Summary
קביעת המגוון פטרייתי בתוך סביבה היא שיטה מנוצל בלימודי בריאות תעסוקתית לזהות את הסכנות הבריאותיות. פרוטוקול זה מתאר מיצוי DNA מדגימות האוויר תעסוקתית עבור הגברה ורצף של אזורים ITS פטרייתי. גישה זו מזהה הרבה מינים פטרייתי זה ניתן להתעלם על ידי שיטות הערכה מסורתית.
Abstract
שיטות מסורתיות של זיהוי חשיפות פטרייתי בסביבות תעסוקתית, כגון תרבות וגישות מבוסס מיקרוסקופיה, יש מספר מגבלות המביאים הדרה של מינים רבים. ההתקדמות בתחום בשני העשורים האחרונים הובילו בריאות תעסוקתית חוקרים לפנות מולקולרי המבוסס על גישות לזיהוי סיכונים פטרייתי. שיטות אלה גרמו הגילוי של מינים רבים בתוך סביבות מקורה בעיסוק זה לא זוהו בשיטות מסורתיות. זה פרטי פרוטוקול גישה לקביעת גיוון פטרייתי בתוך האוויר דוגמאות דרך הפקת דנ א גנומי, הגברה, רצף, זיהוי טקסונומי של פטריות פנימי עיבד אזורים מרווח (ITS). התוצאות שלה רצף זיהוי מינים רבים פטרייתי, כי הם לא זוהה או קשה לזהות לרמה מינים באמצעות תרבות או מיקרוסקופ. בעוד ששיטות אלה אינם מספקים מדדים כמותיים של הנטל פטרייתי, הם מציעים גישה חדשה זיהוי הזארד, יכול לשמש כדי לקבוע הכוללת מינים עושרה ורב -גוניותה בתוך סביבה תעסוקתית.
Introduction
חשיפות פטרייתי וסביבות מקורה בעיסוק יכול לגרום morbidities בדרכי הנשימה, כולל רגישות עולה אלרגיות, אסטמה1. זיהוי של מפגעים פטרייתי חשוב עבור הערכת הסיכון ומניעת חשיפה העובדים. מפגעים פטרייתי אלו עשויים להיות תוצאה של זיהום מקורה, חדירה חיצונית אוויר או הפרעה סביבתית, כי התוצאה הובלת חומרים פטרייתי לאזורים איפה העובדים הנוכחי2. שיטות להערכת חשיפה פטרייתי כללו דגימה תרבות בת קיימא, כמו גם זיהוי מיקרוסקופי של נבגי פטריות. גישות אלה יש מספר מגבלות ומשקיפים לעתים קרובות הרבה מינים פטרייתי זה יכול לתרום הנטל הכולל פטרייתי3. גישות התרבות מבדילים רק אלה יצורים פטרייתי קיימא זה יכול להיות מעובד במדיה מזין. זיהוי נבגי פטריות מיני לרמה באמצעות מיקרוסקופ יכול להיות מבולבל על ידי נבגים שיתוף מורפולוגיות דומות. שתי השיטות הן תלויות במידה רבה mycologists לנתח ולזהות המין פטרייתי, עם רבים שנותרו לא מזוהה.
כדי לשפר את מתודולוגיות הקיימים בשימוש זיהוי סיכון מקצועי והערכות לחשיפה, חוקרים רבים הפכו לטכנולוגיות מבוססות-מולקולרית. גישות רצף להערכת גיוון חיידקים בתוך סביבות מקורה בעיסוק חשפו ספקטרום רחב יותר של מינים פטרייתי נתקל לעומת שיטות כמו מיקרוסקופ תרבות בת קיימא3,4 ,5. השיטה המוצגת כאן מתאר את הדגימה האוויר של סביבות תעסוקתית, הפקת דנ א גנומי לצורך זיהוי סכנות פוטנציאליות פטרייתי. זיהוי סיכון מושגת על ידי רצף של גרעיני ribosomal מרווח משועתקים פנימי או ITS, אזורים משתנה מאוד בין פטריות, שימשו בדרך כלל כדי להבדיל בין המינים פטרייתי6,7, 8,9. מינים רבים למצוא במסגרות תעסוקתיות, כמו מינים מסוימים השייכים שלקרוא פטריות בסיסה, לא ניתנים לזיהוי בתרבות קיימא, שקשה להבדיל ברמה המיקרוסקופית. פטריות אלה נצפו בשפע היחסי גבוה בתוך סביבות מקורה בעיסוק מוערך על ידי רצף פטרייתי ITS אזורים3,4,10. רצף שלו סיפק ידע רב יותר לתוך המגוון של פטריות נתקל בתוך סביבות מקורה בעיסוק.
