Summary
타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.
Abstract
클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)는 CRISPR 관련 (Cas) 9 사이트별 진 핵 게놈에 대 한 같은 RNA 기반 nucleases 생성을 과학자 들에 의해 다른 용도로 원핵생물에서 적응 면역 시스템 편집. Cas9에 의해 게놈 엔지니어링 효율적으로 쉽고 튼튼하게 많은 biomedically 관련 된 포유류 세포와 유기 체에 내 생 유전자를 수정 하는 데 사용 됩니다. 여기 우리가 특정 유전자 변이의 생물 학적 기능을 이해 하는 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 하는 방법의 예를 보여줍니다. 우리는 특정 지역에서 생 Calr 소재 시를 대상으로 한 가이드 RNAs (sgRNAs)의 전달에 의해 murine 인터 루 킨-3 (밀-3) 종속 프로 B (Ba/F3) 셀에 calreticulin (CALR) 돌연변이 모델 어디 삽입 또는 삭제 (indel ) CALR 돌연변이 myeloproliferative 신생 (MPN), 혈액 암의 일종을 가진 환자에서 발생. sgRNAs 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 다양 한 크기의 indels를 주고 수리는 대상된 지역에 두 배 물가 틈 (DSBs)을 만듭니다. 우리 다음 조 혈 모 세포 변환에 Calr 돌연변이의 생리 적 수준 식이의 영향을 이해 하 표준 바/F3 세포 변환 분석 결과 사용 합니다. 이 방법은 다양 한 포유류 세포 라인에 그들의 생물학 기능을 공부 하기 다른 유전자에 적용할 수 있습니다.
Introduction
CRISPR/Cas9 기술 최근 살아있는 세포와 유기 체에서 편집 하는 타겟된 게놈 혁명 있다. 그것은 생물 의학 연구를 위한 매우 강력한 도구가 되고있다 고 현재1유전자 질환 치료에 대 한 잠재적인 애비뉴로 널리 사용 되 고 있다. 모든 게놈 편집 도구에 대 한 기초 수정할 genomic 소재 시에 nuclease 유도 DNA 두 배 좌초 휴식 (DSB)의 생성에 의존 합니다. DSBs 비 동종 끝-결합 (NHEJ) 또는 상 동 감독 수리 (HDR)2,3에 의해 수리 수 있습니다. Cas9 nuclease 엔지니어링 nucleases 아연 손가락 nucleases (ZFNs) 같은 다른 게놈에 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs)의 장점은 RNA에 대 한 그것의 의존 대상 비교 원하는 DNA 시퀀스를 nuclease에 대 한 에 ZFNs 및 TALENs2,3에 단백질 DNA 상호 작용.
Prokaryotic 세포4,5에 적응 면역 시스템으로 CRISPR/Cas9 nuclease 통로의 발견 후 많은 노력 적응 포유류 세포 선 및 모델 생물2, 에 사용 하기 위해 통로에 간 3. 유전자 편집 도구로, CRISPR/Cas9 통로 활용 두 가지 주요 구성 요소: 연쇄 상 구 균 pyogenes (Sp) 파생 Cas9 nuclease 관심2,3의 유전자를 대상으로 하는 sgRNAs. sgRNA 20 뉴클레오티드 RNA DNA 기본적인 쌍 complementarity2,3게놈에 특정 사이트에 직접 그 Cas9로 구성 됩니다. 대상 사이트는 sgRNA의 옆의 5' NGG SpCas9 nuclease에 의해 인식 되는 형태로 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 사이트에 있어야 합니다. 이러한 도구를 사용 Cas9 sgRNAs 대상 관심 영역을 설계 하 여 어떤 DNA 순서를 이동 수 있습니다. 또한 Sp Cas9 파생, 특정 응용 프로그램에 따라 다른 특징을 가진 Cas9에 대 한 추가 변종이 있습니다. 예를 들어 편집 하는 대상에 대 한 높은 특이성 또는6,7nicking dna 단일 가닥 절단 용량 Cas9 변종이 있습니다. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 최근 transcriptional 규칙8에 대 한 개발 되었습니다. 과학자 들은 이제 다양 한 유전자 쫓 고 녹아웃 유전자9, 기능 손실 및 이득의 함수 라이브러리 화면10 및 유전 생물 학적 기능 연구 등의 응용 프로그램에 대 한 CRISPR/Cas9 시스템 사용 모델 생물11의 공학입니다.
