Summary
Улучшенная протокол представлен для измерения экспрессии генов переходных от репортера конструкции в клетках aleurone ячменя после бомбардировки частиц. Сочетание автоматизированных зерна, шлифовальные с 96-луночных пластины фермента анализов обеспечивает высокую пропускную способность для процедуры.
Abstract
Aleurone слой зерна ячменя является важной моделью системы для выражения гена гормона регулируется в растениях. В aleurone клетках гены, необходимые для прорастания или раннего развития сеянцев активируются гиббереллин (GA), в то время как гены, связанные с стрессом ответы активируются абсцизовой кислоты (ABA). Механизмы GA и ABA сигнализации могут быть допрошены путем введения Репортер ген конструкции в aleurone клетки через бомбардировка частиц, с результатом переходных измеряется с помощью фермента анализов. Улучшенная протокол сообщается, что частично автоматизирует и оптимизирует шаг гомогенизации зерна и assays энзима, позволяя значительно более высокую пропускную способность, чем существующие методы. Гомогенизация пробы зерна осуществляется с использованием автоматизированных ткани гомогенизатор, и GUS (β-глюкуронидазы) анализов осуществляется с помощью системы 96-луночных пластины. Представитель результаты, с использованием протокола показывают, что активность фосфолипазы D могут играть важную роль в активации HVA1 экспрессии генов, ABA, через фактор транскрипции TaABF1.
Introduction
Слой aleurone ячмень является система устоявшихся моделей для изучения выражения гена гормона регулируется в растения1. В частности ряд генов, необходимых для прорастания или раннего развития сеянцев активируются гиббереллин (GA), в то время как гены, связанные с стрессом ответы активируются абсцизовой кислоты (ABA). ГА и ABA, сигнальные пути взаимосвязаны, как выражение некоторых генов, GA-активированный тормозится Аба и наоборот1.
Ценный стратегия для понимания, что роль конкретного участников в GA/Аба сигнализации был введение эффекторных гена конструкции через бомбардировка частиц, следуют переходных выражение репортер конструкций, которые позволяют результирующий эффект на вниз по течению ген выражение определяется. Использование репортер генов как гусь (β-глюкуронидазы) или Люцифераза позволяет чувствительной и количественного измерения экспрессии генов специально внутри клетки, которые получили эффекторных конструкции. Например введение конструкцией эффекторных кодирования фактор транскрипции TaABF15,6 установлено, что Аба индуцированной генов, например HVA1 индуцированных TaABF1, а GA-индуцированной генов, например Amy32b подвергаются репрессиям. Бомбардировка частиц как экспериментальная стратегия использовала несколько лабораториями для изучения различных аспектов GA/Аба сигнализации. Такая работа привела к выявлению промоутер элементов, важных для активации GA-индуцированной2 и ABA-индуцированной генов3и к открытию киназы протеина4 и транскрипции факторы5 , которые регулируют экспрессии этих генов.
В существующие протоколы2,3,4,5,6 бомбардировка частиц и последующее измерение переходных гена выражения являются довольно трудоемким, как каждый набор бомбардировке едва зерна гомогенизированные вручную в ступку и пестик и фермента анализов осуществляется индивидуально. Эта рукопись сообщает улучшение протокол, который частично автоматизирует и оптимизирует этапа гомогенизации и GUS assays позволяют значительно более высокую пропускную способность, позволяя большее количество процедур для проверки в том же эксперимент, и/или включение более репликация для каждого лечения получить более статистически надежные результаты. Представитель результаты представлены для выражения HVA1 и Amy32b конструкций репортер, регулируется фактор транскрипции TaABF1, а также GA, Аба и других регуляторных молекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка эффекторных и Репортер ген конструкции
- Построить эффекторных конструкции, которые используют учредительный промоутер (например кукурузы убиквитин, UBI) диск выражение от желаемого открытым чтение фрейма. Например Постройте плазмида, содержащие UBI::TaABF1 диск сильное выражение учредительного TaABF15.
- Постройте репортер конструкции, которые включают промоутер, чья деятельность будет оцениваться, размещенных вышестоящего кадра открытом чтения, такие как ГАС. Например Постройте плазмида, содержащие HVA1::GUS для измерения выражение из HVA1 промоутер2,5.
- Построить конструкцией внутреннего контроля (например UBI::Люцифераза).
