Summary
En forbedret protokollen er presentert for måling av forbigående genuttrykk fra reporter konstruksjoner i bygg aleurone celler etter partikkel bombardement. Kombinasjonen av automatiserte korn sliping med 96-brønns plate enzym analyser gir høy gjennomstrømming for prosedyren.
Abstract
Aleurone laget av Bygg korn er en viktig modell for hormon regulert genuttrykk i planter. I aleurone celler, gener kreves for spiring eller frøplante utviklingen er aktivert av gibberellin (GA), mens gener tilknyttet stressresponser aktiveres som abscisic syre (ABA). Mekanismer av GA og ABA signalering kan bli avhørt av introdusere reporter genet konstruksjoner i aleurone celler via partikkel bombardement, med resulterende forbigående uttrykk målt ved hjelp av enzymet analyser. En forbedret protokollen rapporteres som delvis automatiserer og strømlinjeformer korn homogenisering trinn og enzym analyser, tillater betydelig mer ytelse enn eksisterende metoder. Homogenisering av korn prøvene er utført med et automatisert vev homogenizer og GUS (β-glucuronidase) analyser er utført med en 96-brønns plate system. Representant resultatene ved hjelp av protokollen tyder på at fosfolipase D aktivitet kan spille en viktig rolle i aktivering av HVA1 genuttrykk av ABA, gjennom transkripsjon faktoren TaABF1.
Introduction
Bygg aleurone laget er et veletablert modellsystem for studiet av hormon-regulert genuttrykk i planter1. Spesielt er en rekke gener kreves for spiring eller frøplante utviklingen aktivert ved gibberellin (GA), mens gener tilknyttet stressresponser aktiveres som abscisic syre (ABA). Det GA og ABA signalnettverk trasé er sammenvevd, som uttrykk for noen GA-aktivert gener er hemmet av ABA og omvendt1.
En verdifull strategi for å forstå rollen for bestemte aktører i GA/ABA signalnettverk er innføringen av effektor genet konstruksjoner via partikkel bombardement, etterfulgt av forbigående uttrykk i reporter konstruerer at den resulterende effekten på nedstrøms genuttrykk skal fastsettes. Bruken av reporteren gener som GUS (β-glucuronidase) eller Luciferase kan følsom og kvantitativ måling av genuttrykk i cellene som har mottatt den effektor konstruere. For eksempel etablert innføring av en effektor konstruere koding transkripsjon faktoren TaABF15,6 at ABA-indusert gener som HVA1 er indusert av TaABF1, mens GA-indusert gener som Amy32b er undertrykt. Partikkel bombingen som en eksperimentell strategi har blitt brukt av flere laboratorier for å undersøke ulike aspekter av GA/ABA signalering. Arbeidet har ført til identifisering av arrangøren elementer viktig for aktivering av både GA-indusert2 og ABA-indusert gener3og oppdagelsen av protein kinaser4 og transkripsjon faktorer5 som regulerer den uttrykk for disse genene.
Eksisterende protokoller2,3,4,5,6 for partikkel bombardement og påfølgende måling av forbigående genuttrykk er ganske arbeidskrevende, som hvert bombardert knapt korn er homogenisert for hånd i en morter og enzym analyser utføres individuelt. Dette manuskriptet rapporter en forbedret protokoll som delvis automatiserer og strømlinjeformer homogenisering trinnet og GUS søk for å tillate betydelig gjennomstrømning, tillater flere behandlinger for å bli testet i samme eksperimentet, og/eller inkludering av flere replikat for hver behandling for å få mer statistisk robust resultater. Representant resultatene vises for uttrykk for HVA1 og Amy32b reporter konstruksjoner, regulert transkripsjon faktoren TaABF1 og GA ABA og andre regulerende molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av effektor og Reporter Gene konstruksjoner
- Bygge effektor konstruksjoner som bruker en konstituerende promoter (f.eks mais ubiquitin, UBI) til stasjonen uttrykk ønsket åpent lesing rammer. For eksempel konstruere en plasmider inneholder UBI::TaABF1 til stasjonen sterk grunnleggende uttrykk for TaABF15.
- Bygge reporter konstruksjoner som inkluderer arrangøren der aktiviteten skal måles, plassert over et åpent lesing ramme, som GUS. For eksempel konstruere en plasmider som inneholder HVA1::GUS for å måle uttrykk fra HVA1 promoter2,5.
