Summary
Eine verbesserte Protokoll ist für die Messung der transiente Genexpression von Reporter Konstrukte in Gerste Aleuronschicht Zellen nach Bombardement Teilchen vorgestellt. Die Kombination von automatisierten Getreide mahlen mit 96-Well-Platte Enzym-Assays bietet hohen Durchsatz für das Verfahren.
Abstract
Die Aleuronschicht Gerstenkörner ist ein wichtiges Modellsystem für Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen. In Aleuronschicht Zellen Gene benötigt zur Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung werden aktiviert, indem Gibberellin (GA), während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. Die Mechanismen der GA und ABA Signalisierung können abgefragt werden, durch die Einführung von Reporter Genkonstrukte in Aleuronschicht Zellen über Teilchen-Bombardement, mit den daraus resultierenden transiente Expression mit Enzym-Assays gemessen. Eine verbesserte Protokoll wird berichtet, dass teilweise automatisiert und rationalisiert das Korn Homogenisierung Schritt und die Enzym-Assays, wodurch deutlich mehr Durchsatz als bestehende Methoden. Homogenisierung der Getreide Proben erfolgt über eine automatisierte Gewebe-Homogenisator und GUS (β-Glucuronidase) Assays werden mit Hilfe einer 96-Well-Platte-System durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse über das Protokoll legen nahe, dass Phospholipase D Tätigkeit eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der HVA1 Genexpression von ABA, durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 spielen kann.
Introduction
Die Aleuronschicht Gerste ist eine gut etablierte Modellsystem für das Studium der Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen1. Insbesondere werden eine Reihe von Genen, die für die Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung durch Gibberellin (GA), aktiviert, während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. GA und ABA Signalwege sind miteinander verflochten, wie der Ausdruck einiger GA-aktivierten Gene von ABA und umgekehrt1gehemmt wird.
Eine sinnvolle Strategie für Verständnis, dass die Rolle von bestimmten Akteuren bei der Signalisierung GA/ABA wurde die Einführung der Effektor Genkonstrukte über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte, mit denen den daraus resultierende Effekt auf nachgeschalteten Genexpression bestimmt werden. Die Verwendung von Reporter-Gene wie GUS (β-Glucuronidase) oder Luciferase ermöglicht die sensible und quantitative Messung der Genexpression speziell innerhalb der Zellen, die die Effektor-Konstrukt erhalten haben. Zum Beispiel festgestellt die Einführung eines Effektor-Konstrukts Codierung der Transkriptionsfaktor TaABF15,6 , dass ABA-induzierten Genen wie HVA1 von TaABF1, beim GA-induzierten Genen wie Amy32b induziert werden werden unterdrückt. Teilchen-Bombardement als experimentelle Strategie wurde von mehreren Labors untersuchen verschiedene Aspekte des GA/ABA Signalisierung verwendet. Diese Arbeit führte zur Identifizierung der Promotor Elemente wichtig für die Aktivierung des GA-induzierte2 und ABA-induzierten Genen3und zur Entdeckung von Protein Kinasen4 und Transkription Faktoren5 , die Regeln der Expression dieser Gene.
Die vorhandenen Protokolle2,3,4,5,6 für Teilchen-Bombardement und Folgebewertung von transiente Genexpression sind sehr arbeitsintensiv, wie jede Gruppe von bombardiert kaum Getreide wird von Hand in einem Mörser und Stößel homogenisiert und die Enzym-Assays werden individuell durchgeführt. Diese Handschrift berichtet eine verbesserte Protokoll, das teilweise automatisiert und rationalisiert die Homogenisierung Schritt und der GUS assays um deutlich mehr Durchsatz ermöglichen eine größere Anzahl von Behandlungen im gleichen Experiment getestet werden bei schönem und/oder die Aufnahme von mehr Wiederholungen für jede Behandlung mehr statistisch solide Ergebnisse zu erzielen. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck von HVA1 und Amy32b Reporter Konstrukte, reguliert durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 sowie GA, ABA und andere regulatorische Moleküle dargestellt.
