Summary
Een verbeterde protocol wordt gepresenteerd voor de meting van voorbijgaande genexpressie van verslaggever constructies in gerst aleurone cellen na deeltje bombardement. De combinatie van geautomatiseerde graan malen met 96-wells-plaat enzym testen biedt hoge doorvoer voor de procedure.
Abstract
De aleurone laag van gerst korrels is een belangrijk model-systeem voor hormoon-gereglementeerde genexpressie in planten. In de aleurone cellen, genen nodig zijn voor de kieming of vroege zaailing ontwikkeling worden geactiveerd door Gibberelline (GA), terwijl genen geassocieerd met stress reacties worden geactiveerd door abscisic zuur (ABA). De mechanismen van GA en ABA signalering kunnen worden ondervraagd door de invoering van reporter gene constructies in aleurone cellen via deeltje bombardement, met de daaruit voortvloeiende voorbijgaande expressie gemeten met behulp van enzym testen. Een verbeterde protocol wordt gemeld dat gedeeltelijk automatiseert en stroomlijnt de korrel homogenisering stap en de enzym-vitrotests, waardoor aanzienlijk meer doorvoer dan bestaande methoden. Homogenisering van de korrel monsters wordt uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde weefsel homogenizer en GUS (β-glucuronidase) tests worden uitgevoerd met behulp van een 96-Wells plaatsysteem. Representatieve resultaten met behulp van het protocol suggereren dat fosfolipase D activiteit kan een belangrijke rol in het activeren van HVA1 genexpressie door ABA, door middel van de transcriptiefactor TaABF1.
Introduction
De laag van de aleurone gerst is een gevestigde modelsysteem voor de studie van hormoon-gereglementeerde genexpressie in planten1. In het bijzonder worden een aantal genen die nodig zijn voor de kieming of vroege zaailing ontwikkeling geactiveerd door Gibberelline (GA), terwijl genen geassocieerd met stress reacties worden geactiveerd door abscisic zuur (ABA). De GA en ABA signalering trajecten met elkaar verweven zijn, zoals de expressie van bepaalde genen GA-geactiveerd wordt geremd door ABA en vice-versa1.
Een waardevolle strategie voor begrip van dat de rol van bepaalde actoren in GA/ABA signalering is de invoering van effector gene constructies via deeltje bombardement, gevolgd door voorbijgaande expressie van verslaggever constructies waarmee het resulterende effect op stroomafwaarts genexpressie te bepalen. Het gebruik van verslaggever genen zoals GUS (β-glucuronidase) of Luciferase maakt de gevoelige en kwantitatieve meting van genuitdrukking specifiek binnen de cellen die de effector constructie hebben ontvangen. Bijvoorbeeld, vastgesteld de invoering van een effector construct codering van de transcriptiefactor TaABF15,6 dat ABA-geïnduceerde genen zoals HVA1 door TaABF1, terwijl de GA-geïnduceerde genen zoals Amy32b veroorzaakt worden onderdrukt. Bombardement van het deeltje als een experimentele strategie hanteert voor het onderzoeken van de diverse aspecten van GA/ABA signalering door meerdere laboratoria. Dergelijk werk heeft geleid tot de identificatie van de promotor elementen belangrijk voor de activering van zowel de GA-geïnduceerde2 en de ABA-geïnduceerde genen3, en tot de ontdekking van eiwit kinases4 en transcriptie factoren5 die regelen de expressie van deze genen.
De bestaande protocollen2,3,4,5,6 voor deeltje bombardement en de daaropvolgende meting van voorbijgaande genexpressie zijn heel arbeidsintensief, zoals elke set gebombardeerd nauwelijks korrels is gehomogeniseerd met de hand in een mortier en een stamper en het enzym testen afzonderlijk worden uitgevoerd. Dit manuscript rapporten in een verbeterde protocol dat gedeeltelijk automatiseert en stroomlijnt de homogenisering stap en de GUS testen zodat aanzienlijk meer doorvoer, waardoor een groter aantal behandelingen in hetzelfde experiment, worden getest en/of de opneming van meer replicatieonderzoeken voor elke behandeling om meer statistisch robuuste resultaten te verkrijgen. Representatieve resultaten worden weergegeven voor de expressie van HVA1 en Amy32b verslaggever constructies, gereguleerd door de transcriptiefactor TaABF1 alsmede door GA, ABA, en andere regelgevende moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van Effector en Reporter Gene construeert
- Bouwen effector constructies die een constitutief promotor (bijv. maïs ubiquitin, UBI dienst) op station expressie van een gewenste open leesraam. Bijvoorbeeld, bouw een plasmide met UBI::TaABF1 tot station sterke constitutieve uitdrukking van TaABF15.
