Summary
ويرد بروتوكولا محسنة لقياس التعبير الجيني عابرة من ثوابت مراسل في الخلايا الارون الشعير بعد قصف الجسيمات. مزيج الحبوب الآلي طحن مع فحوصات إنزيم لوحة 96-جيدا يوفر إنتاجية عالية لهذا الإجراء.
Abstract
الطبقة الارون الحبوب الشعير نظام نموذجا هاما للتعبير الجيني ينظم هرمون في النباتات. في الخلايا الارون، الجينات المطلوبة للإنبات أو يتم تنشيط التنمية الشتلات في وقت مبكر من جبرلين (GA)، في حين يتم تنشيط الجينات المرتبطة باستجابات الإجهاد من حمض التسقيط (ABA). يمكن استجوابهم آليات GA وأبا إشارات بإدخال ثوابت الجينات مراسل الارون الخلايا عن طريق القصف الجسيمات، مع تعبير عابر الناتجة تقاس باستخدام فحوصات إنزيم. وضع بروتوكول تحسين يقال أن جزئيا بأتمتة ويبسط خطوة التجانس الحبوب وفحوصات إنزيم، السماح بإنتاجية أكبر بكثير من الأساليب القائمة. تجانس عينات الحبوب يجري استخدام الخالطون نسيج الآلي، وفحوصات غوس (β-جلوكورونيداسي) وتنفذ باستخدام نظام لوحة 96-جيدا. نتائج تمثيلية باستخدام البروتوكول تشير إلى أن النشاط phospholipase د قد تلعب دوراً مهما في تنشيط الجينات HVA1 برابطة المحامين الأمريكية، من خلال عامل النسخ TaABF1.
Introduction
طبقة الارون الشعير نظام نموذجي راسخة لدراسة التعبير الجيني ينظم هرمون في النباتات1. على وجه الخصوص، يتم تنشيط عدد من الجينات المطلوبة للإنبات أو الشتلات المبكرة من جبرلين (GA)، في حين يتم تنشيط الجينات المرتبطة باستجابات الإجهاد من حمض التسقيط (ABA). تتشابك GA وأبا إشارات المسارات، كما تحول دون التعبير عن بعض الجينات تنشيط الجمعية العامة برابطة المحامين الأمريكية، والعكس بالعكس1.
استراتيجية قيمة لفهم دور الأطراف الفاعلة خاصة في الإشارات GA/أبا قد تم الأخذ بنيات الجينات المستجيب عبر قصف الجسيمات، متبوعاً بالتعبير عابر للمراسل بنيات تسمح بذلك من الأثر على التعبير الجيني المتلقين للمعلومات تحديد. يسمح استخدام الجينات مراسل مثل غوس (β-جلوكورونيداسي) أو لوسيفراس قياس الكمية وحساسة للتعبير الجيني على وجه التحديد داخل الخلايا التي حصلت في بناء المستجيب. على سبيل المثال، أنشأت الأخذ ببناء المستجيب ترميز عامل النسخ5،TaABF16 أن الجينات التي يسببها أبا مثل HVA1 هي الناجمة عن TaABF1، بينما الجينات التي يسببها GA مثل Amy32b يتم قمعها. قد استخدمت القصف الجسيمات كاستراتيجية تجريبية بمختبرات متعددة للتحقيق في الجوانب المتنوعة لإشارات GA/أبا. مثل هذا العمل قد أدى إلى تحديد عناصر المروج هامة لتفعيل المستحثة ألجأ2 والجينات التي يسببها أبا3، وإلى اكتشاف بروتين مؤنزم4 وعوامل النسخ5 التي تنظم التعبير عن هذه الجينات.
