Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Måling af genekspression i bombarderede Byg Aleurone lag med øget gennemløb

Published: March 30, 2018 doi: 10.3791/56728

Summary

En forbedret protokol præsenteres for måling af forbigående genekspression fra reporter konstruktioner i Byg aleurone celler efter partikel bombardement. Kombinationen af automatiserede korn slibning med 96 brønde plade enzym-assays giver høj overførselshastighed for proceduren.

Abstract

Aleurone lag af Byg korn er en vigtig modelsystem for hormon-regulerede genekspression i planter. I aleurone celler, gener kræves for spiring eller tidlige sætteplante udvikling er aktiveret af gibberellin (GA), mens gener forbundet med stress svar er aktiveret af abscisic syre (ABA). Mekanismerne i GA og ABA signalering kan blive afhørt ved at indføre reporter gen konstruktioner i aleurone celler via partikel bombardement, med den deraf følgende forbigående udtryk målt ved hjælp af enzym-assays. En forbedret protokol er rapporteret som delvist automatiserer og strømliner korn homogenisering trin og enzym-assays, giver betydeligt mere hurtigere end eksisterende metoder. Homogenisering af korn prøver er udført ved hjælp af en automatiseret væv homogeniseringsapparat, og GUS (β-glucuronidasesystemer) assays udføres ved hjælp af en 96-brønd pladesystem. Repræsentative resultater ved hjælp af protokollen tyder på at fosfolipase D aktivitet kan spille en vigtig rolle i aktivering af HVA1 genekspression af ABA, gennem transkriptionsfaktor TaABF1.

Introduction

Byg aleurone lag er en veletableret modelsystem for studiet af hormon-regulerede genekspression i planter1. Især aktiveres en række gener, der kræves til spiring eller tidlige sætteplante udvikling ved gibberellin (GA), mens gener forbundet med stress svar er aktiveret af abscisic syre (ABA). GA og ABA signalering veje er forbundet, som udtryk for nogle GA-aktiveret gener er hæmmet af ABA, og vice-versa1.

En værdifuld strategi for forståelse af særlige aktører i GA/ABA signalering rolle har været indførelsen af effektor gen konstruktioner via partikel bombardement, efterfulgt af forbigående udtryk for reporter konstruktioner, der giver den resulterende effekt på downstream genekspression skal fastlægges. Brug af reporter gener som GUS (β-glucuronidasesystemer) eller Luciferase tillader den følsomme og kvantitativ måling af genekspression specielt inden for de celler, der har modtaget effektor konstruktion. For eksempel, etableret indførelsen af en effektor konstruere kodning transkriptionsfaktor TaABF15,6 , at ABA-inducerede gener såsom HVA1 er induceret af TaABF1, mens GA-inducerede gener såsom Amy32b undertrykkes. Partikel bombardement som en eksperimentel strategi er blevet brugt af flere laboratorier til at undersøge forskellige aspekter af GA/ABA signalering. Dette arbejde har ført til identifikation af promotor elementer vigtig for aktivering af både GA-induceret2 og ABA-inducerede gener3og til opdagelsen af protein kinaser4 og transskription faktorer5 , der regulerer de udtryk for disse gener.

Den eksisterende protokoller2,3,4,5,6 til partikel bombardement og efterfølgende måling af forbigående genekspression er ganske arbejdsintensive, som hvert sæt bombarderet knap korn er homogeniseret i hånden i en morter og støder og enzym-assays skal foretages individuelt. Dette manuskript rapporterer en forbedret protokol, der delvist automatiserer og strømliner trinnet homogenisering og GUS-undersøgelser for at tillade betydeligt flere gennemløb, tillader et større antal behandlinger til testes i det samme eksperiment, og/eller den inddragelse af flere flergangsbestemmelser for hver behandling for at opnå mere statistisk solide resultater. Repræsentative resultater er vist for udtryk for HVA1 og Amy32b reporter konstruktioner, reguleret af transkriptionsfaktor TaABF1 samt af GA, ABA og andre regulerende molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af effektor og Reporter gen konstruktioner