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Protocol
1. Vorbereitung der Effektor und Reportergen konstruiert
- Effektor-Konstrukte, die konstitutiven Promoter (z. B. Mais Ubiquitin, UBI) beschäftigen Laufwerk Ausdruck aus einem gewünschten offenen Leseraster zu bauen. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit UBI::TaABF1 Antrieb stark konstitutive Ausdruck des TaABF15.
- Reporter-Konstrukte, die der Veranstalter enthalten, deren Aktivität gemessen werden, soll, zu bauen, platziert einen offenen Leserahmen, wie GUSvorgeschaltet. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit HVA1::GUS zur Messung der Ausdruck aus der HVA1 Veranstalter2,5.
- Aufbau eines internen Kontrollsystems Konstrukt (z. B. UBI::Luciferase).
- Mit einer Kieselsäure verbindlichen Spalte Protokoll (siehe Tabelle der Materialien), aller erforderlichen Genkonstrukte qualitativ hochwertige Plasmid vorbereiten. Mit UV-Spektroskopie (siehe Tabelle der Materialien), sorgfältig messen die Konzentration der einzelnen Plasmid-Vorbereitung.
2. Vorbereitung der Gerstenkörner für die Bombardierung
- Richten Sie eine Tabellenkalkulation (siehe Abbildung 1 für ein Beispiel) unter Angabe der Plasmide, die bombardiert werden, die entsprechenden Hormonbehandlungen und andere relevante Informationen für jede Behandlung, die Teil des Experiments werden.
- Ein Schneidebrett mit einer sterilen Rasierklinge abgeschnitten die Embryonen aus Körnern des Himalaya Gerste (40 für jede Behandlung in das Experiment einbezogen). Schließen Sie Körner aus, die verfärbten oder wesentlich kleiner als der Durchschnitt sind.
- Legen Sie die embryoless Körner in einer 50 mL-Tube. 40 mL Wasser und Fels für 10 Minuten hinzufügen.
- Gießen Sie das Wasser sorgfältig (um nicht zu verlieren Körner) und 40 mL 10 % Bleichmittel. Rock für 20 Minuten.
- Gießen Sie das Bleichmittel und geben Sie 40 mL sterilem Wasser hinzu. Rock für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese steriles Wasser waschen noch viermal.
- 40 mL Imbibing Lösung (20 mM Natrium Succinat, 20 mM-Kalzium-Chlorid, pH 5,0) zugeben und 40 μl der Stammlösung Chloramphenicol (10 mg/mL).
- Saugende Lösung (mit Chloramphenicol) aus der Tube in ein Vermiculit Platte übertragen (siehe Tabelle der Materialien). Übertragen Sie dann die Körner auf die Oberfläche des nassen Filterpapiers in Vermiculit Platte. Die Körner gleichmäßig verteilt. Gießen Sie in genügend saugende Lösung weiterhin die Körner teilweise (aber nicht vollständig) getaucht. Legen Sie den Deckel auf die Vermiculite-Platte.
- Inkubieren Sie die embryoless Körner bei 24 ° C für ca. 48 h mit Leuchtstoffbeleuchtung. Fügen Sie zusätzliche Imbibing Lösung als notwendig.
- Öffnen Sie eine 90 mm Kunststoff Petrischale und gießen Sie selbst und 20 mL in der umgekehrten Deckel 20 mL Imbibing Lösung in die Schüssel. Fügen Sie jeweils 20 μl von Chloramphenicol (10 mg/mL hinzu). Zwei Paare der feinen Spitze Zange durch Eintauchen in Alkohol zu sterilisieren.