القائمة بروتوكولات2،3،4،5،6 لقصف الجسيمات وقياس اللاحقة للتعبير الجيني عابرة هي تماما العمل المكثف، كما قصفت كل مجموعة هو تجانس بالكاد من الحبوب باليد بقذائف الهاون والمدقة وتجري فحوصات إنزيم على حدة. تقارير هذه المخطوطة هو بروتوكول تحسين جزئيا بأتمتة ويبسط خطوة التجانس وفحوصات جوس للسماح بإنتاجية أكبر بكثير، السماح لعدد أكبر من العلاجات لفحصها بالتجربة نفسها، و/أو إدراج replicates أكثر لكل معاملة للحصول على المزيد من النتائج إحصائيا قويا. وتظهر نتائج تمثيلية للتعبير عن نيات مراسل HVA1 و Amy32b ، وينظم على عامل النسخ TaABF1 وكذلك الجمعية العامة، وأبا، والجزيئات التنظيمية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد المستجيب والجينات مراسل بنيات
- بناء المستجيب بنيات التي توظف مروج تأسيسي (مثل الذرة أوبيكويتين، يو بي أي) إلى التعبير بالسيارة من إطار المطلوب قراءة مفتوحة. على سبيل المثال، بناء بلازميد يحتوي على UBI::TaABF1 إلى محرك قوي التعبير التأسيسي من TaABF15.
- بناء بني مراسل التي تشمل المروج التي يتمثل نشاطها إلى قياس ووضع المراحل الأولى من إطار القراءة المفتوحة، مثل غوس. على سبيل المثال، بناء بلازميد يحتوي على HVA1::GUS لقياس التعبير من HVA1 المروج2،5.
- بناء بنية رقابة داخلية (مثل يو بي أي::لوسيفراس).
- استخدام عمود ربط والسليكا البروتوكول (انظر الجدول للمواد)، وإعداد بلازميد عالية الجودة لكل من بنيات الجينات المطلوبة. استخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول للمواد)، بدقة قياس تركيز كل إعداد بلازميد.
2-إعداد الحبوب الشعير للقصف
- قم بإعداد جدول بيانات (انظر الشكل 1 على سبيل مثال) تشير إلى البلازميدات التي سيتم قصف والعلاجات المناسبة هرمون، والمعلومات الأخرى ذات الصلة لكل من المعاملة التي ستكون جزءا من هذه التجربة.
- استخدام قطع مجلس وشفرة حلاقة عقيمة، قطع الأجنة من الحبوب من الشعير هيمالايا (40 لكل معاملة المدرجة في هذه التجربة). استبعاد الحبوب التي أصغر بكثير من متوسط أو مشوه.
- ضع جميع الحبوب امبريولس في أنبوب 50 مل. إضافة 40 مل من المياه والصخور لمدة 10 دقائق.
- صب الماء بعناية (لتجنب فقدان الحبوب) وإضافة 40 مل التبييض 10%. روك لمدة 20 دقيقة.
- من أجل الخروج التبييض وإضافة 40 مل الماء المعقم. روك لمدة 5 دقائق. كرر هذا يغسل الماء المعقم أربع مرات أكثر.
- إضافة 40 مل من "محلول الشرب" (20 مم سوكسيناتي الصوديوم، وكلوريد الكالسيوم 20 مم، pH 5.0) و 40 ميكروليتر من الكلورامفينيكول الحل الأسهم (10 ملغ/مل).
- نقل معظم "الحل الشرب" (مع الكلورامفينيكول) من الأنبوب إلى "لوحة الفيرميكوليت" (انظر الجدول للمواد). ثم نقل الحبوب على سطح الورق تصفية الرطب في "لوحة الفيرميكوليت". انتشرت الحبوب بشكل متساو. أغرقت صب في الحل إيمبيبينج ما يكفي للحفاظ الحبوب جزئيا (ولكن ليس تماما). ضع غطاء على رأس "لوحة الفيرميكوليت".
- احتضان الحبوب امبريولس عند 24 درجة مئوية لحوالي 48 ساعة مع إضاءة الفلورسنت. إضافة "حل الشرب" إضافية حسب الضرورة.
- فتح طبق بيتري بلاستيك 90 ملم وصب 20 مل من "حل الشرب" في الطبق نفسه و 20 مل في غطاء مقلوب. إضافة 20 ميكروليتر الكلورامفينيكول (10 مغ/مل) لكل منهما. تعقيم اثنين من أزواج من الملقط نقطة غرامة بغمس لهم في الكحول.
