Summary
提出了一种改进的协议, 用于测量粒子轰击后大麦糊粉层细胞中的瞬时基因表达。采用全自动谷物研磨与96井板酶检测相结合, 为该过程提供了较高的吞吐量。
Abstract
大麦籽粒糊粉层层是植物激素调控基因表达的重要模型体系。在糊粉层细胞中, 萌发或早期幼苗发育所需的基因由赤霉素 (GA) 激活, 而与应激反应相关的基因则由脱落酸 (ABA) 激活。通过粒子轰击引入糊粉层细胞的基因构造, 可以对 GA 和 ABA 信号的机制进行审问, 并利用酶法测定结果的瞬态表达。报告了一种改进的协议, 部分自动化和简化了谷物均匀化步骤和酶的测定, 使吞吐量大大超过现有方法。采用全自动组织均质器进行谷物样品的均匀化, 用96井板系统进行 GUS (β glucuronidase) 测定。使用该协议的代表性结果表明, 磷脂酶 D 活性可以发挥重要作用, 激活HVA1基因表达的 ABA, 通过转录因子 TaABF1。
Introduction
大麦糊粉层层是植物激素调控基因表达研究的一个成熟的模型系统1。特别是, 一些需要发芽或早期幼苗发育的基因由赤霉素 (GA) 激活, 而与应激反应相关的基因则由脱落酸 (ABA) 激活。ga 和 aba 信号通路是交织在一起的, 因为一些 ga 激活基因的表达被 ABA 抑制, 反之亦然1。
了解特定行为者在 GA/ABA 信号中的作用的一个有价值的策略是通过粒子轰击引入效应基因构造, 接着是记者构造的瞬态表达, 从而使结果影响下游基因表达的确定。使用报告基因, 如GUS (β-glucuronidase) 或荧光素酶允许对基因表达式的敏感和定量测量, 特别是在接收到效应器结构的细胞内。例如, 引入了一个对转录因子 TaABF15,6编码的效应器构造, 它建立了 ABA 诱导的基因, 如HVA1是由 TaABF1 诱导的, 而 GA 诱导的基因, 如Amy32b被压抑。粒子轰击作为一种实验策略已被多个实验室用来研究遗传/ABA 信号的不同方面。这项工作已导致识别启动子元素重要的激活两个 GA 诱导的2和 ABA 诱导的基因3, 并发现蛋白激酶4和转录因子5 , 调节这些基因的表达。
现有协议2,3,4,5,6为粒子轰击和随后的瞬态基因表达测量是相当劳动密集型的, 因为每套轰炸在砂浆和杵中, 几乎没有谷物是均匀的, 酶的测定是单独进行的。这篇手稿报告了一个改进的协议, 部分自动化和优化均匀化步骤和 GUS 化验, 以允许大量的吞吐量, 允许更多的治疗在同一实验中测试, 和/或包含更多的复制, 每种治疗获得更有统计学意义的结果。代表的结果显示为HVA1和Amy32b报告器构造的表达式, 由转录因子 TaABF1 以及 GA、ABA 和其他调控分子调控。
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Protocol
1. 效应器和报告基因构造的制备
- 构建使用本构启动子 (如玉米泛素, UBI) 的效应器构造, 以从所需的开放阅读框架中驱动表达式。例如, 构造一个包含UBI::TaABF1的质粒, 以驱动 TaABF15的强本构表达式。
- 生成包括要测量其活动的启动器的报告器结构, 放置在打开的阅读框架的上游, 如GUS。例如, 构造一个包含HVA1::GUS的质粒, 用于测量从HVA1启动子2,5的表达式。
- 生成内部控件构造 (例如UBI::荧光素酶)。
- 使用硅胶绑定列协议 (参见材料表), 为每个必需的基因构造准备高质量的质粒。使用紫外光谱 (参见材料表), 仔细测量每种质粒制备的浓度。
2. 为轰炸准备大麦谷物
- 设置电子表格 (请参见图 1 ), 指出将被轰炸的质粒、适当的激素治疗以及将作为实验一部分的每种治疗的其他相关信息。
- 使用切割板和无菌剃刀刀片, 从喜马拉雅大麦的谷物中切下胚胎 (试验中包括的每种治疗 40)。排除变色或大大小于平均值的谷物。
- 将所有的 embryoless 颗粒放入50毫升管中。加入40毫升的水和岩石10分钟。
- 仔细倒入水 (以避免失去谷物), 并添加40毫升10% 漂白剂。摇滚20分钟。