- С помощью столбца привязки кремнезема протокола (см. Таблицу материалы), подготовить плазмида высокого качества для каждого из требуемых гена конструкций. С помощью ультрафиолетовой спектроскопии (см. Таблицу материалы), тщательно измерить концентрацию каждого плазмида подготовки.
2. Подготовка зерна ячменя для бомбардировки
- Настройка таблицы (см. рис. 1 в качестве примера) указанием плазмиды, которые будут подвергаться обстрелу, соответствующие гормональная терапия и другую соответствующую информацию для каждого лечения, который будет частью эксперимента.
- С помощью разделочную доску и стерильные лезвия бритвы, отрезать эмбрионов из зерна ячменя Гималаев (40 для каждого лечения, включены в эксперимент). Исключите зерна, которые бесцветные или существенно меньше, чем в среднем.
- Поместите все embryoless зерна в 50 мл трубки. Добавьте 10 минут 40 мл воды и рок.
- Вылейте воду осторожно (чтобы избежать потери зерна) и добавить 40 мл 10% хлорной извести. Рок на 20 минут.
- Вылейте на отбеливатель и добавьте 40 мл стерильной воды. Рок на 5 минут. Повторите это мыть стерильную воду еще четыре раза.
- Добавить 40 мл раствора, впитывая (сукцинат натрия 20 мм, 20 мм кальция хлорид, рН 5,0) и 40 мкл хлорамфеникол Стоковый раствор (10 мг/мл).
- Перевести большую часть впитывая решения (хлорамфеникол) из трубки в вермикулитовые плиты (см. Таблицу материалы). Затем перенесите зерна на поверхность влажной фильтровальной бумаги в вермикулитовые плиты. Равномерно из зерна. Налейте достаточно привитие решение сохранить зерна частично (но не полностью) погруженной. Поместите крышку на вершине вермикулитовые плиты.
- Инкубируйте embryoless зерна при 24 ° C около 48 ч с флуоресцентным освещением. При необходимости добавьте дополнительные впитывая решение.
- Открыть пластиковые Петри 90 мм и налейте 20 мл раствора, впитывая в блюдо сам и 20 мл Перевернутый крышкой. Добавьте 20 мкл Хлорамфеникол (10 мг/мл) в каждый. Стерилизуйте две пары щипцов тонкой точке путем погружения их в спирте.
- Поместите несколько embryoless зерна в крышке Петри. С помощью щипцов, аккуратно удалите (прозрачный) семян пальто из каждого зерна. При удалении семян пальто с гладкой стороны зерна, не повредить основные клетки (aleurone). Очищенные зерна передать Петри, содержащие впитывая решение.
- После пилинга семян пальто из всех зерен, вернуть их на вермикулитовые плиты. Инкубируйте очищенные embryoless зерна при 24 ° C 16-20 часов.
- Непосредственно перед использованием зерна для бомбардировки, удалите поверхностная влага, встряхивая их между фильтр документов в чашке Петри.
3. Подготовка плазмидной ДНК для бомбардировки
- Ярлык 1,5 мл трубки для каждого лечения, которые будут включены в эксперимент бомбардировки. В каждую пробирку добавить 2,5 мкг UBI::Люцифераза внутреннего контроля плазмида, 2,5 мкг плазмида репортер ГАС , и необходимое количество эффекторных плазмида (обычно 0,025 мкг до 2,5 мкг). Добавьте воду, довести объем до 5 мкл.
- Подготовить 1,6 мкм золото microcarriers (см. Таблицу материалы) ниже опубликованы протоколы6.
- Для каждого обращения 50 мкл взвешенных microcarriers в 1,5 мл, содержащих плазмида ДНК. По словам производителя протоколы6пальто microcarriers с плазмидной ДНК.
- На последнем шаге когда покрытием плазмида microcarriers подвешены в 48 µL 100% этанола, накапайте 8 мкл условно microcarriers на каждый из пяти macrocarriers и позволяют воздух сухой.
4. частица бомбардировки Embryoless Ячмень зерно
- Настройка аппарата бомбардировка частиц (см. Таблицу материалы)6.
- Поместите диск разрыв 1550 psi в крышку сохраняя и смонтировать его на инструменте.
