Summary
향상 된 프로토콜은 입자 사격 후 보 리 aleurone 세포에서 기자 구문에서 일시적인 유전자 발현의 측정에 대 한 제공 됩니다. 96 잘 접시 효소 분석 실험 연 삭 자동화 된 곡물의 조합을 절차에 대 한 높은 처리량을 제공 합니다.
Abstract
보 리 곡물의 aleurone 레이어 식물에서 호르몬 통제 유전자 발현에 대 한 중요 한 모델 시스템입니다. Aleurone 세포에서 유전자 발 아에 필요한 또는 스트레스 응답 연관 유전자 abscisic 산 (ABA)에 의해 활성화 되는 동안 초기 종묘 개발 지 베 렐 린 (GA)에 의해 활성화 됩니다. GA와 ABA 신호 메커니즘은 효소 분석 실험을 사용 하 여 측정 결과 과도 식으로 입자 사격을 통해 aleurone 세포로 리포터 유전자 구조를 도입 하 여 심문 수 있습니다. 향상 된 프로토콜을 부분적으로 자동화 하 고 간소화 곡물 균질 단계 및 효소 분석 실험 보고는 기존의 방법 보다 훨씬 더 많은 처리량을 허용. 균질 곡물 샘플 자동된 조직 균질 화기를 사용 하 여 밖으로 실행 되 고 거 스 (β-glucuronidase) 분석 실험 96 잘 접시 시스템을 사용 하 여 실시 됩니다. 프로토콜을 사용 하 여 대표 결과 phospholipase D 활동 ABA, 녹음 방송 요인 TaABF1 통해 HVA1 유전자 식의 활성화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 것이 좋습니다.
Introduction
보 리 aleurone 레이어 식물1호르몬 통제 유전자 발현의 학문을 위한 기초가 튼튼한 모델 시스템입니다. 특히, 스트레스 응답 연관 유전자 abscisic 산 (ABA)에 의해 활성화 되는 동안 발 아 또는 초기 종묘 개발에 필요한 유전자의 수 지 베 렐 린 (GA)에 의해 활성화 됩니다. GA와 ABA 신호 경로 고리로 연결 되었다는, 일부가 활성화 유전자의 표정을 ABA와 반대로1저해로.
조지아/ABA 신호에 특정 배우의 역할 입자 사격, 기자 구문에 효과 허용 하는 과도 식으로 다음을 통해 이펙터 유전자 구조 도입 되었습니다 이해를 위한 중요 한 전략 다운스트림 유전자 식 결정 됩니다. 거 스 (β-glucuronidase) 등 Luciferase 리포터 유전자를 사용 하 여 특별히 이펙터 구조 받은 셀 내에서 유전자 발현의 과민 하 고 양적 측정을 수 있습니다. 예를 들어 녹음 방송 요인 TaABF15,6 인코딩 이펙터 구문의 도입 HVA1 같은 ABA 유발 유전자는 Amy32b 같은 유전자가 유도 하는 동안 TaABF1에 의해 유도 된 설립 억 누른 다. 입자 사격 실험 전략으로 조지아/ABA 신호의 다양 한 측면을 조사 하기 위해 여러 실험실에 의해 사용 되었습니다. 같은 일이 유도2 및 ABA 유도 유전자3, 활성화에 대 한 중요 한 발기인 요소의 식별 하 고 단백질 kinases4 의 발견을 주도하 고 있다 및 녹음 방송 요인5 규제는 이 유전자의 표현입니다.
기존 프로토콜2,3,,45,입자 사격 및 일시적인 유전자 발현의 후속 측정에 대 한6 는 아주 노동 집약, 각 세트의 포 격으로 간신히 곡물은 박격포 및 방 앗 공이에서 손으로 무 균 그리고 효소 분석 실험 개별적으로 수행 됩니다. 이 원고를 보고 부분적으로 자동화 하 고 균질 단계를 능률화 하는 향상 된 프로토콜 및 동일한 실험에서 테스트 하는 치료의 많은 수를 허용 훨씬 더 많은 처리량을 허용 하도록 분석 실험은 거 스는 또는 더 많은 통계적으로 강력한 결과를 얻을 각 치료에 대 한 더 많은 복제의 포함. 대표 결과 GA, ABA, 및 다른 규제 분자 뿐만 아니라 녹음 방송 요인 TaABF1에 의해 통제 하는 HVA1 및 Amy32b 기자 구문, 표현에 대 한 표시 됩니다.