הפרוטוקול המתוארים כאן פרטים השיטות נהגו לאסוף לחלץ, להגביר את האזורים ITS פטרייתי מ bioaerosols לניתוח רצף. גישה זו מנצל את המכון הלאומי לבריאות (NIOSH) ובטיחות תעסוקתית ציקלון בשני שלבים תרסיס סמפלר לאסוף את החלקיקים באוויר. סמפלר זו פותחה כדי לאסוף את bioaerosols נפרדת respirable (≤4 מיקרומטר אווירודינמי קוטר) ו- respirable (> 4 מיקרומטר אווירודינמי קוטר) חלקיקים, המאפשר זיהוי של אורגניזמים פטרייתי בתוך סביבות מקורה ביותר נוטים להיות בשאיפה של העובד11. דוגמי אוויר אחרים, לרבות ציקלון סמפלרים, הינם זמינים על שוק זה יש את היכולת לאסוף את החלקיקים בתוך הטווח respirable (< 4 מיקרומטר) באמצעות מסננים12,13. לעומת זאת, הדוגם תרסיס בשני שלבים ציקלון NIOSH מפריד מינים פטרייתי מבוסס על קוטר אווירודינמי שלהם לתוך צינורות פוליפרופילן, חד פעמיים אשר ניתן לעבד באופן מיידי עבור יישומי הזרם14.
התהליכים של חילוץ דנ א גנומי ותגביר את האזורים ITS פטרייתי מפורטים של פרוטוקול זה. למתודולוגיות החילוץ הציג פותחו במיוחד עבור הפקת דנ א גנומי פטריות וחיידקים, כמו הרבה ערכות מסחרי למטרה בתרבית של תאים, חיידקים או שמרים במיוחד15. צבעי יסוד השתמשו במחקר זה נבחרו בהתבסס על הכיסוי שלהם הכוללת של פטריות 1 שלה והן שלה 2 אזורים4,5. רצף של אזורים אלה מאפשר השוואת הרבה רצפים ITS הפקידה, כולל אלה הרצף האזור 1 שלה, שלה 2 אזור או אזורים 1 שלה והן 2 שלה. המגוון פטרייתי של האוויר דוגמאות שנאספו הגדרה מקורה באמצעות שיטות אלה מוצגים, חשיפת מספר ניכר של רצפי להציב את phyla פטריות שק ו פטריות בסיסה, כמו גם רצפים אחרים השייכים phyla פטרייתי פחות דומיננטי, כגון זוגניות. המגוון הרחב של רצפי פטרייתי מזוהה באמצעות גישה זו לא יילכדו באמצעות מתודולוגיות זיהוי סיכון מסורתיים כמו טיפוח או מיקרוסקופ. רצף של אזורים ITS פטרייתי מספק שיטה משופרת כדי לזהות מפגעים פטרייתי וגם מאפשרים הבנה טובה יותר של חשיפות תעסוקתיות ומקורה פטרייתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכינים את הדוגם תרסיס NIOSH
הערה: הדוגם תרסיס NIOSH זה דוגמאות תרסיס בשני שלבים ציקלון שאוסף את bioaerosols באמצעות שני צינורות הדגימה והן מסנן טפלון (PTFE).
- לפני הרכבה, בדקו בקפדנות את הדוגם. בדוק הדוגם כדי להבטיח זאת אינו פגום, כל הברגים במקום ואת צמוד הינם ההדבקה איטום סביב התפר הנוצרת על-ידי שני חצאים לא נפגע. בדוק את הדוגם o-ring כדי לוודא שאין כל nicks, סדקים או דמעות ויש לה ציפוי קל מאוד של גריז סיליקון.
הערה: הדוגם כולל מסנן PTFE מיקרומטר 3 37 mm פוליסטירן או קלטת פוליפרופילן לסנן שלושה חלקים.- להרכיב את הקלטת מסנן על-ידי הצבת של תאית או כרית תמיכה מסנן מפלסטיק (כלול עם המסננים) על פני השטח gridded של היצירה הבסיס (ראה איור 1). השתמש במסנן מלקחיים לשים את המסנן על גבי משטח תמיכה מסנן עם הצד אוסף פונה כלפי מעלה.
- חותם הקלטות מסנן באמצעות מכבש ידני או פנאומטי. יד הסגר יאפשר אוויר באזור המסנן ולהפחית את היעילות אוסף. הכנס את פיסת בצורת טבעת (הגלימה סיומת), והשתמש העיתונות לדחוף אותו בחוזקה, באופן שווה. לחץ כלפי מטה הגלימה הרחבה על המסנן מספיק חזק כדי להבטיח אוויר אינה דולפת סביב המסנן.
הערה: החלק העליון בקלטת אינו נמצא בשימוש בעת הדגימה אך יש לשמור כדי לכסות את המסנן לאחר סיום דגימה. - להתאים את הקלטת שהורכב על החלק העליון של הדוגם, ומדחיק ככל האפשר. עטיפת נייר-דבק 19 מ מ (3/4 אינץ ') סביב החלק החיצוני של מסנן קלטת, סמפלר להחזיק בקלטת מסנן במקום ולפעול כחותם גיבוי כדי למנוע דליפות.