- Bouwen verslaggever constructies waarin de promotor waarvan de activiteit is te worden gemeten, voorafgaand aan een open leesraam, zoals GUSgeplaatst. Bijvoorbeeld, het bouwen van een plasmide met HVA1::GUS voor het meten van de expressie van het HVA1 promotor2,5.
- Bouwen van een interne controle construct (bijvoorbeeld UBI::luciferase).
- Met behulp van een kolom silica bindend protocol (Zie Tabel of Materials), kwalitatief hoogwaardige plasmide voorbereiden op elk van de vereiste gene constructies. Met behulp van ultraviolet spectroscopie (Zie Tabel of Materials), zorgvuldig meten van de concentratie van elk preparaat plasmide.
2. voorbereiding van gerst korrels voor bombardement
- Een werkblad instellen (Zie Figuur 1 voor een voorbeeld) die aangeeft van de plasmiden die zal worden gebombardeerd, de juiste hormoon-behandelingen, en andere relevante informatie voor elke behandeling die deel van het experiment uitmaken zal.
- Met behulp van een snijplank en een steriele scheermesje, is afgesneden van de embryo's van korrels van Himalaya gerst (40 voor elke behandeling opgenomen in het experiment). Korrels die verkleurde of aanzienlijk kleiner is dan het gemiddelde uit te sluiten.
- Plaats alle de embryoless korrels in een tube van 50 mL. Voeg 40 mL water en rock gedurende 10 minuten.
- Giet het water zorgvuldig (om te voorkomen dat verliezen korrels) en voeg 40 mL 10% bleekwater. Rock gedurende 20 minuten.
- Uitstorten van het bleekmiddel en voeg 40 mL steriel water. Rock voor 5 minuten. Herhaal dit steriel water wassen viermaal meer.
- Voeg toe 40 mL Imbibing oplossing (20 mM natrium succinaat, 20 mM calciumchloride, pH 5.0) en 40 μL van chlooramfenicol stockoplossing (10 mg/mL).
- Allermeest naar de Imbibing oplossing (met chlooramfenicol) overdracht van de buis in een vermiculiet plaat (Zie Tabel van materialen). Breng de korrels op het oppervlak van het natte koffiefilter in de vermiculiet plaat. De korrels gelijkmatig verdeeld. Giet in voldoende imbibing oplossing te houden van de korrels gedeeltelijk (maar niet volledig) ondergedompeld. Plaats het deksel op de top van de vermiculiet plaat.
- Incubeer de embryoless korrels bij 24 ° C gedurende ongeveer 48 uur met TL-verlichting. Aanvullende Imbibing oplossing zo nodig toevoegen.
- Een 90 mm kunststof petrischaal openstellen en giet 20 mL Imbibing oplossing in de schotel zelf en 20 mL in het omgekeerde deksel. Voeg 20 μL van chlooramfenicol (10 mg/mL) toe aan elk. Twee paar fijne punt pincet steriliseren door dompelen hen in alcohol.
- Plaats een paar van de embryoless korrels in het deksel van de petrischaal. Met behulp van de verlostang, zachtjes verwijderen de vacht zaad (transparant) elke korrel. Tijdens het verwijderen van de zaad vacht van de gladde kant van de korrel, de onderliggende (aleurone)-cellen niet te beschadigen. De geschilde korrel overbrengen in de petrischaal met Imbibing oplossing.
- Na pellen het zaad vacht van alle van de korrels, kunt u dat terugsturen naar de vermiculiet plaat. Incubeer de gepelde embryoless korrels bij 24 ° C voor 16-20 uur.
- Net voordat u de korrels voor bombardement, oppervlakte vocht te verwijderen door schudden ze tussen filtreerpapier in een petrischaal.