이 프로토콜에서 우리 CALR 돌연변이의 생물 학적 기능을 이해 하 바/F3 세포 변환 분석 결과와 CRISPR/Cas9 방법론을 결합 한다. 학사/f 3 셀은 murine IL 3 종속 조 혈 세포 라인 IL 3 렌더링 될 수 있는 특정 oncogenes BCR ABL12등의 표현에 따라 독립. 이해 여부 돌연변이 calreticulin cytokine 독립적인 성장에 바/F3 셀을 변형할 수 있다, 우리는 엑손 9 indel 돌연변이 소개 하는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 내 인 성 Calr 소재 시의 대상으로 하 고 다음 적용할 셀에서 IL-3를 철회를 긍정적인 선택 압력, 업과 MPN 환자에서 발견 기능 이득 CALR 돌연변이의 목표와 함께. 프로토콜 포함 디자인, 복제 및 sgRNAs, 안정적인 Cas9 표현 세포의 개발의 전달 하 고 CRISPR에 대 한 심사 대상 유전자 편집. 이 프로토콜 다른 유전자와 관심의 다양 한 cytokine 종속 셀 라인에 적용할 수 있는 모델링 및 암에서 관련된 유전자의 생물 학적 기능 공부에서 특히 중요 하며
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Protocol
1. sgRNA 디자인을 사용 하 여 온라인 도구13
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자유롭게 사용 가능한 온라인 도구를 사용 하 여 관심사의 유전자를 대상으로 하는 sgRNAs 디자인.
- 복사 및 광범위 한 연구소 sgRNA 디자이너 웹 도구에 관심사의 유전자의 NCBI 참고 순서를 붙여 넣습니다: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
참고:이 도구 exons 내의 분열 사이트 sgRNA 시퀀스를 식별 하 고 하지만 여전히 intron/엑손 경계를 확장 하는 exon 내 쪼개 다. - 다운로드 및 오픈 텍스트 출력 파일에서 excel.
- SgRNA 시퀀스 및 sgRNA 컨텍스트 시퀀스를 채워집니다 열에 초점. SgRNA 시퀀스에 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 포함 되어 있지 않습니다 하지만 컨텍스트 시퀀스 할 note.
- Note에 대상 효능 점수 예측된 분열 효율성 점수 1의 점수 높은 절단 효율성을 나타냅니다 1-0의 규모에 나열.
- '정렬' 기능 효능 점수 또는 '대상 컷 %' 칼럼을 통해 대상의 유전자 내의 위치 목표를 주문 하거나 excel을 사용 합니다.
참고: 유전자 내의 위치 정렬 대상으로 특정 도메인 또는 관심의 exon sgRNAs를 식별 하는 데 유용 합니다. - 높은 관심의 영역을 대상으로 3-6 sgRNAs 선택 (> 0.6) 효능 점수 대상. 돌연변이의 종류는 원하는 (제발 참조 그림 1 설명 하는 calreticulin에 대 한 사용 대상 전략) 표현 형에 대 한 책임 수 있습니다 아는 것이 유용할 수 있습니다.
참고: 다른 좋은 후보자의 부족 때 제안된 0.6 효능 점수 임계값 아래 sgRNAs는 고려 되어야 한다. - 화면에 MIT gRNA 분석 웹 도구를 사용 하 여 잠재적인 대상 오프 효과 (http://crispr.mit.edu/). 각 sgRNA 선택, (를 포함 하 여 PAM) 대상 시퀀스를 실행 합니다.
참고: 넓은 연구소 sgRNA 디자이너 웹 도구 사용 될 수도 오프 대상 효과 (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)에 대 한 화면으로.- 참고는 MIT sgRNA 분석 도구 점수 각 sgRNA 1-100의 규모에 있는 100의 점수는 더 높은 특이성을 나타냅니다. 점수를 70 보다 큰 이상적 이며 최소 오프 대상 효과 함께 sgRNA를 나타냅니다. 이 웹사이트는 또한 목록을 생성 게놈 및 얼마나 많은 불일치 내의 그들의 위치에서 대상 안타의 각각 후보 가이드와 함께 있다.
참고: 대상에서 안타 4 불일치 또는 큰 안전14간주 됩니다. 미만 4 불일치 오프 대상 안타 exons14내가 경우 문제가 될 수 있습니다.
- 참고는 MIT sgRNA 분석 도구 점수 각 sgRNA 1-100의 규모에 있는 100의 점수는 더 높은 특이성을 나타냅니다. 점수를 70 보다 큰 이상적 이며 최소 오프 대상 효과 함께 sgRNA를 나타냅니다. 이 웹사이트는 또한 목록을 생성 게놈 및 얼마나 많은 불일치 내의 그들의 위치에서 대상 안타의 각각 후보 가이드와 함께 있다.
- 2-3 sgRNAs를 대상으로 대상 유전자에 대 한 관심의 영역 내에서 독특한 위치 그리고 있는 최고의 짝된 분열 효율성과 오프 대상 선택 ( Calr의 엑손 9를 대상으로 하는 sgRNA 시퀀스에 대 한 표 1 참조).
참고: 실험 목표에 따라 큰 중점 언급 한 도구에서 가져온 다른 값에 삽입할 수 있습니다.
- 복사 및 광범위 한 연구소 sgRNA 디자이너 웹 도구에 관심사의 유전자의 NCBI 참고 순서를 붙여 넣습니다: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
2. 복제 sgRNA Oligos13
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앞으로 올리고 생성
- PAM 사이트 없이 sgRNA 시퀀스의 목록을 만듭니다.
