Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Innsamling og utvinning av yrkesmessig Air prøver for analyse av sopp DNA

doi: 10.3791/56730 Published: May 2, 2018

Summary

Avgjøre fungal mangfoldet i et miljø er en metode som brukes i helse studier å identifisere helsefare. Denne protokollen beskriver DNA utvinning fra yrkesmessig Luftprøver for forsterkning og sekvensering av sopp dens regioner. Denne tilnærmingen oppdager mange fungal arter som kan bli oversett av tradisjonelle vurderingsmetoder.

Abstract

Tradisjonelle metoder for å identifisere fungal eksponeringer i yrkesmessig miljøer som kultur og mikroskopi-baserte tilnærminger, har flere begrensninger som har resultert i utelukkelse av mange arter. Fremskritt innen de siste to tiårene har ført helse forskere å slå til molekylær-baserte tilnærminger for å identifisere fungal farer. Disse metodene har resultert i deteksjon av mange arter innen innendørs og yrkesmessig miljøer som ikke ble funnet ved hjelp av tradisjonelle metoder. Denne protokollen detaljer tilnærming for å bestemme fungal mangfold i luften prøver gjennom genomisk DNA utvinning, forsterkning, sekvensering og taksonomisk identifikasjon av sopp interne transkribert spacer (ITS) regioner. Sekvensering resultatene i deteksjon av mange fungal arter som oppdaget eller er vanskelig å identifisere arter nivå med kultur eller mikroskopi. Mens disse metodene ikke gir kvantitative tiltak av sopp byrden, de tilbyr en ny tilnærming til Faremomenter og kan brukes til å fastsette generelle arter rikdom og mangfold i en yrkesmessig miljø.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fungal eksponeringer innendørs og yrkesmessig kan føre til åndedretts morbidities, inkludert økt følsomhet og astma1. Identifikasjon av sopp farer er viktig for å vurdere risiko og forebygge arbeidstaker eksponering. Disse sopp farer kan være et resultat av innendørs forurensning, uteluft inntrenging eller miljømessige forstyrrelser som fører til transport av sopp materialer i områder der arbeidstakere er tilstede2. Metoder for å vurdere fungal eksponering har inkludert levedyktig kultur prøvetaking samt mikroskopiske identifikasjon av sopp sporer. Disse metodene har flere begrensninger og ofte overse mange fungal arter som kan være medvirkende til total fungal byrden3. Kultur-baserte tilnærminger kan bare skille dem levedyktig fungal organismer som kan bli dyrket på næringsstoffer media. Identifisere fungal sporer arter nivå via mikroskopi kan bli forvirret av sporer dele lignende morphologies. Begge metodene er svært avhengige mycologists å analysere og identifisere fungal arter, med mange gjenværende uidentifisert.

For å forbedre eksisterende metoder som brukes i yrkesmessig Faremomenter og eksponering vurderinger, har mange forskere slått til molekylær-baserte teknologier. Sekvensering tilnærminger for å vurdere mikrobiell mangfold i innendørs og yrkesmessig har avdekket et bredere spekter av sopp oppdaget sammenlignet med metoder som mikroskopi og levedyktig kultur3,4 ,5. Metoden som presenteres her beskriver luften prøvetaking yrkesmessig miljøer og utvinning av genomisk DNA til å identifisere potensielle fungal farer. Faremomenter oppnås ved sekvensering av kjernefysisk ribosomal interne transkribert spacer, eller dens, områder som er svært variabel blant sopp og har blitt brukt til å skille fungal arter6,7, 8,9. Mange arter finnes i yrkesmessig innstillinger, som noen arter som tilhører rekken Basidiomycota, ikke er identifiserbare i levedyktig kultur og er vanskelig å skille mikroskopisk. Disse sopp er observert i høy relative overflod i innendørs og yrkesmessig miljøer vurdert av sekvensering fungal ITS regioner3,4,10. DENS sekvensering har gitt større kunnskap i mangfoldet av sopp oppstått innenfor innendørs og yrkesmessig miljøer.

