Summary
Um protocolo melhorado é apresentado para a medição transitória da expressão do gene do repórter construções nas células de aleurona de cevada após o bombardeio de partículas. A combinação de grãos automatizado moagem com ensaios enzimáticos de placa de 96 poços fornece alto throughput para o procedimento.
Abstract
A camada de aleurona de grãos de cevada é um importante modelo sistema para expressão gênica hormônio-regulada em plantas. Nas células de aleurona, genes necessários para a germinação ou desenvolvimento inicial de plântulas são ativados por Giberelina (GA), enquanto os genes associados com respostas de estresse são ativados pelo ácido abscísico (ABA). Os mecanismos de sinalização GA e ABA podem ser interrogados por introduzir construções de gene repórter em células de aleurona através do bombardeamento de partículas, com a expressão transitória resultante medida através de ensaios enzimáticos. Um protocolo melhorado é relatado que parcialmente automatiza e agiliza a etapa de homogeneização de grão e os ensaios enzimáticos, permitindo que a taxa de transferência significativamente mais do que os métodos existentes. Homogeneização das amostras de grãos é realizada usando um homogeneizador de automatizado, e ensaios de GUS (β-glucuronidase) são realizados através de um sistema de placa de 96 poços. Resultados representativos, usando o protocolo sugerem que a atividade da fosfolipase D pode desempenhar um papel importante na ativação da expressão do gene HVA1 pela ABA, através do fator de transcrição TaABF1.
Introduction
A camada de aleurona de cevada é um sistema bem estabelecido de modelo para o estudo da expressão gênica de hormônio-regulada em plantas1. Em particular, um número de genes necessários para a germinação ou desenvolvimento inicial de plântulas é ativado por Giberelina (GA), enquanto os genes associados com respostas de estresse são ativados pelo ácido abscísico (ABA). O GA e ABA vias de sinalização estão interligados, como a expressão de alguns genes GA-ativado é inibida pela ABA e vice-versa1.
Uma estratégia valiosa para a compreensão que do papel dos actores particulares na GA/ABA sinalização foi a introdução das construções de gene effector através do bombardeamento de partículas, seguido pela expressão transiente de construções de repórter que permitem que o efeito resultante na expressão do gene a jusante para ser determinado. O uso de genes repórter como GUS (β-glucuronidase) ou Luciferase permite a medição quantitativa e sensível da expressão do gene especificamente dentro das células que receberam a construção effector. Por exemplo, a introdução de uma construção effector codificação o fator de transcrição TaABF15,6 estabeleceu que genes induzida por ABA como HVA1 são induzidos por TaABF1, enquanto genes GA-induzido, como Amy32b são reprimidos. Bombardeio de partículas como uma estratégia experimental serviu por vários laboratórios para investigar os diversos aspectos de sinalização GA/ABA. Esse trabalho levou à identificação de elementos do promotor importantes para a ativação de GA-induzido2 e genes induzida por ABA3e a descoberta de proteínas quinases4 e fatores de transcrição5 que regulam o expressão destes genes.
O existente protocolos2,3,4,5,6 para o bombardeamento de partículas e mensuração subsequente da expressão do gene transiente são bastante trabalhoso, como cada conjunto de bombardeados mal de grãos é homogeneizado à mão em um almofariz e um pilão e os ensaios enzimáticos são realizados individualmente. Este manuscrito relata um protocolo melhorado que parcialmente automatiza e agiliza a etapa de homogeneização e o GUS ensaios para permitir que a taxa de transferência significativamente mais, permitindo um maior número de tratamentos a ser testado no mesmo experimento, e/ou a inclusão de mais repetições para cada tratamento obter mais resultados estatisticamente robustos. Resultados representativos são mostrados para a expressão de construções HVA1 e Amy32b do repórter, regulados pelo factor de transcrição TaABF1, bem como pelo GA, ABA e outras moléculas reguladoras.
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Protocol
1. preparação do efetor e Gene repórter constrói
- Construa construções efetoras que empregam um promotor constitutivo (por exemplo, milho ubiquitin, UBI) a expressão de unidade de um frame de leitura aberto desejado. Por exemplo, construa um plasmídeo que contém UBI::TaABF1 a expressão constitutiva forte de unidade de TaABF15.
- Construa construções de repórter que incluem o promotor, cuja actividade está a ser medido, colocados a montante de um frame de leitura aberto, tais como GUS. Por exemplo, construa um plasmídeo que contém HVA1::GUS para medir a expressão do promotor HVA1 2,5.