- SgRNA 시퀀스의 5' 끝은 G. 하지 않으면 시퀀스의 5' 끝에 G를 추가
참고:이 G는 U6 구동 sgRNA 전사 수준 극대화 필요 합니다. G의 추가 m 1 sgRNA (표 1) 필요 합니다. - G 최적화 가이드 시퀀스 (PAM)의 5' 끝에 "CACC" 시퀀스를 추가 (표 2) BsmBI로 단련된 oligos의 결 찰에 필요한 돌출부를 생성 하기 위해 lentiGuide 벡터를 소화 (3 단계 참조).
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역방향 올리고 생성
- G 최적화 가이드 시퀀스 (PAM)을 보완 하는 역.
- 반대로 보충된 G 최적화 가이드 시퀀스 (표 2)의 5' 끝에 "AAAC" 시퀀스를 추가 합니다.
- 뇌관 종합 회사에서 설계 oligos를 주문.
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Anneal 및 oligos phosphorylate
- 앞으로 올리고 (100 µ M), 역방향 올리고 (100 µ M)의 1 µ L의 1 µ L을 추가, T4 결 찰 x 10의 1 µ L, 0.5 µ L T4 polynucleotide 키 니 아 제 (PNK)의 버퍼 및 H2O PCR 튜브에 6.5 µ L (총 = 10 µ L).
- thermocycler에서 다음 프로그램 실행: 37 ˚C 30 분, 95 5 분 ˚C, 95에서 경사 0.1에서 25로 ° C/s.
- 1: 250 H2o.에서 반응 제품을 희석
3. lentiGuide-순수 하지 않아 벡터13 의 소화
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다이제스트 lentiGuide-순수 하지 않아 벡터
- 다음 구성 요소와 50 µ L 소화 반응 조립: 원형 플라스 미드, BsmBI 제한 효소의 2 µ L (30 대), 5 µ L의 제한 효소 버퍼 및 H2o.의 50 µ L까지 5 µ g
- 55 ° c.에서 실행 하는 2 시간에 대 한 반응 첫 번째 시간 후 BsmBI 제한 효소의 더 많은 1 µ L를 추가 합니다.
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Dephosphorylate 컷된 백본
- 소화 벡터를 7 µ L의 인산 가수분해 효소 반응 버퍼와 인산 가수분해 효소 효소의 2 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
- PCR 정화 잘라내기 및 상업 키트를 사용 하 여 dephosphorylated 백본.
참고: 대체 miniprep 키트와 함께 제공 된 핑크 컬러 열 때문이 더 큰 플라스 미드의 크기를 수용할 수 있는 컬러 열을 블루. 차입 전에 90 ˚C 열 블록에 차입 버퍼를가 열 하 고 (두 번째 시간을 통해 다시 첫 번째 차입에서 eluted DNA를 실행) 끝에 두 번 열에서 DNA를 방출 하 여 수확량을 늘릴 수 있습니다.
4. 결 찰 ofAnnealed Oligos 소화 백본13 에
- 추가 50 ng 소화 백본의 1 µ L의 단련 올리고 희석, T4 결 찰 x 10의 1 µ L, 1 µ L t 4 리가의 및 H2O PCR 튜브에 10 µ L까지 버퍼. 실 온에서 1 h에 대 한 품 어
- 결 찰 반응의 2 µ L Stbl3 셀을 변환 합니다. 100 µ g/mL 암 피 실린을 lysogeny 국물 (파운드) 한 접시에 접시와 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 3 식민지를 선택 하 고 미니 준비 문화에 접종.
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올바른 올리고 삽입 확인
- 각 문화 및 상업 키트를 사용 하 여 U6 발기인에 뇌관에서 시작 올리고 삽입 사이트를 통해 순서는 miniprep를 수행 합니다.
- Midi-준비 또는 시퀀스 확인 문화 맥시 준비를 수행 합니다.
5. 셀 lLines 안정적으로 표현 SpCas9 세대
참고:이 프로토콜 lentiviral 감염에 의해 pLX_TRC311 Cas9 플라스 미드의 납품을 포함 한다. 이 프로토콜 murine 인터 루 킨-3 (밀-3) 종속 프로-B (Ba/F3) 세포, 현 탁 액 셀 라인에 대 한 세부 정보에서 설명 하 고 각 셀 형식에 대 한 선호 문화 조건을 사용 하 여 다른 셀 형식에 맞게 수 있습니다. 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스 보충 RPMI 이루어져 바/f 3 셀에 대 한 문화 매체/L-글루타민과 10 ng/mL murine 인터 류 킨 3의.
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HEK 293T 세포 transfect
- 10 cm 조직 문화 접시 당 3 x 106 HEK 293T 세포 씨앗 Transfection 전에 하룻밤 시드 셀을 계속.
참고: HEK 293T 세포 부착 셀 라인 하 고 정기적으로 바이러스 생산을 위해 사용 됩니다. 셀은 DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스/L-글루타민 보충에 유지 됩니다. 세포는 transfection 시 80% 합칠 이어야 한다. - 전 따뜻한 감소 혈 청 미디어 (Opti-MEM)와 성장 매체.
