Summary
Gezielte gen bearbeiten CRISPR/Cas9 hat das Verständnis der biologischen Funktionen der Gene erheblich erleichtert. Hier nutzen wir die CRISPR/Cas9-Methodik zu Modell Calreticulin Mutationen in hämatopoetischen Zellen Zytokin-abhängige um ihre onkogenen Aktivität zu studieren.
Abstract
Gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) ist eine adaptive Immunsystem in Prokaryoten, die von Wissenschaftlern, RNA-geführte Nukleasen wie CRISPR-assoziierten (Cas) 9 für standortspezifische eukaryotische Genom zu generieren umgewidmet worden bearbeiten. Genom-Engineering von Cas9 wird verwendet, um effizient, leicht und robust endogene Gene in vielen biomedizinisch relevante Säugetieren Zelllinien und Organismen ändern. Hier zeigen wir ein Beispiel dafür, wie die CRISPR/Cas9 Methode um zu verstehen, die biologische Funktion von bestimmten genetischen Mutationen zu nutzen. Wir modellieren Calreticulin (Carl) Mutationen im murinen Interleukin-3 (mIL-3) abhängigen Pro-B (Ba/F3) Zellen durch Lieferung von einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) gezielt den endogenen Carl Locus in der jeweiligen Region wo einsetzen und/oder Löschung (Indel ) Carl Mutationen bei Patienten mit myeloproliferative Neoplasmen (MPN), eine Art Blutkrebs. Die SgRNAs erstellen Doppelstrang Brüche (DSB) in der gezielten Region, die von nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) um Indels in verschiedenen Größen geben ausgebessert werden. Dann setzen wir den standard Ba/F3 zellulären Transformation Assay, die Wirkung der physiologischen Ebene Ausdruck von Carl Mutationen auf hämatopoetischen zellulären Transformation zu verstehen. Dieser Ansatz kann auf andere Gene, ihre biologische Funktion in verschiedenen Säugetieren Zelllinien zu studieren angewendet werden.
Introduction
CRISPR/Cas9 hat vor kurzem revolutioniert gezielte Genom-Bearbeitung in lebenden Zellen und Organismen. Es ist ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug für die biomedizinische Forschung geworden und wird derzeit als ein möglicher Weg für Therapie von Erbkrankheiten1genutzt werden. Die Grundlage für alle Genome editing-Tools stützt sich auf die Schaffung einer Nuklease-induzierten DNA gestrandeten Doppelunterbrechung (DSB) auf der genomischen Lokus geändert werden. Die DSB können durch nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) oder unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR)2,3repariert werden. Der Vorteil der Cas9 Nuklease über andere Genom engineering Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFN) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) ist seine Abhängigkeit von RNA für die Ausrichtung der Nuklease an eine gewünschte DNA-Sequenz im Vergleich auf die Protein-DNA-Wechselwirkungen in ZFN und TALENs2,3gefunden.
Nach der Entdeckung des CRISPR/Cas9-Nuklease-Signalwegs als adaptive Immunsystem in prokaryotischen Zellen4,5steckt viel Aufwand in der Anpassung des Weges für den Einsatz in Säugetieren Zelllinien und Modell Organismen2, 3. als ein Werkzeug für die Bearbeitung von gen CRISPR/Cas9 Weg nutzt zwei Hauptkomponenten: dem Streptococcus Pyogenes (Sp) abgeleitet Cas9 Nuklease und SgRNAs gezielt das Gen von Interesse2,3. Die SgRNA besteht aus 20 Nukleotide, direkte Cas9 auf eine bestimmte Website über das Genom durch RNA-DNA-Basenpaare Komplementarität2,3. Der Ziel-Site von den SgRNA muss neben einer Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) in Form von 5' NGG, liegen die von der SpCas9-Nuklease anerkannt wird. Mit diesen Werkzeugen kann Cas9 an jeder DNA-Sequenz richten, durch die Gestaltung SgRNAs dieses Ziels der Region von Interesse. Darüber hinaus Sp abgeleitet Cas9, gibt es weitere Varianten für Cas9 mit verschiedenen Funktionen je nach Anwendungsfall. Zum Beispiel gibt es Cas9 Varianten mit höhere Spezifität für die zielgenaue Bearbeitung oder Einzel-Strang Spaltung Kapazität für DNA nicking6,7. Darüber hinaus wurde katalytisch inaktive Cas9 vor kurzem für transcriptional Regelung8entwickelt. Wissenschaftler haben nun das CRISPR/Cas9-System für eine Vielzahl von Anwendungen, z. B. gen Profi und Knockout für die biologischen Funktionen der Gene9, Verlust der Funktion und Gewinn der Funktion Bibliothek Bildschirme10 und genetische Studie verwendet. Engineering von Modell Organismen11.