- Construir uma construção de controle interno (por exemplo, UBI::luciferase).
- Usando uma coluna de ligação de sílica protocolo (consulte Tabela de materiais), preparar o plasmídeo de alta qualidade para cada uma das construções de gene necessário. Usando espectroscopia ultravioleta (veja a Tabela de materiais), cuidadosamente medir a concentração de cada preparação do plasmídeo.
2. preparação de grãos de cevada para bombardeio
- Configurar uma planilha (ver Figura 1 para obter um exemplo) indicando o plasmídeo que será bombardeado, os tratamentos hormonais adequados e outras informações relevantes para cada tratamento que farão parte do experimento.
- Usando uma placa de corte e uma lâmina de barbear estéril, cortar os embriões a partir de grãos de cevada Himalaya (40 para cada tratamento incluído no experimento). Exclua os grãos que são descoloridos ou substancialmente menor do que a média.
- Coloque todos os grãos de embryoless em um tubo de 50 mL. Adicione 40 mL de água e pedra por 10 minutos.
- Despeje a água com cuidado (para evitar a perda de grãos) e adicionar 40 mL de água sanitária 10%. Rocha por 20 minutos.
- Deite fora a água sanitária e adicionar 40 mL de água estéril. Pedra por 5 minutos. Repeti esta lavagem de água estéril quatro vezes mais.
- Adicionar 40 mL de solução de absorver (succinato de sódio de 20 mM, 20 mM de cloreto de cálcio, pH 5,0) e 40 μL de solução cloranfenicol (10 mg/mL).
- Transferência da solução (com cloranfenicol) absorver a maioria do tubo em uma placa de Vermiculite (ver Tabela de materiais). Depois transferi os grãos para a superfície do papel filtro molhado na placa de vermiculita. Espalhe os grãos uniformemente. Despeje em suficiente imbibing solução para manter os grãos parcialmente (mas não completamente) submerso. Coloque a tampa na parte superior da placa de vermiculita.
- Incube os grãos de embryoless a 24 ° C, durante cerca de 48 h com iluminação fluorescente. Adicione solução absorvendo adicionais conforme necessário.
- Abrir-se um prato de petri de plástico 90mm e despeje 20 mL da solução de absorver para o prato em si e 20 mL a tampa invertida. Adicione 20 μL de cloranfenicol (10 mg/mL) a cada um. Esterilize dois pares de pinças de ponta fina, mergulhando-os em álcool.
- Coloque alguns grãos de embryoless na tampa da caixa de Petri. Usando a pinça, remova suavemente a camada de sementes (transparente) de cada grão. Ao remover o revestimento de semente do lado liso do grão, não danificam células subjacentes (aleurona). Transfira o grão descascado para a placa de Petri contendo solução absorvendo.
- Depois de descascar o revestimento de semente de todos os grãos, devolvê-los à placa de vermiculita. Incube os grãos descascados embryoless a 24 ° C por 16-20 horas.
- Imediatamente antes de usar os grãos para bombardeio, remova a umidade da superfície sacudindo-os entre papéis de filtro em um prato de petri.
3. preparação do ADN do plasmídeo para bombardeio
- Rotule um tubo de 1,5 mL para cada tratamento que será incluído no experimento de bombardeio. A cada tubo, adicionar 2,5 µ g de UBI:: plasmídeo de controle interno deluciferase , 2,5 µ g de um plasmídeo do repórter GUS e a quantidade desejada (normalmente 0,025 µ g de 2,5 µ g) de um plasmídeo effector. Adicione água para trazer o volume total de 5 µ l.
- Prepare-se 1,6 µm ouro microcarriers (ver Tabela de materiais) seguinte publicado protocolos6.
- Para cada tratamento, adicione 50 µ l de suspensão microcarriers no tubo de 1,5 mL contendo Plasmídeo. Revesti o microcarriers com o plasmídeo de acordo com o protocolos6 do fabricante.
- Na etapa final, quando os plasmídeo-revestido microcarriers são suspensos em 48 µ l 100% de etanol, pipetar 8 μL da suspensão microcarriers para cada um dos cinco macrocarriers e deixe-os ao ar seco.
4. partícula bombardeio de grãos de cevada Embryoless
- Configurar o aparelho de bombardeio de partículas (ver Tabela de materiais)6.