- להבריג כל שפופרת בחוזקה באופן מלא סמפלר עד זה תחתונים ולפעול גלישת אטימה קלטת סביב כל שפופרת כחותם משני נגד דליפות.
הערה: הרכבת התחתית הראשונה, צינור פוליפרופילן 15 מ"ל, אוספת חלקיקים שאינם respirable עם קוטר אווירודינמי > 4 מיקרומטר. הצינור השני, צינור פוליפרופילן microcentrifuge 1.5 mL, אוספת חלקיקים respirable בין 1 ו- 4 מיקרומטר. חלקיקים קטנים יותר, הנותרים < 1 מיקרומטר, נאספים על PTFE לסנן (ראה איור 2).
- כיילו את זרימת האוויר דרך הדוגם NIOSH עם צנצנת כיול לפני כל שימוש כמו הבדלים המסננים ואת דוגמי יגרום את זרימת האוויר משתנה.
- לשימוש צנצנת כיול, להכניס סכינים סטריליים מתאים הצנצנת העליון של המסנן את הקלטת, מקם את הדוגם בצנצנת ולאחר לאטום את הצנצנת.
- לחבר את הצנצנת כיול מד זרימה כיול, המשאבה הדגימה. להפעיל את המונה תזרים ולאפשר לו להתחמם לכמה דקות. שימו לב כי מד זרימה תמיד חייב להיות מסנן המצורפת שלה כניסת כדי להימנע מזיהום מד זרימה, את הדוגם.
- להפעיל את המשאבה הדגימה ולאפשר לו לפעול לכמה דקות לחמם ולייצב.
- התאם את המשאבה כדי להגדיר את קצב זרימה נכונה ב- 3.5 L/דקה.
הערה: קצב הזרימה הדוגם תרסיס NIOSH מוגדרת בדרך כלל 3.5 L/min. בקצב הזה זרימה, הדוגם תואמת לקריטריונים ACGIH/ISO של חלקיקים respirable הדגימה16. המחירים זרימה אחרים יכולים לשמש אם ניתוק שונים הגדלים הם הרצויה או כדי להקטין את רמת הרעש, אבל להיות מודע כי אם קצב זרימה שונים, ואז הדוגם כבר לא להתאים לקריטריונים דגימה respirable. - כיול תסתיים, כבה את המשאבה ואת מד זרימת.
2. סטטי ואישי תרסיס דגימה
- להגדיר את הדוגם תרסיס NIOSH לדיגום גם אזור אישי או סטטי.
הערה: סטטי דגימה מתייחסת לשימוש את הדוגם תרסיס בעוד היא מצורפת חצובה או התקן אחר אחזקות (ראה איור 3), כפי לעומת אישי דגימה כאשר סמפלר של משאבת הם רכובים על האדם נחקר (ראה איור 4).- לדיגום אזור סטטי, לשמור דוגמי קרוב ככל האפשר אל אזור ספציפי הנלמדים. שמור את דוגמי מן האוויר אינלטס, חדר כניסות ומקומות שעשויים להיות בדרך של זרימת האוויר.
הערה: ריכוזי תרסיס יכול להשתנות במידה ניכרת אפילו במרחקים קצרים, במיוחד אם המקור תרסיס נמצא חדר ה-17. - עבור דגימה אישי, להגדיר את הדוגם בתוך אזור הנשימה של האדם. לצרף את הדוגם דש, כתף או בחזה, למקם את המשאבה דגימה במותניים או בתרמיל.
הערה: אזור הנשימה נפוץ ההנחה תהיה האונה 30 ס מ סביב האף של האדם שממנו רוב האוויר נמשך במהלך שאיפה17.
- לדיגום אזור סטטי, לשמור דוגמי קרוב ככל האפשר אל אזור ספציפי הנלמדים. שמור את דוגמי מן האוויר אינלטס, חדר כניסות ומקומות שעשויים להיות בדרך של זרימת האוויר.
- ודא כי הדוגם אבובים היא מרחק של אינלטס דוגם, כי שום דבר לא חוסם את פתחי הכניסה או להפריע זרימת האוויר לתוך הדוגם. הדוגם אבובים חייב להיות לא צבט או לפגוע. כל חסימה יגרום המשאבה לעצור.
- להפעיל את המשאבות. לאחר דקה או שתיים, לבדוק אם המשאבות עדיין פועלים.