- Место macrocarrier, содержащий сочетание желаемого плазмида (вместе с остановки экрана) в сборку запуска microcarrier. Вставьте Ассамблея в верхний слот камеры бомбардировки. Задайте расстояние между разрывной мембраной, сохраняя крышки и крышки Крышка macrocarrier на стандартном расстоянии (6 мм) и место остановки экрана поддержки (стандарт) средней позиции, позволяя macrocarrier расстояние 11 мм (рис. 2A).
- Организовать 8 embryoless зерна в жесткой радиальному шаблону (с тоньше концами, направленными внутрь) на кружок фильтровальной бумаги, тесьмой вниз плоской крышкой Петри 90 мм (см. рис. 2B).
- Поместите блюдо с зерна в камеру бомбардировки, на расстоянии 6 см от остановки экрана.
- Эвакуировать зале бомбардировки в 95 кПа и затем бомбардируют образца.
- После выпуска вакуум, передачи обстреляли зерна на чашку Петри помечены 60 мм, содержащий 4 мл впитывая раствора, содержащего 1 мг/мл левомицетина.
- Повторяйте, пока не будут завершены все бомбардировки. Инкубируйте (на платформе тряску при 100 об/мин) при 24 ° C для 24 часов.
5. Добыча растворимого белка из обстреляли зерна
- С помощью щипцов, удалите 8 обстреляли зерна из Петри 60 мм и промокните их сухой на бумажное полотенце. Разделить зерна на две трубки помечены 2.0 мл (4 зерен в трубку) каждый из которых содержит 800 мкл шлифовальные буфер (100 мм Na фосфаты pH 7.2, 5 мм DTT, 10 мкг/мл leupeptin, 20% глицерина) и бисера 5 мм из нержавеющей стали. Повторите этот процесс для всех обстреляли зерна.
- Место (до 48) 2.0 мл трубки в двух стоек шарик гомогенизатора (см. Таблицу материалы). Закрепите стойки на гомогенизатор.
- Встряхните образцы на 30 Гц за 3 минуты.
- Удаление гомогенизатор стойки из гомогенизатор и разместить их на льду (5 мин) для повторного охлаждения образцов.
- Закрепите стойки обратно на гомогенизатор - в противоположной ориентации. Погрозит образцы снова 30 Hz 3 минуты.
- Прохладный стойки на льду, повторите шаги 5.3-5.5. Это будет добавить до в общей сложности 12 минут тряски.
- Центрифуга экстракты зерна на 16000 x g при 4 ° C на 10 минут.
- Сразу же после центрифугирования, сцеживаться ясно supernatants в второй набор microcentrifuge трубок. Дайте каждой трубы быстро вихря. Храните трубы на льду.
- После передачи супернатанта, восстановить стального корда от гранул, так они можно стирать и использовать повторно.
6. измерение активности Люцифераза из экстрактов зерна
- Для каждой трубы экстракт зерна, чтобы быть assayed, подготовить 12 мм x 75 мм стеклянные пробирки содержащие 200 мкл смеси Assay Люцифераза (45 мм трис сульфат рН 7,7, 15 мм MgCl2, 20 мм DTT, 1,5 мм ЭДТА, 1 мм люциферин, АТФ 1 мм).
- Добавьте 100 мкл первый экстракт зерна в первый пробирного трубки. Вихрь быстро, чтобы перемешать. Немедленно положите трубку в Трубодержатель Люминометр и закройте дверцу. По окончании измерения удалите трубки из Люминометр – оставив дверь открытой для размещения следующего трубки.
- Повторите этот процесс до тех пор, пока все образцы были измерены.
7. измерение активности ГАС от зерна экстракты
- Добавьте 200 мкл ГАС Assay Buffer (50 мм Na фосфат рН 7,2, 2,5 мм 4-methylumbelliferyl - D-глюкуронида, 10 мм DTT, 2 мм ЭДТА, 10 мкг/мл leupeptin, 20% метанола, азид натрия 0,02%) в каждой скважине 96 хорошо плиты.
- Место 50 мкл каждого зерна экстракт в соответствующий хорошо. Смешайте с наконечником, после добавления. Печать верхней с пленки для запайки.
- Инкубируйте 20 часов 96 хорошо пластины при 37 ° C в темноте.
- Центрифуга 96 хорошо пластины на 4000 x g при 4 ° C на 10 минут и поместите его на льду.
- Добавьте 250 мкл 0,2 М Na2CO3 в каждой скважине черный 96 хорошо плиты.
