Summary
Determinar a diversidade fúngica dentro de um ambiente é um método utilizado em estudos de saúde ocupacional para identificar riscos para a saúde. Este protocolo descreve a extração de DNA de amostras de ar ocupacional para amplificação e sequenciamento de regiões ITS fúngicas. Esta abordagem detecta muitas espécies de fungos que podem ser negligenciados pelos métodos tradicionais de avaliação.
Abstract
Métodos tradicionais de identificação fúngicas exposições em ambientes ocupacionais, tais como cultura e abordagens baseadas em microscopia, tem várias limitações que resultaram na exclusão de muitas espécies. Avanços no campo nas últimas duas décadas têm levado pesquisadores saúde ocupacional recorrer a abordagens baseadas em molecular para a identificação de riscos de fungos. Esses métodos resultaram na detecção de muitas espécies dentro de ambientes interiores e profissionais que não foram detectados usando métodos tradicionais. Este detalhes de protocolo amostras de uma abordagem para determinação de diversidade de fungosa no ar através de extração de DNA genômica, amplificação, sequenciamento e identificação taxonômica de fungos interna transcritos regiões espaçador (ITS). SEUS resultados de sequenciamento na detecção de muitas espécies de fungos que são não detectados ou difíceis de identificar ao nível de espécie, usando a cultura ou a microscopia. Enquanto esses métodos não fornecer medidas quantitativas da carga fúngica, eles oferecem uma nova abordagem para identificação de perigo e podem ser usados para determinar a riqueza global de espécies e diversidade dentro de um ambiente ocupacional.
Introduction
Exposições de fungosas em ambientes interiores e ocupacionais podem resultar em morbidades respiratórias, incluindo a sensibilização alérgica e asma1. Identificação de perigos fúngicas é importante para avaliar o risco e evitar a exposição do trabalhador. Estes perigos fúngicos podem ser resultado de contaminação interna, intrusão de ar exterior ou perturbações ambientais que resultam no transporte de materiais fúngicos em áreas onde os trabalhadores estejam presentes2. Métodos para avaliar a exposição fúngica incluem amostragem cultura viável, bem como a identificação microscópica de esporos fúngicos. Estas abordagens têm várias limitações e muitas vezes ignoram muitas espécies de fungos que poderiam estar contribuindo para a carga geral fúngica3. Abordagens baseadas em cultura só podem diferenciar esses organismos fúngicos viáveis que podem ser cultivados em meios nutritivos. Identificação de esporos de fungos, a nível da espécie através de microscopia pode ser confundido por esporos partilha morfologias semelhantes. Ambos os métodos são altamente dependentes de micologistas para analisar e identificar as espécies de fungos, com muitos remanescentes não identificado.
Para aperfeiçoar metodologias existentes usadas em avaliações de exposição e identificação de risco ocupacional, muitos pesquisadores se voltaram para tecnologias baseadas em molecular. Abordagens de sequenciamento para avaliar a diversidade microbiana em ambientes interiores e ocupacionais revelou um amplo espectro de espécies de fungos encontrados em comparação com métodos tais como a microscopia e cultura viável3,4 ,5. O método aqui apresentado descreve a amostragem do ar de ambientes ocupacionais e extração de DNA genômico para a identificação de potenciais riscos de fungos. Identificação de perigo é realizada por sequenciamento nuclear ribosomal espaçador transcrito interno, o ITS, regiões que são altamente variáveis entre fungos e tem sido comumente usadas para diferenciar espécies de fungos6,7, 8,9. Muitas espécies encontraram em ambientes ocupacionais, tais como algumas espécies do filo Basidiomycota, não são identificáveis na cultura viável e são difíceis de diferenciar ao microscópio. Estes fungos têm sido observados em abundância relativa alta dentro de ambientes interiores e profissionais avaliados pelo sequenciamento fúngicas ITS regiões3,4,10. SEU sequenciamento proporcionou maior conhecimento para a diversidade de fungos encontrados nos ambientes de interiores e ocupacionais.