Protokollen beskrevet her detaljer metodene brukes til å samle, trekke ut og forsterke fungal ITS regioner fra bioaerosols for sekvensen analyse. Denne tilnærmingen benytter National Institute for Occupational Safety og helse (NIOSH) totrinns syklon aerosol sampler samle partikler i luften. Denne sampler ble utviklet for å samle bioaerosols og egen respirabelt (≤4 µm aerodynamisk diameter) og ikke-respirabelt (> 4 µm aerodynamisk diameter) partikler, som gir mulighet for identifisering av sopp organismer i innendørs miljøer som er mest sannsynligvis pustes inn av en arbeidstaker11. Andre luft samplere, inkludert syklon samplere, er tilgjengelige på markedet som kan samle partikler innen respirabelt (< 4 µm) bruker filtrerer12,13. Derimot skiller NIOSH to-trinns syklon aerosol sampler fungal arter basert på deres aerodynamisk diameter til disponibel, polypropylen rør som kan behandles umiddelbart for nedstrøms programmer14.

Prosessene med utpakking genomisk DNA og forsterke fungal ITS regionene er beskrevet i denne protokollen. De utvinning metodikkene som presenteres er utviklet spesielt for utvinning av genomisk DNA fra sopp og bakterier, som mange kommersielle kits målrette pattedyrceller, bakterier eller gjær15spesielt. Primere brukt i denne studien er valgt basert på deres samlede dekning av både fungal sin 1 og dens 2 regioner4,5. Sekvensering av disse regionene tillater sammenligning av mange banked ITS sekvenser, inkludert den sekvensen regionen sin 1, dens 2 regionen eller både sin 1 og dens 2 regioner. Fungal mangfoldet av Luftprøver samlet i en innendørs bruker disse metodene vises, avslører et betydelig antall sekvenser plassert i stamtreet Ascomycota og Basidiomycota samt andre sekvenser tilhører mindre dominerende fungal rekker, som Zygomycota. Det brede mangfoldet av sopp sekvenser identifisert ved hjelp av denne tilnærmingen vil ikke hentes med tradisjonelle fare identifikasjon metoder som dyrking eller mikroskopi. Sekvensering av sopp ITS områder gir en forbedret metode for å identifisere fungal farer og gi en bedre forståelse av innendørs og yrkesmessig fungal eksponeringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. klargjør NIOSH aerosol sampler

Merk: Den NIOSH aerosol sampler er en totrinns syklon aerosol sampler som samler bioaerosols med to utvalg rør og filtere polytetrafluoroethylene (PTFE).

  1. Før montering, nøye kontrollere sampler. Kontroller sampler å sikre at det ikke er skadet, alle skruene er på plass og lun og tetting tape rundt skjøten dannet av de to halvdelene er intakt. Inspisere sampler O-ring for å sikre at den ikke har hakk, sprekker eller tårer og at den har en veldig lett belegg av silikon fett.
    Merknad: Sampler inneholder filtere 37 mm 3 µm PTFE i polystyren eller polypropylen tredelt filteret kassetten.
    1. Montere filteret kassetten ved å plassere en cellulose eller plast filter Støtte pad (følger med filtrene) på gridded overflaten av base stykke (se figur 1). Bruk filteret tang for å sette filteret på filteret støtte puten med samling siden vendt oppover.
    2. Forsegle filter kassettene ved hjelp av en manuell eller pneumatisk trykk. Hånd nedleggelsen vil tillate luft å lekke rundt filteret og redusere samling effektiviteten. Sett ringformede stykket (filtypen hetten), og bruk trykk for å skyve det ned tett og jevnt. Trykk ned forlengelsen hetten på filteret tett nok for å sikre luften ikke lekker rundt filteret.
      Merk: Toppen stykke kassetten brukes ikke mens prøvetaking men skal lagres for å dekke filteret når prøvetaking er fullført.
    3. Passer montert kassett på toppen av sampler og skyv det ned så langt som mulig. Vikle et stykke 19 mm (3/4 tommer) tape rundt utsiden av filteret kassetten og sampler å holde filteret kassetten på plass og opptre som en backup sel å hindre lekkasjer.
    4. Skru hver rør tett og fullstendig i sampler til det nederst og vikle tetting tape rundt hver rør som en sekundær tetning mot lekkasjer.
      Merk: Første røret, en 15 mL polypropylen tube, samler ikke-respirabelt partikler med en aerodynamisk diameter på > 4 µm. Den andre tuben, en 1,5 mL polypropylen microcentrifuge tube, samler respirabelt partikler mellom 1 og 4 µm. Gjenværende mindre partikler, < 1 µm, er samlet på PTFE filter (se figur 2).
  2. Kalibrere luftstrømmen gjennom NIOSH sampler med en kalibrering krukke før bruk som forskjeller i filtrene og samplere vil føre luftstrømmen å variere.
    1. Bruke en kalibrering krukke, glasset og Luer passer inn i toppen av filteret kassetten, plassere sampler i glasset, og forsegle glasset.
    2. Koble kalibrering glasset til en kalibrering flyt meter og prøvetaking pumpen. Slår strømmen måleren på og la den varmes opp i noen minutter. Merk at gjennomstrømningsmåler må alltid ha et filter som er knyttet til sin innløpet til unngå forurensende flyt meter og sampler.
    3. Slå på prøvetaking pumpen og la den kjøre i noen minutter til å varme opp og stabilisere.
    4. Justere pumpen for å angi riktig flow rate på 3,5 L/min.
      Merk: Infusjonshastigheten for NIOSH aerosol sampler er vanligvis satt til 3,5 L/min. På denne strømningsrate overholder sampler ACGIH/ISO kriteriene for respirabelt partikkel prøvetaking16. Andre strømningshastigheter kan brukes hvis forskjellige cut-off størrelser er ønsket, eller for å redusere støy, men vær klar over at hvis en annen flow rate, deretter sampler ikke vil overholder respirabelt prøvetaking kriteriene.
    5. Når kalibreringen er ferdig, slå av pumpen og gjennomstrømningsmåler.