  1. Bygge effektor konstruktioner, der beskæftiger en konstitutive promoter (f.eks. majs ubiquitin, UBI) at drive udtryk fra en ønskede åben behandling ramme. For eksempel konstruere et plasmid som indeholder UBI::TaABF1 til kørsel stærk konstitutiv udtryk af TaABF15.
  2. Bygge reporter konstruktioner, der indeholder arrangøren hvis aktivitet der skal måles, anbringes opstrøms på en åben læsning ramme, som GUS. For eksempel konstruere et plasmid som indeholder HVA1::GUS for at måle udtryk fra HVA1 promotor2,5.
  3. Opbygge en intern kontrol konstruktion (fx UBI::luciferase).
  4. Bruge en kolonne, silica bindende protokol (Se Tabel af materialer), forberede høj kvalitet plasmid for hver af de krævede gen konstruktioner. Ved hjælp af ultraviolet spektroskopi (Se Tabel af materialer), omhyggeligt måler koncentrationen af hver plasmid forberedelse.

2. forberedelse af Byg korn til bombardement

  1. Oprette en regneark (Se figur 1 for et eksempel) med angivelse af plasmider, der vil blive bombarderet, passende hormon behandlinger og andre relevante oplysninger for hver behandling, der vil være en del af forsøget.
  2. Du bruger et skærebræt og en steril barberblad, skåret af embryoner fra kerner af Himalaya Byg (40 for hver behandling, inkluderes i eksperimentet). Udelukke korn, som er misfarvet eller væsentlig mindre end gennemsnittet.
  3. Placere alle de embryoless korn i en 50 mL tube. Tilsættes 40 mL vand og rock i 10 minutter.
  4. Hæld vand omhyggeligt (for at undgå at miste kerner) og tilsættes 40 mL 10% blegemiddel. Rock i 20 minutter.
  5. Udøse blegemiddel og tilsættes 40 mL sterilt vand. Rock i 5 minutter. Gentag denne sterilt vand vask fire gange.
  6. Tilsættes 40 mL Imbibing (20 mM natrium succinat, 20 mM calciumchlorid, pH 5,0) og 40 μL af chloramphenicol stamopløsning (10 mg/mL).
  7. Overføre de fleste af de Imbibing løsning (med chloramphenicol) fra røret ind i en Vermiculite plade (Se Tabel af materialer). Derefter overføre korn på overfladen af den våde filterpapir i Vermiculite plade. Spredt ud kornene jævnt. Hæld i nok imbibing løsning til at holde kornene delvist (men ikke helt) neddykket. Låget lægges på toppen af Vermiculite plade.
  8. Inkubér embryoless kerner på 24 ° C for omkring 48 h med fluorescerende belysning. Tilføj yderligere Imbibing løsning som nødvendigt.
  9. Lukke sig op en 90 mm plast petriskål og hæld 20 mL af Imbibing løsning i skålen selv og 20 mL i den omvendte låg. Tilsæt 20 μL af chloramphenicol (10 mg/mL) til hver. Sterilisere to par af fin spids pincet ved at dyppe dem i alkohol.
  10. Læg et par af embryoless kerner i låget af petriskålen. Brug af pincet, forsigtigt fjerne (gennemsigtig) frø pelsen fra hvert korn. Samtidig med at fjerne frø frakke fra den glatte side af korn, ikke skade de underliggende (aleurone) celler. Overføre de skrællede korn til petriskålen indeholdende Imbibing løsning.
  11. Efter peeling frø frakke fra alle af kornene, skal du returnere dem til Vermiculite plade. Inkuber de skrællede embryoless korn på 24 ° C i 16-20 timer.
  12. Lige før ved hjælp af korn til bombardement, overflade fugt fjernes ved at ryste dem mellem papirfiltre i en petriskål.