- 튜브로 감소 된 혈 청 미디어의 500 µ L, pLX_TRC311-Cas9 구축, pCMV-VSV-G lentiviral 포장 플라스 미드의 4 µ g 및 psPAX2 lentiviral 포장 플라스 미드의 4 µ g의 7 µ g을 추가
참고: 총 DNA 293T 세포의 10 cm 접시 당 15 µ g 이다. - DNA를 잘 혼합 하 고 45 µ L transfection 시 약의 추가. 부드럽게 혼합 하 고 그것은 20 분 동안 서 보자.
참고: 미디어를 사용할 감소 된 혈 청 혈 청 transfection 시 약 및 플라스 미드 DNA 사이 복잡 한 형성을 억제 하기 때문에 중요 하다. - 293T 접시에 오래 된 매체를 발음 하 고 새로운 성장 매체의 5 mL를 추가 합니다.
- 293T 접시에 드롭 현명한 방식으로 DNA와 transfection 시 믹스를 추가 합니다. 부드럽게 소용돌이 고 24 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
- 24 및 48 h 게시물 transfection에 바이러스 supernatants 수확. Cryovial 튜브 (1.6 mL/튜브와 1.5 mL 것입니다 감염에 대 한 사용)에 0.22 μ m 필터와 약 수를 통과.
- -80 ° c.에 게 바이러스 상쾌한
참고: lentiviral 상쾌한 6 개월 이내에 사용할 수 있습니다. 가능 하면 spinfection transductions 수행 되어야 한다 신선한 바이러스).
- 10 cm 조직 문화 접시 당 3 x 106 HEK 293T 세포 씨앗 Transfection 전에 하룻밤 시드 셀을 계속.
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바/F3 셀 lentiviral 감염
- 냉동 하는 경우 얼음, 바이러스 상쾌한을 녹여.
- 셀 4 분에 대 한 300 x g에서 원심
- 상쾌한 발음 하 고 resuspend 3 x 106 셀/mL의 농도에서 세포.
- Resuspended 세포, 바이러스 상쾌한의 1.5 mL, polybrene의 4 µ L의 500 µ L 추가 (재고: 2 mg/mL)와 m-IL3 6 잘 조직 배양 접시에서의 10 ng/mL. 미디어 컨트롤 바이러스 상쾌한 대신 1.5 mL와 잘는 감염 되지 않은 포함 되었는지 확인 합니다.
참고: 바이러스 상쾌한 추가 금액 감염 (MOI)의 다양성에 대응 한다 < 1. - 37 ° c.에 120 분 440 x g에서 격판덮개 원심
- 원심 분리기에서 접시를 받아 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에 밤새 껏 성장 허용.
- 24 시간 후 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 6 잘 플레이트에서 신선한 따뜻한 미디어의 5 mL와 함께 resuspend.
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Cas9에 감염 된 세포의 선택
- 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 blasticidin, 48 h 게시물 spinfection의 5 µ g/mL으로 보충 하는 신선한 따뜻한 미디어와 resuspend.
- Blasticidin 또는 감염된 (부정적인) 제어 셀 죽 었 때까지 9 일 동안 셀을 선택 합니다.
- 선택이 완료 되 면 내성 세포 blasticidin의 낮은 농도와 매체에 전송.
6. 기자 Cas9에 대 한 분석 결과 활동15
- 부모 셀과 셀 안정적으로 표현 Cas9 pXPR-011 lentiviral 감염에 의해 transduce (참조 단계 5.1-5.2).
참고:이 벡터는 GFP와 GFP를 대상으로 한 가이드 포함 되어 있습니다. 세포 활성 Cas9를 포함 하는 GFP (그림 2)의 감소에 발생 합니다. - 2 µ g/mL puromycin, 48 h 게시물 spinfection의 3 일에 대 한 셀을 선택 합니다.
- Cytometry 여 GFP 식에 대 한 샘플을 분석 했다.
참고: 50% 이상의 GFP 감소 최적의 Cas9 활동을 나타냅니다. Blasticidin 선택의 높은 농도 경우 Cas9 활동을 증가 하는 데 사용할 수 보다 50% 감소를 관찰 했다. 모든 셀 라인 blasticidin 선택을 허용할 수 있습니다. 이 경우에, 다른 선택 카세트와 Cas9 벡터의 사용이 필요할 수 있습니다. 또한, 모든 셀 라인 Cas9의 안정적인 표현을 허용할 수 있습니다. 이 경우에, Cas9의 과도 transfection는 사용할 수 있습니다.
7. Spinfection sgRNAs Cas9 표현 세포로의
- 단계 5.1-5.2 sgRNAs의 lentiviral 감염에 대 한 관심의 세포로.
참고: 단계 5.1.3에서에서 바꿉니다 pLX_TRC311 Cas9 구문을 섹션 4에서 확인 lentiGuide-순수 하지 않아 구조. - 48 h, spinfection 게시 puromycin의 2 µ g/mL로 3 일에 대 한 셀을 선택 합니다.
- 항생제의 낮은 농도 가진 중간 내성 세포를 전송 하 고 충분 한 편집에 대 한 허용 하도록 다른 4 일 선택 계속.