2. statisk og personlig aerosol prøvetaking

  1. Definer den NIOSH aerosol sampler for enten personlig eller statisk utvalg.
    Merk: Statisk utvalg refererer til bruk aerosol sampler mens den er koblet til en tripod eller andre holde enheten (se Figur 3), som versus personlig prøvetaking når sampler og pumpen er montert på personen blir studert (se Figur 4).
    1. For statisk område prøvetaking, holde prøvetakere så nær som mulig til det bestemte området blir studert. Hold prøvetakere fra luftinntakene, rom innganger og steder i banen til luftstrømmen.
      Merk: Aerosol konsentrasjoner kan variere betydelig over korte avstander, spesielt hvis aerosol er i rommet17.
    2. For personlig prøvetaking, definere sampler i personens puste sone. Knytt sampler til jakkeslaget, skulderen eller brystet og plassere prøvetaking pumpen på livet eller i en ryggsekk.
      Merk: Sonen puste er vanligvis antatt for å være en 30 cm halvkule rundt en persons nese som fleste av luft trekkes under innånding17.
  2. Kontroller at sampler rør er godt klar av sampler viker og at ingenting hindrer sundene eller forstyrre luftstrømmen til sampler. Sampler rør må ikke klem eller kinked. Eventuell blokkering vil føre pumpen å stoppe.
  3. Slå på pumpene. Etter et minutt eller to, sjekk hvis pumpene er fremdeles running.
    Merk: Oppførsel luften prøvetaking for tidsperioder som spenner fra så lite som 10 min til en full 8t SKIFT, avhengig av miljøet10,18,19. Resultatene presenteres i figur 6 er representant for en 60 min samplingsperiode i et innemiljø.
  4. Når luften prøvetaking er ferdig, samle prøven rør og filter. Fjerne tetting tape, skru rør og cap dem. Plass den tredje delen av filteret kassetten over filteret. Lagre prøver på 4 ° C til du er klar for behandling.