In diesem Protokoll verbinden wir die CRISPR/Cas9-Methodik mit Ba/F3 zellulären Transformation Assays, die biologische Funktion von Carl Mutationen zu verstehen. BA/F3-Zellen sind eine murinen IL-3 angewiesen hämatopoetische Zelllinie, die IL-3 gerendert werden kann unabhängig auf Ausdruck bestimmter Onkogene wie BCR-ABL-12. Um zu verstehen, ob mutierten Calreticulin Ba/F3 Zellen Zytokin unabhängiges Wachstum verändern kann, wir gezielte Exon 9 der endogenen Carl -Locus mit CRISPR/Cas9 Indel Mutationen einführen und dann zog sich IL-3 aus den Zellen anwenden eine positive Selektionsdruck, mit dem Ziel der Rekapitulation Gain of Function Carl Mutationen bei MPN Patienten gefunden. Das Protokoll umfasst Planung, Klonen und Lieferung von SgRNAs, die Entwicklung von stabilen Cas9 mit dem Ausdruck ihrer Zellen und Screening für CRISPR zielgerichtet gen zu bearbeiten. Dieses Protokoll kann auf verschiedene Gene und verschiedenen Zytokin-abhängige Zelllinien von Interesse angewendet werden und ist besonders wertvoll bei der Modellierung und die biologische Funktion von Genen, die in der Krebstherapie zu studieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
(1) SgRNA mittels Online-Designtools13
-
Design SgRNAs gezielt das gen des Interesses mit frei verfügbaren Online-Tools.
- Kopieren und Einfügen der NCBI Referenzsequenz des Gens von Interesse in der Broad Institute SgRNA Designer Web-Tool: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
Hinweis: Dieses Tool identifiziert SgRNA Sequenzen mit Spaltstellen innerhalb der Exons und diejenigen, die sich aber immer noch die Intron/Exon-Grenze erstrecken Spalten innerhalb der Exon. - Download und öffnen Sie die Textdatei für die Ausgabe in excel.
- Fokus auf die Spalten bevölkert mit den SgRNA Sequenzen und SgRNA Kontext Sequenzen. Beachten Sie, dass die SgRNA-Sequenzen keine Protospacer angrenzenden Motiv (PAM enthalten) aber die Kontext-Sequenzen tun.
- Beachten Sie, dass die zielgenaue Wirksamkeit Punktzahl die vorhergesagten Spaltung Effizienz Punktzahl auf einer Skala von 0 bis 1 listet wo eine Kerbe von 1 eine höhere Effizienz der Spaltung bezeichnet.
- Verwendung die "Art"-Funktion von excel um zu bestellen die Targets durch die Wirksamkeit Punktzahl oder Position im gen des Ziels über der Spalte "Ziel-Schnitt".
Hinweis: Sortierung nach Lage innerhalb des Gens ist nützlich zur Identifikation von SgRNAs, die auf einer bestimmten Domäne oder Exon von Interesse. - Wählen Sie 3 bis 6 SgRNAs, die auf den gewünschten Bereich mit hohen (> 0,6) auf Ziel Wirksamkeit Partituren. Es ist nützlich zu wissen, welche Arten von Mutationen für den Phänotyp verantwortlich sein können, das gewünschte (siehe Abbildung 1 erklären die targeting-Strategie für Calreticulin verwendet).
Hinweis: SgRNAs unter den vorgeschlagenen Schwellenwert von 0,6 Wirksamkeit sollte bei gibt es ein Mangel an andere guten Kandidaten berücksichtigt werden. - Verwenden Sie die MIT gRNA Analyse Webtool zum Bildschirm für mögliche Ziel-Effekte (http://crispr.mit.edu/). Führen Sie für jede SgRNA ausgewählt die Zielsequenz (einschließlich der PAM).
Hinweis: Das Broad Institute SgRNA Designer Web-Tool kann auch verwendet werden um Bildschirm für Ziel-Effekte (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- Beachten Sie, dass MIT SgRNA Analyse-Tool erhält jede SgRNA auf einer Skala von 1-100 wo bezeichnet eine Punktzahl von 100 höhere Spezifität. Einen Wert größer als 70 ist ideal und stellt ein SgRNA mit minimalen Ziel-Effekten. Dieser Website erzeugt auch eine Liste von Ziel-Hits mit ihrer Position innerhalb des Genoms und wieviele Fehlanpassungen haben sie jeweils mit dem Bewerber-Guide.
Hinweis: Off-Target-Hits mit vier Fehlanpassungen oder mehr gelten als sichere14. Ziel-Hits mit weniger als vier Fehlanpassungen können problematisch sein, wenn sie innerhalb von Exons14fallen.
- Beachten Sie, dass MIT SgRNA Analyse-Tool erhält jede SgRNA auf einer Skala von 1-100 wo bezeichnet eine Punktzahl von 100 höhere Spezifität. Einen Wert größer als 70 ist ideal und stellt ein SgRNA mit minimalen Ziel-Effekten. Dieser Website erzeugt auch eine Liste von Ziel-Hits mit ihrer Position innerhalb des Genoms und wieviele Fehlanpassungen haben sie jeweils mit dem Bewerber-Guide.
- 2-3 SgRNAs welche Zielgruppe verschiedene Standorte in der Region von Interesse für das Zielgen, und die haben die höchste Punktzahl der gekoppelten Spaltung Effizienz und Ziel zu wählen (siehe Tabelle 1 für SgRNA Sequenzen Exon 9 des Carl-targeting).
Hinweis: Abhängig von den experimentellen Zielen kann stärker auf die verschiedenen Werte aus der erwähnten Werkzeuge platziert werden.
- Kopieren und Einfügen der NCBI Referenzsequenz des Gens von Interesse in der Broad Institute SgRNA Designer Web-Tool: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
2. Klonen SgRNA Oligos13
-
Die nach vorne Oligo generieren
- Erstellen Sie eine Liste von SgRNA Sequenzen ohne die PAM-Website.