O protocolo descrito aqui detalhes os métodos usados para coletar, extrair e amplificar fúngicas ITS regiões de Bioaerossóis para análise de sequências. Esta abordagem utiliza o Instituto Nacional de segurança ocupacional e saúde (NIOSH) amostrador de aerossol de ciclones de dois estágios coletar partículas no ar. Este amostrador foi desenvolvido para coletar Bioaerossóis e separado respirável (≤ 4 µm de diâmetro aerodinâmico) e não-respirável (> 4 µm de diâmetro aerodinâmico) partículas, que permite a identificação de organismos fúngicos dentro de ambientes internos que são mais provável ser inaladas por um trabalhador11. Outros amostradores de ar, incluindo samplers de ciclone, estão disponíveis no mercado que têm a capacidade de coletar partículas dentro da faixa respirável (< 4 µm) usando filtros de12,13. Em contraste, o amostrador de aerossol de ciclones de dois estágios NIOSH separa com base em seu diâmetro aerodinâmico em descartáveis, polipropileno tubos que podem ser processados imediatamente para aplicações a jusante14espécies de fungos.
Os processos de extração de DNA genômico e amplificando as regiões ITS fúngicas são detalhados no presente protocolo. As metodologias de extração apresentadas foram desenvolvidas especificamente para a extração de DNA genômico de fungos e bactérias, como muitos jogos comerciais como alvo de leveduras especificamente15, bactérias ou células de mamíferos. Os primers utilizados neste estudo são selecionados com base em sua cobertura global de ambos os fungos 1 ITS e ITS 2 regiões4,5. Sequenciamento destas regiões permite a comparação de muitas sequências ITS bancadas, incluindo aqueles essa sequência região ITS 1, a 2 de sua região ou regiões o ITS 1 e 2 ITS. A diversidade de fungosa de amostras de ar coletadas em uma configuração interior usando que esses métodos são mostrados, revelando um número substancial de sequências colocadas nos filos Ascomycota e Basidiomycota, bem como outras sequências pertencentes a menos dominantes filos de fungos, tais como Zygomycota. A ampla diversidade de sequências fungosas identificados usando esta abordagem não desejaria ser capturada utilizando metodologias de identificação de risco tradicionais como cultivo ou microscopia. Sequenciamento de regiões ITS fúngicas fornece um método aprimorado para identificar riscos de fungos e permitir uma melhor compreensão das exposições fúngicas indoor e ocupacionais.
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Protocol
1. preparar o sampler de aerossol NIOSH
Nota: O sampler de aerossol NIOSH é um sampler de aerossol de ciclones de dois estágios que recolhe Bioaerossóis usando dois tubos de amostragem e um filtro de politetrafluoretileno (PTFE).
- Antes da montagem, verifique cuidadosamente o sampler. Verifique o sampler para garantir que ele não está danificado, todos os parafusos estão no lugar e confortável, e a fita de vedação em torno a costura formada por duas metades está intacta. Inspecione a amostra do-Ring para garantir que não tem quaisquer cortes, rachaduras ou lágrimas e que tem uma camada muito fina de graxa de silicone.
Nota: O amostrador inclui um filtro PTFE de 3 µm de 37 mm em poliestireno ou fita de polipropileno filtro de três peças.- Montar a fita de filtro colocando uma celulose ou a almofada de suporte plástico (incluído com os filtros) na superfície da peça base quadriculada (ver Figura 1). Use filtro pinça para colocar o filtro em cima da almofada de apoio com o lado da coleção voltada para cima.
- Sele as fitas de filtro usando uma prensa manual ou pneumática. Encerramento de mão permitirá o ar vazar em torno do filtro e reduzir a eficiência de coleta. Insira a peça em forma de anel (o capuz de extensão) e usar a imprensa para empurrar para baixo firmemente e uniformemente. Pressione para baixo o capuz de extensão para o filtro firmemente o suficiente para garantir o ar não vaza em torno do filtro.
Nota: A parte superior da fita não é usada durante a amostragem, mas deve ser salvo para cobrir o filtro uma vez que a amostragem é completa. - Encaixar a gaveta montada na parte superior do sampler e empurre para baixo tanto quanto possível. Enrole um pedaço de fita de 19 mm (3/4 de polegada) do lado de fora da gaveta do filtro e amostrador para prender a fita de filtro no lugar e para agir como um selo de backup para evitar vazamentos.