- وضع عدد قليل من الحبوب امبريولس في غطاء طبق بيتري. بلطف باستخدام الملقط، إزالة المعطف البذور (شفاف) من كل الحبوب. أثناء إزالة المعطف البذور من الجانب السلس من الحبوب، لا تضر الخلايا (الارون) الأساسية. نقل الحبوب مقشرة على طبق بتري يحتوي على "الشرب الحل".
- بعد تقشير البذور معطف من جميع الحبوب، إعادتها إلى "لوحة الفيرميكوليت". احتضان الحبوب امبريولس مقشرة عند 24 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة.
- قبل استخدام الحبوب للقصف، إزالة الرطوبة السطحية التي تهتز لها بين أوراق التصفية في طبق بتري.
3-إعداد بلازميد الحمض النووي للقصف
- قم بتسمية أنبوب 1.5 مل لكل معاملة التي سيتم تضمينها في تجربة القصف. لكل أنبوبة إضافة 2.5 ميكروغرام من يو بي أي::لوسيفراس الرقابة الداخلية بلازميد، 2.5 ميكروغرام بلازميد مراسل غوس ، والمبلغ المطلوب (عادة 0.025 ميكروغرام إلى 2.5 ميكروغرام) من بلازميد المستجيب. إضافة المياه تحقيق الحجم الإجمالي إلى 5 ميليلتر.
- إعداد 1.6 ميكرون الذهب ميكروكاريرس (انظر الجدول للمواد) التالية نشرت البروتوكولات6.
- لكل معاملة، إضافة 50 ميليلتر من ميكروكاريرس مع وقف التنفيذ في أنبوب 1.5 مل تحتوي على الحمض النووي بلازميد. معطف ميكروكاريرس مع بلازميد الحمض النووي وفقا للشركة المصنعة للبروتوكولات6.
- في الخطوة الأخيرة، عندما يتم تعليق في 48 100% ميليلتر الإيثانول، بيبيت 8 ميكروليتر من ميكروكاريرس مع وقف التنفيذ على كل من ماكروكاريرس خمسة ميكروكاريرس المغلفة بلازميد والسماح لهم بالهواء الجاف.
4-الجسيمات القصف من الحبوب الشعير امبريولس
- قم بإعداد الجهاز القصف الجسيمات (انظر الجدول للمواد)6.
- ضع قرص تمزق هذه المبادرة 1550 إلى الحد الأقصى الاحتفاظ وجبل على الصك.
- ضع ماكروكارير التي تحتوي على تركيبة بلازميد المطلوب (جنبا إلى جنب مع شاشة توقف) إلى الجمعية العامة إطلاق ميكروكارير. إدراج الجمعية في الفتحة أعلى دائرة القصف. تعيين المسافة بين تمزق القرص الاحتفاظ بغطاء وغطاء غطاء ماكروكارير على مسافة قياسية (6 ملم)، ووضع دعم شاشة التوقف في الموقف الوسط (قياسي)، مما يسمح لمسافة سفر ماكروكارير 11 مم (الشكل 2A).
- ترتيب الحبوب امبريولس 8 في نمط شعاعي ضيق (مع نهايات أرق مشيراً إلى الداخل) في دائرة تصفية ورق الذي يتم مسجلة أسفل مسطحة لغطاء طبق بيتري 90 مم (انظر الشكل 2).
- ضع الطبق مع الحبوب إلى غرفة عمليات القصف، على مسافة 6 سم من شاشة التوقف.
- إخلاء قاعة القصف إلى 95 كيلوباسكال وثم قصف العينة.
- بعد الإفراج عن الفراغ، نقل الحبوب قصفت على طبق بيتري مسمى 60 ملم تحتوي على 4 مل من "محلول الشرب" يحتوي على 1 ملغ/مل كلورامفينيكول.