8. 바/F3 세포 변환 및 m-IL3 철수를 사용 하 여 긍정적인 선택
참고:이 분석 결과 밀 3 종속 바/f 3 셀에 대 한 설명 하지만 어떤 사이토카인 종속 셀 라인에 적용할 수 있습니다.
- 기 하 급수적으로 성장 하는 학사/f 3 셀 ectopically Cas9 및 sgRNA 관심의 표현 아래로 회전 합니다.
- 상쾌한 발음 하 고 셀 5 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)을 씻어.
- 셀 아래로 회전 하 고 8.2에 세척 단계를 반복 4 번 (이 단계를 통해 미디어의 IL 3 무료).
- PBS를 발음 하 고 IL 3 없이 신선한 미디어의 5 mL에 셀 resuspend.
- hemocytometer 또는 셀 생존 분석기를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 시드 3 중 IL 3 없이 신선한 미디어의 2 mL의 총 볼륨에서 1 x 105 셀/mL의 농도에서 6 잘 조직 문화 접시에 있는 셀입니다.
- 모니터링 및 셀 8 일 총 매 2 일.
참고: 바/F3 셀 IL 3 일반적으로 부족 한 일 게시물 IL-3 기아 죽어. 분석 결과에서 부정적인 제어를 포함 하는 것이 중요 하다 (일반적으로 비를 대상으로 가이드 사용 됩니다 제어로).
9. CRISPR를 편집 하는 대상에 대 한 심사
- 디자인 CRISPR 뇌관 업스트림과 다운스트림 sgRNA 분열 사이트의 심사
참고: 예측된 분열 사이트에서 뇌관 최소한 100 bp를 사용 하 여 탐지 하지 큰 삽입 또는 삭제 (indel) sgRNA 대상 사이트에 의해 영향을 받을 것을 보장. - (성장 곡선의 끝)에서 변형 된 세포와 세포 중 cytokine 철수에서 게놈 DNA (gDNA)를 격리 합니다.
참고: 항상 유전자 편집 컨트롤 비 대상으로 가이드 overexpressing 셀을 포함 합니다. 전과 후 변환 위해 선택한 긍정적으로 클론을 식별 하 고 증식 이점을 셀에서 gDNA를 분리. - 다음 구성 요소와 50 µ L PCR 조립: 2 x PCR 믹스, 앞으로 뇌관 (10 µ M), 역방향 뇌관 (10 µ M)의 1 µ L, 50-100 ng gDNA, 및 H2O 50 µ L까지 1 µ L의 25 µ L.
참고: 수많은 하이파이 polymerases 단계 9.3에서에서 사용할 수 있습니다. - Thermocycler 다음 매개 변수를 사용 하 여 샘플을 실행: 1 분 동안 95 ° C, 30의 주기 (1 분, 52 ° C 30에 대 한 94 ° C s, 72 ° C 30에 대 한 s), 그리고 10 분 동안 72 ° C. 이 PCR는 표 3에 나열 된 Calr 뇌관에 최적화 되어 있습니다. 9.1 gDNA에 테스트 단계에서 설계 된 뇌관 쌍에 대 한 PCR 조건 최적화.
- 1 x 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼를 사용 하 여 10 V/cm에서 2 %agarose 젤에 5 µ L의 샘플을 실행 합니다. 존재에 대 한 샘플 검사 / 증폭된 밴드의 관심사의 유전자를 크기에 해당.
- PCR 반응 (45 µ L)의 나머지를 사용 하 여 PCR 정화를 수행.
- 키트는 플라스 미드 벡터에 클로닝 PCR와는 amplicons 클론. 예를 들어 pGEM T-간편한 벡터는 일반적으로 사용 됩니다.
- Stbl3 또는 다른 호환 셀 전지와 관련 항생제와 파운드 한 천 격판덮개에 격판덮개로 플라스 미드를 변환. 10-20 식민지, 각 하나, 소형 예비를 선택 하 고 각 클론 생어 대상 indels CRISPR/Cas9 편집에서 생성 하는 시퀀스.