- Parafusar cada tubo firmemente e totalmente o sampler até que fundo e envoltório de fita em torno de cada tubo de vedação para atuar como um selo secundário contra vazamentos.
Nota: O primeiro tubo, um tubo de polipropileno de 15 mL, coleta não-respirável partículas com diâmetro aerodinâmico de > 4 µm. O segundo tubo, um tubo de polipropileno microcentrifuga de 1,5 mL, coleta partículas respiráveis entre 1 e 4 µm. As restantes partículas menores, < 1 µm, são coletadas sobre o PTFE filtro (ver Figura 2).
- Calibre o fluxo de ar através do amostrador NIOSH com uma jarra de calibração antes de cada utilização, como diferenças de filtros e amostradores fará com que o fluxo de ar variar.
- Para usar um frasco de calibração, insira o encaixe de Luer do frasco na parte superior da gaveta do filtro, coloque a amostra no frasco e fechar o frasco.
- Conectar-se a jarra de calibração de um medidor de fluxo de calibração e a bomba de amostragem. Ligue o medidor de fluxo e deixe-a aquecer por alguns minutos. Observe que o medidor de fluxo sempre deve ter um filtro ligado a sua entrada para evitar a contaminação do medidor de fluxo e o amostrador.
- Ligue a bomba de amostragem e permitir que ele seja executado por alguns minutos aquecer e estabilizar.
- Ajuste a bomba para definir a taxa de fluxo correto a 3,5 L/min.
Nota: A taxa de fluxo para o classificador de aerossóis NIOSH é geralmente definida como 3,5 L/min. A este ritmo de fluxo, o sampler conforma-se aos critérios de amostragem de partículas respiráveis16ACGIH/ISO. Outras taxas de fluxo podem ser usadas se o corte de diferentes tamanhos é desejadas ou para reduzir o nível de ruído, mas esteja ciente de que se uma vazão diferente é usada, então o sampler estarão já não em conformidade com os critérios de amostragem respirável. - Quando a calibração for concluída, desligue a bomba e medidor de fluxo.
2. amostragem de aerossol estático e pessoal
- Configure o sampler de aerossol NIOSH para amostragem de qualquer área pessoal ou estático.
Nota: Amostragem estática refere-se a usar o sampler de aerossol enquanto está ligado a um tripé ou outro dispositivo de exploração (ver Figura 3), como contra o pessoal de amostragem quando o sampler e a bomba são montados sobre a pessoa que está sendo estudada (ver Figura 4).- Para amostragem de área estática, mantém os amostradores tão perto como possível à área específica sendo estudados. Manter os amostradores longe de entradas de ar, quarto entradas e lugares que podem ser no caminho do fluxo de ar.
Nota: Concentrações de aerossóis podem variar consideravelmente mesmo em distâncias curtas, especialmente se a fonte de aerossol na sala17. - Para amostragem pessoal, configure o sampler na zona de respiração da pessoa. Anexar o sampler para a lapela, ombro ou no peito e coloque a bomba de amostragem na cintura ou em uma mochila.
Nota: A zona de respiração é comumente considerada um hemisfério de 30cm cercam o nariz de uma pessoa da qual a maioria de ar durante a inalação17desenhada.
- Para amostragem de área estática, mantém os amostradores tão perto como possível à área específica sendo estudados. Manter os amostradores longe de entradas de ar, quarto entradas e lugares que podem ser no caminho do fluxo de ar.
- Certifique-se que o tubo amostrador é bem claro das entradas amostrador e que nada está obstruindo as entradas ou interferir com o fluxo de ar para o sistema de punção. O tubo amostrador não deve ser preso ou torcido. Qualquer bloqueio fará com que a bomba parar.
- Ative as bombas. Após um minuto ou dois, verificar se as bombas ainda estão funcionando.