3. utvinning av genomisk DNA fra Luftprøver

  1. Pakk ut genomisk DNA (gDNA) fra hvert trinn i den NIOSH BC251 sampler. Behandle luften prøvetaking samling rør og filtrere separat for å tillate for fastsettelse av respirabelt og ikke-respirabelt mikrobiell aerosoler i utvalget.
    Merk: Alternativt, de tre trinnene kan kombineres og utdraget hvis prøven inoculum er for liten.
    1. I klasse II biologiske sikkerhetskabinett regjering eller laminær strømning ren benk, tas aseptisk fjerne filteret. Tørk prøvetaking kassetten med 70% etanol og snuse prøvetaking kassetten åpnes i en kassett-åpning verktøyet. Bruk et filter lifter for å presse filter og støtte puten oppover. Forstå filteret filter tang og plasserer den i et sterilt Petriskål. Skjær filteret i 6 like store stykker og plassere dem i en 2 mL forsterkede rør som inneholder 300 mg glassperler (0.2 - 0,5 mm).
    2. Sett røret som inneholder filteret i flytende nitrogen for 30 s og plasser det straks i en perle mill homogenizer satt på 4.5 m/s for 30 s.
    3. Gjenta trinn 3.1.2 én eller to ganger til filteret er makulert. Små biter av intakt filteret forbli. Legg til 0,5 mL lyseringsbuffer (4 M urea, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), pH 7.4).
    4. Legge 0,3 mL lyseringsbuffer til 15 mL og 1,5 mL luft sampler rør. Vortex tube for 10-15 s mens oppreist og en 10-15 s invertert. Overføre innholdet i hver rør til 2 mL forsterkede rør som inneholder 300 mg glassperler.
      Merk: De fleste av materialet samlet i hver sampler rør vil samle øverst på røret.
    5. Behandle alle rør perle mill homogenizer på 4.5 m/s for 30 s og sentrifuger dem på 20.000 x g for 1 min på 22 ° C. Overføre supernatants til bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør og sentrifuge rør på 20 000 x g for 1 min på 22 ° C. Gjenta dette trinnet.
  2. Legge til 30 µL av lysis reagensen (se Tabell of Materials) til hver rør og Inkuber rørene på 37 ° C i 15 min.
  3. Legge til 0,2 mL bindende buffer (10 M urea, 6 M guanidine-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100, pH 4.4) og proteinasen K (100 µg/mL) hver rør og ruge rør ved 70 ° C i 10 min. Tilsett 100 µL av isopropanol til hver tube.
  4. Overføre ekstrakt løsninger til glass fiber filter rør (700 µL kapasitet) i 2 mL samling rør og sentrifuge samling rør på 20 000 x g for 30 s på 22 ° C. Forkaste samling rør og plasser filteret rør i nye 2 mL samling rør.
  5. Legg til 0,5 mL hemmer fjerning bufferen (5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% etanol) hver rør og sentrifuge samling rør på 20 000 x g for 30 s på 22 ° C. Forkaste samling rør og plasser filteret rør i nye 2 mL samling rør.
  6. Legg til 0,5 mL vaskebuffer (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% etanol) hver rør og sentrifuge samling rør på 20 000 x g for 30 s på 22 ° C. Forkaste samling rør og plasser filteret rør i nye 2 mL samling rør. Gjenta denne prosessen.
  7. Sentrifuge samling rør på 20 000 x g for en ekstra 1 min på 22 ° C til å fjerne eventuelle gjenværende vaskebuffer. Forkaste samling rør og plasser filteret rør i nye samling rør.
  8. Legg 100 µL varme (≥70 ° C) elueringsbufferen (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) til hver tube og Inkuber dem ved romtemperatur for 1-2 min. sentrifuge samling rør på 20 000 x g for 30 s på 22 ° C. Overføre tom filter rør til en bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør og bruk nytt eluates fra trinn 3.8. Inkuber ved romtemperatur for 1-2 min. sentrifuge 20.000 x g for 30 s på 22 ° C.
    Merk: Eluates kan brukes umiddelbart for trinn 4 eller lagret ved 20 ° C til klar til bruk. Genomic DNA kan lagres i opptil ett år på 20 ° C. Det anbefales at DNA lagres på-80 ° C hvis langtidslagring kreves.