- 5'-Ende der Sequenz fügen Sie eine G hinzu, wenn die 5'-Ende der SgRNA-Sequenz kein G ist.
Hinweis: Dieses G ist notwendig für die Maximierung der U6-driven SgRNA Transkription Ebene. Zugabe von einem G ist notwendig für m1 SgRNA (Tabelle 1). - 5'-Ende der G-optimierte Leitfaden Sequenz (kein PAM) Sequenz "CACC" hinzufügen (Tabelle 2) um die Überhänge, erforderlich für die Unterbindung der geglühten Oligos in BsmBI erzeugen LentiGuide Vektor verdaut (siehe Schritt 3).
-
Die umgekehrte Oligo generieren
- Umgekehrte Ergänzung der G-optimierte Leitfaden-Sequenz (kein PAM).
- Fügen Sie die Sequenz "AAAC", 5'-Ende der umgekehrte ergänzt G-optimierte Leitfaden Sequenz (Tabelle 2).
- Eine Grundierung Synthese Unternehmen bestellen Sie gestalteten Oligos.
-
Tempern und phosphorylieren oligos
- Fügen Sie vorwärts Oligo (100 µM) 1 µL reverse Oligo (100 µM) 1 µL, 1 µL 10 x T4 Ligatur-Puffer, 0,5 µL T4-Polynukleotid-Kinase (PNK) und 6,5 µL H2O, ein PCR-Röhrchen (Total = 10 µL).
- Führen Sie das folgende Programm in den Thermocycler: 37 ° c für 30 min, 95 ° c für 5 min, Rampe von 95 auf 25 auf 0,1 ° C/s.
- Verdünnen Sie das Reaktionsprodukt bei 1: 250 in H2O.
3. Verdauung von LentiGuide-Puro Vektor13
-
Digest-LentiGuide-Puro-Vektor
- Montieren Sie eine 50 µL Verdauung Reaktion mit den folgenden Komponenten: 5 µg kreisförmigen Plasmid, 2 µL (30 Stück) BsmBI Restriktionsenzym, 5 µL Restriktionsenzym Puffer und bis zu 50 µL H2O.
- Führen Sie die Reaktion für 2 h bei 55 ° C. Fügen Sie nach der ersten Stunde 1 µL BsmBI Restriktionsenzym.
-
Dephosphorylate das geschnittene Rückgrat
- Der verdauten Vektor 7 µL Phosphatase Reaktion Puffer und 2 µL Phosphatase Enzym hinzufügen.
- 30 min bei 37 ° c inkubieren
- PCR reinigen, der Schnitt und die Rezeptorsignals Rückgrat mithilfe eines kommerziellen Kits.
Hinweis: Ersatz der zur Verfügung gestellten rosa farbigen Säulen mit dem Miniprep Kit blau farbige Säulen da diese große Plasmid Größen besser aufnehmen können. Der Ertrag kann durch Erhitzen des Elution Puffers in einem 90 ° c Hitze Block vor der Elution und eluierenden die DNA aus der Spalte zweimal am Ende (die eluierten DNA aus der ersten Elution zurück durch ein zweites Mal ausgeführt) erhöht werden.
4. Unterbindung OfAnnealed Oligos in verdaut Rückgrat13
- Fügen Sie 50 ng verdaute Rückgrat, 1 µL geglüht Oligo Verdünnung, 1 µL 10 x T4 Ligatur-Puffer, 1 µL T4-Ligase und bis zu 10 µL H2O zu einem PCR-Schlauch. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren
- Stbl3 Zellen mit 2 µL der Ligatur Reaktion zu verwandeln. Platte auf einer Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte mit 100 µg/mL Ampicillin und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Wählen Sie 3 Kolonien und in eine Mini-Vorbereitung-Kultur zu impfen.
-
Validieren korrekt Oligo einfügen
- Führen Sie eine Miniprep für jede Kultur und Sequenz durch die Oligo-Insertionsstelle Primer in der U6-Veranstalter mit einem kommerziellen Kit ab.
- Führen Sie eine Midi-Prep oder ein Maxi-Prep der Sequenz verifiziert Kultur.
5. Generation der Zelle lLines stabil mit dem Ausdruck SpCas9
Hinweis: Dieses Protokoll umfasst die Lieferung von pLX_TRC311-Cas9-Plasmid durch Lentivirale Infektion. Dieses Protokoll wird für murine Interleukin-3 (mIL-3) abhängigen Pro-B (Ba/F3) Zellen, eine Aussetzung Zelllinie ausführlich beschrieben und könnte zu anderen Zelltypen, die unter Verwendung der bevorzugten Kulturbedingungen für jeden Zelltyp angepasst werden. Das Kulturmedium für Ba/F3 Zellen besteht aus RPMI ergänzt mit fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin und 10 ng/mL murinen Interleukin 3.
-
HEK-293T Zellen zu transfizieren
- Samen Sie 3 x 106 HEK-293T Zellen pro 10 cm Gewebe Kulturschale. Halten Sie kernigen Zellen vor Transfektion über Nacht.
Hinweis: HEK-293T Zellen sind eine adhärente Zell-Linie und routinemäßig für Virus-Herstellung verwendet werden. Die Zellen werden in DMEM mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin ergänzt beibehalten. Zellen sollten 80 % Zusammenfluss Zeitpunkt der Transfektion. - Pre-Warm reduziert Serum Medien (Opti-MEM) und Wachstumsmedium.