Nota: Conduta de ar de amostragem por períodos de tempo, variando de menos de 10 min para um turno de trabalho completo 8 h, dependendo do ambiente10,18,19. Os resultados apresentados na Figura 6 são representativas de um período de amostragem de 60 min em um ambiente interno. - Depois de amostragem de ar for concluída, colete os tubos de amostra e filtro. Remova a fita da selagem, desaparafuse os tubos e sem recursos. Coloque a terceira peça da gaveta filtro sobre o filtro. Armazenar as amostras em 4 ° C até que esteja pronto para processamento.
3. extração de DNA genômico de amostras de ar
- Extrai DNA genômico (gDNA) de cada fase de amostras do NIOSH BC251. Processar o tubos de colheita de amostragem de ar e filtro separadamente para permitir a determinação de aerossóis microbianas respiráveis e não-respirável na amostra.
Nota: Como alternativa, os três estágios podem ser combinados e extraiu-se inóculo de amostra é muito pequeno.- Em uma classe de segurança biológica II ou banco limpo de fluxo laminar, assepticamente, retire o filtro. Limpe a gaveta de recolha de amostras utilizando etanol a 70% e alavanca a gaveta de amostragem abrir usando uma ferramenta de abertura da gaveta. Use um levantador de filtro para empurrar o filtro e suporte almofada para cima. Segure o filtro usando fórceps de filtro e colocá-lo em uma placa de Petri estéril. O filtro de corte em 6 pedaços iguais e colocá-los em um tubo de 2 mL reforçado contendo grânulos de vidro de 300 mg (0,2 - 0,5 mm).
- Colocar o tubo contendo o filtro em nitrogênio líquido por 30 s e imediatamente colocá-lo em um homogeneizador de moinho do grânulo situado a 4,5 m/s para 30 s.
- Repita o passo 3.1.2 uma ou duas vezes até que o filtro é desfiado. Pequenos pedaços de filtro intacto podem permanecer. Adicione 0,5 mL de tampão de lise (ureia 4 M, 200 mM Tris, 20 mM de NaCl, ácido de 200mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 7,4).
- Adicione 0,3 mL de tampão de Lise aos tubos de amostrador de ar de 1,5 mL e 15 mL. Vórtice do tubo para 10-15 s enquanto ereto e depois mais 10-15 s invertido. Transferi o conteúdo de cada tubo para tubos de 2 mL reforçado contendo grânulos de vidro de 300 mg.
Nota: A maioria do material coletado em cada tubo amostrador irá acumular perto do topo do tubo. - Processar todos os tubos em homogeneizador de moinho o talão a 4,5 m/s para 30 s e centrífuga-los em 20.000 x g por 1 min a 22 ° C. Sobrenadantes de transferência para tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL e centrifugar os tubos a 20.000 x g por 1 min a 22 ° C. Repita este passo.
- Adicionar 30 µ l de reagente de lise (consulte a Tabela de materiais) para cada tubo e incubar os tubos a 37 ° C por 15 min.
- Adicionar 0,2 mL de tampão de ligação (ureia 10 M, 6 M guanidina-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100, pH 4,4) e proteinase K (100 µ g/mL) para cada tubo e incubar os tubos a 70 ° C por 10 min. Adicione 100 µ l de isopropanol para cada tubo.
- Transferir as extrato soluções em tubos de filtro de fibra vidro (capacidade de 700 µ l) colocados em tubos de colheita de 2ml e centrifugar os tubos de coleta a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Descartar os tubos de coleção e coloque os tubos de filtro em novos tubos de colheita de 2 mL.
- Adicionar 0,5 mL de tampão de remoção de inibidor (5m guanidina-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% de etanol) para cada tubo e centrifugar os tubos de coleta a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Descartar os tubos de coleção e coloque os tubos de filtro em novos tubos de colheita de 2 mL.
- Adicionar 0,5 mL de tampão de lavagem (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% de etanol) para cada tubo e centrifugar os tubos de coleta a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Descartar os tubos de coleção e coloque os tubos de filtro em novos tubos de colheita de 2 mL. Repita este processo.
- Centrifuga os tubos de coleta a 20.000 x g durante um adicional 1 min a 22 ° C, para remover qualquer tampão de lavagem residual. Descartar os tubos de coleção e coloque os tubos de filtro para novos tubos de coleção.