참고: 원하는 경우 단일 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 일괄 수행할 수 편집 특정 indel와 클론을 분리 하는 인구. 또한, 차세대 시퀀싱 (NGS) 방법을 더 견고 하 게 대상에 sgRNA 대상 지역에 걸친 PCR amplicons의 깊은 시퀀싱을 사용 하 여 편집 척도를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 분해 또는 조 수에 의해 Indels의 추적을 정확 하 게는 스펙트럼 및 셀 (https://tide.nki.nl/#about)16의 수영장에서 생성 하는 대상된 돌연변이의 주파수를 결정 하는 subcloning 대신 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
여기에 설명 된 메서드를 사용 하 여,이 실험의 목표 소개 하는 조 혈 세포 변환에 생 Calr 소재 시에 indel 돌연변이의 기능 효과 공부 하는입니다. CRISPR/Cas9 시스템 바/f 3 셀에 내 인 성 Calr 돌연변이 만드는 도구로 사용 됩니다. 두 개의 sgRNAs 어디 삽입/삭제 (indel) 돌연변이 또는 일반적으로에서 발생 CALR지역에서 엑손 9 Calr (그림 1)의 대상으로 선정 됐다-돌연변이 MPN 환자17,18. 첫 번째 sgRNA (m1)의 높은 절단 효율성과 유리한 대상에서 점수에 따라 선정 되었다 (표 1). 두 번째 sgRNA (m2) 주로 엑손 9 내의 그것의 위치에 대 한 선정 됐다 고 높은 절단 효율성 및 대상에서 유리한 편집 영역의 추가 sgRNAs 부족 점수 (표 1). 두 가지 sgRNAs (m1 또는 m2)는 관찰 된 효과 때문에 대상 유전자 편집 했다 되도록 별도 감염에 사용 되었다. -대상 효과 여러 독립 sgRNAs에 의해 공유 될 것. 비 대상 컨트롤 (출 격) 부정적인 제어로도 사용 되었다. Calr 엑손 9에 Cas9 endonuclease의 모집이 로커이 스 DSBs 만들 전망 이다. DSBs 것 다음 가변 크기 (그림 1)의 indels를 생성할 수 있는 NHEJ에 의해 복구할 수 있습니다.
생체 외에서 학사/f 3 셀에 CRISPR/Cas9 시스템 개발, 안정적 Cas9 단백질을 표현 하는 세포 위에서 설명한 프로토콜에 의하여 lentiviral 중재 변환에 의해 만들어졌다. 강력한 Cas9 활동에 Cas9 식 결과 안정. 바/F3-Cas9 세포에 Cas9 활동 pXPR-011, GFP와 GFP15를 대상으로 하는 가이드를 포함 하는 기자 구문에 의해 측정 되었다. 세포 활성 Cas9를 포함 하는 GFP15의 감소에 발생 합니다. GFP는 cytometry를 사용 하 여 셀에 측정 되었다. 학사/F3-Cas9 셀 GFP, 강력한 Cas9 활동 (그림 2)에 해당의 약 76%의 감소를 표시.
입력 1 cytokine 수용 체, thrombopoietin 수용 체 (MPL), 리스로 수용 체 (EPOR) 그리고 granulocyte 식민지 자극 요소 수용 체 (G-CSFR) 개별적으로 각각 되었다 같은 안정적으로 확인 하 바/F3-Cas9 세포에 표현 된 그들의 바/f 3 셀의 변화 유도에 돌연변이 calreticulin와 cooperativity. SgRNA 구문 (m1, m2 또는 출 격 (비 타겟팅 가이드))의 변환 다음 각각의 Cas9와 관심의 수용 체를 표현 안정적 학사/F3 셀 라인에서 실행 되었다. 셀 편집 하는 CRISPR/Cas9 유전자에 대 한 충분 한 시간이 있도록 puromycin 7 일 다음 선택 했다. 긍정적인 선택 압력 다음 굶주린 cytokine (밀-3)의 세포에 의해 적용 되었다. 이 기아 압력의 목표 Calr 엑손 9, 유사한에 indels MPN 환자에서 관찰, cytokine 독립적인 성장과 바/f 3 셀의 변화에 따른 선택은입니다. 성장 곡선 총 8 일 동안 실시 하 고 셀 그들의 변환 (그림 3)19를 측정 하기 위해 매 2 일을 계산 했다. 게놈 DNA 추출에 대 한 펠 릿 세포의 성장 곡선 및 편집 하는 대상에 대 한 확인 게시물 cytokine 기아 (그림 3)19확장 indels를 모니터링 하 고 성장 곡선의 끝에 시작 하기 전에 수집 했다.
Cytokine 독립적인 성장 Calr에서 관찰 되었다-하지 Calr하지만 바/F3-MPL-Cas9 셀 (그림 4B), 타겟-타겟 부모의 바/F3-Cas9 셀 (그림 4A), 또는 학사/F3-Cas9 ectopically (그림 4C EPOR 표현 세포 ) 또는 G-CSFR (그림 4D)19. Calr 대상 바/F3-MPL-Cas9 세포에 밀 3 독립적인 성장 대상에 유전자 편집의 결과 이었다고 확인, 세포 수확된 8 일 게시물 밀 3 철수 되었고 게놈 DNA 추출 된19살. 대상 사이트에 걸쳐 422 bp 지역 표 3에 나열 된 프라이 머를 사용 하 여 증폭 되었다. 수행한 하위 PCR amplicons의 복제 및 30 개별 클론 생어에 보내진 순서. M1 또는 m2 Calr-타겟된 바/F3-MPL-Cas9 세포, 모든 포함 하는 하위 클론 indels 의도 컷된 사이트 (그림 5)19에 다양 한 크기의. 11 중 13 m 1 하위 클론 환자에서 발견 + 1 bp frameshift 돌연변이 (그림 5), 그와 유사한 시킨 indels를 포함 하도록 발견 되었다. M2 Calr에 대 한-대상 셀, 10/17 하위 클론 발견 + 1 bp frameshifts (그림 5)19주도 indels를 포함. 이러한 데이터를 확인 하는 CRISPR/Cas9-중재의 소개 + 1bp frameshift 돌연변이 Calr 내 생 엑손 9 로커 스 Calr19종양 활동을 부여 하는 것 충분 하다. 그림 5 에서 시퀀싱 데이터 또한 나왔다는 heterozygous의 소개 + 1bp frameshift 돌연변이 생 Calr 소재 시에는 바/F3-MPL 셀, 관측으로 일관 된 그 CALR 를 변환할 충분 한 돌연변이 일반적으로 MPN 환자17,18heterozygous. NHEJ는 indels 사이 높은 질에 결과 복구, 이후 관심의 클론을 정렬 하는 단일 셀을 수행 수 있습니다. 이 CRISPR/Cas9에 의해 만들어진 특정 돌연변이의 효과 연구 하는 연구원을 허락할 것 이다.