- Fügen Sie 500 µL reduzierte Serum Medien, 7 µg pLX_TRC311-Cas9-Konstrukt, 4 µg Plasmid pCMV-VSV-G Lentivirale Verpackung und 4 µg Plasmid psPAX2 Lentivirale Verpackung in ein Rohr
Hinweis: Gesamt-DNA pro 10 cm Teller der 293T Zellen ist 15 µg. - Mischen Sie die DNA gut und 45 µL Transfection Reagens. Vorsichtig mischen und 20 min stehen lassen.
Hinweis: Es ist wichtig, reduzierte Serum-Medien zu verwenden, da Serum die Komplexbildung zwischen Transfection Reagens und Plasmid DNA hemmen wird. - Aspirieren Sie das alte Medium in der 293T-Platte und 5 mL neue Wachstumsmedium.
- Die 293T Platte den DNA und Transfection Reagens-Mix auf kluge Weise Drop hinzufügen. Wirbel-sanft und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h.
- Virale Überstände bei 24 und 48 h Post Transfektion zu ernten. Durchlaufen Sie ein 0,22 µm Filter und Aliquot in ein Cryoröhrchen Rohr (1,6 mL/Schlauch und 1,5 mL wird für Infektion verwendet werden).
- Speichern von viralen Überstand bei-80 ° C.
Hinweis: Lentivirale überstand kann innerhalb von 6 Monaten verwendet werden. Wenn möglich, sollten Spinfection Transductions mit frischen Virus durchgeführt werden).
- Samen Sie 3 x 106 HEK-293T Zellen pro 10 cm Gewebe Kulturschale. Halten Sie kernigen Zellen vor Transfektion über Nacht.
-
Lentivirale Infektion Ba/F3 Zellen
- Auftauen des viralen Überstands auf Eis, wenn gefroren.
- Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g für 4 min.
- Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie die Zellen in einer Konzentration von 3 x 106 Zellen/mL.
- Hinzufügen von 500 µL resuspendierte Zellen, 1,5 mL virale überstand, 4 µL Polybrene (Bestand: 2 mg/mL) und 10 ng/mL von m-IL3 in einer Gewebekultur 6-Well-Platte. Stellen Sie sicher, eine nicht infizierte gut mit 1,5 mL der Medien statt virale Überstand als Kontrolle.
Hinweis: Sollte die Höhe der viralen überstand hinzugefügt zu einer Vielzahl von Infektionen (MOI) entsprechen < 1. - Zentrifugieren Sie die Platte bei 440 X g 120 Minuten bei 37 ° C.
- Nehmen Sie die Platte aus der Zentrifuge und in 37 ° C und 5 % CO2 Inkubator legen und über Nacht wachsen lassen.
- Spin-down der Zellen nach 24 h, und mit 5 mL frisches warmes Medien in einem 6-Well-Platte aufzuwirbeln.
-
Auswahl von Cas9 infiziert Zellen
- Spin-down der Zellen und mit frischen warmen Medien ergänzt mit 5 µg/mL Blasticidin, 48 h Post Spinfection aufzuwirbeln.
- Markieren Sie die Zellen, für 9 Tage mit Blasticidin oder bis nicht infizierten (Negativkontrolle) Zellen tot sind.
- Sobald die Auswahl abgeschlossen ist, übertragen Sie die resistenten Zellen auf Medium mit niedriger Konzentration von Blasticidin.
(6) Reporter Assay für Cas9 Tätigkeit15
- Transduzieren elterlicher Zellen und Cas9 mit pXPR-011 stabil zu äußern, indem Lentivirale Infektion (siehe Schritte 5.1-5.2).
Hinweis: Dieser Vektor enthält GFP und eine Anleitung für GFP. Zellen mit aktiven Cas9 führt zu einer Reduzierung der GFP (Abbildung 2). - Markieren Sie die Zellen, für 3 Tage mit 2 µg/mL Puromycin, 48 h Post Spinfection.
- Analysieren Sie die Proben für die GFP Expression von Durchflusszytometrie.
Hinweis: Eine GLP-Reduktion von mindestens 50 % stellt optimale Cas9 Aktivität. Eine höhere Konzentration von Blasticidin Auswahl genutzt werden, Cas9 Aktivität zu erhöhen, wenn weniger als eine Ermäßigung von 50 % beobachtet. Nicht alle Zelllinien verträgt Blasticidin Auswahl. Verwendung von Cas9 Vektoren mit anderen Auswahl-Kassetten kann in diesem Fall notwendig sein. Darüber hinaus verträgt nicht alle Zelllinien stabile Expression von Cas9. In diesem Fall kann transiente Transfektion von Cas9 verwendet werden.
7. Spinfection der SgRNAs in Cas9 mit dem Ausdruck ihrer Zellen
- Führen Sie die Schritte 5.1-5.2 für Lentivirale Infektion von SgRNAs in Zellen von Interesse.
Hinweis: In Schritt 5.1.3 ersetzen Sie pLX_TRC311-Cas9-Konstrukt mit dem LentiGuide-Puro-Konstrukt aus Abschnitt 4 validiert. - 48 h nach Spinfection, markieren Sie die Zellen für 3 Tage mit 2 µg/mL Puromycin.
- Medium mit niedriger Konzentration von Antibiotika resistenten Zellen übermitteln und weiter Auswahl für weitere 4 Tage, um ausreichende Bearbeitung zu ermöglichen.