- Adicionar 100 µ l tampão de eluição (≥70 ° C) (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) para cada tubo de aquecer e incube-los em temperatura ambiente por 1-2 min.. centrifugar os tubos de coleta a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Transferir os tubos do filtro vazio para um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL e re-aplicar eluídos da etapa 3.8. Incubar a temperatura ambiente por 1-2 min. centrifugar a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C.
Nota: Eluídos podem ser usados imediatamente para a etapa 4 ou armazenada a-20 ° C até que esteja pronto para usar. DNA genômico pode ser armazenado por até um ano a-20 ° C. É recomendável que o DNA ser armazenado a-80 ° C se o armazenamento a longo prazo é necessário.
4. amplificação de ADN ribossómico de fungo
- Use primers fúngicas universais para amplificar suas regiões 1 e 2 do gDNA extraído.
Nota: Para este protocolo, o primer par Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') são usados para fornecer a maior cobertura do ITS regiões4,5. Outros conjuntos de cartilha, tais como aquelas que amplificar regiões ITS1 ou ITS2 sozinhos, podem ser usados.- Criar reacções em cadeia do polymerase (PCR) para cada amostra em triplicado 50 µ l reacções da polimerase estéril 0,5 mL ou placas PCR de 96 poços da seguinte forma: 5 µ l de modelo extraído DNA (da etapa 3), 33,3 µ l de água de grau PCR, 5 µ l de tampão de x PCR 10 , 1,5 µ l de 50mm MgCl2, 1 µ l de 10 mM STNPCR 2'-5'-trifosfatos, 0,5 µ l de 20 µM Fun18Sf para a frente da primeira demão, 0,5 µ l de 20 µM ITS4R inversa da primeira demão e 0,2 µ l de Taq DNA polimerase.
- Realizar reações em um termociclador: desnaturação a 95 ° C por 3 min; 6 ciclos de desnaturação (96 ° C, 30 s) recozimento (50 ° C, 45 s) e a extensão da primeira demão (72 ° C, 3 min); 20 ciclos de desnaturação (96 ° C, 30 s), recozimento (50 ° C, 45 s) e a extensão da primeira demão (72 ° C, 1 min); e a extensão da primeira demão a 72 ° C durante 10 min. manter as misturas de reação a 4 ° C até o próximo passo.
- Combinar que as reações de PCR triplicadas purificam usando um kit de purificação baseados em membrana de sílica.
Nota: Este procedimento permite a remoção de componentes PCR (primeiras demão, dNTPs, enzimas, sais, etc.) e outros contaminantes das preparações de DNA amplificadas.- Combine as três reações para cada amostra (150 µ l total) em tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL. Adicionar tampão de ligação (5m guanidina-HCl, 30% de isopropanol) em um volume de 5 x (750 µ l) e misturar a solução pipetando acima e para baixo 10 vezes.
- Adicione 450 µ l da mistura para girar colunas colocadas em tubos de coleção e centrifugar os tubos a 17.900 x g durante 30 s. Descarte os filtrados. Adicione o restante µ l 450 para as colunas e centrifugar a 17.900 x g por 30 s a 22 ° C.
Nota: As colunas de rotação contêm uma membrana de silicone que permite a adsorção do DNA para as colunas. - Descartar os filtrados e adicionar o tampão de lavagem 750 µ l (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% de etanol) para as colunas de rotação. Centrifugar as colunas a 17.900 x g por 30 s a 22 ° C.
Nota: Este processo remove os contaminantes a reação de PCR acima mencionada. - Descartar o filtrado e centrifugar as colunas vazias a 17.900 x g por 1 min a 22 ° C.
Nota: Este passo é para remover qualquer resíduo de buffer que pode interferir com aplicações a jusante de lavagem. - Transferi as colunas de rotação para tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL. Adicionar 45 µ l de tampão de eluição (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) e incubar os tubos à temperatura ambiente por 5 min. Centrifugar as colunas de rotação a 17.900 x g por 1 min a 22 ° C.
- Usar o DNA eluted imediatamente para as etapas 4 e 5 ou armazenar a-20 ° C até que esteja pronto para uso.