- كرر حتى تم إكمال كافة عمليات القصف. احتضان (على منصة تهز 100 لفة في الدقيقة) عند 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
5-استخراج البروتين للذوبان من الحبوب قصفت
- استخدام الملقط، إزالة الحبوب قصفت 8 من طبق بيتري 60 ملم ولطخة لهم الجافة على منشفة ورقية. تقسيم الحبوب إلى أنبوبين مل 2.0 المسمى (الحبوب 4 كل أنبوب) كل منها يحتوي على 800 ميكروليتر "طحن المخزن المؤقت" (100 مم نا فوسفات الهيدروجيني 7.2، 5 مم DTT، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، والغليسيرول 20 ٪) وحبه 5 مم من فولاذ المقاوم للصدأ. كرر هذه العملية لكل من الحبوب قصفت.
- ضع (تصل إلى 48) 2.0 مل أنابيب إلى رفوف اثنين من الخالطون حبة (انظر الجدول للمواد). تحميل الرفوف على الخالطون.
- هز العينات في 30 هرتز لمدة 3 دقائق.
- إزالة الرفوف الخالطون من الخالطون ووضعها على الجليد (5 دقائق) لإعادة تبريد العينات.
- جبل الرفوف مرة أخرى على الخالطون-في الاتجاه المعاكس. هز العينات مرة أخرى في 30 هرتز لمدة 3 دقائق.
- بارد رفوف على الجليد، ثم كرر "الخطوات 5، 3" إلى 5.5. هذا وسوف تضيف ما يصل إلى ما مجموعة 12 دقيقة من الهز.
- الطرد المركزي مقتطفات الحبوب في س 16,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- فورا بعد الطرد المركزي، صب supernatants واضحة في مجموعة ثانية من أنابيب ميكروسينتريفوجي. إعطاء كل أنبوب دوامة سريعة. تخزين الأنابيب على الجليد.
- بعد نقل المادة طافية، استرداد الخرز الصلب من الكريات حيث يمكن غسلها وإعادة استخدامها.
6-قياس النشاط لوسيفراس من مقتطفات الحبوب
- لكل أنبوبة من استخراج الحبوب تكون جزيئي، إعداد أنبوب اختبار زجاج 12 مم × 75 مم تحتوي على 200 ميكروليتر من "خليط الإنزيم لوسيفراس" (45 ملم تريس كبريتات الأس الهيدروجيني 7.7، 15 مم مجكل2، 20 مم DTT، 1.5 مم يدتا، لوسيفرين 1 مم، ATP 1 مم).
- إضافة 100 ميكروليتر من استخراج الحبوب أول أنبوب الفحص الأولى. الدوامة بسرعة مزيج جيد. فورا وضع الأنبوبة في حامل أنبوب لومينوميتير وأغلق الباب. عند الانتهاء من القياس، إزالة الأنبوب من لومينوميتير – ترك الباب مفتوحاً لموضع الأنبوب القادم.
- كرر هذه العملية حتى تم قياس جميع العينات.
7-قياس النشاط جوس من مقتطفات الحبوب
- إضافة 200 ميكروليتر من "المخزن المؤقت للمقايسة غوس" (50 مم نا الفوسفات الرقم الهيدروجيني 7.2، 2.5 ملم 4-ميثيلومبيليفيريل-د-بالجلوكويورونويد، 10 مم DTT، 2 مم يدتا، 10 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، 20% ميثانول، أزيد الصوديوم 0.02 في المائة) لكل بئر من صفيحة جيدا 96.
- استخراج مكان 50 ميكروليتر من كل الحبوب في المقابلة أيضا. مزيج مع التلميح بعد إضافة. ختم الجزء العلوي مع ختم الفيلم.
- احتضان 96 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 20 ساعة.
- الطرد المركزي 96 لوحة جيدا في س 4,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ووضعه على الجليد.
- إضافة 250 ميكروليتر من 0.2 م Na2CO3 لكل بئر من لوحة سوداء 96 جيدا.