8. Ba/F3 zellulären Transformation und Positive Selektion über m-IL3 Rückzug
Hinweis: Dieser Test ist für mIL-3 abhängigen Ba/F3 Zellen beschrieben aber könnte auf jede Zytokin abhängige Zelle Zeile angewendet werden.
- Spin-down exponentiell wachsenden Ba/F3 Zellen ectopically Cas9 und die SgRNA von Interesse zum Ausdruck bringen.
- Aspirieren Sie überstand und waschen Sie die Zellen mit 5 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Spin-down der Zellen und wiederholen Sie den Waschschritt unter Punkt 8.2 viermal (diese Schritt wird sichergestellt, dass die Medien frei von IL-3).
- Aspirieren der PBS und Aufschwemmen der Zellen in 5 mL frische Medien ohne IL-3.
- Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer oder einer Zelle Lebensfähigkeit Analyzer.
- Samen der Zellen in dreifacher Ausfertigung in einer Gewebekultur 6-Well-Platte in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL in einem Gesamtvolumen von 2 mL frische Medien ohne IL-3.
- Überwachen und die Zellen alle 2 Tage für insgesamt 8 Tage zu zählen.
Hinweis: Ba/F3 Zellen fehlt IL-3 in der Regel sterben 2 Tage nach IL-3 Hunger. Es ist wichtig, eine negative Kontrolle in der Probe enthalten (in der Regel eine nicht-targeting Anleitung dient als Kontrolle).
9.-Screening für CRISPR zielgerichtet bearbeiten
- Screening-Primer vor- und nachgelagerten SgRNA-Spaltstelle CRISPR-Design
Hinweis: verwenden Sie Primer mindestens 100 bp aus dem vorhergesagten Spaltstelle um sicherzustellen, dass die Erkennung nicht von einem großen einfügen/löschen (Indel) an die Ziel-Site SgRNA oder beeinflusst werden. - Genomischen DNA (gDNA) zu isolieren, aus transformierten Zellen (am Ende der Wachstumskurve) und Zellen Pre-Zytokin Rückzug.
Hinweis: Immer enthalten Sie Zellen überexprimiert-targeting Führer als ein Steuerelement für die Bearbeitung von gen. GDNA aus Zellen zu isolieren, vor und nach der Transformation identifiziert Klone, die positiv für ausgewählt wurden und haben einen proliferativen Vorteil. - Montieren Sie eine 50 µL PCR mit den folgenden Komponenten: 25 µL 2 X PCR Mix, 1 µL forward Primer (10 µM), rückwärts-Primer (10 µM) 1 µL, 50-100 ng gDNA und H2O bis 50 µL.
Hinweis: Zahlreiche High Fidelity Polymerasen können im Schritt 9.3 verwendet werden. - Beispiele in einem Thermocycler mit den folgenden Parametern ausführen: 95° C für 1 min, 30 Zyklen (94 ° C für 1 min, 52 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s), und 72 ° C für 10 Minuten. Diese PCR ist optimiert für die Carl -Primer in Tabelle 3aufgeführt. PCR-Bedingungen für die Primerpaar entworfen im Schritt 9.1 basierend auf Teste es auf gDNA zu optimieren.
- 5 µL der Proben auf ein 2 % Agarose-Gel mit 10 V/cm mit 1 X Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer ausgeführt. Untersuchen Proben für die Anwesenheit / Abwesenheit einer verstärkten Band entspricht in der Größe bis das gen des Interesses.
- Verwenden Sie den Rest der PCR-Reaktion (45 µL) um eine PCR-Reinigung durchzuführen.
- Klonen der Amplifikate mit einer PCR, Klonen Kit in ein Plasmid-Vektor. Beispielsweise dienen in der Regel pGEM T-easy Vektoren.
- Verwandeln Sie das Plasmid in Stbl3 Zellen oder anderen kompatiblen Zellen und Platte auf LB-Agar-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum. Wählen Sie 10-20 Kolonien, Mini-Vorbereitung jedes Gespräch und jeder Klon nach Sanger Sequenzierung der Indels erstellt von CRISPR/Cas9 Bearbeitung zu charakterisieren.