- Legen Sie ein paar der embryoless Körner in den Deckel der Petrischale. Entfernen Sie mit der Pinzette, vorsichtig (transparent) Samenschale aus jedem Korn. Beschädigen Sie beim Entfernen der Samenschale von der glatten Seite des Getreides nicht die darunter liegenden Zellen (Aleuronschicht). Übertragen Sie das geschälte Korn auf der Petrischale mit saugende Lösung.
- Nach dem peeling die Samenschale aller Körner, kehren sie an die Vermiculite-Platte. 16-20 Stunden inkubieren Sie die geschälten embryoless Körner bei 24 ° C.
- Nur vor die Körner für die Bombardierung, entfernen Sie Oberflächenfeuchtigkeit durch Schütteln sie zwischen Filterpapiere in einer Petrischale.
3. Vorbereitung der Plasmid-DNA für die Bombardierung
- Beschriften Sie eine 1,5 mL-Tube für jede Behandlung, die in der Bombardierung Experiment aufgenommen werden. Hinzufügen jedes Rohr 2,5 µg von UBI::Luciferase interne Kontrolle Plasmid, 2,5 µg Plasmid ein GUS -Reporter und die gewünschte Menge (in der Regel 0,025 µg zu 2,5 µg) ein Effektor-Plasmid. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen zu 5 µL zu bringen.
- Bereiten Sie 1,6 µm gold-Microcarriers (siehe Tabelle der Materialien) Protokolle6veröffentlicht.
- Fügen Sie für jede Behandlung 50 µL abgehängte Microcarriers in der 1,5 mL Tube mit Plasmid DNA hinzu. Mantel der Microcarriers mit Plasmid DNA gemäß des Herstellers Protokolle6.
- Im letzten Schritt wenn Plasmid-beschichtete Microcarriers werden in 48 µL 100 % Ethanol, Pipettieren 8 μL der abgehängten Microcarriers auf jede der fünf Macrocarriers und sie an der Luft lassen trocknen.
(4) Teilchen-Bombardement von Embryoless Gerstenkörner
- Richten Sie die Partikel Bombardement-Apparat (siehe Tabelle der Materialien)6.
- Eine Berstscheibe 1550 Psi in den Sicherungsring Deckel aufgelegt und es auf dem Instrument.
- Platzieren Sie ein Macrocarrier, enthält die gewünschte Plasmid-Kombination (zusammen mit einer Stopp-Bildschirm) in das Microcarrier Start Baugruppe. Fügen Sie die Assembly in den oberen Steckplatz der Bombardierung Kammer. Legen Sie den Abstand zwischen der Berstscheibe, Beibehaltung der GAP und der Macrocarrier Deckel im standard Abstand (6 mm), und legen Sie die anhalten-Screen-Unterstützung an der (standard) mittlere Position, so dass eine Macrocarrier-Reise-Entfernung von 11 mm (Abbildung 2A).
- 8 embryoless Körner in einem engen radiale Muster (mit den dünneren enden nach innen zeigen) auf ein Filterpapier-Kreis, der sich flach auf den Deckel einer 90 mm Petrischale mit Klebeband ist zu vereinbaren (siehe Abb. 2 b).
- Legen Sie die Schale mit den Körnern in die Bombardierung Kammer, in einem Abstand von 6 cm vor dem Bildschirm anhalten.
- Evakuieren Sie die Bombardierung Kammer bis 95 kPa zu und dann bombardieren Sie die Probe.
- Übertragen Sie nach der Veröffentlichung des Vakuums bombardiert Körner auf einer beschrifteten 60 mm Petrischale mit 4 mL Imbibing Lösung enthält 1 mg/ml Chloramphenicol.
- Wiederholen Sie, bis alle die Bombardierungen durchgeführt wurden. 24 Stunden (auf einer schütteln Plattform bei 100 u/min) bei 24 ° C inkubieren.