그림 1: 스키마의 CRISPR/Cas9 유전자 편집 Calr의 엑손 9의 대상으로. 2 sgRNAs 대상 영역 내에 마우스 Calr 엑손 9에 해당 하는 사이트를 대상으로 설계 되었습니다 의해는 + 1bp frameshift 돌연변이 인간 mpn (빨간 막대). 대상 시퀀스 PAMs (진한 파란색)으로 표시 되 고 예상된 사이트 Cas9에 의해 분열의 빨간 삼각형으로 표시 됩니다. CRISPR/Cas9에 의해 생성 하는 DSBs 다음 NHEJ, 가변 길이19indels를 생성할 것으로 예상 된다에 의해 수리는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Cas9 활동 분석 결과. 부모의 바/F3 셀과 바/f 3 셀 Cas9 overexpressing pXPR-011 Cas9 활동 측정으로 불리고 있었다. GFP 감소 Cas9 활동 증가와 상관 한다. 부모의 바/F3 셀은 FITC +는 FITC ~ 76%로 감소 된다 바/F3-Cas9 셀에 비해 ~ 100%. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 감염 및 학사/f 3 셀에 sgRNAs의 선택에 대 한 타임 라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 내 인 성 Calr 소재 시에 + 1 bp frameshift 돌연변이의 소개 Calr 종양 활동을 부여 하는 것 충분 하다. 부모의 바/F3-Cas9에서 (A D) 성장 곡선 (A) 바/F3-MPL-Cas9 셀 (B), 바/F3-EPOR-Cas9 (C), 세포 및 셀 바/F3-G-CSFR-Cas9 (D) Calr-타겟 바에 IL 3 독립적인 성장 보여줍니다 / F3-MPL-Cas9 세포만19. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 생어 시퀀싱 확인. 확인 대상에 생 Calr (exon 9) 학사/F3-MPL 셀에서의 편집. + 1 bp frameshift 돌연변이 검은19에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 대상 유전자 | sgRNA ID | 대상 시퀀스 (5' 3') | 스트랜드 | 분열 효율 | 끄기-목표 점수 | ||
| Calr | m1 | AGAGGACAAGAAGCGTAAAGAGG | + | 0.7 | 70 | ||
| Calr | m2 | GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGAGG | + | 0.3 | 28 | ||
표 1시 20분-PAM을 포함 하 여 메 르 protospacer 시퀀스 두 sgRNAs Calr의 엑손 9 타겟팅에 대 한 (굵게 표시 됨)에서 사이트 19.
| 뇌관 ID | 시퀀스 (5' 3') |
| m1-F | CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG |
| m1-R | AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC |
| m 2-F | CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG |
| m2-R | AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC |
표 2: Protospacer 시퀀스 및 그들의 반대로 보완 "CACC"와 "AAAC" BsmBI 제한 효소를 사용 하 여 pLenti 가이드 벡터에 클로닝을 위한 추가 19.
| 뇌관 ID | 시퀀스 (5' 3') |
| Calr_Fwd | ACCACCTGTCTTTCCGTTCT |
| Calr_Rev | GGCCTCTACAGCTCATCCTT |
표 3: CRISPR PCR 뇌관 업스트림과 다운스트림 sgRNA 분열 사이트의 심사.
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Discussion
여기 우리 공부 조 혈 모 세포에서 CALR 돌연변이의 생물학 기능을 편집 하는 CRISPR/Cas9 유전자의 사용을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 매우 여러 요인에 따라 달라 집니다. 첫째, 그것은 어떤 종류의 돌연변이 원하는 표현 형에 대 한 책임 수 있습니다 아는 것이 중요입니다. 이 프로토콜에서 판독 밀 3 독립 학사/f 3 셀의 변화 이며 돌연변이의 유형은 indels CALR의 엑손 9에. 그러나, 원하는 돌연변이 단 하나 기본적인 쌍 대체 하는 경우에, 다음 HDR 중재 수리는 선호 하는 방법 때문에 정확한 포인트 변이 또는 삽입 단일 가닥 또는 두 가닥 DNA 기증자 템플릿2, 에서 발생할 수 있습니다. 3.을 바란다면 녹아웃, 유전자 다음 초기 코딩 exons를 대상으로 대규모 게놈 삭제의 창조는20을 선호 하는 것.