Hinweis: Auf Wunsch bearbeitet einzelne Zelle aktiviert Fluoreszenz Zelle, die Sortierung (FACS) auf den größten durchgeführt werden konnten Bevölkerung um einen Klon mit einem spezifischen Indel zu isolieren. Darüber hinaus kann nächste Generation sequencing (NGS) Methoden zur robuster quantifizieren zielgerichtet bearbeiten mit tiefen Sequenzierung PCR Amplifikate die Zielregion SgRNA überspannt. Beispielsweise kann Tracking der Indels durch Zersetzung oder TIDE statt subcloning verwendet werden, um genau zu bestimmen, das Spektrum und die Häufigkeit der gezielte Mutationen erzeugt in einem Pool von Zellen (https://tide.nki.nl/#about)16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit Hilfe der beschriebenen Methode hier ist das Ziel dieses Experiments, die funktionellen Auswirkungen der Einführung von Indel Mutationen an den endogenen Carl -Locus auf hämatopoetischen Zellen Transformation zu studieren. Das CRISPR/Cas9-System dient als Werkzeug erstelle endogene Carl Mutationen in Ba/F3 Zellen. Zwei SgRNAs wurden ausgewählt, um gezielt Exon 9 von Carl (Abbildung 1), in der Region wo Einfügungen und/oder Löschung (Indel) Mutationen in der Regel in Carl treten-mutierten MPN Patienten17,18. Die ersten SgRNA (m1) wurde gewählt, aufgrund seiner hohen Spaltung Effizienz und günstige off-Zielwerte (Tabelle 1). Die zweite SgRNA (m2) wurde gewählt, vor allem wegen seiner Lage in Exon 9 und aus Mangel an zusätzlichen SgRNAs in der Region mit hohen Spaltung Effizienz und günstige Ziel bearbeiten Partituren (Tabelle 1). Zwei unterschiedliche SgRNAs (m1 oder m2) wurden in separate Infektionen verwendet, um sicherzustellen, dass die beobachteten Effekte aufgrund auf Zielgen zu bearbeiten waren. Ziel-Effekte werden voraussichtlich von mehreren unabhängigen SgRNAs gemeinsam genutzt werden. Das Steuerelement-targeting (Scramble) diente auch als Negativkontrolle. Rekrutierung von Cas9 Endonuklease, Carl Exon 9 wird voraussichtlich um DSB an diesem Ort zu erstellen. Die DSB würde dann von NHEJ, die Indels Variable Größen (Abbildung 1) generieren können repariert werden.
Um die in-vitro- CRISPR/Cas9 System in Ba/F3 Zellen zu entwickeln, wurden Zellen stabil mit dem Ausdruck des Cas9-Proteins durch Lentivirale vermittelte Transduktion entsprechend dem oben beschriebenen Protokoll gemacht. Stabile Cas9 Expression führt zu robusten Cas9 Aktivität. Cas9 Aktivität in Ba/F3-Cas9 Zellen wurde durch pXPR-011, ein Reporter Konstrukt gemessen, die GFP und eine Anleitung für GFP15enthält. Zellen mit aktiven Cas9 führt zu einer Reduzierung der GFP15. GFP wurde in die Zellen mittels Durchflusszytometrie gemessen. BA/F3-Cas9 Zellen eine Reduktion von ca. 76 % in GLP, entsprechend robuste Cas9 (Abbildung 2) angezeigt.
Geben Sie 1 Zytokin-Rezeptoren, wie z. B. der Thrombopoetin-Rezeptor (MPL), der Erythropoietin-Rezeptor (EPOR) und der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Rezeptoren (G-CSFR) Faktor wurden jeweils einzeln, stabil ausgedrückt in Ba/F3-Cas9 Zellen zu bestimmen, ihre Kooperativität mit mutierten Calreticulin bei der Induktion von Transformation von Ba/F3 Zellen. Transduktion der SgRNA Konstrukte (m1, m2 oder ein Gerangel (Guide-targeting)) erfolgte dann in jedem der Ba/F3-Zell-Linien stabil mit dem Ausdruck Cas9 und den Rezeptor von Interesse. Zellen wurden dann für 7 Tage mit Puromycin ausgewählt, um genügend Zeit für die Bearbeitung von CRISPR/Cas9 gen zu ermöglichen. Dann wurde ein Positivauswahl Druck ausgeübt, durch verhungern die Zellen der Zytokin (mIL-3). Das Ziel dieser Hunger-Druck ist zu erkennen, ob Indels in Carl Exon 9, ähnlich wie bei MPN Patienten beobachtet werden, was Zytokin-unabhängige Wachstum und Transformation von Ba/F3 Zellen ausgewählt. Die Wachstumskurve für insgesamt 8 Tage durchgeführt wurde und die Zellen wurden alle 2 Tage gezählt, um ihre Transformation (Abbildung 3)19messen. Zelle Pellets für genomische DNA-Extraktion wurden gesammelt, vor dem Start der Wachstumskurve und am Ende die Wachstumskurve für zielgenaue Bearbeitung zu überprüfen und die Indels überwachen, die Post Zytokin Hunger (Abbildung 3)19erweitert.
Cytokine unabhängiges Wachstum verzeichneten Carl-gezielte Ba/F3-MPL-Cas9 Zellen (Abbildung 4 b), aber nicht Carl-gezielte elterliche Ba/F3-Cas9 Zellen (Abb. 4A) oder Ba/F3-Cas9 Zellen mit dem ectopically Ausdruck EPOR (Abbildung 4 ) oder G-CSFR (Abbildung 4)19. Um zu bestätigen, dass mIL-3 unabhängige Carl ausgerichtete Ba/F3-MPL-Cas9 Zellen ein Ergebnis der Bearbeitung auf Zielgen wuchs, wurden Zellen geerntet 8 Tage Post mIL-3 Rücktritt und genomischer DNA extrahiert19war. Ein 422 bp Region, die der Ziel-Site wurde unter Verwendung der in Tabelle 3aufgeführten Zündkapseln verstärkt. Vor-Klonen der PCR Amplifikate wurde durchgeführt und 30 einzelnen Klone erhielten für Sanger Sequenzierung. Für m1 oder m2 Carl-gezielte Ba/F3-MPL-Cas9 Zellen, alle Sub-Klone enthalten Indels unterschiedlicher Größe bei der geschnittenen Standort (Abbildung 5)19. 11 von 13 m1 Sub-Klone wurden gefunden, Indels enthalten, die führte zu + 1 bp Frameshift Mutationen (Abbildung 5), ähnlich denen bei Patienten gefunden. Für m2 Carl-gezielt Zellen, fanden sich 10 von 17 Sub Klone Indels enthalten, die zu + 1 bp Frameshifts (Abbildung 5)19geführt. Diese Daten bestätigen, dass CRISPR/Cas9-vermittelte Einführung + 1bp Frameshift-Mutationen der endogenen Carl Exon 9 Locus ist ausreichend onkogenen Aktivität bis Carl19zu verleihen. Die Sequenzierungsdaten in Abbildung 5 legt nahe, dass auch die Einführung von heterozygoten + 1bp Frameshift-Mutationen, die endogene Carl Locus ist ausreichend, um Ba/F3-MPL Zellen, Einklang mit der Beobachtung, dass Carl verwandeln Mutationen sind in der Regel heterozygot MPN Patienten17,18. Da NHEJ reparieren führt zu hohen Heterogenität zwischen den Indels, könnten einzelne Zelle sortieren um einen Klon von Interesse zu isolieren durchgeführt werden. Dadurch könnten die Forscher Studie zu den Auswirkungen der spezifischen Mutationen von CRISPR/Cas9 erstellt.