4. forsterkning av sopp ribosomal DNA

  1. Bruke universelle fungal primere for å forsterke distrikter 1 og 2 fra det utdraget gDNA.
    Merk: For denne protokollen, primer par Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3 ") / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') brukes til å gi den største dekningen av dens regioner4,5. Andre primer sett, slik som de som forsterke ITS1 eller ITS2 områder alene, kan brukes.
    1. Definere utvalg kjedereaksjoner (PCR) for hver prøve i tre eksemplarer 50 µL reaksjoner i sterilt 0,5 mL PCR rør eller 96-brønns PCR plater som følger: 5 µL av utdraget mal DNA (fra trinn 3), 33.3 µL PCR klasse vann, 5 µL av 10 x PCR buffer , 1,5 µL av 50 mM MgCl2, 1 µL av 10 mM 2-deoxynucleoside 5-triphosphates, 0,5 µL av 20 µM Fun18Sf frem primer, 0,5 µL av 20 µM ITS4R omvendt primer og 0,2 µL av Taq DNA polymerase.
    2. Utføre reaksjoner i en termisk cycler: rødsprit ved 95 ° C i 3 min; 6 sykluser av rødsprit (96 ° C, 30 s) annealing (50 ° C, 45 s) og primer forlengelsen (72 ° C, 3 minutter); 20 sykluser av rødsprit (96 ° C, 30 s), gløding (50 ° C, 45 s), og primer forlengelsen (72 ° C, 1 min); og primer utvidelse ved 72 ° C i 10 min. holde reaksjon blandinger på 4 ° C før neste trinn.
  2. Kombinere tre eksemplarer PCR reaksjonene rense bruker en silica membranbasert rensing kit.
    Merk: Denne fremgangsmåten tillater fjerning av PCR komponenter (primere, dNTPs, enzymer, salter, osv.) og andre forurensninger fra forsterket DNA forberedelsene.
    1. Kombinere tre reaksjonene for hver prøve (150 µL totalt) i bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør. Legg bindende buffer (5 M guanidine-HCl, 30% isopropanol) med 5 x volum (750 µL) og bland løsningen av pipettering opp og ned ti ganger.
    2. Legge til 450 µL av blandingen å spinne kolonner i samling rør og sentrifuge rør 17,900 x g for 30 s. kast filtratet. Legge til den resterende 450 µL kolonnene og sentrifuge 17,900 x g for 30 s på 22 ° C.
      Merk: Spinn kolonnene inneholder en silica membran som gjør opptak av DNA til kolonnene.
    3. Forkaste filtratet og legge 750 µL vaske bufferen (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% etanol) til kolonnene spinn. Sentrifuge kolonnene 17,900 x g for 30 s på 22 ° C.
      Merk: Denne prosessen fjerner forurensninger fra PCR reaksjonen nevnt ovenfor.
    4. Forkaste filtratet og sentrifuge de tomme kolonnene 17,900 x g for 1 min på 22 ° C.
      Merk: Dette trinnet er å fjerne eventuelle gjenværende vaske bufferen som kan forstyrre nedstrøms programmer.
    5. Overføre kolonnene spin til bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør. Legge til 45 µL av elueringsbufferen (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) og ruge rør ved romtemperatur for 5 min. sentrifuge kolonnene spinn på 17,900 x g for 1 min på 22 ° C.
    6. Bruke eluted DNA umiddelbart for trinn 4 og 5 eller lagre på 20 ° C til du er klar for bruk.
      Merk: Amplicons kan lagres i opptil ett år på 20 ° C. Det anbefales at DNA lagres på-80 ° C hvis langtidslagring kreves.

5. verifisering av sopp ITS forsterkning med agarose gel geleelektroforese

  1. Kastet en 1% agarose gel inneholder 1 µg/mL ethidium bromide. Løs opp agarose i kokende 1 x Tris-acetate-EDTA (TAE) buffer. Når løsningen har kjølt ned til ca 50 ° C, Legg ethidium bromide og hell i gel kastet.
  2. Etter agarose gel har styrket, fordype gel i 1 x TAE og forberede amplicons lastes på gel. 8 µL av forsterket DNA, legge 2 µL av 5 x lasting buffer.
    Merk: Disse volumene kan justeres avhengig av konsentrasjonen av ønsket lasting bufferen.
  3. Laste inn prøvene, alle 10 µL, på gel sammen med en DNA stige for referanse. Kjøre gel på 75 V (6 V/cm) i ca 90 minutter og visualisere band, vanligvis sett mellom 750 og 1000 base parene, med ultrafiolett lys (se figur 5).