- Добавить 6,25 мкл каждого центрифугировали смеси assay ГАС в соответствующий хорошо (содержащие 0,2 М Na2CO3) черный 96 хорошо пластины. Смешайте с наконечником, после добавления. Включать скважин с 6.25 мкл 10 мкм, 40 мкм и 100 мкм 4-methylumbelliferone в качестве стандартов.
- Место пластину черного в тарелку флуориметр и читать флуоресценции methylumbelliferone. Возьмите чтений на длине волны возбуждения 360 Нм и длина волны излучения 460 Нм. Настроить усиление документа таким образом, что хорошо содержащие 6,25 мкл 40 мкм 4-methylumbelliferone и 250 мкл 0,2 М Na2CO3 дает чтение флуоресценции 1000 единиц.
8. анализ данных
- Введите значения для Люцифераза и GUS анализов в электронную таблицу. Исключите из рассмотрения любого образца с чтением Люцифераза ниже, чем 20 000 относительной люминесценции единиц s-1, как это показывает, что ген конструкции не были успешно доставлено в aleurone клетки.
- Для каждого успешно обстреляли зерна экстракт (выступавший от имени группы четырех embryoless зерен), вычисления нормализованных ГАС выражение из необработанных данных ЦСУ и Люцифераза следующим: нормированный гусь = [(GUS выражение - GUS пустой) x (2 000 000)] / (Люцифераза выражение-Люцифераза пустым).
Примечание: Это нормализует количество ГАС активности на то, что бы было отмечено в бомбардировки, которая дала Люцифераза чтение 2,000,000. - Доклад относительный уровень экспрессии конструкции конкретного репортер присутствии эффекторных конструкции или гормонального лечения проходит проверку сравнения на уровень экспрессии в отсутствие эффекторов или гормонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод, описанный здесь может использоваться для вилочное любой ген тест в aleurone клетки зерна ячменя. Уровень экспрессии гена теста может быть удобно измерять (рис. 2). Выше пропускная способность протокола, описанные здесь значительно увеличивает эффективность измельчения семян и фермента проба шагов. Этот метод был использован для оценки способности транскрипционным фактором TaABF15,6 для того чтобы активировать экспрессия гена Аба индуцированной HVA17. В результатах представительных, представленные здесь конструкцией HVA1::GUS репортер был введен в aleurone клетки вместе с UBI::TaABF1 эффектор конструкцию (рис. 3A). Хотя TaABF1/HVA1 соотношение всего 0.01 было достаточно, чтобы вызвать вывозимому индукции HVA1 гена репортера в отсутствие внешних АБА, более высокие уровни TaABF1 конструкции привело к все более HVA1 выражения, в зависимости от дозы (рисунок 3BC).
Этот экспериментальный протокол может также включать использование гормонов или других соединений после бомбардировки инкубационный период для оценки роли этих молекул в регуляции экспрессии генов. Предыдущая работа других следователей предложил важность фосфолипазы D в некоторых аспектах ABA сигнализации. В частности продукт активности фосфолипазы D, фосфатидной кислоты, были вовлечены в качестве промежуточного продукта в некоторых ответах ABA8,9. Тот факт, что 1-Бутанол, ингибитором фосфолипазы D (PLD), было показано для предотвращения экспрессии генов, ABA-индуцированной aleurone клеток предполагает, что устройство PLD может быть неотъемлемой частью ABA сигнализации в этой ткани. Бомбардировка протокол был использован для тестирования ли 1-бутанола могут препятствовать Аба индуцированной или TaABF1-индуцированной HVA1 выражение. Как и ожидалось, экзогенных ABA или TaABF1 сильно может побудить выражение HVA1::GUS репортер конструкции (рис. 3 c). В любом случае наличие 1-бутанол сильно ингибировала индукции HVA1 . Это предполагает, что устройство PLD могла бы играть важную роль в активации HVA1 экспрессии генов, ABA, через TaABF1.