3. forberedelse af Plasmid DNA til bombardement

  1. Mærke en 1,5 mL tube for hver behandling, der skal medtages i bombardement eksperiment. Hver tube tilføje 2,5 µg af UBI::luciferase intern kontrol plasmid, 2,5 µg en GUS reporter plasmid, og den ønskede mængde (typisk 0,025 µg til 2,5 µg) en effektor plasmid. Tilsæt vand for at bringe den samlede mængde til 5 µL.
  2. Forberede 1,6 µm guld microcarriers (Se Tabel af materialer) følgende offentliggjort protokollerne6.
  3. For hver behandling, tilsættes 50 µL af suspenderede microcarriers ind i 1,5 mL rør indeholdende plasmid DNA. Pels microcarriers med plasmid DNA ifølge producentens protokoller6.
  4. På det sidste trin, når de plasmid-belagt microcarriers er suspenderet i 48 µL 100% ethanol, afpipetteres 8 μL af suspenderede microcarriers på hver af fem macrocarriers og lad dem tørre.

4. partikel bombardement af Embryoless Byg korn

  1. Konfigurere apparatet partikel bombardement (Se Tabel af materialer)6.
  2. Placer en 1550 psi brud disk ind i fastholde hætten og montere den på instrumentet.
  3. Læg en macrocarrier, der indeholder den ønskede plasmid kombination (sammen med en standsning skærm) i microcarrier lanceringen forsamling. Indsæt forsamlingen i det øverste slot bombardement kammer. Angive afstanden mellem brud disken bevarer cap og macrocarrier dække låg på den standard afstand (6 mm), og placere stop skærm support på (standard) midterste position, at tillade en macrocarrier rejseafstand af 11 mm (figur 2A).
  4. Arranger 8 embryoless korn i en stram radialt mønster (med tyndere enderne peger indad) på et filtrerpapir cirkel, der er tapede ned flad til låget af en 90 mm petriskål (Se figur 2B).
  5. Placer fadet med korn ind i bombardement salen, i en afstand af 6 cm fra skærmen standsning.
  6. Evakuere bombardement kammer til 95 kPa og derefter bombardere prøven.
  7. Efter at slippe vakuum, overføre de bombarderede korn til en mærket 60 mm petriskål indeholdende 4 mL af Imbibing løsning indeholdende 1 mg/ml af chloramphenicol.
  8. Gentag, indtil alle bombardementerne har afsluttet. Inkuber (på en rystende platform på 100 rpm) på 24 ° C i 24 timer.

5. ekstraktion af opløseligt Protein fra de bombarderede korn

  1. Brug af pincet, fjerne 8 bombarderede kornene fra en 60 mm petriskål og dup dem tørre på et stykke køkkenrulle. Opdele korn i to mærket 2,0 mL rør (4 kerner pr tube) hver indeholder 800 μL slibning Buffer (100 mM Na fosfat pH 7,2, 5 mM DTT, 10 µg/mL leupeptin, 20% glycerol) og en 5 mm rustfrit stål perle. Gentag denne proces for alle bombarderede korn.
  2. Plads (op til 48) 2,0 mL rør ind i de to stativer af perle homogeniseringsapparat (Se Tabel af materialer). Montere stativerne på homogeniseringsapparat.
  3. Ryst prøverne på 30 Hz i 3 minutter.
  4. Fjerne homogeniseringsapparat stativer fra homogeniseringsapparat og placere dem på is (5 min) re køle prøverne.
  5. Montere stativerne tilbage på homogeniseringsapparat - i den modsatte retning. Ryste prøverne igen på 30 Hz i 3 minutter.
  6. Cool på stativer på is, Gentag derefter trin 5.3 til 5.5. Dette vil tilføje til i alt 12 minutter af rysten.
  7. Der centrifugeres korn uddrag på 16.000 x g ved 4 ° C i 10 minutter.
  8. Straks efter centrifugering, dekanteres de klart analysere til et andet sæt af microcentrifuge rør. Give hver tube en hurtig vortex. Gemme rør på is.
  9. Efter overførsel af supernatanten, skal du gendanne stål perlerne fra pellets, så de kan vaskes og genbruges.

6. maaling af Luciferase aktivitet fra korn ekstrakter

  1. For hver tube korn ekstrakt til analyseres, forberede en 12 mm x 75 mm glas reagensglas indeholdende 200 μl af Luciferase Assay blanding (45 mM Tris sulfat pH 7.7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, 1 mM luciferin, 1 mM ATP).
  2. Tilsæt 100 μL af den første korn ekstrakt til det første assay rør. Vortex hurtigt at blande godt. Straks røret anbringes i røret indehaveren af en luminometrisk og lukke døren. Når målingen er færdig, skal du fjerne røret fra luminometrisk – lade døren stå åben for placering af det næste rør.
  3. Gentag denne proces, indtil alle prøver er blevet målt.