הערה: התנהגות אוויר דגימה לתקופות זמן שנעו מ קטנה כמו 10 דקות עבודה מלא 8 שעות משמרת, בהתאם לסביבה10,18,19. התוצאות שהוצגו איור 6 הן נציג של תקופת 60 דקות דגימה בסביבה מקורה. - לאחר השלמת הדגימה האוויר, לאסוף את צינורות מדגם מסנן. הוצא את הקלטת איטום, להתיר את הצינורות, קאפ אותם. מקם את החלק השלישי של קלטת מסנן מעל המסנן. לאחסן דגימות ב 4 ° C עד מוכן לעיבוד.
3. הפקת דנ א גנומי מדגימות האוויר
- לחלץ הדנ א (gDNA) מבכל שלב הדוגם NIOSH BC251. לעבד את האוויר דגימה צינורות איסוף וסינון בנפרד כדי לאפשר קביעה של אירוסולים חיידקים respirable ו- respirable לדוגמה.
הערה: לחלופין, שלושת השלבים ניתן להיות משולב, חילוץ אם מדגם inoculum הוא קטן מדי.- Class II בטיחות ביולוגית ארון או זרימה שכבתית נקיים, גילוח ורחיצה כירורגית להסיר את המסנן. נגב את הקלטת דגימה באמצעות אתנול 70% ופריצה בקלטת דגימה לפתוח בעזרת כלי קלטת-פתיחה. השתמש של מרים מסנן כדי לדחוף את הפנקס מסנן ותמיכה כלפי מעלה. לתפוס את המסנן באמצעות מסנן מלקחיים ומניחים אותו בצלחת פטרי סטריליות. לחתוך את המסנן 6 חלקים שווים ומניחים צינור 2 מ"ל מחוזק המכיל 300 מ ג חרוזי זכוכית (0.2 - 0.5 מ מ).
- מקם את הצינור המכיל למסנן של חנקן נוזלי ל 30 s מיד למקם אותו מהמגן מיל חרוז שוכן בגובה 4.5 מטר לשנייה ב-30 s.
- חזור על שלב 3.1.2 פעם או פעמיים עד המסנן משופשף. חתיכות קטנות של מסנן שלם עשויים להישאר. להוסיף 0.5 מ של פירוק מאגר (אוריאה 4 מטר, 200 מ"מ טריס, 20 מ מ NaCl, 200 מ"מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), pH 7.4).
- הוסף mL 0.3 מאגר פירוק 15 mL, 1.5 mL אוויר דגם של צינורות. מערבולת הצינור במשך 10-15 s תוך זקוף, ואז עוד 10-15 s הפוכה. העבר את התוכן של כל שפופרת צינורות 2 מ"ל מחוזק המכיל 300 מ ג חרוזי זכוכית.
הערה: רוב החומר שנאסף כל שפופרת סמפלר יצטברו בסמוך לחלקו העליון של הצינור. - לעבד את כל צינורות מהמגן מיל חרוז-4.5 מטר לשנייה עבור 30 s ו צנטריפוגה אותם g x 20,000 עבור 1 דקות ב- 22 מעלות צלזיוס. להעביר צינורות סטרילי mL 1.5 microcentrifuge supernatants ו centrifuge הצינורות ב g x 20,000 שוב על 1 דקות ב- 22 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה.
- להוסיף 30 µL של ריאגנט פירוק (ראה טבלה של חומרים) כל צינור, דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- הוספת 0.2 מ של איגוד מאגר (10 מ' שתנן, 6 מ' guanidine-HCl, 10 מ מ טריס-HCl, 20% טריטון X-100, pH 4.4), proteinase K (100 µg/mL) כל צינור, דגירה הצינורות-70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להוסיף 100 µL של אלכוהול איזופרופיל כדי כל שפופרת.
- להעביר את הפתרונות תמצית לתוך סיב מסנן צינורות זכוכית (קיבולת µL 700) ממוקמת ב 2 mL אוסף צינורות ו centrifuge הצינורות אוסף ב- g x 20,000 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. למחוק את הצינורות אוסף ולמקם הצינורות מסנן לתוך צינורות חדשים של אוסף 2 מ"ל.
- להוסיף 0.5 mL מעכב הסרת מאגר (5 מ' guanidine-HCl, 20 מ מ טריס-HCl, pH 6.6, 38% אתנול) כל שפופרת, centrifuge הצינורות אוסף ב- g x 20,000 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. למחוק את הצינורות אוסף ולמקם הצינורות מסנן לתוך צינורות חדשים של אוסף 2 מ"ל.
- להוסיף 0.5 mL שטיפת מאגר (20 מ מ NaCl, 2 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 80% אתנול) כל שפופרת, centrifuge הצינורות אוסף ב- g x 20,000 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. למחוק את הצינורות אוסף ולמקם הצינורות מסנן לתוך צינורות חדשים של אוסף 2 מ"ל. חזור על תהליך זה.
- Centrifuge צינורות אוסף ב- g x 20,000 עבור 1 דקות נוספות ב 22 ° C כדי להסיר את כל מאגר לשארי שטיפת. למחוק את הצינורות אוסף ולמקם הצינורות מסנן לתוך צינורות אוסף חדש.