(5) Extraktion von löslichen Proteinen aus bombardiert Körner
- Mit Pinzette, einer 60 mm Petrischale 8 bombardierten Körner entnehmen und sie auf einem Papiertuch trocken tupfen. Teilen Sie die Körner in zwei beschriftete 2,0 mL Röhrchen (4 Körner pro Röhre) jeweils 800 μl Schleifen Puffer (100 mM Na-Phosphat pH 7,2, 5 mM DVB-t, 10 µg/mL Leupeptin, 20 % Glycerin) und eine 5 mm Edelstahl Perle. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle bombardiert Körner.
- Setzen Sie die zwei Racks mit Wulst-Homogenisator (bis zu 48) 2,0 mL Röhrchen (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie die Regale an den Homogenisator.
- Schütteln Sie die Proben bei 30 Hz, für 3 Minuten.
- Der Homogenisator entfernen Sie Homogenisatoren Racks und legen Sie sie auf dem Eis (5 min) die Proben wieder abkühlen lassen.
- Montieren Sie die Regale zurück auf den Homogenisator - in der entgegengesetzten Richtung. Die Proben wieder bei 30 Hz 3 Minuten schütteln.
- Wiederholen Sie die Regale auf Eis, kühlen Schritte 5,3 bis 5,5. Dies wird auf insgesamt 12 Minuten schütteln addieren.
- Die Korn-Extrakte bei 16.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten zentrifugiert.
- Sofort nach der Zentrifugation Dekantieren klares Überstände in einen zweiten Satz von Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie jedes Rohr eine schnelle Wirbel. Speichern Sie die Rohre auf dem Eis.
- Erholen Sie nach der Übertragung des Überstands, die Stahlkügelchen aus den Pellets gewaschen und wiederverwendet werden können.
6. Messung der Luciferase Aktivität aus Korn-Extrakten
- Für jedes Rohr von Korn-Extrakt, untersucht werden, bereiten ein 12 x 75 mm Test Glasrohr mit 200 μL der Luciferase Assay Mischung (45 mM Tris Sulfat pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DVB-t, 1,5 mM EDTA, 1 mM Luciferin, 1 mM ATP).
- Der erste Test Tube 100 μL der ersten Getreide-Extrakt hinzufügen. Vortex: schnell, gut mischen. Sofort setzen Sie das Rohr in die Rohrhalter die Luminometer und schließen Sie die Tür. Wenn die Messung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Rohr aus Luminometer – ließ die Tür offen für die Platzierung der nächsten Röhre.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Proben gemessen wurden.
7. Messung des GUS-Aktivität aus Korn-Extrakten
- Geben Sie 200 μL der GUS Testpuffer (50 mM Na-Phosphat pH 7,2, 2,5 mM 4-Methylumbelliferyl - D-Glucuronid, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL Leupeptin, 20 % Methanol, 0,02 % Natriumazid) in jeweils einer 96-well-Platte.
- Platz 50 μL jeder Korn-Extrakt in das entsprechende gut. Mischen Sie mit der Spitze nach dem hinzufügen. Dichten Sie oben mit Film Abdichtung ab.
- 20 Stunden inkubieren Sie der 96-well-Platte bei 37 ° C im Dunkeln.
- Die 96-well-Platte bei 4.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten Zentrifugieren und auf Eis legen.
- Geben Sie 250 μl 0,2 M Na2CO3 in jeder schwarz 96-well-Platte.
- Hinzufügen von 6,25 μL jeder zentrifugiert GUS-Assay-Mischung in das entsprechende gut (mit 0,2 M Na2CO3) des schwarzen 96 gut Platte. Mischen Sie mit der Spitze nach dem hinzufügen. Gehören Sie Brunnen mit 6,25 μL von 10 μm, 40 μm und 100 μm 4-Methylumbelliferone als Standards.
- Die schwarze Platte in eine Platte Fluorometer und lesen Sie die Fluoreszenz des Methylumbelliferone zu. Nehmen Sie die Messwerte bei einer Erregung Wellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm. Die Gewinn des Instruments so eingestellt, dass ein gut mit 6,25 μL 40 μM 4-Methylumbelliferone und 250 μl 0,2 M Na2CO3 eine Lesung von 1000 Fluoreszenz Einheiten gibt.
8. die Datenanalyse
- Geben Sie die Werte für die Luciferase und GUS Assays in eine Tabellenkalkulation. Ausschließen von der Betrachtung einer Probe mit einer Luciferase-Lesung von weniger als 20.000 relative Lumineszenz Einheiten s-1, da dies zeigt, dass die Genkonstrukte nicht erfolgreich auf die Aleuronschicht Zellen geliefert wurden.
- Für jedes erfolgreich bombardiert Korn Extrakt (als Vertreter einer Gruppe von vier embryoless Körner), den normalisierten GUS Ausdruck aus den GUS und Luciferase Rohdaten wie folgt zu berechnen: normalisiert GUS = [(Ausdruck der GUS - GUS leer) x (2.000.000)] / (Luciferase Ausdruck – Luciferase leer).
Hinweis: Dies normalisiert sich die Menge der GUS-Aktivität, was in einem Bombardement beobachtet haben würde, die eine Luciferase-Lesung von 2.000.000 gab. - Bericht der relativen Ebene der Ausdruck eines bestimmten Reporter-Konstrukts in Anwesenheit von Effektor Konstrukte oder Hormonbehandlungen von im Vergleich zu der Ebene des Ausdrucks in der Abwesenheit von Effektoren oder Hormone getestet.
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Representative Results
Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, jeder Test Genkonstrukt in Aleuronschicht Zellen der Gerstenkörner einzuführen. Dann kann die Ebene des Ausdrucks aus dem Test-gen bequem gemessen (Abbildung 2). Die höheren Durchsatz Protokoll hier beschriebenen stark erhöht die Effizienz der Samen Schleifen und Enzym-Assay-Schritte. Diese Methode wurde zur Beurteilung der Fähigkeit der Transkription Faktor TaABF15,6 , die Expression des Gens ABA-induzierte HVA17zu aktivieren. In den hier vorgestellten repräsentativen Ergebnissen wurde ein HVA1::GUS Reporter Konstrukt in Aleuronschicht Zellen zusammen mit einer UBI::TaABF1 -Effektor-Konstrukt (Abbildung 3A) eingeführt. Während einer TaABF1/HVA1 -Verhältnis von nur 0,01 war ausreichend, um eine 3-fold Einarbeitung des HVA1 -Reporter-Gens bei fehlender exogener ABA verursachen, höhere Ebenen des Konstrukts TaABF1 führten schrittweise größere HVA1 Ausdruck in einer Dosis-abhängigen Weise (Abb. 3 bC).
Dieses experimentelle Protokoll kann auch die Verwendung von Hormonen oder anderen Verbindungen während der Post-Bombardement Inkubationszeit zu beurteilen, die Rolle von diesen Molekülen in der Regulation der Genexpression zu übernehmen. Frühere Arbeiten von anderen Forschern hat die Bedeutung der Phospholipase D in einigen Aspekten der ABA-Signal vorgeschlagen. Insbesondere hat das Produkt der Phospholipase D Tätigkeit, phosphatidic Säure, als Zwischenprodukt in einigen Antworten auf ABA8,9verwickelt. Die Tatsache, dass 1-Butanol Hemmstoff Phospholipase D (PLD), hat gezeigt, dass ABA-induzierte Genexpression in Aleuronschicht Zellen zu verhindern empfiehlt PLD ein integraler Bestandteil der ABA Signalisierung in diesem Gewebe sein könnte. Das Bombardement Protokoll wurde verwendet, um testen, ob 1-Butanol ABA induziert oder TaABF1-induzierten HVA1 Ausdruck hemmen könnte. Erwartungsgemäß konnte exogene ABA oder TaABF1 stark Expression des HVA1::GUS Reporter Konstrukts (Abbildung 3) induzieren. In beiden Fällen das Vorhandensein von 1-Butanol stark gehemmt HVA1 Induktion. Dies deutet darauf hin, dass PLD eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der HVA1 Genexpression von ABA, durch TaABF1 spielen.
Neben seiner Rolle in der Entwicklung und Keimen von Getreide ist ABA auch wichtig für die Regulierung der Stomata Blende in Blättern. In die Schließzellen der Spaltöffnungen, stimuliert die Produktion von phosphatidic Säure von Stickstoffmonoxid (NO), die wiederum durch Wasserstoffperoxid (H2O2) induziert wird. Für einige Antworten Nein und H2O2 ABA9ersetzen können. Um festzustellen, ob dies auch der Fall in Aleuronschicht Zellen ist, wurde das Bombardement-Protokoll verwendet, um testen, ob die NO Spender Natrium Nitroprusside (SNP) oder H2O2 ABA ersetzen könnte in der Hemmung des Ausdrucks der GA-induzierte Amy32b gen. Während ABA GA-induzierte Ausdruck stark hemmen könnte dem Amy32b::GUS Reporter zu konstruieren, H2O2 weder SNP bereitet signifikante Reduktion (Abbildung 3D). Diese Ergebnisse daher nicht unterstützen eine Rolle für Nein und H2O2 in Aleuronschicht ABA-Zell-Antworten.
Abbildung 1 : Tabelle für eine typische Bombardement Experiment. Die angegebene jedes Plasmid-Vorbereitung in der Röhre für jede Bombardement platziert werden. In diesem Experiment wurden vier Aufnahmen (8 Körner) für jede Behandlung zur insgesamt acht mögliche Proben (4 Körner) für jede Behandlung zu geben. Um die gleichen DNA-Gesamtkonzentration in jedem Bombardement zu erhalten, wurde ein "dummy" Effektor-Plasmid verwendet, um Ersatz für das UBI::TaBF1 -Effektor-Plasmid in einigen Fällen. Behandlung A ist eine "leere" Bombardierung die Hintergrundkonzentration der GUS und Luciferase Aktivität in Aleuronschicht Zellen herstellen. Die Ergebnisse der Bombardierung Experiments in dieser Tabelle beschriebenen sind in Abbildung 3 bgezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Diagramm des Protokolls. (A) schematische Darstellung der Beschuss Gerät. (B) Gold-Partikeln beschichtet mit einem Reporter-Konstrukt trägt der Veranstalter getestet werden, ein Effektor (falls nötig) und eine interne Kontrolle (UBI::luciferase) werden in die Gerste Aleuronschicht Zellen durch Teilchen-Bombardement eingeführt. Nach der Inkubation (in der Regel für 24 h) die Körner sind geschliffen und für GUS-Aktivität und Luciferase Aktivität untersucht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Regulierung der HVA1 und Amy32b Promotoren von TaABF1, ABA und mögliche Mediatoren der ABA Signalisierung. (A) Reporter und Effektor-Konstrukte in den Experimenten verwendet. (B) die Effektor-Konstrukt UBI::TaABF1 wurde in die Aleuronschicht Zellen mit der HVA1::GUS -Reporter und die interne Kontrolle Konstrukt (UBI::luciferase) Co bombardiert. Die Höhe der UBI::TaABF1 Effektor (bezogen auf die HVA1::GUS Reporter) variierte von 0 bis 0,1, wie unterhalb der Balken angezeigt. GUS und Luciferase Aktivitäten wurden nach 24 h Inkubation gemessen. Angezeigten Daten sind die Mittel (± SE) von biologischen 6-8 Wiederholungen. (C) die HVA1::GUS Reporter wurde in Aleuronschicht Zellen mit dem internen Kontrollsystems Konstrukt (UBI::luciferase) in das Vorhandensein oder Fehlen von Effektor Konstrukt UBI::TaABF1Co bombardiert. Die Höhe der TaABF1 Effektor (bezogen auf die Reporter) war 1.0. GUS und Luciferase Aktivitäten wurden nach 24 h Inkubation mit oder ohne 20 µM ABA und 0,4 % 1-Butanol gemessen. (D) der Amy32b::GUS -Reporter war Co bombardiert in Aleuronschicht Zellen mit dem internen Kontrollsystems Konstrukt (UBI::luciferase). GUS und Luciferase Aktivitäten wurden nach 24 h Inkubation in Anwesenheit von 1 mM GA mit oder ohne ABA 20 µM, 1 mM H2O2oder 100 µM Natrium Nitroprusside (SNP) gemessen. Werte für GUS-Aktivität beziehen sich auf den Ausdruck der Amy32b::GUS Reporter bei fehlender GA. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Einführung der Effektor gen konstruiert über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte ist eine sinnvolle Strategie für die Rolle von bestimmten Akteuren in GA/ABA Signalisierung und das daraus resultierende Hormon reguliert gen sezieren Ausdruck.
Allerdings sind die vorhandenen Protokolle für solche Experimente in Gerste Aleuronschicht Zellen2,3,4,5,6 sehr arbeitsintensiv. Jede Gruppe von bombardiert kaum Körner müssen Hand in einem Mörser und Stößel homogenisiert und die daraus resultierenden Extrakte sind individuell für GUS und Luciferase Aktivität untersucht. Die aktuellen Protokolle ist daher die Anzahl der separaten Behandlungen, die im gleichen Experiment aufgenommen werden können, und Schränken Sie die Anzahl der biologischen Replikationen, die vernünftigerweise für jede Behandlung aufgenommen werden können. Diese Einschränkungen erschweren es, umfassende und gleichzeitige Vergleiche zwischen mehreren Behandlungen durchzuführen. Solche Vergleiche können besonders schwierig sein, wenn der Unterschied in der Genexpression zwischen den Behandlungen bescheiden ist und relativ viele biologische Wiederholungen erforderlich ist, um die statistische Signifikanz zu etablieren.
Eine optimierte Protokoll wird hier vorgestellt, die teilweise die Korn-Extrakt-Vorbereitung automatisiert und der GUS assays erheblich höheren Durchsatz zu ermöglichen. Diese neue Version des Protokolls ist es möglich, eine viel größere Gesamtzahl der Proben in einem Experiment, so dass für die Einbeziehung unterschiedlicher Behandlungen pro Experiment und vieles mehr gehören für jede Behandlung repliziert. Für die Zubereitung von Getreide Extrakte nach Bombardement und Inkubation haben wir eine weitgehend automatisierte reibende Protokoll ersetzt, die eine Perle-Homogenisator nutzt, die 48 Proben gleichzeitig (in ca. 20 Minuten) verarbeiten kann. So ein einziger Ermittler bereiten lösliche Protein Auszüge aus fast 200 Proben in weniger Zeit, die es, ein Team von vier Ermittlern zur hand dauern würde mahlen nur 100 Proben. Der modifizierte GUS-Test, durchgeführt in 96-well-Platten, erfordert auch viel weniger Arbeit, die das ursprüngliche Protokoll, das einzelne Röhre eingesetzt zu Proben.
Bei der Vorbereitung der Plasmid-Mischungen für die Bombardierung (Schritt 3.1), ist es möglich, verwenden Sie ein Effektor Reporter-Verhältnis von 1,0, vor allem für Vorversuche zu bestimmen, ob eine besondere Effektor überhaupt keine Wirkung hat. Allerdings kann wegen der Stärke des Veranstalters Mais Ubiquitin (UBI), eine starke Wirkung oft mit viel niedrigere Werte beobachtet werden wie in Abbildung 2 b und in zuvor veröffentlichten Berichte4,5,6zu sehen. Andere wichtige Schritte in diesem Protokoll gehören die Samenschale aus der Gerstenkörner-Peeling und die Verwendung von sorgfältig definierten Einstellungen im Bombardement Apparat. Wenn die Samenhüllen nicht vollständig entfernt werden, wird das gold Microcarriers in der entgegengesetzten Aleuronschicht Zellen Eindringen gehindert werden. Erfolgreiche Durchführung der goldenen Microcarriers in der Aleuronschicht Zellen ist auch ziemlich abhängig von der spezifischen Art der Berstscheibe verwendet, die Position der Microcarrier Deckel, stoppen Bildschirm und Gewebe, bombardiert zu werden. Die Bedingungen berichtet hier in der Regel Ergebnis bei erfolgreichen Durchführung der Genkonstrukte (siehe Schritt 8.1) zu einem hohen Prozentsatz (≥70 %) bombardiert Gerste Getreide Proben. Es sollte erwartet werden, dass andere biologische Materialien unterschiedliche Bedingungen für die Lieferung der optimalen gen erfordern würde.
Obwohl es hier nicht beschrieben ist, wäre es möglich, weitere Straffung der Verfahren durch die Durchführung der Flash-Luciferase-Assays in 96-well-Platten. Jedoch wie die leichten Produktion von Luciferase in einem Luminometer gemessen werden muss, sofort nach dem Mischen des Proteins Extrakt mit dem Substrat (Luciferin), würde von einer Platte Flash-Luminometer mit Injektoren, ein Instrument in der Regel erforderlich, die viel mehr ist teurer als eine einzelne Röhre Luminometer.
Die repräsentativen Ergebnisse berichtet hier bestätigen, dass der Transkriptionsfaktor TaABF1 HVA1 Ausdruck in der Abwesenheit von exogenen ABA5,6aktivieren kann. Aktivierung von HVA1 durch TaABF1 oder exogene ABA war verhindert, indem die PLD-Inhibitor 1-Butanol, darauf hindeutet, dass die Produktion von phosphatidic Säure von PLD für HVA1 Aktivierung erforderlich sind. Diese Ergebnisse für die HVA1 Regelung von TaABF1 und ABA sind vergleichbar mit denen, die durch Zou Et al. 10 für die Aktivierung des HVA22 durch den Transkriptionsfaktor LtWRKY21 und ABA. Die Feststellung, dass die H2O2 oder SNP nicht als Ersatz für exogene ABA bei der Unterdrückung der Aleuronschicht Ausdruck des Amy32b, bestätigt, dass einige Aspekte des ABA-Signalisierung in Getreide unterscheiden sich von was in Stomata Schließzellen auftritt. Die Feststellung, dass H2O2 nicht Downregulate Amy32b Ausdruck tut steht im Einklang mit den Ergebnissen von Ishibashi Et Al. beobachtet 11 für Amylase Enzym-Aktivität.
Erhöhter Durchsatz-Protokoll dient nun zur Durchführung einer umfassenden Studie über die Auswirkungen der TaABF1 Phosphorylierung auf seine Fähigkeit, nachgeschaltete Genexpression regulieren. Wie die anderen Mitglieder der ABF kann Familie von Transkriptionsfaktoren bei einer Reihe von verschiedenen Standorten12,13,14,15,16, mehrere vermeintliche Phosphorylierung phosphoryliert werden Seiten auf TaABF1 geprüft werden müssen. Die höhere Durchsatz erlaubt durch dieses Protokoll ermöglicht eine große Anzahl von mutierten Versionen von TaABF1 (mit potentiell phosphorylatable Serin und Threonin Rückstände geändert) um verhört werden, jeweils mit einer großen Anzahl von biologischen repliziert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Greyson Butler und Margaret Barrett für Hilfe bei der Durchführung der Experimente, Judy Stone für die Beratung über Korn Homogenisierung und Lynn Hannum für Beratung bei Fluorometry. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOB 0443676), durch eine institutionelle Development Award (IDeA) aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant-Nummer P20GM0103423 und durch Zuschüsse unterstützt. die Colby College Division der Naturwissenschaften.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
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