6. sekvensering og analyse av sopp ITS regioner

  1. Sekvens utdraget gDNA eller forsterket fungal ITS regioner og analysere sekvenser med oppdatert og aktuelt metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Distribusjon innen et miljø kan vurderes med relative overflod ved å bestemme antall kloner av hver OTU i luften prøvene. Figur 6 er en krone diagram representerer taksonomisk plassert arter i et innemiljø etter 60 minutter i luften prøvetaking. Det kan være observert at miljøet inneholder en rekke arter innen to store fungal rekker, Ascomycota og Basidiomycota, samt arter som tilhører rekken Zygomycota (Rhizopus microsporus). Tradisjonelle metoder for vurdering er forutinntatt mot Ascomycota arter, som mange Basidiomycota er ikke culturable eller ikke differensieres bruke mikroskopi-baserte metoder. Sekvensering av sopp ITS områder tillater påvisning av rekke fungal arter, spesielt noen Basidiomycota, som ofte går usett. Analyse av dette miljøet viser 68% av sopp sekvensene identifisert tilhørte Basidiomycota med de fleste av dem i ordenen Polyporales.

Taksonomisk dataene innhentet med sekvensering tilnærminger kan brukes til å bestemme taksonomisk mangfoldet i et miljø. Mangfold indekser, som presentert i tabell 1, bestemme hvor rik miljøet er, som beskriver antall arten i hver prøve, samt hvordan ulike miljø er, som tar hensyn til antall arter og overflod av hver. Tabell 1 viser Chao 1 rikdom indekser og Shannon mangfold indekser for to innendørs miljøer. Indeksene viser høyere rikdom og mangfold i luftkondisjonerte miljøer sammenlignet Fordampingsavkjøling cooler miljøer. Også inkludert er Bray-Curtis dissimilarity koeffisienter. Disse beskriver hvordan ulike eksempler i miljøet er om arten i hver prøve. Prøvene i begge miljøene beskrevet i tabell 1 er svært ulik på 98% og 97% for klimaanlegget og Fordampingsavkjøling cooler miljøer, henholdsvis.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av en tredelt filteret kassetten forsamlingen. Filteret kassetten består av tre deler: et topp eller cap stykke (innløp), en forlengelsen cowlen og en base stykke (uttak). En støtte pad og filtrere plasseres på gridded overflaten av base stykket. Utvidelse hetten er deretter forseglet på sokkelen med en manuell eller pneumatisk trykk. For bruk med den NIOSH bioaerosol syklon sampler, overstykket er stoppet prøvetaking og deretter erstattes for lagring og transport. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk fremstilling av NIOSH bioaerosol syklon sampler. Den NIOSH syklon aerosol sampler samler luftbårne partikler av tegning luft i sampler gjennom innløpet og produsere en syklon innskudd partikler på veggen av prøven rør. Luften trekkes først inn i en 15 mL polypropylen tube, hvor stor partikler (> 4 µm) samle på veggene i røret. Luft deretter strømmer ut av første slangen og trekkes inn en 1,5 mL microcentrifuge tube, der mindre partikler (1 til 4 µm) samler. Gjenværende partikler (< 1 µm) samle på et PTFE-filter som luften trekkes ut av sampler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksempel på et statisk sampler oppsett. Bildet viser samplere definert for statisk område prøvetaking. NIOSH samplere er satt til samle 40 tommer (102 cm) og 60 inches (152 cm) fra gulvet, representerer høyder av en sittende og stående voksen, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel på en personlig sampler forsamling. Bildet illustrerer en NIOSH sampler bæres i en ryggsekk av en person. Bryteren sampler og makt er plassert på stroppene på pakken mens prøvetaking pumpen ligger i ryggsekken selv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: eksempel på en agarose gel visualisere forsterket ITS DNA fra Luftprøver. Bildet viser DNA band mellom 750 og 1000 base parene. Disse feltene representerer forsterket fungal ITS regioner fra utdraget Luftprøver. Distrikter varierer i størrelse avhengig av arter opprinnelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: eksempel krone diagram presentere taksonomisk plassert fungal arten i et innemiljø. Krone diagrammet viser den relative overfloden av sopp arter finnes i 4 prøver fra hjem etter en 60 min luften prøvetaking periode med NIOSH bioaerosol syklon sampler. 68% av arten tilhører rekken Basidiomycota med de resterende tilhørighet til Ascomycota (33%) og Zygomycota (1%). Den rikeste ITS sekvenser i dette miljøet tilhørte rekkefølgen Polyporales og ble identifisert som Phanerodontia chrysosporium og Gelatoporia dichroa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Chao-1 rikdom Shannon mangfold Bray-Curtis avstand
mener (min, max) mener (min, max) mener (min, max)
Klimaanlegg (n = 9) 33.86 (15,0, 102.0) 1.39 (0,68, 2.51) 0.9778 (0.8313, 1,00)
Fordampingsavkjøling Cooler (n = 10) 25.46 (12,5, 49.5) 1.10 (0,50, 1.72) 0.9624 (0.3804, 1,00)