Nota: Os amplicons podem ser armazenadas por até um ano a-20 ° C. É recomendável que o DNA ser armazenado a-80 ° C se o armazenamento a longo prazo é necessário.
5. verificação de fungos ITS amplificação utilizando eletroforese em gel de agarose
- Elenco um agarose 1% gel contendo 1 µ g/mL brometo de etídio. Dissolva a agarose em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) 1x a ferver. Uma vez que a solução esfriar a aproximadamente 50 ° C, adicionar o brometo de etídio e despeje gel de conversão.
- Depois que o gel de agarose solidificou-se, imergir o gel em 1 x TAE e preparar os amplicons para ser carregado no gel. A 8 µ l de DNA amplificado, adicione 2 µ l de 5 x tampão de carregamento.
Nota: Estes volumes podem ser ajustados dependendo da concentração do buffer desejado de carregamento. - Carrega as amostras, todas 10 µ l, para o gel junto com uma escada de DNA para a referência de tamanho. Funcione o gel em 75 V (6 V/cm) para cerca de 90 min e Visualizar bandas, normalmente vistas entre 750 e 1.000 pares de bases, utilizando ultravioleta luz (ver Figura 5).
6. sequenciamento e análise de fungos ITS regiões
- Sequenciar o gDNA extraído ou fúngicas amplificado ITS regiões e analisar as sequências usando métodos atuais e adequados.
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Representative Results
A distribuição das espécies dentro de um ambiente pode ser avaliada usando abundância relativa, determinando o número de clones de cada OTU identificados nas amostras de ar. Figura 6 é um gráfico Krona representando as espécies taxonomicamente colocadas dentro de um ambiente interior após 60 min de amostragem de ar. Pode-se observar que o ambiente contém uma variedade de espécies dentro de dois grandes filos de fungos, Ascomycota e Basidiomycota, bem como espécies do filo Zygomycota (Rhizopus microsporus). Os métodos tradicionais de avaliação são inclinados para espécie de Ascomycota, Basidiomycota muitos não são viáveis ou não podem ser diferenciadas usando métodos baseados em microscopia. Sequenciamento de fungos ITS regiões permite a detecção de inúmeras espécies de fungos, especificamente algum Basidiomycota, que muitas vezes passam despercebidos. A análise deste ambiente mostra que 68% das sequências fungosas identificadas pertencia o Basidiomycota com a maioria deles colocados na ordem Polyporales.
Os dados taxonômicos obtidos usando abordagens baseadas em sequenciamento podem ser usados para determinar a diversidade taxonômica dentro de um ambiente. Índices de diversidade, tais como aquelas apresentadas na tabela 1, determinam como o ambiente é rico, que descreve o número de espécies identificadas em cada amostra, bem como diversos como é o ambiente, que leva em conta o número de espécies e abundância de cada. A tabela 1 mostra os índices de riqueza de Chao 1 e Shannon, índices de diversidade para dois ambientes internos. Os índices indicam maior riqueza e diversidade em ambientes climatizados, em comparação com ambientes refrigerador evaporativos. Também estão incluídos os coeficientes de dissimilaridade de Bray-Curtis. Estes descrevem como diferentes amostras dentro do ambiente são relativos as espécies identificadas dentro de cada amostra. As amostras em ambos os ambientes descritos na tabela 1 são altamente dissimilares em 98% e 97% para condicionador de ar e ambientes refrigerador evaporativos, respectivamente.
Figura 1: representação esquemática de um assembly de gaveta filtro de três peças. A gaveta do filtro é composta por três partes: uma parte superior ou tampa (entrada), um capuz de extensão e um pedaço de base (tomada). Uma almofada de apoio e filtro são colocados na superfície da peça base quadriculada. O capuz de extensão é então selado para a base, utilizando uma prensa manual ou pneumática. Para uso com o sampler de ciclone bioaerosol NIOSH, a parte superior é deixada de durante a amostragem e então é substituída para o armazenamento e transporte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representação esquemática do sampler de ciclone NIOSH bioaerosol. O classificador de aerossóis de ciclone NIOSH coleta partículas no ar ar de desenho para o amostrador através da entrada, e produzindo um ciclone que depósitos de partículas sobre a parede dos tubos de amostra. Ar é desenhado pela primeira vez em um tubo de polipropileno de 15 mL, onde grandes partículas (> 4 µm) coletar nas paredes do tubo. Então o ar escorre para fora o primeiro tubo e é desenhado para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga, onde coletar partículas menores (1 a 4 µm). As partículas restantes (< 1 µm) coletar em um filtro PTFE, como o ar é desenhado fora do amostrador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplo de uma configuração estática amostrador. A imagem demonstra amostradores para amostragem de área estática. Os samplers NIOSH são definidos até coletamos 40 polegadas (102 cm) e 60 polegadas (152 cm) do chão, que representa a altura de uma sessão e adulto em pé, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplo de uma montagem de amostrador pessoal. A imagem ilustra um sampler NIOSH usado em uma mochila por um indivíduo. O interruptor de sampler e poder estão localizados nas cintas do pacote enquanto a bomba de amostragem está localizada dentro da mochila em si. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: exemplo de um gel de agarose Visualizar ampliado seu DNA de amostras de ar. A imagem mostra faixas entre 750 e 1.000 pares de bases do ADN. Essas bandas representam regiões ITS fúngicas amplificadas de amostras do ar extraído. SUAS regiões variam em tamanho, dependendo da origem da espécie. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: gráfico de exemplo Krona apresentando taxonomicamente colocados espécies de fungos identificados dentro de um ambiente interno. O gráfico Krona retrata a abundância relativa das espécies de fungos encontrados em 4 amostras coletadas das casas, após um período de amostragem de ar de 60 min com o sampler de ciclone bioaerosol NIOSH. 68% das espécies identificadas pertencem ao filo Basidiomycota com os restantes pertencentes ao Ascomycota (33%) e Zygomycota (1%). As sequências ITS mais abundantes neste ambiente pertenciam à ordem Polyporales e foram identificadas como Phanerodontia chrysosporium e Gelatoporia dichroa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Riqueza de Chao-1 | Diversidade de Shannon | Distância Bray-Curtis | |
| Quer dizer (min, max) | Quer dizer (min, max) | Quer dizer (min, max) | |
| Condicionador de ar (n = 9) | 33.86 (15,0, 102,0) | 1.39 (0,68, 2,51) | 0.9778 (0.8313, 1.00) |
| Refrigerador evaporativo (n = 10) | 25.46 (12.5, 49,5) | 1.10 (0,50, 1,72) | 0.9624 (0.3804, 1.00) |
Tabela 1: dados de exemplo, apresentando espécies e diversidade de índices de riqueza, comparando ambientes internos. A tabela mostra os índices de riqueza de Chao 1 (número de espécies por amostra), índices de diversidade de Shannon (número de espécies) e abundância de cada um e coeficientes de dissimilaridade de Bray-Curtis (como dissimilar a distribuição das espécies é entre as amostras em uma escala de 0 - 1). Estes dados demonstram maior riqueza e diversidade em ambientes climatizados e alta dissimilaridade entre amostras nos dois ambientes. Esta tabela foi modificada de limões et al. 10 com a permissão da Real Sociedade de química.
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Discussion
Determinar a diversidade fúngica dentro de um ambiente ocupacional, usando abordagens baseadas em sequenciamento melhorou a avaliação identificação e exposição de risco de fungos. Usando essa abordagem tem permitido a detecção de muitas espécies de fungos adicionais que muitas vezes não são detectados usando métodos baseados em microscopia de avaliação ou cultura. Um método de amostragem Bioaerossóis de ambientes interiores e ocupacionais e a extração de DNA genômico de amostras de ar para sua amplificação e sequenciamento é aqui apresentado. Determinações da diversidade de fungosa usando estes métodos é altamente dependente: amostras (1) sucesso e completa de extração de DNA genômico de ar, (2) amplificação do gDNA com primers que permitem a comparação entre o amplificado suas sequências para bancados sequências nos preconceitos de amplificação de banco de dados e o limite e (3) correta identificação taxonômica das sequências dentro dos bancos de dados.