3. voorbereiding van de plasmide DNA voor bombardement
- Label een 1,5 mL tube voor elke behandeling die zal worden opgenomen in het experiment bombardement. Toevoegen aan elke buis 2,5 µg UBI::luciferase interne controle plasmide, 2,5 µg een GUS verslaggever plasmide, en de gewenste hoeveelheid (meestal 0,025 µg aan 2,5 µg) een effector plasmide. Voeg water om het totale volume aan 5 µL.
- 1.6 µm gouden microcarriers (Zie Tabel van materialen) bereiden volgende protocollen6gepubliceerd.
- Voor elke behandeling, voeg toe 50 µL van zwevende microcarriers in de 1,5 mL-buis met plasmide DNA. Jas de microcarriers met plasmide DNA volgens fabrikant protocollen6.
- Bij de laatste stap, wanneer de plasmide beklede microcarriers zijn opgehangen in 48 µL 100% ethanol, Pipetteer 8 μL van zwevende microcarriers op elk van de vijf macrocarriers en hen in staat aan de lucht stellen drogen.
4. deeltje bombardement van Embryoless gerst korrels
- Instellen van het deeltje bombardement apparaat (Zie Tabel van materialen)6.
- Plaats een 1550 psi breuk schijf in het behoud GLB en bevestig het op het instrument.
- Plaats een macrocarrier met de gewenste plasmide combinatie (samen met een stoppen-scherm) in de vergadering van de lancering van de microcarrier. Plaats de vergadering in de bovenste sleuf van de kamer van het bombardement. Stel de afstand tussen de breuk schijf behouden GLB en het deksel van de macrocarrier op de standaard afstand (6 mm), en plaats de ondersteuning van het scherm stoppen op de (standaard) middelste positie, waardoor een reisafstand van de macrocarrier van 11 mm (figuur 2A).
- 8 embryoless korrels in een strakke radiaal patroon te regelen (met de dunnere eindigt wijzen naar binnen) op een filtreerpapier cirkel die is geplakt beneden flat het deksel van een petrischaal 90 mm (Zie figuur 2B).
- Zet de schotel met de korrels in de bedwelmingsruimte bombardement, op een afstand van 6 cm vanaf het scherm stoppen.
- Het bombardement kamer evacueren naar 95 kPa en vervolgens het bombarderen van het monster.
- Na het loslaten van de stofzuiger, door de gebombardeerd korrels te overbrengen in een gelabelde 60 mm petrischaal met 4 mL Imbibing oplossing met 1 mg/ml chlooramfenicol.
- Herhaal tot alle van de bombardementen hebben afgerond. Incubeer (op een schudden platform op 100 rpm) bij 24 ° C gedurende 24 uur.
5. extractie van oplosbaar eiwit uit de gebombardeerd korrels
- Met behulp van Tang, verwijder de 8 gebombardeerd korrels uit een petrischaal 60 mm en dep ze droog op een papieren handdoek. Verdeel de korrels in twee gelabelde 2,0 mL buizen (4 korrels per buis) elk met 800 μL slijpen Buffer (100 mM nb fosfaat pH 7,2, 5 mM DTT 10 µg/mL leupeptin, 20% glycerol) en een 5 mm roestvrij staal kraal. Herhaal dit proces voor alle gebombardeerd korrels.
- (48) 2,0 mL buizen in de twee rekken van de kraal homogenizer plaatsen (Zie Tabel van materialen). Monteer de rekken op de homogenizer.
- Schud de monsters bij 30 Hz gedurende 3 minuten.
- Verwijder de rekken van de homogenizer uit de homogenizer en leg ze op ijs (5 min) opnieuw het afkoelen van de monsters.
- Monteer de rekken terug op de homogenizer - in de tegenovergestelde richting. Schud de monsters opnieuw bij 30 Hz gedurende 3 minuten.
- Koel de rekken op het ijs, herhaalt u stappen 5.3 naar 5.5. Dit zal oplopen tot een totaal van 12 minuten schudden.
- Centrifugeer de extracten van de korrel bij 16.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Onmiddellijk na het centrifugeren, decanteren in de duidelijke supernatant in een tweede reeks van microcentrifuge buizen. Geef elke buis een snelle vortex. Bewaar de buizen op ijs.