- 倒出漂白剂, 加入40毫升的无菌水。摇滚5分钟。重复这种无菌水洗四次。
- 添加40毫升的饮用溶液 (20 毫米琥珀酸钠, 20 毫米氯化钙, pH 5.0) 和 40 ul 的氯霉素库存溶液 (10 毫克/毫升)。
- 将大部分的饮用溶液 (与氯霉素) 从管子转移到蛭石板 (参见材料表)。然后将谷物转移到蛭石板上湿滤纸的表面。均匀地分散谷物。倒入足够的饮用溶液, 使谷物部分 (但不完全) 淹没。把盖子放在蛭石板的顶部。
- 用萤光灯孵化24摄氏度的 embryoless 颗粒, 大约48小时。必要时添加其他饮用解决方案。
- 打开一个90毫米塑料培养皿和倒入20毫升的饮用溶液到盘子本身和20毫升进入倒盖。添加 20 ul 的氯霉素 (10 毫克/毫升)。用酒精浸泡两对细点钳。
- 将一些 embryoless 谷物放入培养皿的盖子中。使用镊子, 轻轻地去除每粒谷物 (透明) 的种子大衣。从谷物的平滑面除去种子外衣时, 不要损害底层 (糊粉层) 细胞。将去皮的谷物转移到含有饮用溶液的培养皿中。
- 剥去所有谷物的种子后, 把它们放回蛭石板上。将去皮的 embryoless 颗粒孵化24摄氏度, 16-20 小时。
- 就在使用谷物进行轰炸之前, 通过在培养皿中的滤纸之间摇动来去除表面水分。
3. 用于轰击的质粒 DNA 的制备
- 标记一个1.5 毫升管为每个治疗, 将包括在轰炸实验。对每个管添加2.5 µg 的UBI::荧光素酶内部控制质粒, 2.5 µg GUS报告质粒, 以及所需的量 (通常0.025 µg 到2.5 µg) 的效应质粒。加水, 使总容积达5µL。
- 在发布的协议6之后, 准备1.6 µm 金载体 (参见材料目录)。
- 对于每种治疗, 添加50µL 的悬浮载体到1.5 毫升管含有质粒 DNA。根据制造商的协议6, 将载体与质粒 DNA 一起涂上。
- 在最后一步, 当质粒涂层的载体悬浮在48µL 100% 乙醇, 吸管 8 ul 悬浮载体到每五 macrocarriers 和允许他们空气干燥。
4. Embryoless 大麦颗粒的微粒轰击
- 设置粒子轰击装置 (请参阅材料表)6。
- 将 1550 psi 破裂盘放入固定帽, 并将其安装在仪器上。
- 将含有所需质粒组合 (连同停止屏幕) 的 macrocarrier 放入载体发射组件中。将组件插入到轰击室的顶槽中。设置在标准距离 (6 毫米) 处的破裂盘护盖与 macrocarrier 盖盖之间的距离, 并将停止屏幕支持置于 (标准) 中间位置, 允许 macrocarrier 旅行距离为 11 mm (图 2A)。
- 将 8 embryoless 颗粒排列在一个紧的径向模式下 (用较薄的一端指向内侧) 在滤纸圈上, 将其固定在一个 90 mm 培养皿的盖子上 (参见图 2B)。
- 放置菜与五谷入炮击房间, 在距离从停止的屏幕 6 cm。
- 将轰炸室疏散至95帕, 然后轰击样品。
- 释放真空后, 将被轰击的谷物转移到一个标记为60毫米的培养皿中, 含有4毫升的饮用溶液, 含有氯霉素的1毫克/毫升。
- 重复, 直到所有的轰炸已经完成。孵育 (在一个震动平台在 100 rpm) 在24°c 24 小时。
5. 从轰击颗粒中提取可溶性蛋白质
- 使用镊子, 从60毫米的培养皿中取出8个被轰击的谷物, 并将它们涂抹在纸巾上晾干。将谷物分成两个标记为2.0 毫升的管子 (每管4粒), 每个含800个 ul 研磨缓冲器 (100 毫米 Na 磷酸盐 pH 值 7.2, 5 毫米, µg/毫升 leupeptin, 10 甘油) 和20% 毫米不锈钢珠。对所有被轰击的谷物重复这个过程。
- 将 (最多 48) 2.0 毫升管放入珠均质机的两个机架上 (请参阅材料表)。将机架安装在均质机上。
- 在30赫兹处摇动样品3分钟。
- 从均质机卸下均质机架, 并将其放在冰上 (5 分钟) 以重新冷却样品。
- 将机架重新安装在均质上-在相反的方向上。再次摇动样品在30赫兹3分钟。
- 冷却在冰上的架子, 然后重复步骤5.3 到5.5。这将增加总共12分钟的震动。
- 离心机的谷物提取物在 1.6万 x g 在4°c 10 分钟。