- Bygge en intern kontroll konstruksjon (f.eks UBI::luciferase).
- Bruke en silica bindende kolonne protokollen (se Tabell for materiale), forberede høykvalitets plasmider for hver av de nødvendige genet konstruksjoner. Bruke ultrafiolett spektroskopi (se Tabell for materiale), nøye måle konsentrasjonen av hver plasmider forberedelse.
2. forberedelse av Bygg korn til bombardement
- Lage et regneark (se figur 1 for eksempel) som angir plasmider som vil bli bombardert, passende hormon behandlinger og annen relevant informasjon for hver behandling som vil være en del av eksperimentet.
- Bruker et skjærebrett og et sterilt barberblad, kuttet av embryoer fra korn Himalaya bygg (40 for hver behandling med i eksperimentet). Ekskludere korn misfargede eller betydelig mindre enn gjennomsnittet.
- Plassere hele embryoless korn i en 50 mL tube. Legge til 40 mL vann og rock i 10 minutter.
- Øse ut vannet nøye (for å unngå å miste korn) og legge til 40 mL 10% blekemiddel. Rock i 20 minutter.
- Hell ut blekemiddel og legge 40 mL sterilt vann. Rock i 5 minutter. Gjenta denne sterilt vann vask fire ganger.
- Legge til 40 mL Imbibing løsning (20 mM natrium succinate, 20 mM veisalt, pH 5.0) og 40 μL chloramphenicol lagerløsning (10 mg/mL).
- Overføre de fleste av Imbibing løsningen (med chloramphenicol) fra røret til en vermikulitt Plate (se Tabell for materiale). Deretter overføre korn på overflaten av det våte filter papiret i vermikulitt Plate. Spre ut korn jevnt. Hell i nok imbibing løsningen for å holde korn delvis (men ikke helt) neddykket. Plass lokket over vermikulitt platen.
- Inkuber embryoless korn på 24 ° C i ca 48 timer med fluorescerende lys. Legge til ekstra Imbibing løsning som nødvendig.
- Åpne opp en 90 mm plast Petriskål og hell 20 mL Imbibing løsning i retten seg og 20 mL i invertert lokket. Legge til 20 μL chloramphenicol (10 mg/mL) til hver. Sterilisere to par fin spiss tang av dyppe dem i alkohol.
- Plassere noen av embryoless korn i lokket på Petriskål. Bruke pinsett, forsiktig fjerne (gjennomsiktig) frø jakke fra hver korn. Stund fjerner frø jakke fra glatt siden av korn, ikke skade de underliggende cellene (aleurone). Overføre skrelles korn til Petriskål inneholder Imbibing løsning.
- Etter peeling frø jakke fra alle korn, returnere dem til vermikulitt Plate. Inkuber skrelles embryoless korn på 24 ° C i 16-20 timer.
- Like før du bruker korn for bombardement, fjerne overflaten fuktighet ved å riste dem mellom filter papirer i en Petriskål.
3. forberedelse av plasmider DNA til bombardement
- Merke en 1,5 mL tube for hver behandling som skal inkluderes i bombardement eksperimentet. Hver rør legge 2,5 µg av UBI::luciferase internkontroll plasmider, 2,5 µg en GUS reporter plasmider og ønsket antall (vanligvis 0.025 µg til 2,5 µg) en effektor plasmider. Legge til vann for å bringe det totale volumet til 5 µL.
- Forberede 1.6 µm gull microcarriers (se Tabell for materiale) følgende publisert protokoller6.
- Etter hver behandling, legger du til 50 µL av suspendert microcarriers i 1,5 mL tube med plasmider DNA. Coat microcarriers med plasmider DNA i henhold til produsentens protokoller6.
- På det siste trinnet, når de plasmider-belagt microcarriers er suspendert i 48 µL 100% etanol, Pipetter 8 μL suspendert microcarriers på hver av fem macrocarriers og tillate dem å luften tørr.
4. partikkel bombingen av Embryoless Bygg korn
- Definere partikkel bombardement apparatet (se Tabell for materiale)6.
- Plasser en 1550 psi brudd disk i beholde hetten og montere den på apparatet.