- Na het overbrengen van de bovendrijvende substantie, herstelt u de stalen kralen van de pellets zodat ze kunnen worden gewassen en hergebruikt.
6. meting van de Luciferase activiteit uit graan extracten
- Voor elke buis voor graan extract te worden bepaald, bereiden een reageerbuis 12 x 75 mm glas met 200 μL van Luciferase Assay mengsel (45 mM Tris lanthaansulfaat pH 7.7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1.5 mM EDTA, luciferine 1 mM, 1 mM ATP).
- Voeg 100 μl van het eerste graan-extract aan de eerste test-buis. Vortex snel naar meng goed. Onmiddellijk plaats van de buis in de houder van de buis van de luminometer en sluit de deur. Als de meting is voltooid, verwijdert u de buis uit de luminometer-laat de deur open voor de plaatsing van de volgende buis.
- Herhaal dit proces totdat alle monsters zijn gemeten.
7. meting van GUS activiteit uit graan extracten
- Voeg 200 l GUS Assay Buffer (50 mM nb fosfaat pH 7,2, 2.5 mM 4-methylumbelliferyl--D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptin, 20% methanol, natriumazide 0,02%) aan elk putje van een 96 goed plaat.
- Plaats 50 μl van elk uittreksel van graan in de corresponderende goed. Meng met de tip nadat u hebt toegevoegd. Verzegel de bovenkant met het afdichten van de film.
- Incubeer de 96 goed plaat bij 37 ° C in het donker gedurende 20 uur.
- De 96 goed plaat bij 4000 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten centrifugeren en plaats deze op het ijs.
- 250 μL van 0,2 M Na2CO3 toevoegen aan elk putje van een zwarte 96 goed plaat.
- Toevoegen van 6,25 μL van ieder gecentrifugeerde GUS assay mengsel in de corresponderende goed (met 0,2 M Na2CO3) van de zwarte 96 goed plaat. Meng met de tip nadat u hebt toegevoegd. Putjes met 6,25 μL van 10 μM, 40 μM en 100 μM 4-methylumbelliferone als normen bevatten.
- Plaats van de zwarte plaat in een plaat Fluorimeter en lees de fluorescentie van methylumbelliferone. Neem de lezingen bij een golflengte van de excitatie van 360 nm en een golflengte van de emissie van 460 nm. De winst van het instrument zo ingesteld dat een goed met 6,25 μL van 40 μM 4-methylumbelliferone en 250 μL van 0,2 M Na2CO3 een lezing van 1000 fluorescentie eenheden geeft.
8. de gegevensanalyse
- Voer de waarden voor de luciferase en GUS testen in een spreadsheet. Uitsluiten van overweging een monster met een luciferase lezing van minder dan 20.000 relatieve luminescentie eenheden s-1, zoals dit aangeeft dat de gene constructies niet met succes naar de aleurone cellen werden bezorgd.
- Voor elke met succes gebombardeerd graan uitpakken (namens een groep van vier embryoless korrels), de genormaliseerde GUS expressie uit de ruwe GUS en luciferase gegevens als volgt berekenen: GUS genormaliseerd = [(GUS expressie - GUS leeg) x (2.000.000)] / (luciferase expressie-luciferase leeg).
Opmerking: Dit normaliseert de hoeveelheid GUS activiteit aan wat zou zijn waargenomen in een bombardement dat gaf een lezing luciferase van 2.000.000. - Verslag het relatieve niveau van expressie voor een specifieke verslaggever construct in aanwezigheid van effector constructies of hormoon-behandelingen wordt getest door te vergelijken op het niveau van meningsuiting in de afwezigheid van effectoren of hormonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om elke test gene construct in aleurone cellen van gerst korrels. Het niveau van expressie van het test-gen kan vervolgens worden gemakshalve gemeten (Figuur 2). Het hogere doorvoer protocol beschreven hier sterk verhoogt de efficiency van de zaad slijpen en enzym assay stappen. Deze methode is gebruikt voor de beoordeling van het vermogen van de transcriptie factor TaABF15,6 te activeren van expressie van het ABA-geïnduceerde gen HVA17. In de representatieve resultaten die hier gepresenteerd, werd een HVA1::GUS verslaggever construct geïntroduceerd in de aleurone cellen samen met een UBI::TaABF1 effector construct (figuur 3A). Terwijl een TaABF1/HVA1 verhouding van slechts 0,01 volstond om te veroorzaken van een 3-voudig inductie van het gen HVA1 verslaggever bij gebrek aan exogene ABA, hogere niveaus van de TaABF1 -constructie resulteerde in steeds grotere HVA1 expressie, in een dosis-afhankelijke manier (figuur 3BC).