- להוסיף 100 µL חם (≥70 ° C) • תנאי מאגר (10 מ מ טריס-HCl, pH 8.5) כדי כל שפופרת, דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך 1-2 דקות צנטריפוגה הצינורות אוסף ב- g 20,000 x עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס. העברת הצינורות מסנן ריק שפופרת microcentrifuge mL 1.5 סטרילי ולהחיל מחדש eluates מהשלב 3.8. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1-2 דקות צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס.
הערה: Eluates יכול לשמש באופן מיידי עבור שלב 4 או מאוחסנות ב-20 ° C עד מוכן לשימוש. דנ א גנומי ניתן לאחסן עד שנה ב-20 ° C. מומלץ כי ה-DNA ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס אם נדרש לאחסון לטווח ארוך.
4. הגברה של פטריות ribosomal DNA
- השתמש תחל פטרייתי אוניברסלי כדי להגביר שלה אזורים 1 ו- 2 מן gDNA שחולצו.
הערה: עבור פרוטוקול זה, תחל זוג Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') משמשים למתן את הכיסוי הכי גדול של ITS אזורים4,5. ערכות פריימר אחרות, כגון אלה המדגישים את האזורים ITS1 או ITS2 לבד, יכול לשמש.- להגדיר תגובות שרשרת פולימראז (PCR) עבור כל דגימה בתגובות triplicate 50 µL סטרילי 0.5 mL המבחנות או 96-ובכן PCR צלחות כדלקמן: 5 µL של חילוץ תבנית ה-DNA (מתוך שלב 3), µL 33.3 PCR כיתה מים, µL 5 מאגר x PCR 10 , µL 1.5 של 50 מ מ MgCl2, µL 1 של 10 מ מ 2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates, 0.5 µL של 20 מיקרומטר Fun18Sf פריימר לפנים, 0.5 µL של 20 מיקרומטר פריימר ITS4R הפוכה ו- 0.2 µL של הדנ א. אנזימים .
- לבצע תגובות ב הצנטרפוגה תרמי: דנטורציה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 6 מחזורים של דנטורציה (96 ° C, 30 s) עבור חישול (50 ° C, 45 s) והסיומת פריימר (72 ° C, 3 דקות); 20 מחזורי דנטורציה (96 ° C, 30 s), מחזק (50 ° C, 45 s), והארכת תחל (72 ° C, 1 דקות); ולשמור על הארכת תחל ב-72 מעלות במשך 10 דקות את תערובות התגובה ב 4 ° C עד השלב הבא.
- לשלב שתגובות PCR triplicate לטהר באמצעות ערכת טיהור המבוסס על רפידה סיליקה.
הערה: הליך זה מאפשר הסרת ה-PCR (תחל, dNTPs, אנזימים, מלחים, וכו '.) ורכיבים אחרים מזהמים מהכנות DNA מוגבר.- לשלב את תגובות 3 עבור כל דגימה (סה כ 150 µL) סטרילי mL 1.5 microcentrifuge צינורות. להוסיף מאגר מחייב (5 מ' guanidine-HCl, 30% אלכוהול איזופרופיל) בווליום 5 x (750 µL) ולערבב את הפתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה עשר פעמים.
- הוסף µL 450 של תערובת ספין עמודות באוסף צינורות, centrifuge הצינורות ב g 17,900 x עבור ביטול ס' 30 את filtrates. להוסיף את µL 450 הנותרים העמודות, צנטריפוגה-g 17,900 x עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס.
הערה: העמודות ספין מכילים סיליקה קרום המאפשר ספיחה של ה-DNA לעמודות. - למחוק את filtrates ומוסיפים µL 750 כביסה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 80% אתנול) העמודות ספין. Centrifuge את העמודות ב- g x 17,900 עבור 30 s-22 מעלות צלזיוס.
הערה: תהליך זה הסרת המזהמים את התגובה PCR שהוזכרו לעיל. - למחוק את פילטרט של ו centrifuge את העמודות הריקות-g x 17,900 עבור 1 דקות ב- 22 מעלות צלזיוס.
הערה: השלב זה כדי להסיר את כל ממסר שטיפה מאגר שעלולות לפגוע יישומים במורד הזרם. - להעביר את העמודות ספין סטרילי mL 1.5 microcentrifuge צינורות. להוסיף µL 45 • תנאי מאגר (10 מ מ טריס-Cl, pH 8.5), דגירה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 5 דק צנטריפוגה העמודות ספין-g x 17,900 עבור 1 דקות ב- 22 מעלות צלזיוס.
- השתמש ה-DNA eluted מיד על שלבים 4 ו- 5 או לאחסן ב-20 ° C עד מוכן לשימוש.
הערה: amplicons ניתן לאחסן עד שנה ב-20 ° C. מומלץ כי ה-DNA ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס אם נדרש לאחסון לטווח ארוך.