7. måling af GUS aktivitet fra korn ekstrakter

  1. Tilføje 200 μl af GUS analysebuffer (50 mM Na fosfat pH 7,2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl--D-glucuronid, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptin, 20% methanol, 0,02% natriumazid) til hvert hul i en 96 godt plade.
  2. Sted 50 μL af hver korn ekstrakt i de tilsvarende godt. Bland med spidsen efter tilsætning. Forsegle toppen med forsegling film.
  3. Inkuber 96 godt pladen ved 37 ° C i mørke i 20 timer.
  4. Centrifugeres 96 godt pladen på 4.000 x g ved 4 ° C i 10 minutter og placere den på is.
  5. Tilsæt 250 μL af 0,2 M Na2CO3 til hver brønd med en sort 96 godt plade.
  6. Tilføje 6,25 μL af hver centrifugeret GUS assay blandingen i de tilsvarende godt (indeholdende 0,2 M Na2CO3) af black 96 godt plade. Bland med spidsen efter tilsætning. Omfatte brønde med 6,25 μl af 10 μM, 40 μM og 100 μM 4-methylumbelliferone som standarder.
  7. Placere den sorte plade i en plade fluorometer og læse fluorescens af methylumbelliferone. Tage aflæsninger på en excitation boelgelaengden 360 nm og en emission boelgelaengden 460 nm. Angive gevinst på instrumentet, sådan et godt indeholdende 6,25 μL af 40 μM 4-methylumbelliferone og 250 μL af 0,2 M Na2CO3 giver en læsning af 1000 fluorescens enheder.

8. dataanalyse

  1. Angiv værdierne for den luciferase og GUS assays til et regneark. Udelukke fra behandling enhver proeve med en luciferase læsning af lavere end 20.000 relative luminescence enheder s-1, som angiver, at genet konstruktioner ikke blev med succes leveret til aleurone cellerne.
  2. For hver vellykket bombarderede korn pakke (der repræsenterer en gruppe af fire embryoless korn), beregne den normaliserede GUS udtryk fra de rå data, GUS og luciferase som følger: normaliseret GUS = [(GUS udtryk - GUS tom) x (2.000.000)] / (luciferase udtryk – luciferase tomt).
    Bemærk: Dette normaliserer mængden af GUS aktivitet til hvad ville er blevet observeret i et bombardement, der gav en luciferase læsning af 2.000.000.
  3. Rapportere det relative niveau af udtryk for en bestemt journalist konstruere effektor konstruktioner eller hormon behandlinger testes ved at sammenligne niveauet for udtryk i mangel af effektorer eller hormoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den teknik beskrevet her kan bruges til at indføre enhver test gen konstruktion i aleurone celler af Byg korn. Udtryk fra test-genet kan derefter være bekvemt målt (figur 2). Den højere overførselshastighed protokollen beskrevet her kraftigt øger effektiviteten af frø slibning og enzym assay trin. Denne metode har været brugt til at vurdere transskription faktor TaABF15,6 evne til at aktivere udtryk af ABA-induceret genet HVA17. I de repræsentative resultater præsenteres her, blev en HVA1::GUS journalist konstruere indført i aleurone celler sammen med en UBI::TaABF1 effektor konstruktion (figur 3A). Mens en TaABF1/HVA1 forholdet mellem blot 0,01 var tilstrækkeligt til at forårsage en 3-fold induktion af HVA1 reporter gen i mangel af eksogene ABA, højere niveauer af TaABF1 konstruktion resulterede i gradvis større HVA1 udtryk, i en dosisafhængig måde (figur 3BC).