- Coloque um disco de ruptura de 1550 psi na retenção PAC e montá-lo no instrumento.
- Coloque um macrocarrier que contém a combinação desejada de plasmídeo (juntamente com uma tela de parar) o assembly de lançamento de microcarrier. Introduza o conjunto na ranhura superior da câmara de bombardeio. Definir a distância entre o disco de ruptura, mantendo a tampa e a tampa de cobertura macrocarrier à distância padrão (6 mm) e coloque o suporte de tela de parar na posição do meio (padrão), permitindo uma distância de viagem macrocarrier de 11 mm (Figura 2A).
- Arrume 8 grãos embryoless em um padrão radial apertado (com as extremidades mais finas, apontando para dentro) em um círculo de papel de filtro que está pregado no chão para a tampa de um prato de petri de 90 mm (ver Figura 2B).
- Coloque o prato com os grãos dentro da câmara de bombardeio, a uma distância de 6 cm a partir da tela de parar.
- Evacuar a câmara de bombardeio para 95 kPa e então bombardeia a amostra.
- Depois de lançar o vácuo, transferi os grãos bombardeados para um prato de petri 60mm etiquetados contendo 4 mL de solução absorvendo contendo 1 mg/ml de cloranfenicol.
- Repita até que todos os bombardeamentos foram concluídos. Incube (em uma plataforma de agitação a 100 rpm) a 24 ° C por 24 horas.
5. extração de proteína solúvel de grãos bombardeados
- Usando a pinça, remova os 8 grãos bombardeou um prato de petri 60mm e exterminá-los seco sobre papel absorvente. Divida os grãos em dois tubos etiquetados 2,0 mL (4 grãos por tubo) cada um contendo 800 μL tampão de moagem (100mm at fosfato pH 7,2, 5 mM DTT, 10 µ g/mL leupeptin, 20% de glicerol) e um grânulo de aço inoxidável de 5mm. Repita este processo para todos os de grãos bombardeados.
- Coloque os dois racks de homogeneizador do grânulo (até 48) tubos de 2,0 mL (ver Tabela de materiais). Monte as prateleiras do homogenizador.
- Agite as amostras em 30 Hz durante 3 minutos.
- Retire os cestos homogenizador do homogenizador e colocá-los no gelo (5 min) para re-fixe as amostras.
- Monte os racks volta do homogenizador - na orientação oposta. Agite as amostras novamente a 30 Hz durante 3 minutos.
- Legal os racks no gelo, em seguida, repita passos 5.3 a 5.5. Isto irá adicionar um total de 12 minutos de agitação.
- Centrifugue os extratos de grão a 16.000 x g a 4 ° C por 10 minutos.
- Imediatamente após a centrifugação, decantar os sobrenadantes claros em um segundo conjunto de tubos do microcentrifuge. Dar a cada tubo um vórtice rápido. Armazene os tubos em gelo.
- Depois de transferir o sobrenadante, recupere as esferas de aço de pelotas para que eles podem ser lavados e reutilizados.
6. medida da atividade de Luciferase de extratos de grão
- Para cada tubo de extracto de grãos a ser analisada, prepare um tubo de ensaio de vidro 12 x 75 mm contendo 200 μL de mistura de ensaio Luciferase (45 mM Tris sulfato de pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, Luciferina de 1 mM, 1 mM ATP).
- Adicione 100 μL do primeiro extracto de grãos para o primeiro tubo de ensaio. Vórtice rapidamente para misturar bem. Imediatamente , coloque o tubo no suporte do tubo do luminómetro e feche a porta. Quando a medição estiver concluída, retire o tubo do luminómetro – deixando a porta aberta para a colocação do tubo próxima.
- Repita este processo até que todas as amostras foram medidas.
7. medição de GUS atividade de extratos de grão
- Adicione 200 μL de tampão de ensaio de GUS (50mm at fosfato pH 7,2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glicuronídeo, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptin, 20% de metanol, 0,02% de azida de sódio) para cada poço de uma placa bem 96.
- Colocar 50 μL de cada extrato de grão para a correspondente bem. Misture com a ponta após a adição. Sele o topo com película de vedação.
- Incube a placa bem 96 a 37 ° C, no escuro por 20 horas.
- Centrifugue a placa bem 96 a 4.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos e coloque-o no gelo.
- Adicione 250 μL de 0,2 M Na2CO3 para cada poço de uma placa bem preto 96.