Tabell 1: eksempeldataene presentere mangfold og arter rikdom indekser sammenligne innendørs miljøer. Tabellen viser Chao 1 rikdom indekser (antall arter per prøve) og Shannon mangfold indekser (antall arter) og overflod av hver Bray-Curtis dissimilarity koeffisientene (hvor uensartede distribusjon er mellom eksempler på en skala fra 0 - 1). Disse dataene viser høyere rikdom og mangfold i luftkondisjonerte miljøer og høy dissimilarity blant eksemplene i begge miljøer. Denne tabellen er endret fra sitroner et al. 10 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bestemme fungal mangfoldet i en yrkesmessig miljøbruk sekvensering tilnærminger har forbedret fungal fare identifikasjon og eksponering vurdering. Bruker denne tilnærmingen har tillatt for påvisning av mange sopp vokser det er ofte ikke oppdaget kultur eller mikroskopi-baserte metoder for vurdering. En metode for prøvetaking bioaerosols fra arbeids- og innendørs miljøer og utvinning av genomisk DNA fra Luftprøver forsterkning og sekvensering presenteres her. Bestemmelse av sopp mangfold ved hjelp av disse metodene er svært avhengig av: (1) vellykkede og fullstendige utvinning av genomisk DNA fra luften eksempler, (2) forsterkning av gDNA med primer som tillater sammenligning av forsterket sin sekvenser til banked sekvenser i databasen og grense forsterkning biases, og (3) riktige taksonomisk identifikasjon av sekvenser fra databasene.

Vellykket genomisk DNA utvinning er avhengig av utvinning metoder og reagenser i en studie. Som er nevnt i protokollen, samle mye av bioaerosols og andre biologiske og ikke-biologiske partikler i rør faser av NIOSH to-trinns syklon sampler øverst på røret. Det er svært viktig at rørene åpnes nøye når du legger til lyseringsbuffer ikke å miste noen partikler og at de bli vortexed på en måte som gir alle partikler å falle i lyseringsbuffer (høyre side opp og opp ned). Det er også viktig at filteret være nøye håndtert ved hjelp av aseptiske metoder ikke for å forstyrre noen bioaerosols som har samlet på overflaten før ekstraksjon eller introdusere forurensende DNA. Det har vist at det er mye variasjon mellom mange av kommersielt tilgjengelig genomisk DNA utvinning kits15. Noen utvinning prosedyrer bias mot bestemte fungal arter og resultere i varierende DNA gir20. Hvis DNA avkastningen etter utvinning er lav, kan høyere PCR reaksjon gjentak utføres. Ikke bare gjør utvinning avkastningen varierer, men mange av ideene som bidrar en betydelig mengde mikrobiell DNA forurensning. Derfor er det viktig å inkludere riktig Kontroller hele prosedyren for å identifisere og fjerne potensielle reagens forurensninger fra analyse.

