に少しの間動物変動と低死亡率減少した血流を再現することができましたと動脈狭窄を生産、したがって正確な評価を有効にします。0.24 mm の内径マイクロ コイルを用いて, 胎盤と胎児の血流だった穏やか (胎盤の前狭窄レベルから約 30%) 減少します。MIUH モデルの子孫は、明確に神経学的な解剖学的および行動テスト結果の長期的な変化を示します。
Introduction
子宮内の成長の制限 (IUGR) (として知られている胎児発育制限) 児 (出生体重 <妊娠年齢の 10 パーセンタイル)、(< 妊娠 37 週で生まれた)、早産や低出産 (< 2500 g) の重量を占めるすべての新生児2,3のほぼ 10%。これらの幼児の多くは脳性麻痺および発達障害 (注意欠陥/多動性障害 (ADHD) や学習障害など) 3,4,5などの神経学的な問題を呈する。それらの条件の類似性とその病因と成果の違いがあります。IUGR の病因は、多因子性と胎盤機能不全子宮内血流の低下に関連付けられている、非異常胎児7の最も一般的な原因と見なされます。早産の病因は多因子同様、絨毛羊膜炎、最も頻繁な原因8。
脳の発達に軽度子宮内低灌流 (MIUH) の影響は不明です。現在子宮内低灌流/虚血の利用可能な動物モデルは主に重度の低灌流や虚血再灌流9,10,11の有無のグラデーションの明度を含みます。臨床設定でただし、MIUH の場合はそのような厳しい条件を含むものよりもはるかに頻繁に考慮されます。MIUH の現在利用できるモデルは、いずれか、子宮または卵巣動脈および両側卵巣動脈と大動脈の開存性12,13を持つクリップを含む齧歯動物モデルの縫合結紮を含む齧歯動物モデル 14,15,16,17。これらのモデルの欠点の 1 つは深遠な低灌流と胎児から子宮動脈アーケード内での胎児の位置によっては、ほぼ無傷の血流と胎児に至るまで、広範な間胎児変動と卵巣動脈。これらのモデルの別の欠点は誕生後各胎児の位置を区別することはできません。したがって、研究者は生れの後個々 の子犬で経験した子宮内血流の低下の重症度を区別できません。
複数の動脈狭窄1を含む MIUH のラットのモデルを開発しました。ラッピングの卵巣と子宮動脈周囲 0.24 mm の内径の金属マイクロ コイルにより、狭窄がない閉塞、血管 (図 1)。重要なしかし、軽度の減少を誘導する胚日 17 (人間18胚週間 20-25 に相当) に両側の子宮および卵巣動脈、子宮を供給する動脈の近位部でこれらのマイクロ コイルの適用胎盤と胎児への血流。コイルが子宮を供給すべての 4 つの動脈に適用された後、血流の減少はほとんど同じそれぞれの胎盤と胎児の間で。胎児死亡率は 20% 未満です。子犬は、通常よりも 1 〜 2 日以前 (萌芽期日 21-22) 自然分娩で生まれています。展示大幅低出生重み1ほとんどすべての子犬が生まれています。1明白な組織に損傷を与えることがなく、灰色および白い問題のボリュームが減少します。子犬を呈する新生児反射、筋肉の弱さ、および変更された自発1取得が遅れて。このモデルは臨床徴候や症状、IUGR; 途中で生まれる子供を模倣します。子供生まれた早産展示削減グレーと白質容積白質傷害6、存在の有無、神経学的な開発のマイルス トーンを遅延 ADHD 3,5; など行動上の問題が生じるIUGR 児では、最小限の神経解剖学的変化を展示し、運動・認知の遅延4,7など障害の神経学的な開発のリスクが高い。早産・ IUGR は、条件が異なるが、2 つの条件、すなわち完全言葉の妊娠期間前に未熟な脳に侮辱の基本的なメカニズムを共有します。
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Protocol
実験動物の世話と国立脳と循環器病センター、吹田、日本の利用委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての実験を行った。
1. 動植物 MIUH 手術のための材料を準備しなさい
- 17、妊娠日タイミング妊娠ラットを準備、すなわち胚日 17 (E17)。ダムの平均体重が 307.0 ± 40.7 g (平均 ± SD、 n = 9)。
- 金属マイクロ コイル; を準備します。内径 0.24 mm、ゴールド コーティングのスチール製。
- 材料表に従ってすべての材料を準備します。
2. MIUH 手術を準備します。
- ラットの配置のための 37 ° C で加熱パッドをウォーム アップします。
- 加熱パッドでの滅菌のおむつを配置します。
- 37 ° c 水のお風呂で暖かく滅菌生理食塩水
3. MIUH 手術を行う
- 無菌条件下での手術の手順を実行します。コイル、鉗子、使用前に 70% アルコールで針を消毒します。滅菌手袋を使用し、時折エタノール スプレーを適用することで消毒します。
- 麻酔誘導ボックスにラットを配置します。ボックス (約 5 分) に 4% イソフルランをご紹介します。
- 後動物誘導ボックスで麻酔をかけられ徹底的に仰臥位で加熱パッドに滅菌のおむつにラットを配置します。つま先ピンチへの応答の欠乏によって麻酔の深さを確認します。鼻の円錐形を 1.5 から 2.0 パーセント イソフルランを維持します。
- 骨盤のアーチ部にへそから腹部脱毛泡を適用します。数分後脱毛泡ペーパー タオルで拭き取ってください。髭剃りは、脱毛フォームの代用として使えます。
- 皮膚の depilated 領域にヨード消毒液に浸したガーゼを適用します。
- 外科的切開部以外の腹部をカバーする円形開口手術用覆布を配置します。ガーゼのいくつかの部分は、ドレープの代用として使えます。
- 手術用メスによる切開約 2.5 cm を作るおへそに向かってまっすぐに恥骨の上端から下腹部に長い。下にある筋層切開を行います。
- 滅菌ガーゼのドレープ、開口部の周りのいくつかの部分を置き、温めた生理食塩水とガーゼが濡れています。
- 切開部から子宮角の部分が出てくるので、そっと、腹部の両方の側面を押してください。
- 70% エタノールで外科医の手を消毒します。
- 軽く引いて全体の子宮角腹腔内から手動で鉗子を使用せず。手術用鉗子を使用してお勧めできません、彼らは簡単に変わったり、強く圧縮することにより壊れやすい子宮、胎児血管を損傷があります。
- 湿らせたガーゼに子宮角を配置します。
- その他の子宮角の同じ手順を実行します。
- 胎児の数をカウントします。
- 手術中に子宮を温かくウェット保つために頻繁温めた生理食塩水を適用します。
- それはあまりにも多くの生理食塩水を吸収したときは、おむつを変更します。安定性を維持するために 70% のエタノールとヨウ素の器械のヒント消毒手袋を繰り返します。器械の滅菌のヒントから非滅菌の指を保つことが重要です。
- 顕微鏡下で卵巣と子宮動脈の主なアーケードの近位の部分を識別します。
注: それは胎盤に枝からメインのアーケードを区別するために重要です。子宮角の反転時外科手術より簡単かもしれないことに注意してください。時折、アーケードの非常に近位の部分にコイルを適用することは難しいため、腹腔内の奥深くに位置し、胎盤に動脈が非常にアーケードの近位部分の近くにあります。この場合、コイルは、オフのプロセス最初のブランチ フォーク後アーケードの部分に適用できます。 - 鉗子とそれと平行に走る静脈から動脈を分離し、それらの間のスペースを作る。
- 動脈の下に文字列 (絹縫合糸 4.0、5 cm の長さ) の作品を配置します。
- 動脈を持ち上げたし、壊れやすい静脈から分離、鉗子で文字列の両端を持ち上げます。
- 一方で微細鉗子で、病巣の端を持ち、リフトの動脈 (図 2.1) の横にある病巣を配置します。
- リフトの動脈を回転するには、動脈周囲病巣をラップする、病巣の周りの文字列を使用します。動脈動脈 (図 2.2) 周りのコイルを回転するよりもコイルの周りを回転する方が簡単です。
- (コイルがある 5 ターン) 動脈 3 または 4 回転を回転した後、他の端にコイルを開催するサイトを変更します。動脈鉗子でラップされているコイルのエッジを保持します。その文字列リフト動脈コイルの反対側のサイトを変更します。動脈コイルの周りを回転させるので、コイル完全に (5 ターン) ラップ動脈 (図 2.3、2.4)。
- 文字列を削除します。
- 他の 3 つの動脈の同じ手順を実行します。
- メモ子宮に生理食塩水を温めた頻繁に適用することが重要になります。胎児の死亡率が増加し、低体温症に対する神経保護作用があります。
- 腹腔内に子宮角をそっと返します。鉗子で腹壁切開の端を持ち上げる簡単にこの手順をすることができます。
- スティッチ腹部の筋肉と、スティッチ縫合糸 (絹糸 4.0) で腹部の皮膚。それぞれのスティッチ、すなわち単一縫合後縫合糸を結ぶ。
- 外科的切開のあちこちにヨード消毒液に浸したガーゼを適用します。
- 皮下に 0.5 mg/kg 体重で鎮痛剤メロキシカムを管理します。
- 30 分温めケージでの回復を可能にします。チェック動物完全に目を覚まし、ケージの周りに移動する場合は、ホーム ケージに戻ります。