- Adicionar 6,25 μL de cada mistura de ensaio centrifugada GUS para a correspondente bem (contendo 0,2 M Na2CO3) do negro 96 placa bem. Misture com a ponta após a adição. Inclua poços com 6,25 μL de 10 μM 40 μM e 100 μM 4-methylumbelliferone como padrões.
- Coloque a placa preta em um dados de placa e ler a fluorescência de methylumbelliferone. Fazer as leituras em um comprimento de onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. Defina o ganho do instrumento tal que um bem contendo 6,25 μL de 40 μM 4-methylumbelliferone e 250 μL de 0,2 M Na2CO3 dão uma leitura de 1000 unidades de fluorescência.
8. análise de dados
- Insira os valores para a luciferase e ensaios de GUS em uma planilha. Exclua da consideração qualquer amostra com uma leitura do luciferase inferior a luminescência relativa de 20.000 unidades de s-1, já que indica que as construções do gene não foram entregue com êxito para as células de aleurona.
- Para cada grão bombardeado com sucesso o extrato (representando um grupo de quatro grãos embryoless), calcular a expressão de GUS normalizada a partir dos dados brutos de GUS e luciferase como segue: normalizado GUS = [(expressão de GUS - GUS em branco) x (2.000.000)] / (luciferase expressão – luciferase em branco).
Nota: Isto normaliza a quantidade de atividade de GUS, o que poderia ter sido observado em um bombardeio que deu uma leitura de luciferase de 2.000.000. - Relatar o nível relativo de expressão de uma construção de repórter especial na presença de construções de efetor ou tratamentos hormonais, sendo testados, comparando o nível de expressão na ausência de efetores ou hormônios.
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Representative Results
A técnica descrita aqui pode ser usada para introduzir qualquer teste de construção de gene em células de aleurona de grãos de cevada. O nível de expressão do gene de teste pode então ser convenientemente medidos (Figura 2). O protocolo de taxa de transferência superior descrito aqui grandemente aumenta a eficiência da moagem de sementes e etapas de ensaio enzima. Este método tem sido usado para avaliar a capacidade da transcrição fator TaABF15,6 para ativar a expressão do gene induzida por ABA HVA17. Nos resultados do representante aqui apresentados, uma construção de repórter HVA1::GUS foi introduzida em células de aleurona, juntamente com uma construção UBI::TaABF1 de efetoras (Figura 3A). Enquanto um TaABF1/HVA1 taxa de apenas 0,01 era suficiente para causar uma 3 vezes indução do gene repórter HVA1 na ausência de ABA exógeno, níveis mais elevados de construção de TaABF1 resultaram em progressivamente maior HVA1 expressão, de forma dose-dependente (Figura 3BC).
Este protocolo experimental pode também incorporar o uso de hormônios ou outros compostos durante o período de incubação de pós-bombardeio para avaliar o papel dessas moléculas na regulação da expressão gênica. Trabalhos anteriores por outros investigadores sugeriu a importância da fosfolipase D em alguns aspectos da ABA sinalização. Especificamente, o produto da atividade da fosfolipase D, ácido fosfatídico, tem sido implicado como um intermediário em algumas respostas para ABA8,9. O fato de que 1-butanol, um inibidor da fosfolipase D (PLD), tem sido mostrado para impedir a expressão de gene induzida por ABA nas células de aleurona sugere que o PLD pode ser parte integrante da ABA sinalização neste tecido. O protocolo de bombardeio foi usado para testar se o 1-butanol pode inibir a expressão de HVA1 induzida por ABA ou induzida por TaABF1. Como esperado, ABA exógeno ou TaABF1 podem induzir fortemente expressão da construção de repórter de HVA1::GUS (Figura 3). Em ambos os casos, a presença de 1-butanol fortemente inibida a indução de HVA1 . Isto sugere que o PLD poderia desempenhar um papel importante na ativação da expressão do gene HVA1 pela ABA, através de TaABF1.
Além de seu papel no desenvolvimento e germinando grãos, ABA também é fundamental para a regulação da abertura estomática nas folhas. Nas células guarda dos estomas, a produção de ácido fosfatídico é estimulada pelo óxido nítrico (NO), que por sua vez é induzida pelo peróxido de hidrogênio (H2O2). Para algumas respostas, n e H2O2 pode substituir ABA9. Para determinar se este é também o caso nas células de aleurona, o protocolo de bombardeio foi usado para testar se o nitroprussiato de sódio não doador (SNP) ou H2O2 pode substituir ABA em inibir a expressão da induzida por GA Amy32b gene. Enquanto ABA fortemente pode inibir a expressão induzida em GA para o repórter Amy32b::GUS construir, H2O2 nem SNP causou qualquer redução significativa (Figura 3D). Estes resultados, portanto, não oferecem suporte a um papel para n e H2O2 em respostas de célula ABA de aleurona.