- إضافة ميكروليتر 6.25 كل خليط المقايسة جوس سينتريفوجيد في المقابل جيدا (التي تحتوي على 0.2 م Na2CO3) الأسود 96 لوحة جيدا. مزيج مع التلميح بعد إضافة. وتشمل الآبار مع ميكروليتر 6.25 10 ميكرومترات و 40 ميكرومتر ميكرومترات 100 4-ميثيلومبيليفيروني كمعايير.
- ضع اللوحة السوداء في فلوروميتير لوحة وقراءة الأسفار ميثيلومبيليفيروني. أخذ القراءات في الطول موجي إثارة 360 نيوتن متر، والطول موجي انبعاثات من 460 نانومتر. تعيين كسب الصك أن ميكروليتر 6.25 تتضمن أيضا من 40 ميكرومتر 4-ميثيلومبيليفيروني و 250 ميكروليتر من 0.2 م Na2CO3 يعطي قراءة 1000 وحدة الأسفار.
8-بيانات التحليل
- أدخل القيم لوسيفراس وفحوصات غوس في جدول بيانات. استبعاد من النظر في أي نموذج بقراءة لوسيفراس لأقل من 20,000 التﻷلؤ النسبية وحدات s-1، كما يشير هذا إلى أن بنيات الجينات لم تسلم بنجاح إلى الخلايا الارون.
- لكل الحبوب قصفت بنجاح استخراج (الذين يمثلون مجموعة من الحبوب امبريولس أربعة)، حساب التعبير غوس مسواة من البيانات الخام غوس ولوسيفراس على النحو التالي: تطبيع غوس = [(غوس التعبير-غوس فارغة) x (2,000,000)]/(لوسيفراس التعبير – لوسيفراس فارغ).
ملاحظة: هذا طبيعتها مقدار نشاط غوس إلى ما قد لوحظت في قصف الذي أعطى قراءة لوسيفراس 2,000,000. - تقرير المستوى النسبي للتعبير عن بناء مراسل خاص حضور المستجيب بنيات أو علاجات الهرمون يتم اختباره عن طريق مقارنة بمستوى التعبير في الغياب المستجيبة أو الهرمونات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لإدخال أي بناء اختبار الجينات في الخلايا الارون الحبوب الشعير. ثم قد يكون مستوى التعبير عن الجين اختبار قياس ملائم (الشكل 2). البروتوكول إنتاجية أعلى الموصوفة هنا إلى حد كبير يزيد من كفاءة طحن البذور والخطوات إنزيم المقايسة. وقد استخدمت هذه الطريقة لتقييم قدرة5،TaABF1 عامل النسخ6 على تنشيط التعبير عن الجينات التي يسببها أبا HVA17. في الممثل النتائج المعروضة هنا، وبدأ بناء مراسل HVA1::GUS إلى خلايا الارون جنبا إلى جنب مع بنية المستجيب UBI::TaABF1 (الشكل 3A). في حين TaABF1/HVA1 نسبة 0.01 فقط كان كافياً للتسبب تحريض الجينات مراسل HVA1 3-fold في غياب أبا خارجية المنشأ، ومستويات أعلى لبناء TaABF1 أدى أكبر تدريجيا HVA1 التعبير، بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 3، ج).
قد يتضمن هذا البروتوكول التجريبي أيضا استخدام الهرمونات أو غيرها من المركبات خلال فترة الحضانة بعد انتهاء القصف لتقييم دور هذه الجزيئات في تنظيم التعبير الجيني. واقترحت العمل السابق محققون آخرون أهمية phospholipase د في بعض الجوانب من إشارات أبا. على وجه التحديد، قد تورط نتاج النشاط phospholipase د، حمض فوسفاتيديك، كوسيط في بعض الردود أبا8،9. حقيقة أن 1-butanol، مثبط من فوسفوليباسي د (PLD)، قد ثبت لمنع التعبير الجيني المستحثة أبا في الخلايا الارون يوحي بأن الملعوبة قد يكون جزءا لا يتجزأ من أبا إشارات في هذا النسيج. وكان استخدام البروتوكول القصف اختبار ما إذا كان يمكن أن تمنع 1-butanol التعبير HVA1 المستحثة أبا أو الناجمة عن TaABF1. كما هو متوقع، يمكن بشدة الحث خارجية أبا أو TaABF1 على التعبير عن بناء مراسل HVA1::GUS (الشكل 3). وفي كلتا الحالتين، أعاق وجود 1-butanol بقوة التعريفي HVA1 . وهذا يوحي بأن الملعوبة يمكن أن تلعب دوراً مهما في تنشيط الجينات HVA1 برابطة المحامين الأمريكية، عن طريق TaABF1.