Abbildung 1: Schema der CRISPR/Cas9 gen-Bearbeitung von Exon 9 von Carltargeting. Zwei SgRNAs wurden entwickelt, um eine Website innerhalb der Maus Carl Exon 9 Region entsprechend ausrichten, die gezielt durch die + 1bp Frameshift-Mutationen in menschlichen MPN (roter Balken). Ziel-Sequenzen mit PAMs (dunkelblau) werden angezeigt, und erwarteten Websites der Spaltung von Cas9 sind mit roten Dreiecken gekennzeichnet. DSB erzeugte CRISPR/Cas9 sind dann von NHEJ, repariert die Indels von variabler Länge19generieren soll. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Cas9 Activity Assay. Elterliche Ba/F3 und Ba/F3 Zellen überexprimiert Cas9 wurden mit pXPR-011 Cas9 Aktivität messen ausgestrahlt. Ein Rückgang der GFP korreliert mit einer erhöhten Aktivität der Cas9. Elterliche Ba/F3-Zellen sind ~ 100 % FITC + Ba/F3-Cas9 Zellen gegenüber wo die FITC ~ 76 % reduziert wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Timeline für Infektion und Auswahl von SgRNAs in Ba/F3 Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Einführung von + 1 bp Frameshift-Mutationen in der endogenen Carl Lokus ist ausreichend onkogenen Aktivität, Carl zu verleihen. (A-D) Wachstumskurven im elterlichen Ba/F3-Cas9 Zellen (A) Ba/F3-MPL-Cas9 Zellen (B), Ba/F3-EPOR-Cas9 (C), und Ba/F3-G-CSFR-Cas9 Zellen (D) zeigt IL-3 unabhängigen Wachstum im Carl-gezielte Ba / F3-MPL-Cas9 Zellen nur19. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Sanger-Sequenzierung Überprüfung. Bestätigung der Ziel-Bearbeitung von endogenen Carl (Exon 9) in den Ba/F3-MPL Zellen. + 1 bp Frameshift-Mutationen sind in Schwarz19angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Zielgen | SgRNA ID | Ziel-Sequenz (5' 3') | Strang | Dekolleté-Effizienz | Zielpunktzahl | ||
| Carl | M1 | AGAGGACAAGAAGCGTAAAGAGG | + | 0,7 | 70 | ||
| Carl | m2 | GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGAGG | + | 0,3 | 28 | ||
Tabelle 01:20-Mer Protospacer Sequenzen einschließlich der PAM-site (fettgedruckt) für zwei SgRNAs targeting Exon 9 von Carl 19.
| Primer-ID | Sequenz (5' 3') |
| M1-F | CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG |
| M1-R | AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC |
| m2-F | CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG |
| m2-R | AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC |
Tabelle 2: Protospacer Sequenzen und ihre reverse ergänzt mit "CACC" und "AAAC" hinzugefügt, zum Klonen in pLenti-Guide-Vektor mit Restriktionsenzym BsmBI 19.
| Primer-ID | Sequenz (5' 3') |
| Calr_Fwd | ACCACCTGTCTTTCCGTTCT |
| Calr_Rev | GGCCTCTACAGCTCATCCTT |
Tabelle 3: CRISPR screening PCR Primer vor- und nachgelagerten SgRNA-Spaltstelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier zeigen wir die Verwendung von CRISPR/Cas9 gen bearbeiten, um die biologische Funktion von Carl Mutationen in hämatopoetischen Zellen zu untersuchen. Der Erfolg dieses Protokolls ist stark abhängig von mehreren Faktoren ab. Erstens ist es wichtig zu wissen, welche Arten von Mutationen für den Phänotyp verantwortlich sind, die gewünscht wird. In diesem Protokoll die Anzeige ist die Umwandlung von Ba/F3 Zellen mIL-3 Unabhängigkeit und die Arten von Mutationen sind Indels im Exon 9 von Carl. Wenn die gewünschte Mutation eines einzigen Basenpaar Substitution ist, ist jedoch dann HDR-vermittelte Reparatur die bevorzugte Methode da es präzise Punktmutationen oder Einfügungen aus einem einzigen Strang oder doppelsträngige DNA Spender Vorlage2, einführen können 3. Wunsch, Ko des Gens, die Schaffung der groß angelegte genomische Deletionen auf frühen kodierenden Exons wird bevorzugt20.