5. אימות של הגברה ITS פטרייתי שימוש בג'ל agarose
- הגבס agarose 1% ג'ל המכיל 1 µg/mL אתידיום ברומיד. להמיס agarose רותחים 1 x מאגר טריס-אצטט-EDTA (טה). ברגע הפתרון הוא מקורר עד כ 50 ° C, להוסיף את אתידיום ברומיד ויוצקים לתוך ג'ל יצוק.
- אחרי הג'ל agarose התחזק, לטבול את הג'ל 1 x TAE ולהכין את amplicons שיש לטעון על הג'ל. כדי µL 8 של ה-DNA מוגבר, להוסיף 2 µL של 5 x טעינת מאגר.
הערה: אמצעי אחסון אלה ניתן להתאים בהתאם הריכוז של המאגר הטעינה הרצוי. - לטעון את הדגימות, כל µL 10, על גבי הג'ל יחד עם סולם הדנ א לעיון גודל. הפעל את הג'ל ב-75 V (6 V/ס מ) עבור 90 דקות לדמיין להקות, בדרך כלל קשר בין 750 ו 1,000 זוגות בסיס, באמצעות אולטרה סגול בהיר (ראה איור 5).
6. רצף וניתוח של אזורים ITS פטרייתי
- רצף את gDNA חילוץ או אזורים ITS פטרייתי מוגבר ולנתח את רצפי בשיטות הנוכחי והולמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התפלגות המינים בתוך סביבה יכול להידרש באמצעות השפע היחסי על-ידי קביעת המספר של שיבוטים של כל OTU זיהה בדגימות אוויר. איור 6 הוא תרשים כתר המייצג את המינים taxonomically ממוקמת בתוך סביבה מקורה בעקבות 60 דקות של הדגימה האוויר. זה יכול להיות שנצפו כי הסביבה מכיל מגוון רחב של מינים בתוך שתי הגדולות phyla פטריות, פטריות שק, פטריות בסיסה, וכן מינים השייכים שלקרוא זוגניות (Rhizopus microsporus). שיטות מסורתיות של הערכת מוטים כלפי זני פטריות שק, כמו פטריות בסיסה רבים אינם culturable או אינו יכול להיות מבודלים בשיטות מבוסס מיקרוסקופיה. רצף של אזורים ITS פטרייתי מאפשר זיהוי מינים פטרייתי רבים, במיוחד כמה פטריות בסיסה, לעיתים קרובות שעין. ניתוח של סביבה זו מראה 68% של הרצף פטרייתי מזוהה שייך פטריות בסיסה עם רובם ממוקמים לפי הסדר Polyporales.
הנתונים בטקסונומיה שהושג באמצעות גישות רצף יכול לשמש כדי לקבוע את הגיוון בטקסונומיה בתוך סביבה. מדדי גיוון, כמו אלה המוצגים בטבלה 1, לקבוע כמה עשיר הסביבה היא, אשר מתאר את מספר המינים מזוהה בכל מדגם, כמו גם כמה מגוונות הסביבה היא, אשר לוקח בחשבון את מספר המינים ואת השפע . כל אחד. טבלה 1 מציגה את צ'או 1 העושר מדדי שאנון גיוון אינדקסים עבור שתי סביבות מקורה. המדדים מצביעים על עושרה ורב -גוניותה בסביבות הממוזגים לעומת סביבות אויר קריר יותר גבוהה יותר. נכללים גם הם המקדמים dissimilarity קרטיס בריי. אלה מתארים שונים כמה דוגמאות של סביבת הן לגבי המינים שזוהו בתוך כל דגימה. הדגימות בתוך שתי סביבות המתוארות בטבלה 1 הם מאוד שונים-98% ו 97% עבור המזגן, סביבות אויר קריר יותר, בהתאמה.