DENS forsterkning er et kritisk steg av protokollen. De utvinning metodikkene som brukes kan variere i å fjerne PCR hemmere fra miljøprøver. Dette er særlig gjelder med miljømessige støv prøver21. PCR forsterkning av prøver ut med metoden presenteres her vist noen PCR hemming etter tillegg av 10 mg av støv15. Selv om PCR hemming av størst bekymring i miljømessige støvet prøver, bør det fortsatt være en vurdering når forsterke DNA utdraget fra Luftprøver for å bestemme fungal mangfold. PCR primer sett brukes i denne metoden gir dekning av både sin 1 og dens 2 regioner. Dette gir sammenligning til mange av sekvenser i sekvens databasene. Som med utvinning prosedyren, har mange forsterkning og grunning fordommer vært beskrevet tidligere22. Fungal genomet størrelse og gene kopi nummeret kan også påvirke sin forsterkning23. Disse biases bør tas i betraktning når den tolker dataene resulterende sekvens. Taksonomisk identifikasjon av sin sekvensene er kanskje den mest kritiske komponenten av denne metoden. Det er viktig å holde identifikasjonskriteriene konsekvent. Muligheten til å identifisere sine sekvenser er avhengig av sekvenser banked i databasene. Mange sekvenser kan ikke identifiseres til arter nivå. Har bestemte vilkår når taksonomisk identifikasjon basert på banked sekvenser, som prosentandel identitet konsentrasjon, er avgjørende for å holde datasett konsekvent fra å studere.

Sammenlignet med tradisjonelle vurdering tilnærminger, gir trekke ut og sekvensering fungal DNA fra yrkesmessig Luftprøver en mer komplett representasjon av sopp mangfold i et miljø. I tillegg til begrensningene beskrevet ovenfor, må det bemerkes at resultatene av slike analyser er halvt kvantitative i motsetning til kultur, spore teller eller kvantitativ PCR24 som kan gi kvantitative data. Sekvensering data kan brukes til å bestemme relative overflod per prøve, samt presentere fungal mangfold beregninger. Disse metodene kan brukes sammen med andre metoder, som qPCR, få mer kvantifiserbare data. Datasett opprettet ved hjelp av disse metodene kan brukes i helse studier for å få en bedre forståelse av sopp farer i yrkesmessig miljø. Utvikle mer standardisert tilnærminger av utvinning og primer utvalg er nødvendig å karakterisere og sammenligne sekvensering-baserte studier av sopp mangfold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Funn og konklusjoner i denne rapporten er de av forfatterne, og representerer ikke nødvendigvis den offisielle holdning av National Institute for Occupational Safety og helse, Centers for Disease Control og Prevention.

Acknowledgments

Dette arbeidet var støttes delvis av en tverrfaglig avtale mellom NIOSH og NIEHS (AES12007001-1-0-6).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler NIOSH BC251 The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-373 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096 15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width McMaster-Carr 76505A1 sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm SKC Inc. 225-3LF 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm EMD Millipore FSLW03700 Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps Fisher Scientific 09-753-50 filter forceps
Model 502 Precision PanaPress PanaVise 502 pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape McMaster-Carr 76455A21 19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large SKC Inc. 225-112 calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump SKC Inc. 224-PCXR4 sampling pump
Mass Flowmeter 4140 TSI Inc. 4140 flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit Roche Diagnostics 11796828001 Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps Fisher Scientific 15340162 2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm Sigma-Aldrich G1277 glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163 bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X Sigma-Aldrich C8740 lysis reagent
Platinum Taq polymerase Invitrogen 10966-018 Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix Invitrogen 18427-088 10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo Fisher B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder Thermo Fisher 10488-085 DNA ladder

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119, (6), 748-756 (2011).
  2. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14, (4), 285-293 (2017).
  3. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. (2016).
  4. Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74, (1), 233-244 (2008).
  5. Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16, (1), 33-43 (2014).
  6. Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
  7. Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84, (1), 165-175 (2013).
  8. Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9, (6), e97629 (2014).
  9. Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7, (7), e40863 (2012).
  10. Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. (2017).
  11. Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13, (12), 3321-3328 (2011).
  12. Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11, (12), D215-D219 (2014).
  13. Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10, (3), e0120308 (2015).
  14. Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8, (11), 1136-1142 (2006).
  15. Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14, (3), 766-774 (2012).
  16. ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
  17. Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. CRC Press. (2005).
  18. Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13, (10), D159-D165 (2016).
  19. Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
  20. Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75, (16), 5428-5433 (2009).
  21. Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7, (4), 311-318 (2005).
  22. Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
  23. Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61, (7), 2798-2801 (1995).
  24. Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49, (8), 829-833 (2007).
Innsamling og utvinning av yrkesmessig Air prøver for analyse av sopp DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).More

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter