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Genetics

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56728

Summary

粒子衝突の後大麦アリューロン細胞の構造において、記者から一時的な遺伝子発現の測定のため改良されたプロトコルが表示されます。96 ウェル プレート酵素試金研削自動穀物の組み合わせは、プロシージャの高スループットを提供します。

Abstract

大麦糊粉層は、植物におけるホルモン調節遺伝子発現の重要なモデル システムです。アリューロン細胞における遺伝子は発芽に必要なまたはアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながら初期苗開発はジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達のメカニズムは、酵素試金を使用して測定結果の一時的な式で粒子衝突によるアリューロン細胞にレポーター遺伝子コンストラクトを導入することで尋問することができます。改良されたプロトコルは部分的に自動化および穀物の均質化ステップと酵素試金が合理化される既存の方法よりもはるかに多くのスループットを許可します。穀物のサンプルの均質化が、自動組織ホモジナイザーを使用して行われ、GUS (β-グルクロニダーゼ) の試金は 96 ウェル プレート システムを使用して実行されます。代表的なプロトコルを使用して示唆されたホスホリパーゼ D の活性が転写因子 TaABF1 を ABA によるHVA1遺伝子発現の活性化に重要な役割を果たす可能性があります。

Introduction

オオムギ糊粉層、植物1におけるホルモン調節遺伝子発現の研究の確立されたモデル システムです。特に、発芽や苗の早期開発のために必要な遺伝子の数はアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながらジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達経路が絡み合っている ABA および逆1にいくつか GA 活性化遺伝子の発現が阻害されると。

ジョージア州/ABA シグナル伝達経路で特定俳優の役割の結果を許可する記者の構成要素の過渡式に続いて、粒子の爆撃によってエフェクター遺伝子構造の導入をされている理解のための重要な戦略下流遺伝子発現が決定されます。ガス(β-グルクロニダーゼ) などルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用エフェクター コンストラクトを受けた細胞内遺伝子発現の高感度で定量的に計測が可能します。たとえば、転写因子 TaABF15,6エフェクター コンストラクトの導入確立、ABA で誘導される遺伝子HVA1などによる TaABF1、 Amy32bなどの遺伝子の ga 処理で誘導しながら追加されなくなります。粒子衝突実験的戦略としては、ジョージア州/ABA シグナル伝達経路の多様な側面を調査する複数の研究所で使用されています。このような作業は、ga 処理で誘導2の ABA 誘導遺伝子3、活性化のため重要なプロモーター同定し、蛋白質キナーゼ4の発見につながっているし、転写因子を調節する5これらの遺伝子の表現。

既存プロトコル2,3,4,5,6パーティクルガンと一時的な遺伝子発現のそれに続く測定は、各一連の砲撃労働集約的、します。ほとんどの穀物は乳鉢と乳棒で手作業で均質化し、酵素試金は個別に実施します。この原稿は部分的に自動化および均質化手順を合理化する改善されたプロトコルを報告し、GUS のかなり多くのスループットを許可する試金の同じ実験でテストされる処置の多数を許可および/または、統計的に信頼性の高い結果を得るため、それぞれの治療のためより複製の包含。転写因子 TaABF1 および GA, ABA、およびその他の規制の分子によって規制されているHVA1Amy32bの記者構成要素の式の代表的な結果が表示されます。

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Protocol

1. エフェクターとレポーターの遺伝子の準備を構築します。

  1. 目的の開いたリーディング ・ フレームからドライブ式に構成プロモーター (例えばトウモロコシ ユビキチン、 UBI) を採用しているエフェクターの構造を構築します。たとえば、TaABF1 の5ドライブ強い恒常発現するUBI::TaABF1を含んでいるプラスミッドを構築します。
  2. ガスなどの開いたリーディング ・ フレームの上流側に配置その活動は測定されるプロモーターを含む記者構造を構築します。たとえば、 HVA1プロモーター25からの表現を測定するHVA1::GUSを含んでいるプラスミッドを構築します。
  3. 内部統制構築を構築 (例えばUBI::ルシフェラーゼ)。
  4. シリカ結合列を使用して (材料の表を参照) をプロトコル、ごとに必要な遺伝子構造の高品質のプラスミッドの準備します。紫外分光法を用いた (参照材料表)、慎重にそれぞれのプラスミッドの準備の濃度を測定します。

2. 大麦の爆撃の準備

  1. スプレッドシートの設定 (例については図 1を参照) は、殺到するプラスミド、適切なホルモン治療と実験の一部となる各処置のための他の関連情報を示します。
  2. ヒマラヤ大麦 (実験に含まれている各治療のため 40) の穀物から胚を切ったまな板と滅菌のかみそりの刃を使用します。変色または平均より大幅に小さい粒を除外します。
  3. すべての無胚穀物を 50 mL チューブに配置します。10 分の水と岩石の 40 ミリリットルを追加します。
  4. 慎重に (穀物を失うことを避けるため) に水を注ぐし、10% の漂白剤の 40 mL を加えます。20 分の岩。
  5. 漂白剤を注ぐ、40 mL の滅菌水を追加します。5 分間ロック。この滅菌水洗浄を 4 回繰り返します。
  6. ラガータイプ ソリューション (コハク酸ナトリウム 20 ミリメートル、20 ミリメートル塩化カルシウム、pH 5.0) の 40 mL を加えて、クロラムフェニ コール原液 (10 mg/mL) の 40 μ L。
  7. (クロラムフェニ コール) ラガータイプの溶液のほとんどをチューブからバーミキュ ライト プレートに転送 (材料の表を参照してください)。バーミキュ ライト プレートでろ紙の表面に粒を転送します。粒を均等に します。(しかし完全に) 部分的に穀物を維持する十分な imbibing ソリューションに注ぐが冠水しました。バーミキュ ライト板の上にふたを配置します。
  8. 蛍光灯で約 48 時間の 24 の ° C で無胚穀物を孵化させなさい。必要に応じて追加のラガータイプのソリューションを追加します。
  9. 90 mm プラスチック シャーレを開くし、逆の蓋に自体と 20 mL の皿にラガータイプ溶液 20 mL を注ぐ。クロラムフェニ コール (10 mg/mL) の 20 μ L をそれぞれに追加します。アルコールでそれらを浸すことによって細かい点鉗子の 2 つのペアを滅菌します。
  10. シャーレの蓋に無胚穀物のいくつかを配置します。鉗子を使用して、優しく各結晶粒から種皮 (透明) を削除します。穀物の滑らかな側面から種皮を除去しながら基礎となる (アリューロン) 細胞に損傷を与えない。皮をむかれた穀物を含むラガータイプ液シャーレに転送します。
  11. すべての穀物から種皮を剥離後バーミキュ ライト プレートに戻します。24 ° C で皮をむいた無胚粒は、16-20 時間インキュベートします。
  12. 砲撃の粒を使用して、直前にシャーレに濾紙の間それらの動揺によって表面の水分を削除します。

3. 砲撃のプラスミッド DNA の準備

  1. 1.5 mL チューブの衝突実験に含まれるそれぞれの治療のためにラベルを付けます。各管にUBIの 2.5 μ g を追加::ルシフェラーゼ内部統制プラスミド、 GUSレポーター プラスミドとエフェクター プラスミドの必要な量 (2.5 μ g に通常 0.025 μ g) の 2.5 μ g。5 μ L の総ボリュームをさせる水を追加します。
  2. 1.6 μ m の金 microcarriers (材料の表を参照) を準備次プロトコル6を公開しました。
  3. 各治療のプラスミド DNA を含む 1.5 mL チューブに中断された microcarriers の 50 μ L を追加します。製造元のプロトコル6によるとプラスミド DNA と microcarriers をコートします。
  4. 最後のステップでプラスミド コーティング microcarriers 48 μ L 100% エタノール, 5 macrocarriers のそれぞれに中断された microcarriers のピペット 8 μ L で中断され、空気にそれらを許可するときは乾燥します。

4. パーティクルガン無胚オオムギ子実の

  1. 粒子衝突装置 (材料の表を参照) を設定6
  2. 1550 psi 破裂ディスクにキャップを保持し、楽器でそれをマウントします。
  3. (一緒に停止画面) 目的プラスミドの組み合わせを含む macrocarrier をマイクロ ・ キャリアの進水アセンブリに配置します。アセンブリを照射室の一番上のスロットに挿入します。キャップと標準距離 (6 mm)、macrocarrier カバーの蓋を保持するラプチャー ディスクの間の距離を設定し、11 mm (図 2 a) の macrocarrier 走行距離を許可する (標準) の中間位置に停止画面サポートを配置します。
  4. 90 mm のシャーレの蓋にフラット ダウン テープろ紙円に (内側を指して薄く終了) とタイトな放射状パターンで 8 無胚穀物の手配 (図 2B参照)。
  5. 停止画面から 6 cm の距離で照射室に穀物が付いている皿を配置します。
  6. 95 kpa 照射室を避難し、サンプルを砲撃します。
  7. 真空を解放した後 1 mg/ml クロラムフェニ コールを含むラガータイプ溶液 4 mL を含むラベル 60 mm のペトリ皿に衝撃された穀物を転送します。
  8. 衝突のすべてが完了するまでを繰り返します。24 時間、24 の ° c の (100 rpm で動揺のプラットホーム) の孵化させなさい。

5 衝撃された穀物からの可溶性タンパク質抽出

  1. 鉗子を使用すると、60 mm のペトリ皿から 8 衝撃された穀物を削除し、それらをペーパー タオルの上に乾燥しみ。それぞれ 800 μ L を含む 2 つのラベル付きの 2.0 mL チューブ (管あたり 4 粒) に穀物を分ける研削バッファー (100 mM Na リン酸塩 pH 7.2, 5 mM DTT、10 μ G/ml leupeptin、20% グリセロール) と 5 mm ステンレス鋼ビード。衝撃された穀物のすべてに対してこのプロセスを繰り返します。
  2. (最大 48) 2.0 mL チューブをビード ホモジナイザーの 2 つのラックに配置 (材料の表を参照してください)。ホモジナイザーでラックをマウントします。
  3. サンプルを 30 Hz で 3 分間振る。
  4. ホモジナイザー ラックをホモジナイザーから外し、再度サンプルを冷却するアイス (5 分) の上に置きます。
  5. 反対の方向で - ホモジナイザー戻ってラックをマウントします。3 分間、30 Hz で再度サンプルを振る。
  6. 5.5 手順 5.3 を繰り返します氷の上のラックにクールします。これは揺れの 12 分の合計追加されます。
  7. 10 分の 4 ° C で 16,000 x g で穀物抽出物を遠心分離します。
  8. すぐに、遠心分離後マイクロ遠心チューブ用の 2 番目のセットにクリアの培養上清をデカントします。各管の迅速な渦を与えます。氷の上には、チューブを格納します。
  9. 上清を転送した後洗浄および再利用できるように、スチール ビーズをペレットから回復します。

6. 穀物抽出物からルシフェラーゼ活性の測定

  1. 各管に試金する穀物エキス、ルシフェラーゼ アッセイ混合物の 200 μ L を含む 12 × 75 mm ガラスの試験管を準備 (45 mM Tris 硫酸 pH 7.7、15 mM MgCl2、20 mM DTT、1.5 ミリメートルの EDTA、1 mM ルシフェリン 1 mM ATP)。
  2. 最初の試験管に最初の穀物抽出液 100 μ L を追加します。渦に迅速によく混ぜます。すぐにルミノのチューブ ホルダーに管を配置し、ドアを閉じます。測定が終了したら、ルミノ-次の管の配置のためのドアを開けっ放しからチューブを削除します。
  3. このプロセスを繰り返して、すべてのサンプルが測定されています。

7. 穀物抽出物から GUS 活性の測定

  1. 96 well プレートの各ウェルに GUS アッセイバッファー (50 mM Na リン酸塩 pH 7.2、2.5 mM-メチルウンベリフェリルグリコシド - D-グルクロニド、10 mM DTT、2 ミリメートルの EDTA、10 μ G/ml leupeptin、メタノール 20%、0.02% アジ化ナトリウム) の 200 μ L を追加します。
  2. 各穀物の場所の 50 μ L をよく対応するのに抽出します。ミックス チップを追加した後。フィルム シールの上部をシールします。
  3. 暗闇の中で 37 ° C で 96 well プレート間 20 時間インキュベートします。
  4. 10 分の 4 ° C で 4,000 x g で 96 ウェル プレートを遠心し、氷の上に置きます。
  5. 黒 96 well プレートの各ウェルに 0.2 M Na2CO3の 250 μ L を追加します。
  6. 対応する各遠心ガス分析の混合物の 6.25 μ L を追加まあ (含む 0.2 M Na2CO3) ブラック 96 ウェル プレートします。ミックス チップを追加した後。基準として 6.25 μ 10 μ M、40 μ M、100 μ M 4-メチルウンベリフェロンと井戸があります。
  7. プレート蛍光光度計に黒いプレートを置き、メチルウンベリフェロンの蛍光を読み取る。360 の励起波長での測定値を取る nm、発光波長 460 nm。40 μ M 4-メチルウンベリフェロンのも含む 6.25 μ L と 0.2 M Na2CO3の 250 μ L 1000 蛍光ユニットの読書を与えるような楽器のゲインを設定します。

8. データ分析

  1. スプレッドシートにルシフェラーゼと GUS の試金のための値を入力します。これは遺伝子構造がアリューロン細胞に正常に配信されないことを示します、20,000 の相対発光ユニットの-1より低いのルシフェラーゼ読んですべてのサンプルを対象から除外します。
  2. 各正常に衝撃された穀物の (4 つの無胚穀物のグループを表す) を抽出し、ガスとルシフェラーゼの生データから正規化されたガス式を次のように計算: GUS を正規化 = [(空白ガス - ガス式) (2,000,000) x]/(ルシフェラーゼ式-ルシフェラーゼ空白)。
    注: これは何は 2,000,000 のルシフェラーゼ読書与えた砲撃で観察されて GUS 活性量を正規化します。
  3. エフェクターの構造やエフェクターやホルモンの欠如で式のレベルを比較することによってテストされているホルモン治療の存在下で特定の報道記者構造の表現の相対的なレベルを報告します。

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Representative Results

ここで説明する手法は、大麦アリューロン細胞に任意のテスト遺伝子コンストラクトを導入する使用ことができます。実験遺伝子の表現のレベルがあります便利な測定 (図 2)。ここで大きく説明より高いスループット プロトコルは、研削のシードと酵素試金のステップの効率を高めます。このメソッドは、ABA で誘導される遺伝子HVA17をアクティブにする転写因子 TaABF15,6の能力を評価に使用されています。ここで示した代表的な結果にHVA1::GUS記者コンス トラクターはUBI::TaABF1エフェクター構成 (図 3 a) と共にアリューロン細胞に導入されました。TaABF1をしながらちょうど 0.01 のHVA1比は外因性の ABA の不在でHVA1レポーターの遺伝子の 3 倍誘導を引き起こすに十分なが、徐々 に大きいで起因したTaABF1構造のハイレベルHVA1式 (図 3 b、C) の用量依存的で。

この実験的なプロトコルは、遺伝子発現の規則のこれらの分子の役割を評価するためにポスト衝突の潜伏期間中にホルモンや他の化合物の使用を組み込む可能性がありますも。他の研究者の前の仕事は、ホスホリパーゼ D ABA シグナル伝達経路のいくつかの側面の重要性を示唆しています。具体的には、ホスホリパーゼ D の活性、ホスファチジン酸の製品は ABA8,9にいくつかの反応の中間体として関与しています。1-ブタノール、ホスホリパーゼ D (PLD) の阻害剤示されているアリューロン細胞における ABA 誘導性遺伝子の発現を防ぐために事実では、PLD が ABA シグナルこの組織の不可欠な部分をことを示唆しています。1-ブタノールが ABA 誘導または TaABF1 によるHVA1式を抑制するかどうかをテストする使用された衝突プロトコル。予想通り、外因性の ABA、または TaABF1 は、 HVA1::GUSレポーター構成 (図 3) の表現に強く引き起こすことができます。いずれにしても、1-ブタノールの存在は強くHVA1誘導を抑制しました。PLD が TaABF1 を介して、ABA によるHVA1遺伝子発現の活性化に重要な役割を果たすことが示唆されました。

発芽粒の開発とその役割に加えて、ABA も葉の気孔を制御するために重要です。一酸化窒素 (NO) によって刺激される気孔のガード細胞、ホスファチジン酸の生産を過酸化水素 (H2O2) に起因する順番。いくつかの応答のないし ABA9H2O2で代用できます。Ga 処理で誘導Amy32b の発現を抑制することで NO ドナー ニトロプルシド ナトリウム (SNP) したり H2O2 ABA の代わりにことができるかどうかをテストする使用された衝突プロトコルこれがまたアリューロン細胞の場合であるかどうかを決定するには遺伝子。ABA が強く ga 処理で誘導式を抑制しながらAmy32b::GUS レポーターを構築の H2O2も SNP が大幅な減少 (図 3 D) を引き起こされます。これらの結果、したがって、ロールは、サポートしませんなし、H2O2アリューロン細胞 ABA 応答。

Figure 1
図 1: 典型的な衝突実験のためのスプレッドシートです。各砲撃の管に配置するそれぞれのプラスミッドの準備の量が示されます。この実験では 4 ショット (8 粒) はそれぞれの治療のため 8 可能なサンプル (4 粒) の合計を与えるためそれぞれの治療のために使用されました。各衝突の同じ DNA 濃度を維持するためにいくつかのケースでUBI::TaBF1エフェクター プラスミドの代わりに「ダミー」エフェクター プラスミッドが使用されました。治療は、アリューロン細胞におけるガスとルシフェラーゼ活性のバック グラウンド レベルを確立する「空白」砲撃です。このスプレッドシートに記載されている衝突実験の結果は図 3 bに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: プロトコルのダイアグラム(A)照射装置の模式図。(B)テストするプロモーター、エフェクター (必要な場合)、および内部統制 (UBI::luciferase) を運ぶ記者コンストラクトをコーティングした金粒子は、粒子の衝突によって大麦アリューロン細胞に導入されます。(通常は 24 h) 後、穀物は地面、GUS 活性のルシフェラーゼ活性アッセイします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: TaABF1、ABA、ABA シグナル伝達経路の潜在的な仲介者、 HVA1Amy32bのプロモーターの規則。実験で使用される(A)記者とエフェクターの構造。(B)エフェクター構築UBI::TaABF1は共同HVA1::GUS記者と内部統制構築 (UBI::luciferase) アリューロン細胞に衝撃されました。バーの下に示されているように、( HVA1::GUS記者) を基準にしてUBI::TaABF1エフェクターの量は 0.1、0 から変化。培養 24 時間後ガスとルシフェラーゼの活動を測定しました。表示されるデータは、6-8 生物学的複製の手段 (± SE) です。(C) HVA1::GUS記者は、エフェクターの構造UBI::TaABF1の有無で内部統制構築 (UBI::luciferase) でアリューロン細胞に衝撃共同されました。TaABF1 エフェクター (レポーター) の相対量は 1.0 でした。潜伏 20 μ M と 0.4 %1-ブタノールの有無の 24 h 後 GUS とルシフェラーゼの活動を測定しました。(D) Amy32b::GUS記者が共同内部統制構築 (UBI::luciferase) でアリューロン細胞に衝撃だった1 mM GA 20 μ M の ABA、1 mM H2O2、または 100 μ M のニトロプルシド ナトリウム (SNP) の有無の存在下で培養 24 時間後ガスとルシフェラーゼの活動を測定しました。GUS 活性の値は、ジョージア州の不在でAmy32b::GUS記者の表現基準この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

パーティクルガンによるエフェクター遺伝子の導入構築、記者構造の過渡式続いて GA/ABA シグナル伝達経路と結果ホルモン調節遺伝子で特定の俳優の役割を解剖するための重要な戦略式です。
ただし、大麦アリューロン細胞2,3,4,5,6でこのような実験を行うための既存のプロトコルは非常に労働集約的であります。各グループはほとんどさらされている穀物は、乳鉢と乳棒、均質化の手をする必要があります、結果の抽出物は、ガスとルシフェラーゼ活性のため個別に試金されます。現在のプロトコルは、したがって同じ実験に含めることができる、各治療に含めることができる合理的に生物の複製の数を制限する別の治療数を制限します。これらの制限は複数の治療法を比較する包括的かつ同時遂行がより難しくそれ。このような比較は、治療の間の遺伝子発現の違いはささやかな統計的有意性を確立する生物的複製の比較的大きい数が必要される場合特に困難であります。

合理化されたプロトコルがここで紹介は穀物抽出準備を部分的に自動化してスループットが大幅に向上できるように GUS の試金。実験 1 よりさまざまな治療法の両方を含めることを可能にする、実験のサンプルの多くに大きい合計数を含むように実行可能な各治療のため複製プロトコルがのこの新しいバージョンでは。砲撃とインキュベーション後穀物エキスの準備が、同時に (約 20 分) で 48 サンプルを処理できるビーズ ホモジナイザーを利用して主として自動研削プロトコル置き換えられます。単一の調査官が可溶性タンパク質約 200 からの抽出物を準備することがこのように、サンプルを 4 つの調査官のチームが手にかかる以下の時間のみ 100 サンプルを挽きます。96 ウェル プレートで実施変更のガス分析では、一つ一つのチューブを採用した元のプロトコルを試金するはるかに少ない労働も必要です。

爆撃 (ステップ 3.1) プラスミドの混合物を準備する、記者比 1.0 では、特に特定のエフェクターに影響があるかどうかを決定するための予備的なテストのためのエフェクターを使用することが可能です。ただし、トウモロコシ ユビキチン (UBI) プロモーターの強さのための強力な効果よく観察できますはるかに低い比率で以前に発行されたレポート4,5,6図 2 bに見られるように。このプロトコルの他の重要なステップは、照射装置とオオムギの穀物から種皮の剥離との慎重に定義された設定を使用があります。種皮は完全に削除されません、金 microcarriers は内在のアリューロン細胞を入力できなくなります。アリューロン細胞にゴールドの microcarriers の配信の成功はかなり使用ラプチャー ディスク、マイクロ ・ キャリア カバーの蓋、停止画面、および殺到するティッシュの位置の特定の種類に依存しても。条件結果を報告したここで通常配信の成功に (ステップ 8.1 参照) 遺伝子の構造物の衝撃された大麦穀物のサンプルの割合が高い (70%) に。他の生物学的材料、最適な遺伝子デリバリーのさまざまな条件を必要とするはず。

それがここで説明はしませんが、96 ウェル プレートでフラッシュ ルシフェラーゼ アッセイを行うことにより手順をさらに合理化することが可能でしょう。しかし、基板 (ルシフェリン) 蛋白質のエキスを混合した後すぐに、ルミノのルシフェラーゼから光の生産を測定する必要があります、これ必要になります、板フラッシュ ルミノ式インジェクター、大いに多くは楽器の使用単管ルミノよりも高価です。

ここで報告された代表的な結果を確認転写因子 TaABF1 は外因性 ABA5,6の不在でHVA1式をアクティブ化できます。HVA1 TaABF1 または外因性の ABA での活性化は、PLD 阻害剤 1-ブタノール、PLD によるホスファチジン酸の生産HVA1の活性化のために必要なことを示唆によって防がれました。TaABF1 と ABA によるHVA1制御のためのこれらの結果は、鄒によって得られたものに似ています。10 HVA22転写因子 LtWRKY21、ABA の活性化のため。H2O2または SNP が、糊粉層、Amy32bの発現抑制に及ぼす ABA の代用しないでください検索は、ABA シグナルの穀物のいくつかの側面が気孔細胞で発生する内容とは異なることを確認します。H2O2はレセプター Amy32b 表現ではなく、見つけることは石橋によって観測結果と一致してアミラーゼの酵素活性の11

スループットを向上させるプロトコルは、下流遺伝子の発現を調節する機能の TaABF1 リン酸化の影響の包括的な調査を実施する現在使用されています。ABF の他のメンバーとしての転写因子が異なるサイト12,13,14,15,16、複数の推定されるリン酸化の数でリン酸化します。TaABF1 上のサイトをテストする必要があります。このプロトコルによって許可されるスループットは多数の (潜在的 phosphorylatable セリンとスレオニン残基の変更) TaABF1 の突然変異体のバージョンが許可されますレプリケートされます尋問される各生物の数が多い。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、グレイソン バトラーとマーガレット ・ バレットを実験、ジュディ石粒の均質化についてのアドバイスを蛍光についてのアドバイスをリン ・ ハナムの遂行に助けに感謝します。この作品は全米科学財団 (IOB 0443676) 支えられた制度開発賞 (アイデア) から国立科学研究所の一般医療 [許可番号 P20GM0103423、健康の国民の協会からの補助金コルビー大学自然科学部

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit Sigma NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Himalaya barley grains / / A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate Sigma S2378 Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution home made / 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol Sigma C0378 Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite Fisher NC0430369 Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm) Whatman 1001 090 Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates home made / Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed) Fisher 13-812-42 Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point) Fisher 12-000-122 Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm) BioRad 1652264
macrocarriers BioRad 1652335
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine Sigma S0266 Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi) BioRad 1652331
stopping screens BioRad 1652336
macrocarrier holders BioRad 1652322
Biolistic particle delivery system BioRad PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic Sigma S9763 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2 home made / Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT) Sigma 43819 Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin Sigma L2884 Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol Sigma G5516 Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer home made / Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm) Qiagen 69989
2.0 mL tubes Eppendorf 22363352 This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser) Qiagen 85210
12mm x 75 mm glass test tubes Fisher
luciferin Goldbio LUCK-100 Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP Sigma A7699 Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base Sigma T1503 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid Sigma 258105 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7 home made / Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride Sigma M9397 Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB) home made / Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture home made / Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius) Berthold /
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Goldbio MUG1 Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide Sigma S8032 Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard) Fisher 12565501
GUS assay buffer home made / Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film USA Scientific 2921-1000
96 well plates (black) Costar 3916
sodium carbonate Sigma S7795 Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader Bio-Tek FLX-800

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References

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遺伝学、問題 133、アブシジン酸、糊粉層、大麦、ジベレリン、粒子衝突、一過性発現
スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定
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Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo, D. S., Keyser, B. R., Johnson, R. R. Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput. J. Vis. Exp. (133), e56728, doi:10.3791/56728 (2018).

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