- Plass en macrocarrier som inneholder ønsket plasmider kombinasjonen (sammen med en stoppe skjerm) i samlingen microcarrier lanseringen. Sett forsamlingen i øverste sporet av bombardement chamber. Avstanden mellom ruptur platen beholde cap og macrocarrier dekke lokket på standard avstand (6 mm), og plasser den stoppe støtten (standard) midtstilling, slik at en macrocarrier travel avstand på 11 mm (figur 2A).
- Ordne 8 embryoless korn i et stramt radial mønster (med tynnere endene peker innover) på en filter papir sirkel som er teipet flatt til lokket på en 90 mm Petriskål (se figur 2B).
- Plass fatet med korn i bombardement kammeret, i en avstand på 6 cm fra skjermbildet stoppe.
- Evakuere bombardement kammeret til 95 kPa og deretter bombardere prøven.
- Etter slippe vakuum, overføre bombet korn til en merket 60 mm Petriskål inneholder 4 mL Imbibing løsning som inneholder 1 mg/ml chloramphenicol.
- Gjenta til alle bombardement er fullført. Ruge (på en risting plattform på 100 rpm) på 24 ° C i 24 timer.
5. utvinning av løselig Protein fra bombet korn
- Ved hjelp av pinsett, fjerne 8 bombet korn fra en 60 mm Petriskål og blot dem tørr på et papirhåndkle. Dele korn i to merket 2.0 mL rør (4 korn per tube) hver med 800 μL sliping Buffer (100 mM Na fosfat pH 7.2, 5 mM DTT, 10 µg/mL leupeptin, 20% glyserol) og en 5 mm rustfritt stål perle. Gjenta denne prosessen for alle bombet korn.
- Plasser (opptil 48) 2.0 mL rør i to stativer av perle homogenizer (se Tabell for materiale). Montere stativer på homogenizer.
- Riste prøvene på 30 Hz i 3 minutter.
- Fjerne homogenizer stativer fra homogenizer og plassere dem på is (5 min) re avkjøles prøvene.
- Montere stativer tilbake på homogenizer - i motsatt retning. Riste prøvene igjen ved 30 Hz i 3 minutter.
- Cool stativer på is, deretter gjenta trinn 5.3 til 5.5. Dette vil legge opp til totalt 12 minutter av risting.
- Sentrifuge korn ekstrakter 16.000 x g på 4 ° C i 10 minutter.
- Umiddelbart etter sentrifugering, Dekanter de klare supernatants i et annet sett av microcentrifuge tuber. Gi hver rør en rask vortex. Lagre rørene på is.
- Etter overføring nedbryting, gjenopprette stål perler fra pellets så de kan bli vasket og gjenbrukt.
6. måling av Luciferase aktivitet fra korn ekstrakter
- For hver tube av korn ekstrakt å være assayed, forberede 12 x 75 mm test røret som inneholder 200 μL av Luciferase analysen blanding (45 mM Tris sulfate pH 7.7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, 1 mM luciferin, 1 mM ATP).
- Tilsett 100 μL av første korn ekstraktet første analysen røret. Vortex til blandingen. Umiddelbart sett røret i rør innehaver av luminometer og lukke døren. Når målet er ferdig, Fjern røret fra luminometer-forlater døren åpen for plassering av neste røret.
- Gjenta denne prosessen til alle prøvene blitt målt.
7. måling av GUS aktivitet fra korn ekstrakter
- Tilsett 200 μL av GUS analysebuffer (50 mM Na fosfat pH 7.2, 2,5 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptin, 20% metanol, 0.02% Natriumazid) hver brønn av en 96 godt plate.
- Sted 50 μL av hver korn Pakk ut til tilsvarende godt. Bland med spissen etter. Forsegle toppen med tetting film.
- Inkuber 96 godt platen på 37 ° C i mørket i 20 timer.
- Sentrifuge 96 godt platen 4000 x g på 4 ° C i 10 minutter og sett den på is.
- Tilsett 250 μL 0,2 M Na2CO3 hver brønn av en svart 96 godt plate.
- Tilsett 6,25 μL av hver centrifuged GUS analysen blanding i tilhørende godt (med 0,2 M Na2CO3) av svarte 96 godt plate. Bland med spissen etter. Inkluder brønner med 6,25 μL 10 μM, 40 μM og 100 μM 4-methylumbelliferone standarder.