Figura 1 : Planilha para um experimento típico bombardeio. A quantidade de cada preparação do plasmídeo para ser colocado no tubo para cada bombardeamento é indicada. Neste experimento, quatro tiros (8 grãos cada) foram utilizados para cada tratamento, para dar um total de oito amostras possíveis (4 grãos cada) para cada tratamento. A fim de manter a mesma concentração de DNA total em cada bombardeamento, utilizou-se um plasmídeo effector "dummy" para substituir o plasmídeo de efetoras UBI::TaBF1 em alguns casos. Ao tratamento é um bombardeio "em branco" para estabelecer o nível de fundo de GUS e luciferase atividade nas células de aleurona. Os resultados do experimento bombardeio delineadas nesta planilha são mostrados na Figura 3B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Diagrama do protocolo. (A) diagrama esquemático do dispositivo de bombardeio. (B) partículas de ouro, revestidas com uma construção de repórter carregando o promotor para ser testado, um efetor (se necessário) e um controle interno (UBI::luciferase) são introduzidas dentro das células de aleurona de cevada por bombardeamento de partículas. Após incubação (normalmente de 24 h), os grãos são retificadas e analisada para atividade de GUS e atividade de luciferase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Regulamento dos promotores de HVA1 e Amy32b , TaABF1, ABA e potenciais mediadores da ABA sinalização. (A) repórter e efetoras construções usadas nas experiências. (B) a construção de efetoras UBI::TaABF1 co foi bombardeada em células de aleurona com o repórter HVA1::GUS e construção de controlo interno (UBI::luciferase). A quantidade de UBI::TaABF1 effector (em relação a repórter HVA1::GUS ) variou de 0 a 0,1, como indicado abaixo das barras. GUS e luciferase atividades foram medidas após 24 h de incubação. Dados mostrados são os meios (± SE), de 6-8 repetições biológicas. (C) o repórter HVA1::GUS co foi bombardeado em células de aleurona, com a construção do controlo interno (UBI::luciferase) na presença ou ausência de construção de efetoras UBI::TaABF1. A quantidade de TaABF1 effector (em relação a repórter) foi 1.0. GUS e luciferase atividades foram medidas após 24h de incubação, com ou sem 20 µM ABA e 0,4% 1-butanol. (D) o repórter Amy32b::GUS foi bombardeado co em células de aleurona, com a construção do controlo interno (UBI::luciferase). GUS e luciferase atividades foram medidas após 24h de incubação na presença de 1 mM GA com ou sem ABA de 20 µM, 1 mM H2O2ou nitroprussiato de sódio de 100 µM (SNP). Valores para atividade de GUS são relativo para a expressão do repórter na ausência de GA. Amy32b::GUS , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A introdução do gene effector constrói através do bombardeamento de partículas, seguido pela expressão transiente de construções de repórter é uma estratégia valiosa para dissecar o papel dos actores particulares na GA/ABA sinalização e no gene resultante hormônio-regulada expressão.
No entanto, os protocolos existentes para a realização de tais experiências em cevada aleurona células2,3,4,5,6 são muito trabalhoso. Cada grupo de bombardeado mal grãos devem ser homogeneizado em um almofariz e um pilão de mão, e os extratos resultantes são doseados individualmente para atividade de GUS e luciferase. Os protocolos atuais, portanto, limitam o número de tratamentos distintos que podem ser incluídos no mesmo experimento e restringir o número de repetições biológicas que podem razoavelmente ser incluído para cada tratamento. Estas limitações dificultam mais realizar comparações abrangentes e simultâneas entre os vários tratamentos. Tais comparações podem ser especialmente difícil se a diferença na expressão gênica entre os tratamentos é modesta e um número relativamente grande de repetições biológicas é necessária para estabelecer a significância estatística.
Um protocolo simplificado é aqui apresentado que automatiza parcialmente a preparação do extrato de grão e o GUS ensaios para permitir que substancialmente maior rendimento. Esta nova versão do faz protocolo viável para incluir um muito maior número total de amostras em um experimento, permitindo a ambos a inclusão dos mais diferentes tratamentos por experiência e mais repetições para cada tratamento. Para a preparação dos extratos de grão após bombardeio e incubação, nós substituímos um protocolo de moagem em grande parte automatizado que utiliza um homogeneizador de grânulo que pode processar 48 amostras simultaneamente (em cerca de 20 minutos). Assim, um único investigador pode preparar proteína solúvel extratos de quase 200 amostras em menos tempo que levaria uma equipe de quatro investigadores entregar apenas 100 amostras de moer. O ensaio modificado de GUS, realizado em 96 placas bem, também requer muito menos trabalho que o protocolo original de empregados individual tubo de ensaios.
Na preparação de misturas do plasmídeo para bombardeio (passo 3.1), é possível usar um efetor à relação de repórter de 1.0, especialmente para testes preliminares determinar se um determinado effector tem qualquer efeito algum. No entanto, por causa da força do promotor da ubiquitina milho (UBI), um forte efeito pode frequentemente ser observado com taxas muito mais baixas, como visto na Figura 2B e relatórios publicados anteriormente4,5,6. Outros passos críticos no presente protocolo incluem peeling do revestimento de sementes de grãos de cevada e a utilização de definições cuidadosamente no aparato de bombardeio. Se os revestimentos de semente não são totalmente removidos, o microcarriers de ouro será impedido de entrar às células de aleurona. Sucesso na entrega de microcarriers o ouro dentro das células de aleurona também é bastante dependente do tipo específico de disco de ruptura utilizado, a posição da tampa de cobertura microcarrier, tela de parar e tecido ser bombardeado. As condições aqui relataram resultado na entrega bem sucedida das construções de gene (ver passo 8.1) normalmente a uma alta percentagem (≥70%) de amostras de grãos de cevada bombardeado. Deve presumir-se que outros materiais biológicos que exigem condições diferentes para a entrega do gene ideal.
Embora não é descrito aqui, seria possível agilizar ainda mais o procedimento através da realização de ensaios em 96 placas bem os flash luciferase. No entanto, como a produção de luz de luciferase deve ser medida em um luminómetro imediatamente após a mistura da proteína extrato com o substrato (luciferina), isso exigiria o uso de um luminómetro flash placa com injetores, um instrumento que é muito mais caro do que um único tubo luminómetro.
Os resultados representativos relatados aqui confirmaram que o fator de transcrição TaABF1 pode ativar a expressão HVA1 na ausência de exógenos ABA5,6. Ativação de HVA1 por TaABF1 ou ABA exógeno foi impedida pelo PLD inibidor 1-butanol, sugerindo que a produção de ácido fosfatídico por PLD pode ser necessária para ativação do HVA1 . Estes resultados para regulamento de HVA1 por TaABF1 e ABA são semelhantes aos obtidos por Zou et al 10 para a ativação de HVA22 pelo factor de transcrição LtWRKY21 e pela ABA. A conclusão de que H2O2 ou SNP não substitui ABA exógeno em suprimir a expressão de aleurona de Amy32b, confirma que alguns aspectos da ABA sinalização em grãos de cereais são diferentes do que ocorre nas células de guarda estomáticas. A constatação de que H2O2 não não downregulate Amy32b expressão é consistente com os resultados observados por Ishibashi et al 11 para a atividade de enzima amilase.
O protocolo de maior throughput agora está sendo usado para realizar um estudo abrangente dos efeitos da fosforilação de TaABF1 na sua capacidade de regular a expressão gênica a jusante. Como outros membros da ABF a família de factores de transcrição pode ser fosforilada em um número de diferentes sites12,13,14,15,16, múltiplos fosforilação putativa sites sobre TaABF1 precisam ser testados. A taxa de transferência maior permitida pelo presente protocolo permitirá a um grande número de versões mutantes de TaABF1 (com potencialmente phosphorylatable serina e treonina resíduos modificados) para ser interrogado, cada um com um grande número de biológico Replica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores Obrigado Greyson Butler e Margaret Barrett para ajudar na realização dos experimentos, Judy Stone para aconselhamento sobre homogeneização de grão e Lynn Hannum para aconselhamento sobre fluorometry. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (IOB 0443676), por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do Instituto Nacional de General Medical Ciências, dos institutos nacionais de saúde, sob número de concessão P20GM0103423 e por concessões do a divisão de Colby College de ciências naturais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
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