В дополнение к своей роли в разработке и проросшие зерна АБА также имеет решающее значение для регулирования устьичное отверстие в листья. В гвардии клетки устьиц, производство фосфатидной кислоты стимулируется оксида азота (NO), который в свою очередь индуцированные пероксидом водорода (H2O2). Для некоторых ответов NO и H2O2 может заменить ABA9. Чтобы определить, является ли это также в случае aleurone клеток, бомбардировка протокол был использован для тестирования ли NO доноров натрия нитропруссида (SNP) или H2O2 может подменить ABA в подавлении выражение GA-индуцированной Amy32b гена. В то время как ABA может сильно тормозят GA-индуцированной выражение для построения Amy32b::GUS репортер, H2O2 ни SNP вызвала любое значительное сокращение (рис. 3D). Эти результаты, следовательно, не поддерживают роль для NO и H2O2 в aleurone клетки ABA ответов.
Рисунок 1 : Таблицы для типичного бомбардировки эксперимент. Указывается количество каждого плазмида подготовки быть помещены в трубки для каждого бомбардировки. В этом эксперименте дать в общей сложности восемь возможных выборок (по 4 зерна) для каждого лечения для каждого лечения были использованы четыре выстрела (по 8 зерна). Для поддержания же общая концентрация ДНК в каждом бомбардировки, «думмичный» эффекторных плазмида был использован для замены эффекторных плазмида UBI::TaBF1 в некоторых случаях. Лечение А является «пустой» бомбардировка установить уровень фона ГАС и Люцифераза активности в aleurone клетках. Результаты эксперимента бомбардировки, изложенные в этой таблице показаны на рисунке 3B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема протокола. (A) схема устройства бомбардировки. (B) частицы золота покрытием с конструкцией репортер, промоутер испытанию, эффектор (при необходимости) и внутреннего контроля (UBI::luciferase) вводят в клетки aleurone ячмень бомбардировкой частиц. После инкубации (обычно в течение 24 ч) зерна шлифуются и assayed активность GUS и Люцифераза деятельности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Регулирование HVA1 и Amy32b промоутеров, TaABF1, Аба и потенциальных посредников ABA сигнализации. (A) репортер и эффекторных конструкций, используемых в экспериментах. (B) эффекторных конструкции UBI::TaABF1 совместно подверглась бомбардировке в aleurone клетки с HVA1::GUS репортер и конструкции внутреннего контроля (UBI::luciferase). Количество UBI::TaABF1 эффектор (по отношению к HVA1::GUS репортер) варьируется от 0 до 0,1, как указано ниже в барах. Гусь и Люцифераза мероприятия были измерены после 24 ч инкубации. Данные являются средствами (± SE) биологических реплицирует 6-8. (C) HVA1::GUS репортер совместно обстреляли в aleurone клетки с помощью конструкции внутреннего контроля (UBI::luciferase) в присутствии или отсутствии эффекторных конструкции UBI::TaABF1. Количество TaABF1 эффектор (по отношению к репортер) был 1.0. Гусь и Люцифераза мероприятия были измерены после 24 ч инкубации с или без 20 мкм Аба и 0,4%-1-бутанол. (D) Amy32b::GUS репортер был совместно обстреляли в aleurone клетки с помощью конструкции внутреннего контроля (UBI::luciferase). Гусь и Люцифераза мероприятия были измерены после 24 ч инкубации при наличии 1 мм GA с или без ABA 20 мкм, 1 мм H2O2, 100 мкм натрия нитропруссида (SNP). Значения для деятельности GUS относительны выражение Amy32b::GUS репортер в отсутствие GA. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Введение гена эффекторных конструкции через бомбардировка частиц, следуют переходных выражение репортер конструкций является ценным стратегия для рассечения роль конкретных участников в GA/Аба сигнализации и в результате гена гормона регулируется выражение.
Однако существующие протоколы для проведения таких экспериментов в ячменя aleurone клетки2,3,4,5,6 , очень трудоемким. Каждая группа обстреляла едва зерна должны быть руку гомогенизации в ступку и пестик, и результирующая экстракты являются assayed индивидуально для ГАС и Люцифераза деятельности. Поэтому текущие протоколы ограничить количество отдельных процедур, которые могут быть включены в том же эксперимент и ограничить количество биологических реплицирует, которые обоснованно могут быть включены для каждого лечения. Эти ограничения сделать его более трудным для проведения всеобъемлющей и одновременное сравнение нескольких лечения. Такие сравнения может быть особенно трудно, если разница в экспрессии генов между процедурами является скромным и относительно большое количество биологических реплицирует необходима для создания статистической значимости.
Упрощенный протокол представлен здесь, что частично автоматизирует подготовку экстракт зерна и GUS assays позволяют существенно более высокую пропускную способность. Эта новая версия протокола делает возможным включить гораздо большее общее число образцов в эксперименте, позволяя для включения более различных процедур в эксперимент и больше он реплицирует для каждого лечения. Для подготовки зерна экстрактов после бомбардировки и инкубации мы заменили основном автоматизированного шлифования протокол, который использует гомогенизатор шарик, который может обрабатывать 48 образцов одновременно (в около 20 минут). Таким образом, один следователь может подготовить растворимого белка выдержки из почти 200 образцов в меньше времени, что он будет считать группу четырех следователей в руки молоть только 100 образцов. Изменение ГАС assay, осуществляется в 96 хорошо пластины, также требует гораздо меньше труда, что оригинальный протокол, используются отдельные трубки assays.
При подготовке смеси плазмиду для бомбардировки (шаг 3.1), можно использовать эффекторных репортер соотношение 1.0, особенно для предварительных тестов, чтобы определить, если особое эффекторных имеет никакого эффекта вообще. Однако из-за прочности промоутер кукурузы убиквитин (UBI), сильный эффект можно часто наблюдать с гораздо ниже показателей, как показано на рисунке 2B и в ранее опубликованных докладов4,5,6. Другие важнейшие шаги в этом протоколе включают шелушение семян пальто из зерна ячменя и использование четко определенных параметров в аппарате бомбардировки. Если семян пальто не будут удалены полностью, золото microcarriers будет запрещен въезд subtending aleurone клеток. Успешной доставке Золотой microcarriers в aleurone клетки также весьма зависит от конкретного типа разрывной мембраной используется, положение microcarrier крышка крышка, остановки экрана и ткани к бомбардировке. Условия сообщили здесь обычно результат в успешной доставки генов конструкций (см. шаг 8.1) высокий процент (≥70%) обстреляли Ячмень зерно образцов. Следует ожидать, что другие биологические материалы потребуются различные условия для оптимального гена доставки.
Хотя это не описано здесь, можно было бы дальнейшей рационализации процедуры путем проведения флэш-Люцифераза анализов в 96 хорошо пластины. Однако как свет производства от Люцифераза должна быть измерена в Люминометр сразу же после перемешивания белка экстракт с подложкой (люциферин), это потребует использования плиты флеш Люминометр с форсунок, инструмент, который гораздо больше дороже, чем одна труба люминометра.
Представитель сообщил здесь результаты подтверждают, что фактор транскрипции TaABF1 можно активировать HVA1 выражение в отсутствие внешних ABA5,6. Активация HVA1 TaABF1 или экзогенных ABA была предотвращена PLD ингибитор 1-Бутанол, предполагая, что производство фосфатидной кислоты PLD могут потребоваться для активации HVA1 . Эти результаты для HVA1 регулирования TaABF1 и ABA аналогичны тем полученным Цзоу et al. 10 для активации HVA22 фактор транскрипции LtWRKY21 и ABA. Вывод H2O2 или SNP не заменяют экзогенных ABA в подавлении aleurone выражение Amy32b, подтверждает, что некоторые аспекты ABA сигнализации в зерновых отличаются от того, что происходит в устьичных клетках гвардии. Вывод, что H2O2 не не помощью Amy32b выражение согласуется с результатами наблюдением Исибаси и др. 11 на активность фермента амилазы.
Увеличение пропускной способности протокол в настоящее время используется провести всеобъемлющее исследование эффектов фосфорилирование TaABF1 на его способность регулировать экспрессию генов вниз по течению. Как и другие члены ABF семьи факторов транскрипции можно фосфорилированных ряда различных сайтов12,13,14,15,16, несколько предполагаемых фосфорилирование сайты по TaABF1 должны быть проверены. Более высокая пропускная способность, допускаемых настоящим Протоколом позволит большое количество черепашки версии TaABF1 (с потенциально phosphorylatable серина и треонина остатков изменения) будет допрошен, каждый с большое количество биологических реплицирует.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят за помощь в проведении экспериментов, Джуди камень для консультации по зерна гомогенизации и Линн Ханнум для консультации по флюометрия Грейсон Батлер и Маргарет Барретт. Эта работа была поддержана Национальный научный фонд (IOB 0443676), путем институционального развития Award (IDeA) от национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под номер гранта P20GM0103423 и гранты Отдел Colby Колледж естественных наук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