- Plassere den svarte platen i en plate fluorometer og lese fluorescens av methylumbelliferone. Ta målinger på en eksitasjon bølgelengden til 360 nm og et utslipp bølgelengde på 460 nm. Angi forsterkningen av maskinen slik at et godt inneholder 6,25 μL 40 μM 4-methylumbelliferone og 250 μL 0,2 M Na2CO3 gir en lesning av 1000 fluorescens enheter.
8. analyse
- Angi verdiene for luciferase og GUS analyser i et regneark. Ekskludere fra vurdering enhver prøven med en luciferase lesning av lavere enn 20.000 relative luminescence enheter s-1, som betyr at genet konstruksjoner ikke var ble levert til aleurone cellene.
- For hver vellykket bombet korn ekstrakt (som representerer en gruppe av fire embryoless korn), beregne normalisert GUS uttrykket fra rådata GUS og luciferase som følger: normalisert GUS = [(GUS uttrykk - GUS tomt) x (2.000.000)] / (luciferase uttrykk-luciferase tomt).
Merk: Dette normaliserer mengden GUS aktivitet til hva ville har vært observert i stykker som ga en luciferase lesning av 2.000.000. - Rapporter det relative nivået av uttrykk for en bestemt reporter konstruksjon i nærvær av effektor konstruksjoner eller hormon behandlinger blir testet ved å sammenligne nivået av uttrykk i fravær av effektor eller hormoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Teknikken er beskrevet her kan brukes å innføre noen test genet konstruksjon i aleurone celler av Bygg korn. Hvilket uttrykk fra test genet kan da være enkelt målt (figur 2). Høyere gjennomstrømming protokollen beskrevet her sterkt øker effektiviteten av frø sliping og enzym analysen trinnene. Denne metoden er brukt til å vurdere muligheten for transkripsjon faktor TaABF15,6 å aktivere uttrykk for ABA-indusert genet HVA17. I representant resultatene presenteres her ble en HVA1::GUS reporter konstruere introdusert i aleurone celler med en UBI::TaABF1 effektor konstruksjon (figur 3A). Mens en TaABF1/HVA1 forholdet bare 0,01 var tilstrekkelig til å forårsake en 3-fold induksjon av HVA1 reporter genet i fravær av eksogene ABA, høyere nivåer av TaABF1 Konstruer resulterte i stadig større HVA1 uttrykk i en doseavhengig måte (figur 3BC).
Denne eksperimentelle protokollen kan også inkludere bruk av hormoner eller andre forbindelser under etter bombardement inkubasjonstiden å vurdere rollen disse molekylene i regulering av genuttrykk. Tidligere arbeid av andre etterforskere har foreslått betydningen av fosfolipase D i noen aspekter av ABA signalering. Spesielt har av fosfolipase D aktivitet, phosphatidic syre, vært innblandet som et mellomprodukt i noen svar til ABA8,9. Det faktum at 1-butanol, en inhibitor av fosfolipase D (PLD), har vist å hindre ABA-indusert genuttrykk i aleurone celler antyder at PLD kan være en integrert del av ABA signalering i dette vevet. Bombardement protokollen ble brukt til å teste om 1-butanol kan hemme ABA-indusert eller TaABF1-indusert HVA1 uttrykk. Som forventet, kan enten eksogene ABA eller TaABF1 sterkt induserer uttrykk for HVA1::GUS reporter Konstruer (Figur 3 c). Uansett hemmet tilstedeværelsen av 1-butanol sterkt HVA1 induksjon. Dette tyder på at PLD kan spille en viktig rolle i aktivering av HVA1 genuttrykk av ABA, gjennom TaABF1.
I tillegg til sin rolle i å utvikle og spirende korn, er ABA også avgjørende for å regulere øverst aperture i blader. I cellene av stomata, produksjon av phosphatidic syre er stimulert av nitrogenoksid (NO), som igjen er indusert av Hydrogenperoksid (H2O2). For noen svar, nei og H2O2 kan erstatte ABA9. For å fastslå om dette er også tilfelle i aleurone celler, ble bombardement protokollen brukt til å teste om det nei donor natrium nitroprusside (SNP) eller H2O2 kunne erstatte ABA i hemme uttrykk for GA-indusert Amy32b gene. Mens ABA kan sterkt hemme GA-indusert uttrykk for Amy32b::GUS reporter konstruere, H2O2 verken SNP forårsaket noen betydelig reduksjon (figur 3D). Disse resultatene, derfor ikke støtter en rolle for nei og H2O2 i aleurone celle ABA svar.
Figur 1 : Regneark for en typisk bombardement eksperiment. Hvor mye hver plasmider forberedelse plasseres i røret for hver bombardement angis. I dette eksperimentet, ble fire skudd (8 korn hver) brukt for hver behandling for å gi totalt åtte mulig prøver (4 korn hver) for hver behandling. For å opprettholde den samme totale DNA konsentrasjonen i hver bombardementet, ble en "dummy" effektor plasmider brukes til å erstatte UBI::TaBF1 effektor plasmider i noen tilfeller. Behandling A er en "blank" bombardement å etablere bakgrunnsnivået av GUS og luciferase aktivitet i aleurone celler. Resultatene av bombardement eksperimentet skissert i regnearket vises i figur 3B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Diagram av protokollen. (A) skjematisk av bombardement enheten. (B) gull partikler belagt med en reporter konstruere frakte Promotøren skal testes, en effektor (om nødvendig) og en intern kontroll (UBI::luciferase) blir introdusert inn i bygg aleurone celler av partikkel bombardement. Etter inkubasjon (typisk for 24 h) korn er bakken og assayed for både GUS aktivitet og luciferase aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Regulering av HVA1 og Amy32b arrangører av TaABF1, ABA og potensielle meglere ABA signalnettverk. (A) Reporter og effektor konstruksjoner brukes i forsøkene. (B) effektor Konstruer UBI::TaABF1 var co bombardert i aleurone celler med HVA1::GUS reporter og intern kontroll Konstruer (UBI::luciferase). Hvor mye UBI::TaABF1 effektor (i forhold til HVA1::GUS reporteren) varierte fra 0 til 0.1, som angitt under søylene. GUS og luciferase ble målt etter 24 timer med inkubering. Dataene som vises er (± SE) av 6-8 biologiske gjentak. (C) HVA1::GUS reporter ble co bombardert i aleurone celler med internkontroll konstruere (UBI::luciferase) i tilstedeværelse eller fravær av effektor Konstruer UBI::TaABF1. Hvor mye TaABF1 effektor (i forhold til reporteren) var 1,0. GUS og luciferase ble målt etter 24 timer med inkubering med eller uten 20 µM ABA og 0,4% 1-butanol. (D) Amy32b::GUS reporteren var co bombet i aleurone celler med internkontroll konstruere (UBI::luciferase). GUS og luciferase ble målt etter 24 timer med inkubering i nærvær av 1 mM GA med eller uten 20 µM ABA, 1 mM H2O2eller 100 µM natrium nitroprusside (SNP). Verdier for GUS aktivitet er i forhold til uttrykk for Amy32b::GUS reporteren i fravær av GA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innføring av effektor genet konstruerer via partikkel bombardement, etterfulgt av forbigående uttrykk i reporter konstruerer er en verdifull strategi for dissekere rollen for bestemte aktører i GA/ABA signalering og resulterende hormon regulert genet uttrykk.
Eksisterende protokoller for å utføre slike eksperimenter i bygg aleurone celler2,3,4,5,6 er imidlertid svært arbeidsintensiv. Hver gruppe bombardert knapt korn må være hånd homogenisert i en morter, og de resulterende ekstrakter er assayed individuelt GUS og luciferase aktivitet. Gjeldende protokollene derfor begrense antallet forskjellige behandlinger som kan inkluderes i samme eksperiment, og begrense antall biologiske gjentak som kan rimelig inkluderes for hver behandling. Disse begrensningene gjør det vanskeligere å gjennomføre omfattende og samtidige sammenligninger mellom flere behandlinger. Slike sammenligninger kan være spesielt vanskelig hvis genuttrykk mellom behandlingene er beskjeden og et relativt stort antall biologiske gjentak er behøvde å opprette statistiske betydning.
En strømlinjeformet protokoll er presentert her som delvis automatiserer korn ekstra forberedelsen og GUS søk for å tillate betydelig høyere gjennomstrømming. Denne nye versjonen av protokollen gjør det mulig å inkludere en mye større antall prøver i et eksperiment, slik at begge inkludering av flere forskjellige behandlinger per eksperiment og mer replikerer for hver behandling. For utarbeidelse av korn ekstrakter etter bombardement og inkubasjon, har vi erstattet en stor grad automatiserte sliping protokoll som benytter en perle homogenizer som kan behandle 48 prøver samtidig (i ca 20 minutter). Således, en enkelt etterforsker kan forberede løselig protein utdrag fra nesten 200 eksempler på kortere tid det ville ta et team av fire etterforskerne å hånd slipe bare 100 prøver. Modifisert GUS analysen, utført i 96 bra plater, krever også mye mindre arbeidskraft som den originale protokollen som ansatt personlige tube søk.
I forbereder plasmider blandinger bombardement (trinn 3.1), er det mulig å bruke en effektor reporter forhold av 1.0, spesielt for foreløpige tester for å fastslå om en bestemt effektor har noen effekt i det hele tatt. Men på grunn av styrken til arrangøren av mais ubiquitin (UBI), kan en sterk effekt ofte være observert med mye lavere prosenter, som vist i figur 2B som tidligere publiserte rapporter4,5,6. Andre avgjørende skritt i denne protokollen inkludere peeling av frø jakke fra Bygg korn og bruk av nøye definerte innstillinger i bombardement apparatet. Hvis frø strøk ikke er fullstendig fjernet, vil gull microcarriers bli forhindret fra å komme inn subtending aleurone cellene. Vellykket leveranse av gull microcarriers inn i aleurone cellene er også ganske avhengig av den bestemte typen brudd platen brukes, plasseringen av microcarrier dekke lokk, stoppe skjermen og vev å bli bombardert. Betingelsene rapporterte her vanligvis resulterer i vellykket leveranse av genet sammensetningene (se trinn 8.1) til en høy prosentandel (≥70%) av bombet Bygg korn prøver. Bør det forventes at andre biologiske materialer ville kreve forskjellige forhold for optimal gen levering.
Selv om det ikke er beskrevet her, ville det være mulig å ytterligere effektivisere prosedyren ved flash luciferase analyser i 96 bra plater. Men som lys produksjonen fra luciferase må måles i en luminometer umiddelbart etter blanding protein pakke med underlaget (luciferin), vil dette kreve bruk av en plate flash luminometer med injektorer, et instrument som er mye mer dyrere enn en enkelt rør luminometer.
Representant resultatene rapporteres her bekrefter at transkripsjon faktoren TaABF1 kan aktivere HVA1 uttrykk i fravær av eksogene ABA5,6. Aktivering av HVA1 ved TaABF1 eller eksogene ABA ble forhindret av den PLD hemmer 1-butanol, tyder på at produksjonen av phosphatidic syre av PLD kan kreves for HVA1 aktivisering. Disse resultatene for HVA1 regulering av TaABF1 og ABA er lik de ved Zou et al. 10 for aktivering av HVA22 ved transkripsjon faktoren LtWRKY21 og ABA. Finne at H2O2 eller SNP ikke erstatning for eksogene ABA i undertrykke aleurone uttrykk for Amy32b, bekrefter at noen aspekter av ABA signalering i korn er forskjellig fra hva som skjer i øverst celler. Funn at H2O2 ikke ikke downregulate Amy32b uttrykk er konsistent med resultatene observert av Ishibashi et al. 11 for amylase enzym aktivitet.
Den økte gjennomstrømning protokollen brukes nå å gjennomføre en omfattende studie av virkningene av TaABF1 fosforylering i sin evne til å regulere nedstrøms genuttrykk. Som andre medlemmer av ABF kan familie av transkripsjonsfaktorer bli fosforylert på en rekke forskjellige områder12,13,14,15,16, flere mulige fosforylering nettsteder på TaABF1 må testes. Høyere gjennomstrømningen tillates av denne protokollen tillater et stort antall mutant versjoner av TaABF1 (med potensielt phosphorylatable serine og threonin rester endret) å bli avhørt, hver med et stort antall biologiske replikerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takke Greyson Butler og Margaret Barrett for hjelp i å utføre eksperimenter, Judy Stone for råd om korn homogenisering og Lynn Hannum for råd om fluorometry. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (IOB 0443676), ved en institusjonell Development Award (idé) fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under bevilgning nummer P20GM0103423 og tilskudd fra Colby College delingen av naturvitenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