- 立即离心后, 醒酒清除上清液成第二组离心管。给每个管子一个快速的漩涡。把管子储存在冰上。
- 转移上清液后, 从小球中回收钢珠, 以便清洗和再利用。
6. 从谷物提取物中测定荧光素酶活性
- 要测定每个谷物提取管, 准备一个12毫米 x 75 毫米玻璃试管, 其中含有 200 ul 的荧光素酶检测混合物 (45 毫米三硫酸酯 pH 值 7.7, 15 毫米氯化镁2, 20 毫米, 1.5 毫米 EDTA, 1 毫米荧光素, 1 毫米 ATP)。
- 将第一粒提取物的 100 ul 添加到第一检测管中。涡旋迅速搅拌良好。立即将管置于紫外线的管架中, 并关闭门。当测量完成后, 从紫外线中取下管子--让门打开, 以便放置下一管。
- 重复此过程, 直到测量完所有样品。
7. 谷物提取物中 GUS 活性的测定
- 添加 200 ul 的 GUS 化验缓冲器 (50 毫米 Na 磷酸盐 pH 7.2, 2.5 毫米 4-甲基伞形酮-葡糖苷酸, 10 毫米, 2 毫米 EDTA, 10 µg/毫升 leupeptin, 20% 甲醇, 0.02% 钠氮) 的每一个井的96个井板。
- 将每个谷物提取物的 50 ul 放置到相应的井中。添加后与提示混合。用密封膜密封顶部。
- 在37摄氏度在黑暗中孵化96井板20小时。
- 离心机96井板在 4000 x g 在4°c 10 分钟并且安置它在冰。
- 添加 250 ul 0.2 M Na2CO3到每个井的黑色96井板。
- 将每离心 GUS 检测混合物的 6.25 ul 添加到相应的井中 (包含0.2 米 Na2CO3) 的黑色96井板。添加后与提示混合。包括水井与 6.25 ul 10 微米, 40 微米, 100 微米 4-甲基伞形酮作为标准。
- 把黑盘子放进盘子荧光计, 读甲基伞形酮的荧光。以 360 nm 的激发波长和 460 nm 的发射波长进行读数。设置仪器的增益, 使含有 6.25 ul 的40微米 4-甲基伞形酮和 250 ul 的 0.2 MNa2CO 3 的油井读数为1000年荧光单位。
8. 数据分析
- 在电子表格中输入荧光素酶和 GUS 化验的值。排除从考虑任何样本与荧光素酶读数低于2万相对发光单位 s-1, 因为这表明, 基因构造没有成功地传递到糊粉层细胞。
- 对于每个成功轰击的谷物萃取物 (代表一组四 embryoless 谷物), 从原始 gus 和荧光素酶数据中计算规范化的 gus 表达式如下: 规范化 gus = [(gus 表达式 gus 空白) x (200万)]/(荧光素酶表达-荧光素酶空白)。
注意: 这将 GUS 活动的数量正常化为在一次轰炸中观察到的东西, 使荧光素酶读数为200万。 - 报告一个特定的记者结构的相对水平在存在的效应构造或激素治疗正在测试通过比较的表现水平, 在没有效应或荷尔蒙。
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Representative Results
本文所描述的技术可用于将任何试验基因结构引入大麦籽粒的糊粉层细胞中。然后可以方便地测量测试基因的表达水平 (图 2)。这里描述的高吞吐量协议大大提高了种子研磨和酶测定步骤的效率。该方法已用于评估转录因子 TaABF15、6的能力, 以激活 ABA 诱导的基因HVA17的表达。在这里给出的代表性结果中, HVA1::GUS的报告器构造被引入到糊粉层单元格中, 并与UBI::TaABF1 效果构造(图 3A) 一起传入。虽然TaABF1/HVA1比率仅为 0.01, 足以导致HVA1报告器基因在无外源 ABA 的情况下出现3倍的诱导, 但TaABF1构造的更高级别导致了逐渐增大的HVA1表达式, 以剂量依赖性方式 (图 3B, C)。
这个实验性的协议也可以包括在轰击后潜伏期内使用激素或其他化合物, 以评估这些分子在基因表达调控中的作用。其他研究人员以前的研究表明, 磷脂酶 D 在 ABA 信号的某些方面的重要性。具体来说, 磷脂酶 D 活性的产物, 磷脂酸, 已被牵连作为一个中间的一些回应 ABA8,9。事实证明, 1-丁醇, 磷脂酶 D (PLD) 抑制剂, 已被证明, 以防止 ABA 诱导的基因表达在糊粉层细胞表明, PLD 可能是 aba 信号在这个组织的组成部分。使用轰击协议测试 1-丁醇是否可以抑制 ABA 诱发的或 TaABF1-induced 的HVA1表达式。如所料, 外源 ABA 或 TaABF1 可能强烈诱发HVA1::GUS报告器构造的表达式 (图 3C)。无论哪种情况, 1-丁醇的存在都强烈地抑制了HVA1诱导。这表明, PLD 可以发挥重要作用, 激活HVA1基因表达的 ABA, 通过 TaABF1。
ABA 除了在谷物的发育和发芽中的作用外, 还对调节叶片气孔孔径至关重要。在气孔的守卫细胞中, 磷脂酸的产生是由一氧化氮 (NO) 刺激的, 后者反过来由过氧化氢引起 (H2O2)。对于某些响应, NO 和 H2O2可以替代 ABA9。为了确定在糊粉层细胞中是否也是如此, 轰炸协议被用来测试没有供体的硝普钠 (SNP) 或H2O 2 是否可以替代 ABA 抑制 GA 诱导的 Amy32b 的表达。基因。虽然 ABA 可以强烈抑制 GA 诱导的Amy32b::GUS 报告器构造的表达式, 但无论是 H2O2还是 SNP 都没有造成任何显著的减少 (图 3D)。因此, 这些结果不支持糊粉层单元格 ABA 响应中的 NO 和H2O 2 的角色。
图 1: 用于典型轰炸实验的电子表格.每个轰击的每种质粒准备被放置在管中的数量被表明。在这个实验中, 每种治疗都使用四张 (8 粒) 的疫苗, 每种治疗都给出八种可能的样品 (每种4粒)。为了在每次轰炸中保持相同的总 DNA 浓度, 在某些情况下, 用 "假" 效应质粒代替了UBI::TaBF1效应质粒。治疗 a 是一个 "空白" 的轰炸, 以建立在糊粉层细胞的 GUS 和荧光素酶活性的背景水平。此电子表格中概述的轰炸实验的结果显示在图 3B中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 协议的关系图.(A)轰击装置示意图。(B)包覆有一个记者构造的金粒子, 载有启动子进行测试, 一个效应器 (如果需要) 和内部控制 (UBI:: 荧光素酶) 通过粒子轰击引入大麦糊粉层细胞。孵化后 (通常为24小时), 谷物是地面和化验的 GUS 活动和荧光素酶活性。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 对HVA1和Amy32b启动子的调节, TaABF1、aba 和 aba 信号的潜在中介.在实验中使用的(A)报告器和效应器构造。(B)执行器构造UBI::TaABF1与HVA1::GUS记者和内部控制构造 (UBI:: 荧光素酶) 共同轰击到糊粉层单元格中。UBI::TaABF1效应器 (相对于HVA1::GUS记者) 的数量从0到0.1 不等, 如条形图下面所示。GUS 和荧光素酶的活动测量后24小时的孵化。显示的数据是 6-8 生物复制的手段 (SE)。(C) HVA1::GUS记者在执行器构造UBI::TaABF1的存在或不存在的情况下, 与内部控制构造 (UBI:: 荧光素酶) 共同轰击到糊粉层单元格中。TaABF1 效应器 (相对于记者) 的数量是1.0。GUS 和荧光素酶的活动测量后24小时的孵化与或没有20µM ABA 和 0.4% 1 丁醇。(D) Amy32b::GUS记者与内部控制构造 (UBI:: 荧光素酶) 共同轰击到糊粉层单元格中。GUS 和荧光素酶的活动是在24小时的孵化后测量的存在1毫米 GA 有或没有20µM ABA, 1 毫米 h2O2, 或100µM 钠硝普 (SNP)。在没有 GA 的情况下, GUS 活动的值相对于Amy32b::GUS记者的表达式.请单击此处查看此图的更大版本.
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Discussion
通过粒子轰击引入效应基因构造, 其次是记者构造的瞬态表达, 是解剖特定行为者在 GA/ABA 信号中的作用以及由此产生的激素调控基因的宝贵策略。表达.
然而, 在大麦糊粉层单元格中进行此类实验的现有 协议2, 3, 4, 5, 6 是非常劳力密集.每组被轰击的颗粒必须在砂浆和杵中手工匀质, 结果提取物分别用于 GUS 和荧光素酶的活性测定。因此, 目前的议定书限制了可纳入同一实验的单独治疗的数量, 并限制了可合理地包括在每种治疗中的生物复制数量。这些限制使得在多项治疗之间进行全面和同时的比较更加困难。如果治疗中基因表达的差异不大, 需要大量的生物复制来建立统计学意义, 那么这种比较就特别困难。
这里提出了一个简化的协议, 部分自动化谷物提取制剂和 GUS 化验, 以使吞吐量大大提高。这个新版本的协议使得在实验中包含更大的样本总数是可行的, 因为每个实验都包含了更多不同的治疗方法, 每种治疗方法都有更多的复制。在轰击和孵化后的谷物提取物的制备过程中, 我们取代了一个主要的自动化磨削协议, 它利用了能够同时处理48样品的珠均质机 (大约20分钟)。因此, 一个调查员可以在较短的时间内从近200个样本中制备可溶性蛋白质提取物, 这将需要一组四名调查人员手工研磨100个样本。在96个井板中进行的改进的 GUS 检测, 也需要更少的劳动, 原来的协议, 使用单独的管化验。
在制备用于轰击的质粒混合物时 (步骤 3.1), 可以使用一个效应器来报告比率为 1.0, 特别是初步测试, 以确定一个特定的效应器是否有任何效果。但是, 由于玉米泛素 (UBI) 启动子的强度, 通常可以观察到很低的比率, 如图 2B和以前发布的报告4,5,6。本议定书的其他关键步骤包括从大麦颗粒中剥离种子涂层, 并在轰炸装置中使用精心定义的设置。如果不完全去除种子大衣, 金载体将被阻止进入对糊粉层细胞。成功交付的金载体进入糊粉层细胞也相当依赖于特定类型的破裂盘, 载体盖盖, 停止屏幕, 和组织被轰炸的位置。这里报告的条件通常导致基因构造的成功交付 (参见步骤 8.1) 到高百分比 (≥70%) 被轰击的大麦五谷样品。应该预计, 其他生物材料将需要不同的条件, 以最佳的基因交付。
虽然这里没有说明, 但可以通过在96个井板中进行闪光荧光素酶测定来进一步简化程序。然而, 由于荧光素酶的光生产必须在紫外线的蛋白质提取物与基体 (荧光素) 混合后立即测量, 这将需要使用一个板闪光紫外线与注射器, 一个仪器, 更比单管紫外线贵。
这里报告的代表性结果确认, 转录因子 TaABF1 可以在没有外源 ABA56的情况下激活HVA1表达式。pld 抑制剂 1-丁醇阻止了 TaABF1 或外源 ABA 激活HVA1 , 这表明在HVA1激活时可能需要使用 pld 生产磷脂酸。TaABF1 和 ABA 的HVA1规则的这些结果类似于邹et 。10由转录因子 LtWRKY21 和 ABA 激活HVA22 。发现 H2O2或 SNP 不替代外源 ABA 抑制糊粉层表达Amy32b, 证实, 在谷物中 ABA 信号的某些方面与气孔保护细胞发生的不同。H2O2不 downregulate Amy32b 表达式的发现与石桥et 等所观察到的结果是一致的。11用于淀粉酶活性。
增加的吞吐量协议现在被用来对 TaABF1 磷酸化对其调节下游基因表达能力的影响进行全面研究。由于转录因子家族的其他成员可以在多个不同的站点 (12、13、14、15、16、多个假定的磷酸化 ABF) 中进行磷酸化TaABF1 上的站点需要进行测试。该协议允许的较高吞吐量将允许大量的突变版本的 TaABF1 (可能 phosphorylatable 丝氨酸和苏氨酸残留改性) 被审问, 每一个有大量的生物复制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢格雷松巴特勒和玛格丽特-巴雷特帮助进行实验, 朱迪石头的建议谷物均匀化, 和林恩汉努姆征求意见的荧光。这项工作得到了国家科学基金会 (IOB 0443676) 的支持, 由国立卫生研究院国立医学研究院颁发的机构发展奖 (P20GM0103423), 以及赠款来自科尔比学院自然科学分部。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
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