איור 1: ייצוג סכמטי של אסיפה קלטת מסנן שלושה חלקים. בקלטת מסנן מורכב לשלושה חלקים: חלק עליון או כובע (כניסה), של הברדס סיומת, חתיכה הבסיס (עודפים). כרית תמיכה בעלת מסנן ממוקמים על פני השטח gridded של היצירה הבסיס. הגלימה סיומת לאחר מכן, ננעל על גבי הבסיס באמצעות מכבש ידני או פנאומטי. לשימוש עם הדוגם ציקלון bioaerosol NIOSH, פיסת העליון הוא עזב במהלך דגימה, הוחלף לאחר מכן עבור אחסון ותעבורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ייצוג סכמטי של הדוגם ציקלון NIOSH bioaerosol. הדוגם תרסיס ציקלון NIOSH אוספת חלקיקים באוויר על ידי ציור אוויר לתוך הדוגם דרך הים, והפקת ציקלון כי ההפקדות חלקיקים על הקיר של הצינורות מדגם. האוויר קודם נשאב לתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל, שם גדול חלקיקים (> 4 מיקרומטר) לאסוף על דפנות הצינור. אז האוויר זורם יצא הצינור הראשון, הוא נשאב לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL, שבו חלקיקים קטנים יותר (1 עד 4 מיקרומטר) לאסוף. החלקיקים שנותרו (< 1 מיקרומטר) לאסוף על מסנן PTFE כמו האוויר נשאב החוצה הדוגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: דוגמה של מלכודת סמפלר סטטי. התמונה ממחישה דוגמי להגדיר עבור אזור סטטי הדגימה. דוגמי NIOSH מוגדרים ועד גוביינא 40 אינצ'ים (102 ס מ) ו 60 אינץ ' (152 ס מ) מן הרצפה, המייצג לגבהים של ישיבה או עמידה למבוגרים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: דוגמה של אסיפה סמפלר אישי. התמונה ממחישה דוגמאות NIOSH משוחק על תיק גב על ידי הפרט. הבורר סמפלר וכוח נמצאים על הרצועות של הלהקה בזמן המשאבה דגימה ממוקם בתוך התרמיל עצמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: דוגמה של ג'ל agarose ויזואליזציה של הגביר את הדנ א שלה מדגימות האוויר. התמונה מציגה להקות DNA בין 750 ו 1000 בסיסים. הלהקות האלה מייצגים אזורים ITS פטרייתי מוגבר מדגימות האוויר שחולצו. אזורים שלה משתנים בגודלם בהתאם למקור מינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: הצגת תרשים דוגמא כתר taxonomically להציב פטרייתי מינים זוהו בסביבה מקורה. התרשים כתר מתארת שפע יחסי של המינים פטרייתי 4 דגימות נאספו מבתים לאחר תקופה הדגימה האוויר 60 דקות עם הדוגם ציקלון bioaerosol NIOSH. 68% של המינים שזוהו שייכים שלקרוא פטריות בסיסה עם השתייכות הנותרים פטריות שק (33%) ואת זוגניות (1%). רצפי ITS הנפוץ בסביבה זו השתייכו למסדר Polyporales וזוהו Phanerodontia chrysosporium ו Gelatoporia dichroa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| העושר צ'או-1 | גיוון שאנון | . קרטיס בריי מרחק | |
| זאת אומרת (דקות, מקסימום) | זאת אומרת (דקות, מקסימום) | זאת אומרת (דקות, מקסימום) | |
| המזגן (n = 9) | 33.86 (15.0, 102.0) | 1.39 (0.68, 2.51) | 0.9778 (0.8313, 1.00) |
| מצנן (n = 10) | 25.46 (12.5, 49.5) | 1.10 (0.50, 1.72) | 0.9624 (0.3804, 1.00) |
טבלה 1: נתוני לדוגמה המציג גיוון ומינים העושר מדדי השוואה בין סביבות מקורה. הטבלה מציגה מדדי העושר צ'או 1 (מספר מינים לכל דגימה), מדדי גיוון שאנון (מספר מינים), שפע של כל אחד, המקדמים dissimilarity קרטיס בריי (התפלגות מינים שונים איך הוא בין דגימות בסולם של 0 - 1). נתונים אלה מדגימים גבוה עושרה ורב -גוניותה סביבות ממוזגים, dissimilarity גבוהה בין דגימות בשתי סביבות העבודה. טבלה זו שונתה מ לימונים ואח. 10 , ברשות החברה המלכותית לכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קביעת המגוון פטרייתי בתוך סביבה תעסוקתית באמצעות גישות רצף השתפרה הערכת סיכון פטרייתי זיהוי וחשיפה. באמצעות גישה זו אפשרה איתור מינים פטרייתי נוספים רבים אשר לעיתים קרובות לא מזוהים באמצעות תרבות או מבוסס מיקרוסקופיה שיטות ההערכה. שיטת דגימה bioaerosols סביבות תעסוקתית, מקורה, הפקת דנ א גנומי מדגימות האוויר שלו הגברה, רצף מוצג כאן. האישושים פטרייתי הגיוון בשיטות אלה תלויה מאוד: חילוץ מוצלח (1) ושלמה של דנ א גנומי מן האוויר דוגמאות, (2) הגברה של gDNA עם תחל לאפשר השוואה של מוגבר שלו רצפי הפקידה רצפים של מסד הנתונים ואת מגבלת הסטיגמות הגברה, (3) זיהוי טקסונומי הנכון של הרצף בתוך מאגרי המידע.
מיצוי DNA גנומי מוצלח הוא מסתמך על מתודולוגיות החילוץ של ריאגנטים מועסקים במחקר. כפי שהוזכר בפרוטוקול, הרבה bioaerosols את וחלקיקים אחרים ביולוגי, הלא-ביולוגיים שליקט את שלבי הרכבת התחתית הדוגם בשני שלבים ציקלון NIOSH לאסוף בחלק העליון של הצינור. חשוב מאוד כי הצינורות בזהירות לפתוח בעת הוספת המאגר פירוק לא לאבד שום חלקיקים, שיהיו vortexed באופן המאפשר כל חלקיקים ליפול לתוך המאגר פירוק (צד ימין למעלה, הפוך למטה). זה גם חשוב כי המסנן להיות בקפידה שטופלו בשיטות אספטיות כדי לא לשבש את כל bioaerosols אספו על פני השטח לפני חילוץ או להציג דנ משחיתה. זה הוכח, כי יש כמות גדולה של וריאציה בין רבות של מסחריים זמינים גנומית DNA מיצוי ערכות15. כמה הטיה הליכים החילוץ כלפי מינים ספציפיים פטרייתי ואת התוצאה ב- DNA משתנה התשואות20. אם התשואה דנ א לאחר מיצוי נמוך, גבוה יותר התגובה משכפל PCR יכול להתבצע. לא רק לעשות התשואות חילוץ משתנים, אבל רבים של ערכות לתרום כמות משמעותית של זיהום מיקרוביאלי של ה-DNA. מסיבה זו, חשוב לכלול פקדים תקין לאורך כל ההליך כדי לזהות ולהסיר מזהמים פוטנציאליים ריאגנט מניתוח.
ההגברה שלה הוא צעד קריטי נוסף של הפרוטוקול. למתודולוגיות החילוץ היה יכול להשתנות ביכולתם להסיר מעכבי ה-PCR של הדגימות סביבתיים. . זה בנוגע במיוחד עם דגימות אבק הסביבה21. PCR הגברה של דגימות חילוץ באמצעות השיטה המובאת כאן הציג כמה עיכוב PCR לאחר התוספת של 10 מ ג של אבק15. למרות PCR עיכוב של הדאגה הגדולה ביותר בדגימות אבק סביבתי, זה עדיין צריך להיות שיקול בעת הגברה DNA שחולצו מן האוויר דוגמאות לקביעת גיוון פטרייתי. ומהצמיגים PCR להגדיר בשימוש בשיטה זו מספק כיסוי של אזורים 1 שלה והן 2 שלה. דבר זה מאפשר השוואה רבים של הרצף להציב את מסדי הנתונים של רצף. כמו עם ההליך החילוץ, הטיות רבות הגברה, תחל כבר שתואר לעיל22. גודל את הגנום פטרייתי ומספר עותק גנטי יכול גם להשפיע על שלה הגברה23. הטיות אלה צריכים להילקח בחשבון בעת פירוש הנתונים רצף תוצאות. זיהוי טקסונומי של רצפי שלו הוא אולי המרכיב הקריטי ביותר של שיטה זו. חשוב לשמור על עקביות קריטריוני הזיהוי. היכולת לזהות רצפים שלה תלויה רצפי הפקידה במסדי הנתונים. אין אפשרות לזהות רצפים רבות לשלב מינים. יש קריטריונים ספציפיים בעת ביצוע ההזדהויות טקסונומי בהתבסס על רצפים הפקידה, כמו אחוז זהות המכנסונים, חיוני לשמירת נתונים (datasets) עקבי המחקר ללמידה.
לעומת גישות הערכה מסורתית, חילוץ, קביעת רצף DNA פטרייתי מדגימות האוויר בעיסוק מספק ייצוג מפורט יותר של גיוון פטרייתי בתוך סביבה. בנוסף למגבלות שנדונו לעיל, ראוי לציין כי התוצאה של סוגי ניתוחים אלה היא חצי כמותית בניגוד לתרבות, נבג ספירות או כמותית PCR24 זה יכול להניב נתונים כמותיים. קביעת רצף נתונים יכול לשמש כדי לקבוע את השפע היחסי עבור דגימה, כמו גם לחשב מדדים גיוון פטרייתי. שיטות אלה ניתן להשתמש בשילוב עם שיטות אחרות, כמו qPCR, כדי לקבל יותר מידע כמיתים. קבצי הנתונים שנוצרו באמצעות גישות אלה יכול לשמש בלימודי בריאות תעסוקתית כדי להשיג הבנה טובה יותר של מפגעים פטרייתי בסביבות תעסוקתית ספציפית. פיתוח סטנדרטיים יותר גישות של מיצוי ובחירת פריימר נחוצים יותר לאפיין ולהשוות המבוססת על רצף לימודי של גיוון פטרייתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
הממצאים והמסקנות בדו ח זה הם אלה של המחברים, אינם מייצגים בהכרח עמדה רשמית של המכון הלאומי עבור בטיחות תעסוקתית ובריאות, מרכזי עבור מחלות ומניעתן.
Acknowledgments
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הסכם הסוכנויות בין NIOSH NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