Zweitens muss die Zellinie Zytokin-abhängige um positive Selektion Druck Post Zytokin Rückzug zu ermöglichen. Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle Zelllinien stabile Expression von Cas9 tolerieren können (siehe Punkt 6.3). Dies könnte durch die Blasticidin-Auswahl, die von allen Zelllinien nicht toleriert wird. In diesem Fall kann die Wahl der anderen Cas9-Konstrukte mit verschiedenen Auswahl-Kassetten notwendig sein. Eine Einschränkung der Verwendung von Zytokin-abhängige Zelllinien, wie z. B. Ba/F3 Zellen ist, dass sie anfällig für spontane Zytokin unabhängiges Wachstum, manchmal durch die Akquisition von Mutationen im ectopically ausgedrückt-gen des Interesses nach Zytokin Rücktritt21. Dementsprechend ist die Verwendung geeigneter Kontrollen erforderlich, um sicher sein, dass die beobachteten zelluläre Transformation durch zielgenaue CRISPR gen Bearbeitung ist. In diesem Protokoll beobachteten wir zellulären Transformation in Ba/F3-MPL ausgestrahlt, mit einem SgRNA-Steuerelement-targeting oder in Ba/F3-EPOR und Ba/F3-GCSFR Zellen ausgestrahlt mit Carl-gezielte SgRNAs. Dadurch werden weitere Zuversicht, dass zelluläre Transformation in Ba/F3-MPL Zellen zielgerichtet Bearbeiten von endogenen Carl Locus führt.
In diesem Protokoll führt DNA-Reparatur von NHEJ Indels in variablen Größen, wie in Abbildung 5zu sehen. Analyse von Sanger-Sequenzierung auf einer Teilstichprobe der Bulk-Bevölkerung der bearbeiteten Zellen durchgeführt wurde, um den Ausbau der Indels zu suchen, die zu + 1 bp Frameshift-Mutationen Post Zytokin Rückzug führen. Nächste Generation Sequenzierung im Schritt 9,9 erwähnt ist ein robuster Weg zur Quantifizierung zielgerichtet bearbeiten für Bulk-Zell-Populationen. Analyse auf einem bestimmten Klon gewünscht wird, ist dann einzelne Zelle Sortierung der Masse Bevölkerung notwendig. Einzelne Zelle sortieren ist vorteilhaft für das Verständnis der biologischen Wirkung, die von einer bestimmten Art von Mutation und ist nützlich, wenn das Ziel ist es, die Unterschiede zwischen zwei verschiedenen Arten von Mutationen zu verstehen.
Ein Anliegen mit dem CRISPR/Cas9 System ist Ziel-Effekte, die Spaltung Ereignisse außerhalb der gezielten Region sind. Die Besonderheit des Systems CRISPR/Cas9 zu beurteilen und sicherzustellen, dass die transformierten Populationen keine Nebenwirkungen Ziel führt zu der beobachteten Transformation enthalten, müssten wir prüfen, ob Genom-Bearbeitung außerhalb der Region aufgetreten. Interesse. Dies könnte auf der Suche nach Beweisen für Cas9/NHEJ-driven Genom-Bearbeitung an potenzielle Ziel genomic Loci mit erheblichen Sequenzähnlichkeit, das beabsichtigte Ziel. Dazu nächste Generation Sequenzierung auch ließe sich die Häufigkeit der Ziel-Effekte an bestimmten Orten entlang des Genoms quantitativ zu bewerten. Um das Potenzial für Ziel-Effekte zu verringern, könnte verschiedene Faktoren in das Protokoll aufgenommen werden. Wie in den Ergebnissen erwähnt, mehrere SgRNAs, die die Region von Interesse studieren gewährleistet, dass der Phänotyp das Ergebnis einer Zielereignis ist. Darüber hinaus haben Studien vorgeschlagen, dass abgeschnittene SgRNAs mit 17 Nukleotide die Häufigkeit von Ziel-Spaltung Veranstaltungen22reduzieren kann. Zusätzlich kann über längere Cas9 aus stabilen Ausdruck in einer höheren Frequenz von Ziel-Effekten führen. Es ist wichtig zu beachten, dass ein dual Vektorsystem mit Cas9 und die SgRNA in das Protokoll statt stabile Expression von Cas9 verwendet werden könnte; Allerdings neigen diese Vektoren zu sehr groß sein und einen niedrigen Lentivirale Titer und geringeren Wirkungsgrad der Infektion führen. Infolgedessen könnte transiente Transfektion von Cas9 Konstrukt in den Zellen von Nucleofection verwendet werden. Die jüngsten Berichte haben auch Cas9 Konstrukte mit höhere Spezifität für die Bearbeitung von auf Ziel entwickelt, wie z. B. die eSpCas9 konstruieren6.
Zusammenfassend stellt CRISPR/Cas9 eine effiziente, kostengünstige und zuverlässige Genom engineering Tool, so dass für das Studium der genetischen Mutationen auf physiologischen Ausdruck Ebenen. Hier beschäftigen wir CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung als eine robuste und effiziente Methode, um das Verständnis für die funktionellen Auswirkungen von Carl Mutationen in hämatopoetischen Zellen voraus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wir haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den NIH (R01HL131835), dem Damon Runyon Klinischer Prüfarzt Award und Starr Cancer Consortium unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