Extração de DNA genômica bem sucedida é dependente sobre as metodologias de extração e reagentes utilizados em um estudo. Como é mencionado no protocolo, muitos a Bioaerossóis e outras partículas biológicas e não-biológicos coletados nas fases do tubo do amostrador de ciclones de dois estágios NIOSH recolher na parte superior do tubo. É muito importante que os tubos cuidadosamente aberto ao adicionar a Lise, para não se perder qualquer partículas e que sejam vortexed de uma forma que permite a todas as partículas de cair o tampão de lise (lado direito acima e de cabeça para baixo). Também é importante que o filtro seja cuidadosamente manipuladas usando métodos assépticos para não perturbar qualquer Bioaerossóis que coletaram na superfície antes da extração ou introduzir DNA contaminante. Foi demonstrado que existe uma grande quantidade de variação entre muitos dos comercialmente disponível genomic DNA extração kits15. Algum viés de procedimentos de extração para espécies de fungos específicos e resultam em diferentes DNA produz20. Se o rendimento de DNA após a extração é baixo, mais repetições de reação de PCR podem ser realizadas. Não só os rendimentos de extração variam, mas muitos dos kits contribuem uma quantidade substancial de contaminação microbiana do DNA. Por este motivo, é importante incluir controles adequados durante todo o procedimento para identificar e remover contaminantes potenciais de reagente a partir da análise.
SUA amplificação é outro passo fundamental do protocolo. As metodologias de extração utilizadas podem variar em sua capacidade de remover inibidores do PCR de amostras ambientais. Isto é particularmente preocupante com amostras de poeira ambiental21. Amplificação por PCR de amostras extraídas usando o método apresentado aqui expostas algumas inibição de PCR após a adição de 10 mg de pó15. Embora a inibição da PCR é de maior preocupação em amostras de poeira ambiental, ainda deve ser uma consideração quando amplificar DNA extraído de amostras de ar para a determinação de diversidade de fungosa. A primeira demão do PCR conjunto usada neste método fornece cobertura de regiões o ITS 1 e 2 ITS. Isto permite a comparação de muitas das sequências colocadas nos bancos de dados de sequência. Tal como acontece com o procedimento de extração, muitos preconceitos de amplificação e primer foram descritas anteriormente,22. O número de cópia de tamanho e gene do genoma de fungos também poderia influenciar sua amplificação23. Esses preconceitos devem ser considerados ao interpretar os dados de sequência resultante. Identificação taxonômica das suas sequências é talvez o componente mais importante deste método. É importante manter os critérios de identificação consistente. A capacidade de identificar suas sequências é dependente as sequências depositadas nos bancos de dados. Muitas sequências não podem ser identificadas ao nível de espécie. Ter critérios específicos ao fazer as identificações taxonômicas baseadas em sequências bancadas, como cortes de identidade de percentagem, é fundamental para manter os conjuntos de dados consistente de estudo para estudo.
Em comparação com abordagens de avaliação tradicional, extraindo e sequenciamento de DNA fúngico de amostras de ar ocupacional fornece uma representação mais completa da diversidade fúngica dentro de um ambiente. Além das limitações acima descritas, deve-se notar que os resultados destes tipos de análises são semi quantitativos, ao contrário de cultura, contagem de esporos ou PCR quantitativo24 que pode produzir dados quantitativos. Sequenciamento de dados pode ser usado para determinar a abundância relativa, por exemplo, bem como calcular métricas de diversidade fúngica. Estes métodos podem ser usados em conjunto com outros métodos, como qPCR, para obter mais dados quantificáveis. Os conjuntos de dados criados usando essas abordagens podem ser usados em estudos de saúde ocupacional para uma melhor compreensão dos riscos de fungos em ambientes ocupacionais específicos. Desenvolvimento mais padronizado, abordagens de extração e primer seleção são necessárias para melhor caracterizar e comparar estudos baseados no sequenciamento da diversidade de fungo.
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Disclosures
Os resultados e conclusões deste relatório são as dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional para a segurança ocupacional e saúde, centros de controle e prevenção de doenças.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por um acordo interinstitucional entre o NIOSH e NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
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