Denne forsøgsplan kan også omfatte brugen af hormoner eller andre forbindelser til at vurdere rollen, disse molekyler i reguleringen af genekspression i perioden efter bombardementet inkubation. Tidligere arbejde af andre efterforskere har foreslået betydningen af fosfolipase D i nogle aspekter af ABA signalering. Specifikt, har produktet af fosfolipase D aktivitet, phosphatidic syre, været impliceret som mellemprodukt i nogle svar til ABA8,9. Det faktum, at 1-butanol, en hæmmer af fosfolipase D (PLD), har vist sig at forhindre ABA-induceret Gen-ekspression i aleurone celler tyder på at PLD kan være en integreret del af ABA signalering i dette væv. Bombardement protokol blev brugt til at teste, om 1-butanol kunne hæmme enten ABA-induceret eller TaABF1-induceret HVA1 udtryk. Som forventet, kunne enten eksogene ABA eller TaABF1 kraftigt inducerer udtryk af HVA1::GUS journalist konstruere (figur 3 c). I begge tilfælde hæmmet tilstedeværelsen af 1-butanol stærkt HVA1 induktion. Dette tyder på, at PLD kunne spille en vigtig rolle i aktivering af HVA1 genekspression af ABA, gennem TaABF1.

Ud over sin rolle i udvikling og spirende korn, er ABA også kritisk for at regulere spalteåbningernes blænde i bladene. I de guard cellerne af spalteåbninger, produktionen af phosphatidic syre er stimuleret af nitrogenoxid (NO), som igen er foranlediget af hydrogenperoxid (H2O2). For nogle svar, nej og H2O2 kan erstatte ABA9. For at afgøre, om dette er også tilfældet i aleurone celler, blev bombardement protokol brugt til at teste, om NO donor natrium nitroprusside (SNP) eller H2O2 kunne erstatte ABA hæmme udtryk for GA-induceret Amy32b gen. Mens ABA kunne kraftigt hæmmer GA-induceret udtryk for den Amy32b::GUS journalist konstruere, hverken H2O2 eller SNP forårsaget nogen væsentlig reduktion (figur 3D). Disse resultater er derfor ikke understøtter en rolle for NO og H2O2 i aleurone celle ABA svar.

Figure 1
Figur 1 : Regneark for en typisk bombardement eksperiment. Mængden af hver plasmid præparat, som anbringes i røret til hver bombardement er indiceret. I dette eksperiment, blev fire skud (8 kerner hver) brugt til hver behandling give en samlet af otte mulige prøver (4 kerner) for hver behandling. For at bevare den samme samlede DNA koncentration i hver bombardement, blev en "dummy" effektor plasmid brugt til at erstatte UBI::TaBF1 effektor plasmid i nogle tilfælde. Behandling A er en "blank" bombardement at etablere baggrundskoncentration af GUS og luciferase aktivitet i aleurone celler. Resultaterne af bombardement eksperimentet skitseret i dette regneark er vist i figur 3B. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Diagram over protokollen. (A) skematisk af enhedens bombardement. (B) guld partikler coated med en journalist konstruere transporterer promotor skal testes, en effektor (hvis nødvendigt) og en intern kontrol (UBI::luciferase) er indført i Byg aleurone celler ved partikel bombardement. Efter inkubationen (typisk for 24 h), kornene er jorden og analyseres for både GUS aktivitet og luciferase aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Regulering af HVA1 og Amy32b initiativtagerne af TaABF1, ABA og mulige mediatorer af ABA signalering. (A) Reporter og effektor konstruktioner anvendes i eksperimenter. (B) effektor konstruere UBI::TaABF1 var Co bombarderet i aleurone celler med HVA1::GUS reporter og intern kontrol konstruktion (UBI::luciferase). Mængden af UBI::TaABF1 effektor (i forhold til HVA1::GUS reporter) varierede fra 0 til 0.1, som angivet under søjlerne. GUS og luciferase aktiviteter blev målt efter 24 timers inkubation. Data, der vises er middel (± SE) til 6-8 biologiske replikater. (C) HVA1::GUS reporter var Co bombarderet i aleurone celler med den interne kontrol konstruktion (UBI::luciferase) i tilstedeværelse eller fravær af effektor konstruktion UBI::TaABF1. Mængden af TaABF1 effektor (i forhold til reporter) var 1,0. GUS og luciferase aktiviteter blev målt efter 24 timers inkubation med eller uden 20 µM ABA og 0,4% 1-butanol. (D) Amy32b::GUS reporter var Co bombarderede i aleurone celler med den interne kontrol konstruktion (UBI::luciferase). GUS og luciferase aktiviteter blev målt efter 24 timers inkubation i nærværelse af 1 mM GA med eller uden 20 µM ABA, 1 mM H2O2eller 100 µM natrium nitroprusside (SNP). Værdier for GUS aktivitet er i forhold til udtrykket af Amy32b::GUS reporter i mangel af GA. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Indførelsen af effektor gen konstruerer via partikel bombardement, efterfulgt af forbigående udtryk for reporter konstruktioner er en værdifuld strategi for dissekere rolle af særlige aktører i GA/ABA signalering og den resulterende hormon-reguleret gen udtryk.
Dog er eksisterende protokoller for at udføre sådanne forsøg i Byg aleurone celler2,3,4,5,6 meget arbejdskraftintensive. Hver gruppe af bombarderet knap korn skal være hånd homogeniseret i en morter og støder, og de deraf følgende uddrag er analyseres individuelt for GUS og luciferase aktivitet. De nuværende protokoller derfor begrænse antallet af forskellige behandlinger, der kan indgå i den samme eksperiment, og begrænse antallet af biologiske replikater, der kan rimelighed medtages for hver behandling. Disse begrænsninger gør det vanskeligere at gennemføre omfattende og samtidige sammenligninger mellem flere behandlinger. Sådanne sammenligninger kan være særlig vanskelige, hvis forskellen i genekspression mellem behandlingerne er beskedne og et relativt stort antal biologiske replikater er nødvendig for at etablere Statistisk signifikans.