둘째, 셀 라인 cytokine 종속적 긍정적인 선택 압력 게시물 cytokine 철수 할 수 있도록 해야 합니다. 모든 셀 라인 Cas9의 안정적인 식 용납 수 있습니다 주의 하는 것이 중요 하다 (단계 6.3 참조). 이 모든 셀 라인에 의해 용납 하지 blasticidin 선택 인해 수 있습니다. 이 경우에, 다른 선택 카세트와 다른 Cas9 구문의 선택 할 수도 있습니다. 바/F3 셀 같은 cytokine 종속 셀 라인을 사용 하 여의 경고는 그들은 사이토카인에 따라 관심의 표현된 ectopically 유전자에 있는 돌연변이의 취득 결과로 때때로 자발적인 cytokine 독립적인 성장에 취약 철수21. 따라서, 적절 한 컨트롤의 사용은 관찰된 셀룰러 변환 대상에 CRISPR 유전자 편집 때문 임을 자부 하는 데 필요한. 이 프로토콜에서 우리 비 대상으로 sgRNA 제어 또는 학사/F3-EPOR 불리고 바/F3-MPL 세포와 바/F3-GCSFR 셀 Calr로 불리고 세포 변환을 준수 하지 않았다-sgRNAs를 대상으로. 이 바/F3-MPL 세포에 세포 변환 대상에 생 Calr 소재 시의 편집의 결과 추가 자신감을 제공 합니다.
그림 5에서 보듯이이 프로토콜 NHEJ DNA 수리 indels 가변 크기의 소개. 분석 생어에 의해 시퀀싱 + 1 bp frameshift 돌연변이 게시물 cytokine 철수 이어질 indels의 확장을 찾고 위해 편집된 셀의 대량 인구의 하위 샘플에 수행 되었다. 차세대 시퀀싱 단계 9.9에서에서 언급은 계량 하는 더 강력한 방법에-대상 대량 세포 인구에 대 한 편집. 특정 복제본에 대 한 분석을 원하는 경우 다음 단일 셀 대량 인구의 정렬 필요 하다. 단일 셀 정렬 유리한 돌연변이의 특정 종류에서 발생 하는 생물 학적 효과 이해 하 고 목표는 두 가지 유형의 변이 사이의 차이점을 이해 하는 경우 유용.
CRISPR/Cas9 시스템으로 한 우려 대상된 지역 밖에 서 분열 이벤트는 대상에서 효과입니다. 우리 게놈 편집의 영역 밖에 서 발생 한 여부를 검사 해야 CRISPR/Cas9 시스템의 특이성을 평가 하 고 변형 된 인구 관찰 된 변화를 선도 하는 어떤 대상에서 효과 포함 하지 않는 다는 것을 확인 하 관심입니다. 이 Cas9/NHEJ 기반 게놈 편집 잠재적인 대상에서 게놈 loci에서 의도 된 대상에 중요 한 시퀀스 유사성의 증거에 대 한 보고 할 수 있었다. 이 위해 차세대 시퀀싱도 사용 될 수 양적 게놈에 따라 지정 된 위치에 떨어져 대상 효과의 주파수를 평가 하기 위해. 오프 대상 효과 대 한 가능성을 줄이기 위해, 다른 요인 프로토콜에 포함 될 수 있습니다. 결과에서 설명 했 듯이, 관심 영역을 대상으로 하는 여러 sgRNAs를 공부 하면 표현 형에 대상 이벤트의 결과. 또한, 최근 연구는 17 뉴클레오티드로 잘린된 sgRNAs 오프 대상 분열 이벤트22의 주파수를 줄일 수 있습니다 제안 했다. 또한, 오프 대상 효과의 더 높은 주파수 안정적인 식에서 Cas9에 장기간된 노출 될 수 있습니다. 그것은 Cas9 및 sgRNA는 모두 포함 하는 이중 벡터 시스템 Cas9;의 안정적인 식 대신 프로토콜에서 사용 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 벡터 경향이 매우 큰 낮은 lentiviral titer와 낮은 감염 효율성. 결과적으로, nucleofection에 의해 셀에 Cas9 구문의 과도 transfection는 사용 될 수 있습니다. 최근 보고서는 또한 개발 Cas9 구문을 편집 하는 대상에 대 한 높은 특이성은 eSpCas9 구성6와 같은.
요약, CRISPR/Cas9는 효율적인, 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 게놈을 엔지니어링 도구, 생리 적 식 수준에서 유전자 변이의 연구에 대 한 허용을 나타냅니다. 여기 우리는 CRISPR/Cas9 유전자 조 혈 모 세포에서 CALR 돌연변이의 기능성 효과 대 한 이해를 강력 하 고 효율적인 방법으로 편집을 사용 합니다.
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Disclosures
우리는이 보고서와 관련 된 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (R01HL131835), Damon Runyon 임상 조사 상 및 스타 암 협회에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
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