بالإضافة إلى دورها في البلدان النامية والإنبات الحبوب، أبا ضروري لتنظيم الفتحة ستوماتال في أوراق. في زنزانات حارس الثغور، هو تحفيز إنتاج حمض فوسفاتيديك من أكسيد النيتريك (لا)، الذي هو بدوره فعل بيروكسيد الهيدروجين (حاء2يا2). لبعض الردود، لا وح2س2 يمكن أن تكون بديلاً لابا9. لتحديد ما إذا كان هذا هو الحال في خلايا الارون أيضا، تم استخدام البروتوكول القصف اختبار ما إذا كان أي الجهات المانحة الصوديوم nitroprusside (SNP) أو ح2س2 يمكنها أن تحل محل لابا في تثبيط التعبير عن التي يسببها GA Amy32b الجينات. بينما أبا يمكن أن تعوق بشدة التعبير المستحثة ألجأ تشييد مراسل Amy32b::GUS، ح2س2 لا SNP تسبب أي خفض كبير (3D الشكل). هذه النتائج، ولذلك، لا تدعم دور لا وح2س2 في استجابات الخلية أبا اليوروني.
الشكل 1 : جدول البيانات لتجربة قصف نموذجية- ويرد المبلغ لكل إعداد بلازميد لتوضع في الأنبوب لكل عمليات القصف. واستخدمت في هذه التجربة، أربع طلقات (8 الحبوب في كل) لكل معاملة لإعطاء مجموعة من ثمانية عينات ممكن (4 الحبوب في كل) لكل معاملة. بغية الحفاظ على تركيز الحمض النووي المجموع نفسه في كل قصف، استخدمت بلازميد المستجيب "دمية" أن تكون بديلاً عن بلازميد المستجيب UBI::TaBF1 في بعض الحالات. العلاج بقصف "على بياض" تحديد مستوى النشاط غوس ولوسيفراس في خلايا الارون الخلفية. وترد في الشكل 3Bنتائج التجربة القصف المبينة في جدول البيانات هذا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الرسم التخطيطي للبروتوكول. (أ) التخطيطي للجهاز القصف. (ب) جزيئات الذهب المغلفة مع بنية مراسل يحمل المروج لفحصها والمستجيب (إذا لزم الأمر)، ورقابة داخلية (UBI::luciferase) تدخل في الخلايا الارون الشعير بالقصف الجسيمات. بعد الحضانة (عادة على 24 ساعة)، هي الأرض الحبوب وجزيئي للنشاط غوس والنشاط لوسيفراس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : التنظيم للمروجين HVA1 و Amy32b ب TaABF1، وأبا، والوسطاء المحتملين لإشارات أبا. (أ) المراسل والمستجيب ثوابت المستخدمة في التجارب. (ب) كان قصفت بناء المستجيب UBI::TaABF1 شارك في خلايا الارون مع المراسل HVA1::GUS وبنية الرقابة الداخلية (UBI::luciferase). مقدار المستجيب UBI::TaABF1 (بالنسبة للمراسل HVA1::GUS ) تتراوح من 0 إلى 0.1، كما هو مبين أدناه الحانات. تم قياس أنشطة غوس ولوسيفراس بعد 24 ساعة حضانة. البيانات المعروضة هي الوسيلة (± SE) من 6-8 replicates البيولوجية. (ج) مراسل HVA1::GUS قد شارك تعرضت لقصف في خلايا الارون مع بنية الرقابة الداخلية (UBI::luciferase) في وجود أو عدم وجود بنية المستجيب UBI::TaABF1. والمبلغ للمستجيب TaABF1 (بالنسبة للمراسل) 1.0. تم قياس أنشطة غوس ولوسيفراس بعد 24 ساعة حضانة مع أو بدون 20 ميكرومتر أبا و 0.4% 1-butanol. (د) مراسل Amy32b::GUS قد قصفت شارك في خلايا الارون مع بنية الرقابة الداخلية (UBI::luciferase). تم قياس أنشطة غوس ولوسيفراس بعد 24 ساعة حضانة حضور 1 ملم ألجأ مع أو بدون أبا 20 ميكرومتر، 1 ملم ح2س2أو 100 ميكرومتر الصوديوم nitroprusside (SNP). القيم لنشاط غوس بالنسبة إلى التعبير عن مراسل Amy32b::GUS في غياب ga. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بنيات إدخال الجينات المستجيب عبر قصف الجسيمات، متبوعاً بالتعبير عابرة من بنيات مراسل استراتيجية قيمة لتشريح دور الأطراف الفاعلة خاصة في الإشارات GA/أبا والجين ينظم هرمون الناتجة التعبير.
ومع ذلك، هي البروتوكولات القائمة لإجراء مثل هذه التجارب في الشعير الارون الخلايا2،3،،من45،6 جداً كثيفة العمالة. كل مجموعة من قصف بالكاد الحبوب يجب أن تكون ناحية تجانس بقذائف الهاون والمدقة، والمقتطفات الناتجة هي جزيئي فردياً للنشاط غوس ولوسيفراس. البروتوكولات الحالية وبالتالي الحد من العلاجات منفصلة التي يمكن تضمينها في نفس التجربة، وتحد من عدد replicates البيولوجية التي يمكن تضمينها لكل معاملة معقولة. وهذه القيود جعله أكثر صعوبة القيام بمقارنات شاملة ومتزامنة بين علاجات متعددة. يمكن أن تكون هذه المقارنات صعبة بصورة خاصة إذا كان الفرق في التعبير الجيني بين العلاجات متواضعة وهناك حاجة إلى عدد كبير نسبيا من replicates البيولوجية إثبات دلالة إحصائية.
بروتوكول مبسط يرد هنا بشكل جزئي أتمتة إعداد استخراج الحبوب وفحوصات جوس للسماح بإنتاجية أعلى بكثير. هذا الإصدار الجديد للبروتوكول يجعل من الممكن إدراج عدد إجمالي أكبر كثيرا من عينات في تجربة، مما يسمح لكل من إدراج العلاجات المختلفة أكثر تجربة، وأكثر وإنشاء نسخ متماثلة لكل معاملة. لإعداد خلاصات الحبوب بعد القصف، والحضانة، ونحن قد استبدال بروتوكول طحن الآلي إلى حد كبير أن يستخدم الخالطون حبة يمكنه معالجة 48 عينات في وقت واحد (في حوالي 20 دقيقة). وهكذا، يمكن لمحقق واحد إعداد البروتين للذوبان مقتطفات من ما يقرب من 200 طحن عينات في وقت أقل في أن الأمر سيستغرق فريقا من أربعة محققين لتسليم عينات 100 فقط. كما يتطلب المقايسة غوس المعدلة، نفذت في لوحات جيدا 96، أقل بكثير العمل الأصلي للبروتوكول الذي يستخدم أنبوب الفردية فحوصات.