En strømlinet protokol præsenteres her delvist automatiserer korn ekstrakt forberedelse og GUS-undersøgelser for at give betydeligt højere overførselshastighed. Denne nye version af protokollen gør det muligt at medtage en meget større samlede antal prøver i et eksperiment, giver mulighed for optagelse af flere forskellige behandlinger pr. eksperiment, og mere replikater for hver behandling. Til forberedelse af korn uddrag efter bombardementet og inkubation, har vi erstattet en i vid udstrækning automatiseret slibning protokol, der udnytter en perle homogeniseringsapparat, der kan behandle 48 prøver samtidigt (i ca. 20 minutter). Således, en enkelt investigator kan forberede opløseligt protein ekstrakter fra næsten 200 prøver i kortere tid, at det ville tage et hold af fire efterforskere hånden male kun 100 prøver. Den modificerede GUS assay, udført i 96 godt plader, kræver også meget mindre arbejdskraft, som den oprindelige protokol, som ansat enkelte rør-undersøgelser.

Forberede bombardement (trin 3.1) plasmid blandinger, er det muligt at bruge en effektor reporter forhold på 1,0, især for indledende test til at afgøre, om en bestemt effektor har nogen effekt overhovedet. Men på grund af styrken af majs ubiquitin (UBI) promotor, en stærk virkning kan ofte ses med meget lavere nøgletal, som det ses i figur 2B og i tidligere offentliggjorte rapporter,4,5,6. Andre kritiske trin i denne protokol omfatter afskalning af frø frakke fra Byg korn og brugen af nøje definerede indstillinger i apparatet bombardement. Hvis frø frakker ikke er fuldt fjernet, vil den guld microcarriers blive forhindret i at indtaste de dækbladene aleurone celler. Vellykket levering af det guld microcarriers i aleurone cellerne er også helt afhængig af den specifikke type af brud disc bruges, placeringen af microcarrier dække låg, stoppe skærmen og væv til at blive bombarderet. Betingelserne rapporteret her typisk resultere i vellykket levering af genet konstruktioner (Se trin 8,1) til en høj andel (≥70%) af bombarderede Byg korn prøver. Det må forventes, at andre biologiske materialer kræver forskellige betingelser for optimal gen levering.

Selv om det ikke beskrevet her, ville det være muligt at yderligere strømline proceduren ved at udføre flash luciferase assays i 96 godt plader. Men som det lys produktion fra luciferase skal måles i en luminometrisk umiddelbart efter blanding protein ekstrakt med substrat (luciferin), ville dette kræver brug af en plade flash luminometrisk med injektorer, et instrument, der er meget mere dyrere end en enkelt rør luminometrisk.