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Representative Results
すなわち、子宮を栄養動脈、両側の子宮および卵巣動脈のすべてにマイクロ コイルを適用した後すべての胎児が低灌流の対等なレベルにさらされます。0.24 mm の内径のマイクロ コイルのアプリケーションを引き起こすそれにより胎盤と胎児への血流の軽度低下を引き起こすそれらの動脈の狭窄 (図 3; 胎盤で前狭窄レベルから約 30% を参照してください詳細については 1 を参照)。ダムから生まれた子犬は、IUGR (表 1) を示しています。
ダムは、手術後、数日中に性的と思われます。それ以外は、ダム顕著な合併症を提示していない、手術後 1 週間で完全に回復。ダムは配信後に長い時間のために生きることが (死亡率は観察のための 0% 期間)、看護師の子犬に。コイルは、同じ場所に残ります。
テーブル 1。身体の重み (生後 0 日、P0) 出生時と日 P6 8 だった胚日 29 (E29) に相当します。いいえ手術群で子犬を生まれた E23、偽手術群では 1 日早く (E22); を生まれたに対し1 2 日前 (E21-22) 自然分娩で生まれた軽度子宮内低灌流 (MIUH) 群。したがって、E29 ました P6 P8 に子犬の妊娠期間によります。(n = 8-14 グループごとに、各セックスと時間の各ポイントのために) *P < なし手術対 0.01 制御グループとして偽手術群。一方通行 ANOVA、テューキー Kramer テストが続きます。
図 1。子宮の解剖学的動脈システムのスキーマします。両側の卵巣と子宮動脈の動脈を上流の周り 4 マイクロ コイルを設置されました。点線の矢印は、動脈血の流れの方向を示します。この図は、私たちの前の文書1から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。動脈をコイルのアプリケーションの例です。1. 文字列で動脈を持ち上げます。横動脈栓塞を配置します。2、病巣周囲の動脈を回転によって、病巣は動脈周囲ラップされます。3 (コイルが 5 ターン) 動脈 3 または 4 回転を回転した後、他の端にコイルを開催するサイトを変更します。一緒に鉗子を用いた動脈コイルのエッジを保持します。その文字列リフト動脈コイルの反対側のサイトを変更します。4. コイル周辺動脈の回転、コイル完全に (5 ターン) ラップ動脈。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。子宮の代表的な画像制作レーザー レーザースペックル血流計1.この画像は、コイル狭窄が左の卵巣と子宮動脈で実行された後に左子宮角が右、減少した血流を示します。*: アーケードの卵巣と子宮動脈の狭窄がコイルの場所上部のアスタリスクは卵巣動脈の近位部に対応し、低いものが子宮動脈の近位部分に相当します。点線は、左子宮角の卵巣と子宮動脈のアーケードを示します。赤みを帯びた色は、青みがかった色を示す以下の血流に対しより多くの血流を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
両方の子宮角の卵巣と子宮動脈栓塞狭窄は、すべての胎盤と胎児の一貫性と再現性のある子宮血流の低下を生成します。血流の低下のレベルは、異なる内径マイクロ コイルを使用して変更できます。マイクロ コイル内径 0.24 mm を持つ動脈狭窄したダムから生まれた仔は、IUGR と早産 (詳細については参考 1 を参照) を示しています。子犬は、早産児にみられる症状のような神経解剖学的および行動の変化を示します。これらの神経解剖学的変化、心室の拡大、皮質と脳梁の間伐や脳重量がない明白なセル損失または嚢胞性病変1の減少があります。行動の変化を観察、遅延が含まれます新生児反射、減らされた筋肉強さおよび自発1に変更します。
子宮内の虚血を研究に基づいて重症虚血再灌流と短い期間にわたって動物モデルは頻繁に使用される10,11。卵巣と子宮動脈から形成された動脈アーケードの両端がクリッピングすると、ブロックされている (胎盤と胎児を含む) 子宮角への血液供給が完全に停止します。したがって、クリップの継続時間が短い、する必要があります。 または胎児が死にます。しかし、臨床の現場でその長期にわたる軽度低灌流は、1 時間以内に子宮と完全な回復への血流の急激な封鎖ではなくより頻繁発生可能性があります推測された.
縫合結紮子宮動脈、両側卵巣動脈と大動脈の間のいくつかの内部空間の葉のクリッピングを含むそれらのアーケードの 1 つまたは両方の端を含む齧歯動物モデルは軽度延長ののみ利用可能なモデルをされています。子宮血流の低下13,14,16,19,20。これらの結紮とクリッピング モデルすなわち低再現性を持って、いくつか胎児のみが存続し、血流の低下に苦しみます。子宮頸部と腟に近い位置にある胎児を受けるに対し子宮角の上部すなわち、卵巣に最も近い位置胎児は深遠な虚血に服従する縫合結紮によって卵巣動脈で血液の流れがブロックされると、最小限または12を供給する血液の減少がないです。
プロトコルで 3 つの重要な手順があります。卵巣と子宮動脈の主なアーケードの近位部分を識別することは不可欠です。主な動脈アーケードは、胎盤に多数の枝を持っています。いくつかのこれらの分岐動脈直径の大きい、時々 主要な動脈とほぼ同じ大きさ。したがって、いくつかの他の分枝動脈の中から主要な動脈を区別する混乱することができます。主な動脈アーケードは直径が大きくないことに注意してください。アーケードの横に流れる静脈は動脈よりも直径の数倍大きいです。動脈は、手術の刺激への応答を締めつけにより、狭く、さらになるかもしれません。それと一緒に実行している静脈から動脈を分離する、繊細な作業です。動脈の外膜はアーケードの大半を通じて静脈と連絡を密に、です。静脈出血簡単に鉗子で触れたときこと注意してください。暖かいウェット子宮を維持することです重要です;さもなければ、ダムと胎児苦しむことがありますストレスや、脱水症、何人の胎児は配信前に失われる可能性があります。このコイル狭窄モデル技法の制限が必要な長い手術時間です。約 60 分の期間は、4 つのコイルを適用することによって手術を完了する必要です。この長い手術時間は胎児とダムに追加ストレスを引き起こす可能性があります。
本稿で提示したモデルは MIUH の関連性と再現性の高いモデルで、最も臨床的に考えます。このモデルにより IUGR の MIUH の時間と縦方向の影響の評価。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、日本学術振興会、CNRS、日本学術振興会科研費助成番号 26860858、ナリシゲ神経科学研究助成の年度 2013年研究交流によって支えられました。有用な議論、夫妻真理子原田芝と塩谷恭子に感謝します。優れたテクニカル サポート恵美田中律子真希、睦坂本マリ古田をありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | |||
| Isoflurane anesthesia machine | |||
| Anesthesia induction box | |||
| Heating pad | |||
| Diaper 30x40 cm | |||
| Depilatory foam or shaver | |||
| Iodine disinfectant solution | |||
| Gauze 10x20 cm | |||
| Surgical drape 45x45 cm with a round opening 5 cm in diameter | |||
| Spray bottle with ethanol for disinfection | |||
| Cotton swab | |||
| Forceps with large blunt tips | |||
| Forceps with angled fine tips | |||
| Scissors | |||
| Surgical scalpel, blade size is 27mm long (no.10, Axel, AS ONE Corporation, Osaka, Japan) | |||
| Surgical suture needle | |||
| Metal microcoils; inner diameter 0.24 mm, made from gold-coated steel (SAMINI Co. Ltd., Shizuoka, Japan) | |||
| Silk suture 4-0 | |||
| Sterile saline (0.9% sodium chloride) | |||
| Heating water bath | |||
| Plastic syringes (50ml) and needles (18G) |
References
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