في إعداد الخلائط بلازميد للقصف (الخطوة 3.1)، من الممكن استخدام المستجيب لمراسل نسبة 1.0، خاصة بالنسبة للاختبارات الأولية لتحديد إذا كان المستجيب صفة خاصة أي أثر على الإطلاق. ومع ذلك، بسبب قوة المروج ubiquitin الذرة (يو بي أي)، تأثير قوي يمكن غالباً ملاحظة مع نسب أقل بكثير، كما يتضح في الشكل 2 (ب) وفي التقارير المنشورة سابقا4،،من56. وتشمل الخطوات الحاسمة الأخرى في هذا البروتوكول تقشير البذور معطف من الحبوب الشعير واستخدام الإعدادات المحددة بعناية في الجهاز القصف. إذا لم يتم إزالة المعاطف البذور تماما، ميكروكاريرس الذهب سيمنع من دخول الخلايا الارون سوبتيندينج. النجاح في إيصال ميكروكاريرس الذهب في الخلايا الارون أيضا يعتمد تماما على نوع محدد من تمزق القرص المستخدمة، ووضع غطاء غطاء ميكروكارير وشاشة التوقف، والأنسجة قصف. الشروط التي ذكرت هنا عادة تؤدي إلى النجاح في إيصال من بنيات الجينات (راجع الخطوة 8، 1) إلى نسبة مئوية عالية (إيه سيفن زيرو ٪) من عينات الحبوب الشعير قصفت. ينبغي أن يتوقع أن المواد البيولوجية الأخرى تتطلب شروط مختلفة لإيصال الجينات الأمثل.
على الرغم من أن لا يتم وصف هنا، أنه سيكون من الممكن مواصلة تبسيط الإجراء بإجراء فحوصات لوسيفراس فلاش في لوحات جيدا 96. ومع ذلك، كما يجب أن يقاس إنتاج الضوء من لوسيفراس في لومينوميتير فورا بعد خلط البروتين استخراج مع الركازة (لوسيفرين)، سيتطلب استخدام لوحة فلاش لومينوميتير مع الحقن، صك ما أكثر من ذلك بكثير تكلفة من لومينوميتير أنبوب واحد.
وتؤكد النتائج الممثلة ذكرت هنا أن عامل النسخ TaABF1 يمكن تنشيط HVA1 التعبير في الغياب5،أبا الخارجية6. تفعيل HVA1 TaABF1 أو ABA خارجية منعت بسبب 1 مثبطات الملعوبة-butanol، مما يوحي بأن إنتاج حمض فوسفاتيديك من الملعوبة قد تكون مطلوبة من أجل تفعيل HVA1 . هذه النتائج للتنظيم HVA1 TaABF1 وأبا مماثلة لتلك التي حصل عليها زو et al. 10 لتفعيل HVA22 عامل النسخ LtWRKY21، ورابطة المحامين الأمريكية. استنتاج مفاده أن ح2س2 أو SNP ليست بديلاً لابا خارجية في قمع التعبير اليوروني من Amy32b، يؤكد أن بعض الجوانب من إشارات أبا في الحبوب تختلف عن ما يحدث في خلايا الحرس ستوماتال. الاستنتاج أن ح2س2 لا دوونريجولاتي ب Amy32في التعبير لا يتسق مع النتائج التي لاحظها ايشيباشي et al. 11 لنشاط إنزيم الأميليز.
بروتوكول زيادة الإنتاجية يستخدم الآن القيام بدراسة شاملة لآثار الفسفرة TaABF1 على قدرته على تنظيم التعبير الجيني المتلقين للمعلومات. كسائر أعضاء ABF يمكن فوسفوريلاتيد الأسرة من عوامل النسخ في عدد من المواقع المختلفة12،13،14،،من1516، الفسفرة المفترضة متعددة مواقع في TaABF1 تحتاج إلى اختبار. الإنتاجية الأعلى المسموح به بموجب هذا البروتوكول سيتيح عدد كبير من إصدارات متحولة من TaABF1 (مع سيرين يحتمل أن فوسفوريلاتابل وبقايا ثريونين تعديل) استجوابهم، يتطابق مع عدد كبير من البيولوجية كل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون غريسون بتلر ومارغريت باريت للمساعدة في القيام التجارب وستون جودي لإسداء المشورة بشأن التجانس الحبوب هانوم لين لإسداء المشورة بشأن فلوروميتري. هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم (0443676 المعهد المصرفي)، "جائزة التنمية المؤسسية" (فكرة) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم المنحة P20GM0103423، والمنح المقدمة من كلية كولبي شعبة العلوم الطبيعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