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Protocol
1. 준비 이펙터와 취재 원 유전자의 구성
- 원하는 열려있는 독서 프레임에서 드라이브 식 제정 발기인 (예: 옥수수 유비퀴틴, UBI)를 사용 하는 이펙터 구조를 빌드하십시오. 예를 들어 드라이브 TaABF15의 강한 제정 식 UBI::TaABF1 를 포함 하는 플라스 미드를 생성 합니다.
- 거 스같은 열려있는 독서 프레임의 업스트림 배치 기자 구조 측정, 그 활동은 발기인을 포함 하는 빌드. 예를 들어 HVA1::GUS HVA1 발기인2,5에서 측정을 포함 하는 플라스 미드를 생성 합니다.
- 내부 제어 구조를 구축 (예: UBI::luciferase).
- 실리 카 바인딩 열을 사용 하 여 프로토콜 ( 재료의 표참조), 각 필요한 유전자 구조에 대 한 높은-품질 플라스 미드를 준비. 자외선 분광학을 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 신중 하 게 각 플라스 미드 준비의 농도 측정.
2입니다. 보 리 곡물의 준비 사격에 대 한
- 스프레드시트를 설정 (예를 들어 그림 1 참조) 포 격 될 것 이다 플라스 미드, 적절 한 호르몬 치료 및 실험의 일부가 될 것입니다 각 치료에 대 한 기타 관련 정보를 나타내는.
- 히말라야 보 리는 (실험에 포함 하는 각 치료에 대 한 40)의 곡물에서 배아를 잘라 절단 보드를 사용 하 여 살 균 면도날. 변색 또는 실질적으로 평균 보다 작은 알갱이 제외 합니다.
- 50 mL 튜브에 모든 embryoless 곡물을 놓습니다. 10 분 동안 물과 바위의 40 mL를 추가 합니다.
- 신중 하 게 ()을 피하기 위해 곡물을 잃고 물에 밖으로 부 어과 10% 표 백제의 40 mL를 추가. 20 분 동안 바위입니다.
- 표 백제에 밖으로 부 어과 메 마른 물 40 mL를 추가. 5 분 동안 바위입니다. 이 메 마른 물 세척 4 번 더 반복 합니다.
- 40 mL Imbibing 솔루션 (20 m m 나트륨 호박, 20 m m 칼슘 염화 물, pH 5.0)의 추가 페니 재고 솔루션 (10 mg/mL)의 40 μ.
- 질 석 접시에 튜브에서 Imbibing 솔루션 (페니)의 대부분을 전송 ( 재료의 표참조). 그런 다음 전송 Vermiculite 접시에 젖은 필터 종이의 표면에 곡물. 곡물에 밖으로 균등 하 게 퍼졌다. 충분 한 imbibing 솔루션을 부분적으로 (하지만 완전히)는 곡물을 계속 부 어 침수. 질 석 판 위에 뚜껑을 놓습니다.
- 형광 조명에 대해 48 h 24 ° C에서 embryoless 곡물을 품 어. 필요에 따라 추가 Imbibing 솔루션을 추가 합니다.
- 90 m m 플라스틱 페 트리 접시를 열고 거꾸로 뚜껑으로 자체와 20 mL 접시에 Imbibing 솔루션의 20 mL를 붓는 다. 각 페니 (10 mg/mL)의 20 μ를 추가 합니다. 알코올에 그들을 담거 서 좋은 포인트 집게의 두 쌍을 소독.
- 페 트리 접시의 뚜껑으로 embryoless 곡물의 몇 가지를 놓습니다. 부드럽게는 집게를 사용 하 여 각 곡물에서 (투명) 씨 외 투를 제거 합니다. 곡 식의 부드러운 측면에서 씨 외 투를 제거 하는 동안 기본 (aleurone) 세포를 손상 하지 마십시오. 벗 겨 곡물 Imbibing 솔루션을 포함 하는 배양 접시에 전송.
- 모든 곡물의 씨앗 외 투, 필 링 후 Vermiculite 접시에 그들을 반환 합니다. 16-20 시간 24 ° C에서 벗 겨 embryoless 곡물을 품 어.
- 그냥 사용 하기 전에 곡물 폭격에 대 한, 페 트리 접시에 필터 논문 사이 그들을 흔들어 표면 수 분을 제거 합니다.
3입니다. 사격에 대 한 플라스 미드 DNA의 준비
- 1.5 mL 튜브 사격 실험에 포함 될 각 치료에 대 한 레이블을 지정 합니다. 각 튜브를 유비의 2.5 µ g 추가::luciferase 내부 제어 플라스 미드, 거 스 기자 플라스 미드와 이펙터 플라스 미드의 원하는 금액 (2.5 µ g 일반적으로 0.025 µ g) 2.5 µ g. 총 볼륨 5 µ L을가지고 물을 추가 합니다.
- 1.6 µ m 금 microcarriers ( 재료의 표참조)를 준비 다음 게시 프로토콜6.
- 각 치료에 대 한 플라스 미드 DNA를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 일시 중단 된 microcarriers의 50 µ L를 추가 합니다. 제조 업체의 프로토콜6에 플라스 미드 DNA와 microcarriers를 코트.
- 마지막 단계에서 플라스 미드 코팅 microcarriers 48 µ L 100% 에탄올, 5 macrocarriers의 각각에 정지 microcarriers의 피펫으로 8 μ에에서 일시 중단 되 고 공기에 그들을 허용 하는 때 건조.
4. Embryoless 보 리 곡물의 입자 사격
- ( 재료의 표참조) 입자 사격 장치 설정6.
- 1550 psi 파열 디스크를 고정 캡에 놓고 악기에 마운트 합니다.
- (정지 화면) 함께 원하는 플라스 미드 조합을 포함 하는 macrocarrier microcarrier 실행 어셈블리에 놓습니다. 어셈블리 사격 챔버의 상단 슬롯에 삽입 합니다. 모자 및 표준 거리 (6 m m)에서 macrocarrier 커버 뚜껑 파열 디스크 사이의 거리를 설정 하 고 수 있도록 11 밀리미터 (그림 2A)의 macrocarrier 여행 거리 (표준) 중간 위치에서 정지 화면 지원 장소.
- 정렬 꽉 방사형 패턴에서 8 embryoless 곡물 (얇은 끝 안쪽으로 가리키는) 평면 90 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 아래로 녹화 필터 종이 동그라미에 ( 그림 2B참조).
- 중지 화면에서 6 cm의 거리에서 사격 챔버로 곡물을 가진 접시를 놓습니다.
- 95 인민군을 폭격 챔버를 철수 하 고 샘플을도 배.
- 진공을 해제 한 후 포 격하 곡물 Imbibing 솔루션 페니의 1 mg/ml를 포함 4 mL를 포함 레이블이 60 m m 페 트리 접시에 전송.
- 사격의 모두 완료 될 때까지 반복 합니다. 24 시간 동안 24 ° c (100 rpm에서 떨고 플랫폼)에서 품 어.
5. 포 격하 곡물에서 수용 성 단백질의 추출
- 집게를 사용 하 여, 60 mm 페 트리 접시에서 8 포 격하 곡물을 제거 하 고 그들을 종이 타월에 건조 되 리. 나눌 알갱이 두 레이블이 2.0 mL 튜브 (튜브 당 4 곡물) 각 800 μ 연 삭 버퍼 (100 m m 나 인산 염 pH 7.2, 5mm DTT, 10 µ g/mL leupeptin, 20% 글리세롤)와 5 m m 스테인리스 구슬. 포 격하 곡물의 모든에 대해이 프로세스를 반복 합니다.
- (최대 48) 2.0 mL 튜브 비드 균질 화기의 두 개의 선반에 배치 ( 재료의 표참조). 랙에 균질 화기에 탑재 합니다.
- 3 분 30 Hz에서 샘플을 흔들어.
- 균질 화기에서 균질 화기 선반을 제거 하 고 샘플을 다시 얼음 (5 분)에 그들을 배치.
- 균질 화기-반대 방향에서에서 다시 랙에 탑재 합니다. 흔들어 샘플 다시 30 Hz에서 3 분.
- 그런 다음 얼음, 랙 냉각 5.5 단계 5.3를 반복. 이 떨고의 12 분의 총에 추가 됩니다.
- 10 분간 4 ° C에서 16000 x g에서 곡물 추출 물 원심
- 즉시 후에 원심 분리, microcentrifuge 튜브의 두 번째 세트에 분명 supernatants를 가만히 따르다. 빠른 소용돌이 각 튜브를 제공 합니다. 얼음에 튜브를 저장 합니다.
- 세척 하 고 다시 사용할 수 있도록는 상쾌한 전송 후 펠 릿에서 강철 구슬을 복구 합니다.
6. 곡물 추출 물에서 Luciferase 활동의 측정
- 분석 수로 곡물 추출의 각 관에 대 한 준비 Luciferase 분석 결과 혼합물의 200 μ를 포함 12 m m x 75 m m 유리 테스트 튜브 (45 m m Tris 황산 pH 7.7, 15 m m MgCl2, 20 mM DTT, 1.5 m m EDTA, 소 1 m m, 1mm ATP).
- 첫 번째 분석 결과 튜브를 첫 번째 곡물 추출 물 100 μ를 추가 합니다. 잘 혼합을 신속 하 게 소용돌이. 즉시 는 루미 노의 튜브 홀더 튜브를 삽입 하 고 문을 닫습니다. 측정 완료 되 면 다음 튜브의 배치를 위해 문을 열어두고-루미 노에서 튜브를 제거 합니다.
- 이 프로세스를 반복 하 여 모든 샘플 측정 되었습니다.
7. 곡물 추출 물에서 GUS 활동의 측정
- 96 잘 접시의 각 음에 거 스 분석 결과 버퍼 (50 m m 나 인산 염 pH 7.2, 2.5 m m 4-methylumbelliferyl-D glucuronide 10mm DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptin, 20% 메탄올, 0.02% 나트륨 아 지 드)의 200 μ를 추가 합니다.
- 각 곡물의 장소 50 μ 잘 해당 추출 합니다. 추가 팁과 혼합. 씰링 필름으로 최고 봉인.
- 20 시간 동안 어둠 속에서 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어.
- 96 잘 접시 4 ° C에서 4000 x g에서 10 분간 원심 하 고 얼음에 그것을 배치.
- 블랙 96 잘 접시의 각 음에 0.2 M 나2CO3 의 250 μ를 추가 합니다.
- 해당 각 centrifuged 거 스 분석 결과 혼합물의 6.25 μ 추가 잘 (포함 0.2 M 나2CO3) 블랙 96 잘 접시. 추가 팁과 혼합. 기준으로 10 μ M, 40 μ M, 그리고 100 μ M 4-methylumbelliferone의 6.25 μ와 웰 스를 포함 한다.
- 플레이트 fluorometer에 검은 접시를 놓고 methylumbelliferone의 형광을 읽고. 360의 여기 파장에서 수치를가지고 nm 그리고 460의 방출 파장 nm. 40 μ M 4-methylumbelliferone의 잘 포함 6.25 μ와 0.2 M 나2CO3 의 250 μ 제공 1000 형광 단위의 읽기 같은 악기의 이득을 설정 합니다.
8. 데이터 분석
- 스프레드시트에 luciferase 및 거 스 분석 실험에 대 한 값을 입력 합니다. 이 유전자 구조 aleurone 셀에 성공적으로 배달 되지 않은 나타냅니다 모든 샘플의 20000 상대 발광 단위의-1보다 낮은 luciferase 읽기와 고려 대상에서 제외 합니다.
- 각 성공적으로 포 격하 곡물 추출 (4 embryoless 곡물의 그룹 대표), 다음과 같이 원시 거 스와 luciferase 데이터에서 정규화 된 거 스 식 계산: 거 스 정규화 = [(거 스 식-거 스 빈) (2000000) x] / (luciferase 식-빈 luciferase)입니다.
참고:이 무슨 2000000의 luciferase 독서를 준 사격에서 관찰 되어 거 스 활동의 금액을 정규화 합니다. - 이펙터 구문 또는 호르몬 치료 이펙터 또는 호르몬의 부재에 식의 수준에 비교 하 여 테스트 되 고 있을 때 특정 기자 구문 식의 상대적 수준을 보고 합니다.
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Representative Results
여기에 설명 된 기술은 보 리 곡물의 aleurone 세포로 어떤 테스트 유전자 구조를 소개 사용할 수 있습니다. 테스트 유전자 발현의 수준 다음 있을 수 있습니다 (그림 2)를 편리 하 게 측정. 높은 처리량 프로토콜 크게 여기에 설명 된 연 삭 씨앗과 효소 분석 실험 단계의 효율성을 증가 합니다. 이 방법은 HVA17ABA 유도 유전자 표현의 활성화 녹음 방송 요인 TaABF15,6 의 능력을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 여기에 제시 하는 대표적인 결과 HVA1::GUS 기자 구문 UBI::TaABF1 이펙터 구조 (그림 3A)와 aleurone 세포에 도입 되었다. 동안 TaABF1/HVA1 비율의 단지 0.01 HVA1 취재 원 유전자의 3 유도 exogenous ABA의 부재에서 발생 하기에 충분 한, 점차적으로 더 큰 귀착되 었 다 TaABF1 구조물의 상부 HVA1 는 복용량-의존 방식 (그림 3BC)에서 식.
이 실험 프로토콜 또한 유전자 발현의 규칙에 이러한 분자의 역할을 평가 하기 위해 사후 사격 인큐베이션 기간 동안 호르몬 또는 다른 화합물의 사용을 통합할 수 있습니다. 다른 조사자에 의해 이전 작업은 ABA 신호의 몇 가지 측면에서 phospholipase D의 중요성을 제안 했다. 특히, phospholipase D 활동, phosphatidic 산의 제품 일부 응답 ABA8,9에 있는 중간으로 연루 되었습니다 했다. 그 1-butanol, phospholipase D (PLD)의 억제제 보였다 aleurone 셀에 ABA 유발 유전자 발현을 방지 하기 위해 사실 PLD ABA 신호이 조직에서의 중요 한 부분이 될 수도 있습니다 제안 합니다. 사격 프로토콜 1 butanol ABA 유도 또는 유도 하는 TaABF1 HVA1 식 억제 수 있는지 여부를 테스트를 사용 되었습니다. 예상 했던 대로, exogenous ABA 또는 TaABF1 HVA1::GUS 기자 구조 (그림 3C)의 표현을 유도 강하게 수 있습니다. 두 경우 모두, 1 butanol의 존재는 강하게 HVA1 유도 억제. 이것은 PLD TaABF1 통해 ABA에 의해 HVA1 유전자 발현의 활성화에 중요 한 역할을 재생할 수 있는 제안.
개발 하 고 출 아 곡물의 역할, ABA은 또한 잎 stomatal 조리개 조절 중요 합니다. Stomata의 가드 셀에 phosphatidic 산의 생산은 산화 질소 (NO)에 의해 자극을 차례로 과산화 수소 (H2O2)에 의해 유발 됩니다. 일부 응답 없음 및 H2O2 는 ABA9에 대 한 대체할 수 있습니다. 또한 aleurone 셀의 경우 인지를 확인 하려면 사격 프로토콜 아니 기증자 나트륨 nitroprusside (SNP) 또는 H2O2 억제가 유도 된 Amy32b의 표현에 ABA에 대 한 대체할 수 있는지 여부를 테스트에 사용 된 유전자. ABA가 유도 식 억제 강력 하 게 수 있는 동안 Amy32b::GUS 기자 구성 에 대 한 H2O2 도 SNP 발생 어떤 뜻깊은 감소 (그림 3D). 이러한 결과 따라서 지원 하지 않는 역할 없음에 대 한 및 aleurone 셀 ABA 응답에서 H2O2 .
그림 1 : 일반적인 사격 실험에 대 한 스프레드시트. 각 사격에 대 한 튜브에 삽입 되어야 합니다 각 플라스 미드 준비의 양을 표시 됩니다. 이 실험에서 4 타 (각 8 곡물)는 각 치료에 대 한 총 8 개의 가능한 샘플 (각 4 곡물)를 각 치료를 위해 사용 되었다. 각 사격에 동일한 총 DNA 농도 유지, "더미" 이펙터 플라스 미드는 어떤 경우에 UBI::TaBF1 이펙터 플라스 미드에 대 한 대체를 사용 합니다. 치료 A aleurone 세포에 거 스와 luciferase 활동의 배경 수준을 설정 하는 "빈" 사격 이다. 이 스프레드시트에 설명 된 사격 실험의 결과 그림 3B에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 프로토콜의 다이어그램. 사격 장치의 (A) 회로도 (B) 테스트할 발기인는 이펙터 (필요한 경우), 및 내부 제어 (UBI::luciferase)을 들고 기자 구문으로 코팅 된 금 입자 입자 사격에 의해 보 리 aleurone 세포로 소개 된다. (일반적으로 24 시간)를 위한 부 화 후 곡물 지상 고 거 스 활동과 luciferase 활동에 대 한 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : TaABF1, ABA, ABA 신호의 잠재적인 중재자에 의해 HVA1 와 Amy32b 발기인의. (A) 기자와 이펙터 구조 실험에 사용. (B) 이펙터 구문 UBI::TaABF1 공동 HVA1::GUS 기자와 내부 제어 구조 (UBI::luciferase) aleurone 세포로 폭격 했다. UBI::TaABF1 이펙터 ( HVA1::GUS 기자) 기준의 금액 막대 아래에 표시 된 대로 0.1, 0에서 다양 한. 거 스와 luciferase 활동은 외피의 24 시간 후 측정 했다. 표시 된 데이터는 6-8 생물 복제의 수단 (± SE). (C) HVA1::GUS 기자는 공동 폭격 내부 제어 구조 (UBI::luciferase)와 aleurone 세포로 이펙터 구문 UBI::TaABF1의 유무에서. (기자)를 기준으로 TaABF1 이펙터의 양은 1.0 이었다. 거 스와 luciferase 활동 20 µ M ABA 및 0.4 %1-butanol 없이 외피의 24 시간 후 측정 했다. (D) Amy32b::GUS 기자 공동 내부 제어 구조 (UBI::luciferase)와 aleurone 세포로 포 격하 했다. 거 스와 luciferase 활동 1 m m가 없어도 20 µ M ABA, 1 m m H2O2또는 100 µ M 나트륨 nitroprusside (SNP)의 외피의 24 시간 후 측정 했다. 조지아의 부재에서 Amy32b::GUS 기자의 표현에 상대적으로 거 스 활동에 대 한 값은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이펙터 유전자의 도입 구성 입자 사격을 통해, 해 부 결과 호르몬 조절 유전자와 조지아/ABA 신호에 특정 배우의 역할에 대 한 귀중 한 전략은 과도 식 기자 구문 뒤 식입니다.
그러나, 보 리 aleurone 셀2,3,,45,6 에서 같은 실험 수행에 대 한 기존 프로토콜은 매우 노동 집약 이다. 각 그룹의 폭격 겨우 곡물 손 박격포와 유 봉, 무 균 이어야 하며 결과 추출 거 스와 luciferase 활동에 대 한 개별적으로 분석 됩니다. 현재 프로토콜은 따라서 같은 실험에 포함 될 수 있으며 합리적으로 각 치료에 대 한 포함 될 수 있는 생물 복제의 수를 제한 하는 별도 처리의 수를 제한 합니다. 이러한 제한은 어려워질 더 포괄적이 고 동시 비교 여러 치료를 실시 하. 치료 사이의 유전자 발현의 차이 겸손 하 고 생물 복제의 비교적 큰 숫자 통계적 의미를 확립 하는 데 필요한 경우 이러한 비교 특히 어려울 수 있습니다.
효율적인된 프로토콜은 여기에 제시 된 곡물 추출 물 준비를 부분적으로 자동화 하 고 실질적으로 더 높은 처리량을 허용 하도록 분석 실험은 거 스. 그것을 실현 실험, 실험, 그리고 더 많은 다른 치료 모두 포함에 대 한 허용에 훨씬 더 큰 총 수의 샘플을 포함 하는 각 치료에 대 한 복제는 프로토콜의이 새로운 버전. 사격과 부 화 후의 곡물 추출 물 준비에 대 한 우리 크게 자동된 연 삭 프로토콜을 동시에 (약 20 분)에서 48 샘플을 처리할 수 있는 구슬 균질 화기를 활용 하 여 대체 했습니다. 따라서, 단일 탐정 준비할 수 있는 수용 성 단백질 거의 200에서 추출 되 4 수 사관의 팀 손에 적은 시간에 샘플만 100 샘플 갈기. 96 잘 접시에서 수정 된 거 스 분석 결과 또한 개별 튜브 고용 원래 프로토콜 분석 실험 훨씬 적은 노동을 필요 합니다.
사격 (3.1 단계) 플라스 미드 혼합물 준비, 기자 비율이 1.0, 특히 경우 특정 이펙터 효과가 전혀 결정 하 예비 검사의 이펙터를 사용 하 여 가능 하다. 그러나, 옥수수 유비퀴틴 (UBI) 발기인의 강도 때문에 강한 효과 자주 관찰할 수 있습니다 훨씬 낮은 비율, 그림 2B 에서 이전 게시 된 보고서4,,56볼. 이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 사격 장치에 보 리 곡물에서 씨 외 투의 박 리와 신중 하 게 정의 된 설정 사용 하 여 포함 됩니다. 씨 외 투는 완전히 제거 되지 않습니다, 골드 microcarriers subtending aleurone 세포를 입력에서 못합니다. Aleurone 셀에 금 microcarriers의 성공적인 배달을 확실히 특정 유형의 파열 디스크 사용, microcarrier 커버 뚜껑, 정지 화면, 및 조직 폭격을 위치에의 지 이기도 합니다. 조건 여기 일반적으로 유전자 구조 (단계 8.1 참조)의 배달에 결과를 보고 포 격하 보 리 곡물 샘플의 높은 비율 (≥70%). 그것은 다른 생물 학적 재료 최적의 유전자 배달에 대 한 다른 조건이 필요로 한다고 예상 한다.
여기 설명 되지 않지만 추가 96 잘 접시에 플래시 luciferase 분석 실험을 수행 하 여 절차를 간소화 수 것입니다. 그러나, luciferase에서 빛 생산 기판 (소)는 단백질 추출 물 혼합 직후는 루미 노에서 측정 해야 합니다,이 필요는 접시 플래시 루미 노 주입기, 많은 악기를 사용 하 여 단일 튜브 루미 노 보다 비싼.
여기에서 보고 된 대표적인 결과 확인 녹음 방송 요인 TaABF1 exogenous ABA5,6의 부재에 HVA1 식 활성화할 수 있습니다. HVA1 TaABF1 또는 exogenous ABA의 활성화 PLD 억제제 1-butanol, PLD로 phosphatidic 산의 생산은 HVA1 정품 인증에 필요한 있을 수 있습니다 제안에 의해 방지 되었다. TaABF1와 ABA에 의해 HVA1 규제에 대 한 이러한 결과 비슷합니다 Zou 외. 여 녹음 방송 요인 LtWRKY21에 의해 그리고 ABA에 의해 HVA22 의 활성화를 위한 10 . H2O2 또는 SNP 외 인 ABA의 Amy32b, aleurone 식 억제에 대 한 대체 하지 않습니다 발견 ABA 시리얼 곡물에 신호의 일부 측면은 stomatal 가드 셀에서 발생 다릅니다 확인 합니다. H2O2 downregulate Amy32b 표현 하지 않는 찾는 이시바시 외 에 의해 관찰 된 결과와 일치 하는 11 아 밀라 제 효소의 활동에 대 한입니다.
늘어난된 처리량 프로토콜은 지금 TaABF1 인 산화 하류 유전자 발현을 조절 하는 능력에의 효과의 포괄적인 연구를 수행 하기 위해 사용 되 고 있습니다. ABF는의 다른 구성원으로 가족 녹음 방송 요인의 다양 한 다른 사이트12,13,,1415,16, 여러 상 상속 인 산화에 phosphorylated 수 있습니다. 사이트 TaABF1에 시험 될 필요가 있다. 이 프로토콜에서 허용 하는 더 높은 처리량 (잠재적으로 phosphorylatable 떠들고와 수정 트레오닌 잔류물) TaABF1의 돌연변이 체 버전의 많은 수를 허용할 것 이다 심문 수를 각 생물의 많은 수로 복제.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 실험, 곡물 균질에 대 한 조언 주 디 돌 및 fluorometry에 대 한 조언 린 Hannum 수행에 대 한 도움 Greyson 버틀러와 마가렛 배 럿을 감사 합니다. 이 작품은 기관 개발 수상 (IDeA는) 국립 과학 연구소에서의 일반 의료 보조금 번호 P20GM0103423, 건강의 국가 학회에 의해 그리고에서 교부 금에 의해 국립 과학 재단 (IOB 0443676)에 의해 지원 되었다 Colby 대학 자연 과학의 사단입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