Deze experimentele protocol kan ook het gebruik van hormonen of andere verbindingen tijdens de incubatietijd van na bombardement te beoordelen van de rol van deze moleculen in de regulatie van genexpressie opnemen. Vorige werk door andere onderzoekers heeft het belang van fosfolipase D in sommige aspecten van ABA signalering voorgesteld. Specifiek, heeft het product van fosfolipase D activiteit, phosphatidic zuur, als tussenstof in sommige reacties op ABA8,9zijn betrokken. Het feit dat 1-butanol, een inhibitor van de omwenteling van fosfolipase D (PLD), is gebleken om te voorkomen dat ABA-geïnduceerde genexpressie in cellen van de aleurone stelt dat de PLD zou kunnen een integraal onderdeel zijn van ABA signalering in dit weefsel. Het bombardement protocol werd gebruikt om te testen of 1-butanol ABA-geïnduceerde of TaABF1-geïnduceerde HVA1 expressie kon remmen. Zoals verwacht, kan exogene ABA of TaABF1 sterk induceren expressie voor de HVA1::GUS verslaggever construct (Figuur 3 c). In beide gevallen, de aanwezigheid van 1-butanol sterk geremd de HVA1 -inductie. Dit suggereert dat PLD een belangrijke rol in de activering van HVA1 genexpressie door ABA, via TaABF1 spelen kan.
Naast haar rol in het ontwikkelen en ontkiemen korrels, is ABA ook essentieel voor regulering van stomatal diafragma in bladeren. In de cellen van de bewaker van de stoma, de productie van phosphatidic zuur wordt gestimuleerd door stikstofmonoxide (NO), die op zijn beurt wordt veroorzaakt door waterstof peroxide (H2O2). Voor sommige reacties, NO H2O2 voor ABA9kan worden ingevoegd. Om te bepalen of dit ook het geval in aleurone cellen, werd het bombardement protocol gebruikt om te testen of het geen donor natrium nitroprusside (SNP) of H2O2 voor ABA vervangen kon in het remmen van de uitdrukking van de GA-geïnduceerde Amy32b gen. Terwijl ABA sterk GA-geïnduceerde expressie remmen kan voor de Amy32b::GUS verslaggever construeren, H2O2 noch SNP veroorzaakt een aanzienlijke vermindering (figuur 3D). Deze resultaten, daarom, ondersteunen geen een rol voor NO en H2O2 in aleurone cel ABA reacties.
Figuur 1 : Werkblad voor een typische bombardement experiment. Het bedrag van elk preparaat van de plasmide worden geplaatst in de buis voor elke bombardement wordt aangegeven. In dit experiment, werden vier schoten (elke 8 korrels) gebruikt voor elke behandeling te geven van een totaal van acht mogelijk monsters (elke 4 korrels) voor elke behandeling. Teneinde de dezelfde totale DNA-concentratie in elk bombardementen, werd een "dummy" effector plasmide gebruikt ter vervanging van de plasmide effector UBI::TaBF1 in sommige gevallen. Behandeling A is een "lege" bombardement om het achtergrondniveau van GUS en luciferase activiteit in aleurone cellen. De resultaten van het experiment van de bombardementen die worden beschreven in dit werkblad worden weergegeven in figuur 3B. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Diagram van het protocol. (A) schema van het bombardement apparaat. (B) goud deeltjes bedekt met een verslaggever constructie die de promotor te beproeven, een effector (indien nodig) en een interne controle (UBI::luciferase) worden ingevoerd in de cellen van de aleurone gerst door deeltje bombardement. Na incubatie (typisch voor 24u), de korrels zijn grond en vehiculumcontrolegroep GUS activiteit zowel luciferase activiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Regulering van de initiatiefnemers van het HVA1 en Amy32b door TaABF1, ABA en potentiële bemiddelaars van ABA signalering. (A) verslaggever en effector constructies die in de experimenten worden gebruikt. (B) de effector construct UBI::TaABF1 werd mede gebombardeerd in aleurone cellen met de verslaggever van de HVA1::GUS en de interne controle-construct (UBI::luciferase). De hoeveelheid UBI::TaABF1 effector (ten opzichte van de HVA1::GUS -verslaggever) varieerde van 0 tot 0,1, zoals aangegeven onder de balken. GUS en luciferase activiteiten werden gemeten na 24 uur incubatie. Gegevens worden weergegeven zijn de middelen (± SE) van 6-8 biologische wordt gerepliceerd. (C) de verslaggever van de HVA1::GUS werd mede gebombardeerd in aleurone cellen met de interne controle-construct (UBI::luciferase) in de aanwezigheid of afwezigheid van de effector constructie UBI::TaABF1. De hoeveelheid TaABF1 effector (ten opzichte van de verslaggever) was 1.0. GUS en luciferase activiteiten werden gemeten na 24 uur incubatie met of zonder 20 µM ABA en 0,4% 1-butanol. (D) de Amy32b::GUS -verslaggever was mede gebombardeerd in aleurone cellen met de interne controle-construct (UBI::luciferase). GUS en luciferase activiteiten werden gemeten na 24 uur incubatie in aanwezigheid van 1 mM GA met of zonder 20 µM ABA, 1 mM H2O2of 100 µM natrium nitroprusside (SNP). Waarden voor GUS activiteit zijn ten opzichte van de uitdrukking van de verslaggever van de Amy32b::GUS bij gebrek aan GA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De invoering van effector gen construeert via deeltje bombardement, gevolgd door voorbijgaande expressie van verslaggever constructies is een waardevolle strategie voor het ontleden van de rol van bepaalde actoren in GA/ABA signalering en in het resulterende hormoon-gereglementeerde gen expressie.
Bestaande protocollen voor het uitvoeren van dergelijke experimenten in gerst aleurone cellen2,3,4,5,6 , zijn echter zeer arbeidsintensief. Elke groep van gebombardeerd nauwelijks korrels moeten hand gehomogeniseerd in een mortier en een stamper en de resulterende extracten zijn vehiculumcontrolegroep GUS en luciferase activiteit afzonderlijk. De huidige protocollen daarom beperken het aantal aparte behandelingen die kunnen worden opgenomen in hetzelfde experiment, en het beperken van het aantal biologische replicatieonderzoeken die redelijkerwijs opgenomen voor elke behandeling worden kunnen. Deze beperkingen maken het moeilijker voor het uitvoeren van uitgebreide en gelijktijdige vergelijkingen tussen meerdere behandelingen. Dergelijke vergelijkingen kunnen vooral moeilijk zijn als het verschil in de expressie van genen tussen de behandelingen bescheiden is en een relatief groot aantal biologische replicatieonderzoeken toegangpunt is vereist om statistische significantie.
Een gestroomlijnde protocol wordt hier gepresenteerd die gedeeltelijk de korrel extract voorbereiding automatiseert en de GUS testen zodat aanzienlijk hogere doorvoer. Deze nieuwe versie van het protocol maakt het haalbaar is om het opnemen van een veel grotere totale aantal monsters in een experiment, waardoor zowel de opneming van meer verschillende behandelingen per experiment, en meer voor elke behandeling wordt uitgevoerd, repliceert. Voor de bereiding van extracten van de korrel na het bombardement en incubatie, hebben we vervangen door een grotendeels geautomatiseerd slijpen protocol dat gebruikmaakt van een kraal homogenizer die 48 monsters tegelijk (in ongeveer 20 minuten verwerken kan). Dus, een enkele onderzoeker kan bereiden oplosbaar eiwit uittreksels uit bijna 200 monsters in minder tijd die het een team van vier onderzoekers bij de hand duren zou slijpen slechts 100 monsters. De gewijzigde bepaling van GUS, uitgevoerd in 96 goed platen, vereist ook veel minder arbeid die het oorspronkelijke protocol die in dienst van de individuele buis testen.
Bij de voorbereiding van de plasmide mengsels voor bombardement (stap 3.1), is het mogelijk gebruik van een effector verslaggever/ratio van 1.0, met name voor voorlopige tests om te bepalen als een bepaald effector helemaal geen effect heeft. Echter, vanwege de sterkte van de promotor maïs ubiquitin (UBI), een sterk effect kan vaak worden waargenomen met veel lagere verhoudingsgetallen, zoals te zien in figuur 2B en eerder gepubliceerde rapporten4,5,6. Andere kritische stappen in dit protocol worden de peeling van de vacht van het zaad van de gerst korrels en het gebruik van zorgvuldig gedefinieerde instellingen in het bombardement apparaat opnemen. Als de zaad-jassen niet volledig worden verwijderd, zal de gouden microcarriers uit het invoeren van de subtending aleurone cellen worden voorkomen. Succesvolle levering van de gouden microcarriers in de aleurone cellen is ook nogal afhankelijk van het specifieke type van de breuk schijf gebruikt, de positie van de deksel van de microcarrier, stoppen scherm en weefsel worden gebombardeerd. De voorwaarden gemeld hier meestal leiden tot succesvolle levering van het gen constructies (zie stap 8.1) om een hoog percentage (≥70%) gebombardeerd gerst graan monsters. Het mag worden verwacht dat dat andere biologische materialen verschillende omstandigheden voor optimale gene levering zou vereisen.
Hoewel het hier niet wordt beschreven, zou het mogelijk zijn om de procedure verder te stroomlijnen door het uitvoeren van de tests van de flash luciferase in 96 goed platen. Echter, zoals de lichte productie van luciferase moet onmiddellijk na het mengen van het eiwit extract met een substraat (luciferine) worden gemeten in een luminometer, dit zou vereisen het gebruik van een flash luminometer plaat met injectoren, een instrument dat is veel meer duurder dan de luminometer van een enkele buis.
De representatieve resultaten gemeld hier bevestigen dat de transcriptiefactor TaABF1 HVA1 expressie in de afwezigheid van exogene ABA5,6kunt activeren. Activering van HVA1 door TaABF1 of exogene ABA werd verhinderd door de PLD remmer 1-butanol, suggereren dat de productie van phosphatidic zuur door PLD mogelijk vereist voor HVA1 activering. Deze resultaten voor de verordening van de HVA1 door TaABF1 en ABA zijn vergelijkbaar met die welke zijn verkregen door Zou et al. 10 voor de activatie van HVA22 door de transcriptiefactor LtWRKY21 en ABA. De bevinding dat H2O2 of SNP doen geen substituut voor exogene ABA in het onderdrukken van aleurone expressie van Amy32b, bevestigt dat sommige aspecten van ABA signalering in granen verschillend zijn van wat er in stomatal guard cellen gebeurt. De bevinding dat H2O2 niet downregulate Amy32b expressie niet strookt met de resultaten waargenomen door Ishibashi et al. 11 voor amylase enzymactiviteit.
Nu wordt de grotere gegevensdoorvoer-protocol gebruikt voor het uitvoeren van een grondige studie van de effecten van TaABF1 fosforylering op haar vermogen om te reguleren downstream genexpressie. Als andere leden van de zaak-ABF kan familie van transcriptiefactoren worden phosphorylated op een aantal verschillende sites12,13,14,15,16, meerdere putatief fosforylatie sites op TaABF1 moeten worden getest. De hogere doorvoer toegestaan door dit protocol zal een groot aantal mutant versies van TaABF1 (met potentieel phosphorylatable serine en threonine residuen bewerkt) toelaten om te worden ondervraagd, elk met een groot aantal biologische repliceert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Greyson Butler en Margaret Barrett voor hulp bij de uitvoering van de experimenten, Judy Stone voor advies over graan homogenisering en Lynn Hannum voor advies over fluorometry. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (IOB 0443676), door een institutionele Development Award (idee) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health subsidie onder nummer P20GM0103423, en door toelagen van de verdeling van het Colby College van natuurwetenschappen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