De repræsentative resultater rapporteret her bekræfte, at transkriptionsfaktor TaABF1 kan aktivere HVA1 udtryk i mangel af eksogene ABA5,6. Aktivering af HVA1 af enten TaABF1 eller eksogen ABA blev forhindret af PLD inhibitor 1-butanol, tyder på, at produktionen af phosphatidic syre af PLD kan være påkrævet for HVA1 aktivering. Disse resultater for HVA1 regulering af TaABF1 og ABA er magen til dem, der opnås ved Zou et al. 10 for aktivering af HVA22 af transkriptionsfaktor LtWRKY21 og ABA. Den konstatering, som H2O2 eller SNP ikke erstatte eksogene ABA i undertrykke aleurone udtryk for Amy32b, bekræfter, at nogle aspekter af ABA signalering i korn er adskilt fra hvad der sker i spalteåbningernes guard celler. Den konstatering, at H2O2 gør ikke nedregulere Amy32b udtryk er i overensstemmelse med de resultater, der er observeret af Ishibashi et al. 11 for amylase enzymaktivitet.

Øget gennemstrømning protokollen anvendes nu til at gennemføre en omfattende undersøgelse af virkningerne af TaABF1 fosforylering på sin evne til at regulere downstream genekspression. Som andre medlemmer af ABF kan familie af transkriptionsfaktorer blive fosforyleret på en række forskellige websteder12,13,14,15,16, flere formodede fosforylering websteder på TaABF1 skal afprøves. Den højere overførselshastighed tilladt af denne protokol vil tillade et stort antal muterede versioner af TaABF1 (med potentielt phosphorylatable Serin og Threonin restkoncentrationer modificeret) for at blive afhørt, hver med et stort antal biologiske replikater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Greyson Butler og Margaret Barrett til hjælp ved udførelsen af eksperimenter, Judy Stone for rådgivning om korn homogenisering og Lynn Hannum for rådgivning om fluorometry. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (IOB 0443676), en institutionel udvikling Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under grant nummer P20GM0103423, og tilskud fra Colby College Division af naturvidenskab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit Sigma NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Himalaya barley grains / / A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate Sigma S2378 Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution home made / 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol Sigma C0378 Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite Fisher NC0430369 Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm) Whatman 1001 090 Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates home made / Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed) Fisher 13-812-42 Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point) Fisher 12-000-122 Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm) BioRad 1652264
macrocarriers BioRad 1652335
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine Sigma S0266 Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi) BioRad 1652331
stopping screens BioRad 1652336
macrocarrier holders BioRad 1652322
Biolistic particle delivery system BioRad PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic Sigma S9763 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2 home made / Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT) Sigma 43819 Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin Sigma L2884 Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol Sigma G5516 Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer home made / Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm) Qiagen 69989
2.0 mL tubes Eppendorf 22363352 This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser) Qiagen 85210
12mm x 75 mm glass test tubes Fisher
luciferin Goldbio LUCK-100 Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP Sigma A7699 Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base Sigma T1503 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid Sigma 258105 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7 home made / Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride Sigma M9397 Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB) home made / Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture home made / Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius) Berthold /
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Goldbio MUG1 Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide Sigma S8032 Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard) Fisher 12565501
GUS assay buffer home made / Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film USA Scientific 2921-1000
96 well plates (black) Costar 3916
sodium carbonate Sigma S7795 Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader Bio-Tek FLX-800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
  2. Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
  3. Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
  4. Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
  5. Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
  6. Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
  7. Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
  8. Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
  9. Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
  10. Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
  11. Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
  12. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  13. Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
  14. Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
  15. Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
  16. Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).

Tags

Genetik sag 133 abscisic syre aleurone byg gibberellin partikel bombardement forbigående udtryk
Måling af genekspression i bombarderede Byg Aleurone lag med øget gennemløb
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo,More

Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo, D. S., Keyser, B. R., Johnson, R. R. Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput. J. Vis. Exp. (133), e56728, doi:10.3791/56728 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter