Summary
Determinare la diversità fungina all'interno di un ambiente è un metodo utilizzato in studi di salute sul lavoro per identificare i pericoli per la salute. Questo protocollo descrive estrazione del DNA dai campioni d'aria professionali per l'amplificazione e sequenziamento delle regioni ITS fungine. Questo approccio rileva molte specie fungine che possono essere trascurati dai metodi tradizionali di valutazione.
Abstract
Tradizionali metodi di identificazione fungine esposizioni negli ambienti di lavoro, quali la cultura e gli approcci basati su microscopia, presentano alcune limitazioni che hanno provocato l'esclusione di molte specie. Gli avanzamenti nel campo negli ultimi due decenni hanno condotto i ricercatori di salute professionale a cui rivolgermi approcci molecolari per identificare i pericoli fungini. Questi metodi hanno portato nella rilevazione di molte specie all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro che non sono stati rilevati utilizzando metodi tradizionali. Dettagli di questo protocollo un approccio per determinare la diversità fungina all'interno aria campioni attraverso estrazione del DNA genomico, amplificazione, sequenziamento e identificazione tassonomica di fungine interno trascritto regioni distanziale (ITS). I risultati di sequenziamento nella rilevazione di molte specie fungine che sono non rilevato o difficile da identificare a livello di specie mediante coltura o microscopia. Mentre questi metodi non forniscono misure quantitative dell'onere fungine, offrono un nuovo approccio all'identificazione del pericolo e può essere utilizzati per determinare la complessiva ricchezza di specie e la diversità all'interno di un ambiente di lavoro.
Introduction
Fungine esposizioni in ambienti indoor e sul lavoro possono causare morbidità respiratoria, compresa la sensibilizzazione allergica e asma1. Identificazione dei pericoli fungini è importante per la valutazione del rischio e prevenire l'esposizione del lavoratore. Questi pericoli fungini possono essere un risultato di contaminazione interna, intrusione di aria esterna o disturbi ambientali che provocano il trasporto di materiali fungine in aree dove i lavoratori sono presenti2. Metodi per valutare l'esposizione fungina hanno incluso campionamento cultura vitale, come pure l'identificazione microscopica delle spore fungine. Questi approcci hanno diverse limitazioni e spesso si affacciano molte specie fungine che potrebbero contribuire al generale fungine onere3. Approcci basati sulla cultura è in grado di distinguere solo quegli organismi fungine vitali che possono essere coltivate su terreni di coltura. Identificazione di spore fungine a livello di specie tramite microscopia può essere confuso dalle spore simili morfologie di condivisione. Entrambi i metodi sono altamente dipendenti micologi per analizzare ed identificare le specie fungine, con molti restanti non identificato.
Per migliorare le metodologie esistenti utilizzate nell'identificazione di rischio professionale e valutazioni dell'esposizione, molti ricercatori si sono rivolti a tecnologie molecolari. Approcci basati sul sequenziamento per la valutazione della diversità microbica all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro hanno rivelato un ampio spettro di specie fungine incontrato rispetto ai metodi quali microscopia e vitale cultura3,4 ,5. Il metodo presentato qui descrive il campionamento dell'aria di ambienti di lavoro e l'estrazione del DNA genomico per l'identificazione di potenziali pericoli fungini. Identificazione del pericolo avviene mediante sequenziamento il distanziatore trascritto interno ribosomal nucleare o ITS, regioni che sono altamente variabili tra funghi e sono stati comunemente utilizzate per differenziare le specie fungine6,7, 8,9. Molte specie si trovano in ambienti di lavoro, come alcune specie appartenenti al phylum Basidiomycota, non sono identificabili nella cultura vitale e sono difficili da differenziare microscopicamente. Questi funghi sono stati osservati in alta abbondanza relativa all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro, valutata dal sequenziamento fungine ITS regioni3,4,10. IL sequenziamento ha fornito una maggiore conoscenza della varietà di funghi all'interno di ambienti interni ed occupazionali rilevata.
Il protocollo descritto qui dettagli i metodi utilizzati per raccogliere, estrarre e amplificare fungine ITS regioni da bioaerosols per l'analisi di sequenza. Questo approccio utilizza il National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) campionatore di aerosol di ciclone bistadio raccogliere le particelle nell'aria. Questo sampler è stato sviluppato per raccogliere bioaerosols e separato respirabile (≤ 4 µm di diametro aerodinamico) e non respirabile (> 4 µm di diametro aerodinamico) particelle, che consente per l'identificazione di organismi fungosi all'interno di ambienti che sono i più probabilità di essere inalato da un lavoratore11. Altri campionatori di aria, tra cui i campionatori di ciclone, sono disponibili sul mercato che hanno la capacità di raccogliere le particelle all'interno della gamma respirabile (< 4 µm) usando filtri12,13. Al contrario, il campionatore di aerosol NIOSH bistadio ciclone separa specie fungine basato sul loro diametro aerodinamico nelle provette monouso, in polipropilene che possono essere elaborati immediatamente per applicazioni a valle14.
I processi di estrazione del DNA genomico e amplificando le regioni ITS fungine sono dettagliati nel presente protocollo. Le metodologie di estrazione presentate sono state sviluppate specificamente per l'estrazione del DNA genomico da funghi e batteri, come molti kit commerciali di destinazione in particolare lieviti15, batteri o cellule di mammifero. I primers utilizzati in questo studio sono selezionati basati sulla loro copertura complessiva del 1 ITS fungine e ITS 2 regioni4,5. Sequenziamento di queste regioni consente il confronto di molte sequenze ITS sopraelevate, compresi quelli quella sequenza della regione 1 ITS, ITS 2 regione o regioni ITS 2 sia il suo 1. La diversità fungosa di campioni di aria raccolti in un'impostazione interna utilizzando che questi metodi sono illustrati, rivelando un sostanza numero di sequenze inseriti nei phyla Ascomycota e Basidiomycota, nonché altre sequenze appartenendo a phyla fungoso meno dominante, come Zygomycota. La grande diversità delle sequenze fungine identificati utilizzando questo approccio sarebbe non essere catturata utilizzando metodologie di identificazione di rischio tradizionali come coltivazione o microscopia. Sequenziamento delle regioni ITS fungine fornisce un metodo avanzato per identificare i pericoli fungini e consentire una migliore comprensione delle esposizioni fungine indoor e sul lavoro.
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Protocol
1. preparare il campionatore di aerosol NIOSH
Nota: Il campionatore di aerosol NIOSH è un campionatore di aerosol bistadio ciclone che raccoglie bioaerosols utilizzando due tubi di campionamento e di un filtro di politetrafluoroetilene (PTFE).
- Prima del montaggio, ispezionare attentamente il campionatore. Controllare il campionatore per assicurarsi che non sia danneggiato, tutte le viti sono in atto e aderente e il nastro di sigillo intorno la giuntura formata dai due metà è intatto. Ispezionare il campionatore o-ring per garantire che non ha alcun Nick, crepe o rotture e che ha un molto leggero strato di grasso al silicone.
Nota: Il campionatore include un filtro PTFE 3 µm di 37 mm in polistirolo o cassetto dei filtri tre pezzi in polipropilene.- Montare la cassetta filtro inserendo una cellulosa o rilievo di supporto filtro in plastica (incluso con i filtri) sulla superficie del pezzo base griglia (Vedi Figura 1). Utilizzare filtro forcipe per appoggiare il filtro sopra il pad supporto filtro con il lato di raccolta rivolta verso l'alto.
- Sigillare le cartucce di filtro utilizzando una pressa manuale o pneumatica. Chiusura a mano consentirà di aria per una perdita intorno al filtro e ridurre l'efficienza di raccolta. Inserire il pezzo a forma di anello (il camino di estensione) e utilizzare la stampa per spingere saldamente e in modo uniforme. Premere verso il basso il camino di estensione sul filtro abbastanza saldamente per garantire aria non ci siano perdite intorno al filtro.
Nota: La parte superiore della cassetta non viene utilizzata durante il campionamento ma deve essere salvata per coprire il filtro una volta che il campionamento è completo. - Montare la cassetta montata sulla parte superiore del campionatore e spingerlo verso il basso, per quanto possibile. Avvolgere un pezzo di nastro di 19 mm (3/4 pollici) intorno alla parte esterna del cassetto dei filtri e sampler per tenere il cassetto dei filtri sul posto e di agire come un sigillo di backup per evitare perdite.
- Avvitare ogni tubo saldamente e completamente il sampler fino a fondo e avvolgere intorno a ciascuna provetta il nastro di sigillamento di agire come una tenuta secondaria contro le perdite.
Nota: Il primo tubo, un tubo da 15 mL in polipropilene, raccoglie le particelle non respirabili con un diametro aerodinamico di > 4 µm. Il secondo tubo, un tubo di polipropilene microcentrifuga da 1,5 mL, raccoglie particelle respirabili tra 1 e 4 µm. Le rimanenti particelle più piccole, < 1 µm, sono raccolti su PTFE filtro (Vedi Figura 2).
- Calibrare il flusso d'aria attraverso il campionatore NIOSH con un barattolo di calibrazione prima di ogni utilizzo come differenze nei filtri e campionatori farà sì che il flusso d'aria variare.
- Per utilizzare un vaso di calibrazione, inserire il raccordo Luer del vaso nella parte superiore della cassetta filtro, posizionare il campionatore nel vaso e sigillare il vaso.
- Collegare il vaso di taratura di un misuratore di portata di calibrazione e la pompa di campionamento. Accendere il misuratore di portata e lasciarla riscaldare per pochi minuti. Si noti che il misuratore di portata deve avere sempre un filtro attaccato alla sua presa per evitare di contaminare il flussometro e il campionatore.
- Accendere la pompa di campionamento e farlo girare per qualche minuto riscaldare e stabilizzare.
- Regolare la pompa per impostare la corretta portata a 3,5 L/min.
Nota: La portata per il campionatore di aerosol NIOSH è solitamente impostata su 3,5 L/min. Questa portata, il campionatore è conforme ai criteri ACGIH/ISO per particelle respirabili campionamento16. Altri tassi di flusso possono essere utilizzati se dimensioni differenti cut-off sono desiderati o per ridurre il livello di rumore, ma essere consapevoli che se viene utilizzata una portata differente, quindi il campionatore non sarà non più conforme ai criteri di campionamento respirabile. - Quando la calibrazione è terminata, spegnere la pompa e misuratore di portata.
2. campionamento di aerosol statica e personali
- Impostare il campionatore di aerosol NIOSH per entrambi campionamento area personale o statico.
Nota: Campionamento statico si riferisce a usando il campionatore di aerosol mentre è collegato a un treppiede o un altro dispositivo di tenuta (Vedi Figura 3), come contro personal campionamento quando il campionatore e pompa sono montati sulla persona in fase di studio (Vedi Figura 4).- Per il campionamento di area statica, mantenere i campionatori più vicino possibile al settore specifico allo studio. Mantenere i campionatori lontano da prese d'aria, camera ingressi e posti che potrebbero essere nel percorso del flusso d'aria.
Nota: Le concentrazioni di Aerosol possono variare considerevolmente anche su brevi distanze, soprattutto se l'origine di aerosol è nella camera17. - Per il campionamento personale, è possibile impostare il campionatore all'interno della zona di respirazione della persona. Allegare il campionatore per il bavero, spalla o del torace e posizionare la pompa di campionamento in vita o in uno zaino.
Nota: La zona di respirazione è presupposto comunemente per essere un emisfero di 30cm che circondano il naso di una persona dalla quale viene disegnata la maggior parte dell'aria durante l'inalazione17.
- Per il campionamento di area statica, mantenere i campionatori più vicino possibile al settore specifico allo studio. Mantenere i campionatori lontano da prese d'aria, camera ingressi e posti che potrebbero essere nel percorso del flusso d'aria.
- Assicurarsi che il campionatore della tubazione è ben chiaro delle entrate del campionatore e che nulla è che ostruisce le insenature o interferire con il flusso d'aria nel campionatore. Il campionatore della tubazione non deve essere schiacciato o piegato. Qualsiasi blocco causerà l'arresto della pompa.
- Attivare le pompe. Dopo un minuto o due, verifica se le pompe sono ancora in esecuzione.
Nota: Condotta aria di campionamento per periodi di tempo che vanno da un minimo di 10 min per un turno di lavoro completo 8 h, a seconda l'ambiente10,18,19. I risultati presentati nella Figura 6 sono rappresentativi di un periodo di campionamento di 60 min in ambiente interno. - Al termine del campionamento dell'aria, raccogliere le provette e filtro. Rimuovere il nastro di sigillamento, svitare i tubi e li di cap. Posizionare il terzo pezzo della cassetta filtro sopra il filtro. Conservare i campioni a 4 ° C fino al momento per l'elaborazione.
3. estrazione del DNA genomico dai campioni d'aria
- Estrarre il DNA genomico (gDNA) da ogni fase del campionatore NIOSH BC251. Elaborare l'aria tubi di raccolta di campionamento e filtrare separatamente per consentire la determinazione di aerosol microbici respirabile e non respirabile nel campione.
Nota: In alternativa, le tre fasi possono essere combinate ed estratta in caso di inoculo del campione è troppo piccolo.- In una classe II biologica sicurezza gabinetto o banco pulito laminare, rimuovere asetticamente il filtro. Pulire la cassetta di campionamento utilizzando etanolo al 70% e fare leva la cassetta di campionamento aprire utilizzando uno strumento di apertura cassetto. Utilizzare un sollevatore di filtro per spingere il cuscinetto di supporto e filtro verso l'alto. Afferrare il filtro utilizzando filtro forcipe e metterlo in una capsula di Petri sterile. Il filtro taglia in 6 parti uguali e metterli in una provetta da 2 mL rinforzata contenente microsfere di vetro 300 mg (0,2 - 0,5 mm).
- Collocare la provetta contenente il filtro in azoto liquido per 30 s e metterlo immediatamente in un omogeneizzatore del mulino di tallone fissato a 4,5 m/s per 30 s.
- Ripetere il passaggio 3.1.2 una o due volte fino a quando il filtro è tagliuzzato. Piccoli pezzi di filtro intatto possono rimanere. Aggiungere 0,5 mL di tampone di lisi (4 M urea, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, acido etilendiamminotetracetico 200mm (ed), pH 7.4).
- Aggiungere 0,3 mL di tampone di lisi per la 15 mL e 1,5 mL aria campionatore tubi. Vortice del tubo per 10-15 s mentre in posizione verticale e poi un altro 10-15 s invertita. Trasferire il contenuto di ciascuna provetta provette 2 mL rinforzata contenente 300 mg microsfere di vetro.
Nota: la maggior parte del materiale raccolto in ciascun tubo campionatore si accumulano nella parte superiore del tubo. - Elaborare tutte le provette nell'omogeneizzatore del mulino di perlina a 4,5 m/s per 30 s e centrifuga li a 20.000 x g per 1 min a 22 ° C. Trasferire i surnatanti microcentrifuga sterile 1,5 mL e centrifugare le provette a 20.000 x g ancora per 1 min a 22 ° C. Ripetere questo passaggio.
- Aggiungere 30 µ l di reagente di lisi (Vedi Tabella materiali) a ciascuna provetta e incubare le provette a 37 ° C per 15 min.
- Aggiungere 0,2 mL di buffer obbligatorio (10 M urea, 6m guanidina-HCl, Tris-HCl 10 mM, 20% Triton X-100, pH 4.4) e proteinasi K (100 µ g/mL) a ciascuna provetta e incubare le provette a 70 ° C per 10 min. aggiungere 100 µ l di isopropanolo in ogni provetta.
- Trasferire le soluzioni Estratto in tubi filtro fibra di vetro (capacità di 700 µ l) collocati in provette di raccolta da 2 mL e centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Scartare i tubi di raccolta e inserire i tubi del filtro in nuove provette di raccolta da 2 mL.
- Aggiungere 0,5 mL di tampone di rimozione dell'inibitore (5m guanidina-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% etanolo) in ogni provetta e centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Scartare i tubi di raccolta e inserire i tubi del filtro in nuove provette di raccolta da 2 mL.
- Aggiungere 0,5 mL di tampone di lavaggio (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% etanolo) in ogni provetta e centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Scartare i tubi di raccolta e inserire i tubi del filtro in nuove provette di raccolta da 2 mL. Ripetere questo processo.
- Centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per un ulteriore 1 min a 22 ° C per rimuovere qualsiasi residuo di tampone. Scartare i tubi di raccolta e inserire i tubi del filtro in nuove provette di raccolta.
- Aggiungere 100 µ l tampone di eluizione (≥ 70 ° C) (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) a ciascuna provetta di caldo e li Incubare a temperatura ambiente per 1-2 min. Centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Trasferire i tubi filtro vuoto a un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL e ri-applicare eluati da passo 3.8. Incubare a temperatura ambiente per 1-2 min. centrifuga a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C.
Nota: Eluati possono essere utilizzati immediatamente per passaggio 4 o conservato a-20 ° C fino all'uso. Il DNA genomico può essere immagazzinato per fino ad un anno a-20 ° C. Si raccomanda che, se archiviazione a lungo termine è necessario, DNA essere conservati a-80 ° C.
4. l'amplificazione del DNA ribosomiale fungo
- Utilizzare universal primer fungine per amplificare le regioni 1 e 2 dal gDNA Estratto.
Nota: Per questo protocollo, il primer coppia di Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') vengono utilizzati per fornire la massima copertura delle regioni ITS4,5. Altri set di primer, come quelli che amplificare regioni ITS1 e ITS2 da solo, può essere utilizzato.- Impostare le reazioni a catena della polimerasi (PCR) per ciascun campione in triplice copia 50 reazioni di µ l in provette per PCR sterile 0,5 mL o piastre PCR a 96 pozzetti come segue: 5 µ l di Estratto di DNA (dal passaggio 3), 33,3 µ l di acqua di grado PCR, 5 µ l di tampone di x PCR 10 , 1,5 µ l di MgCl2, 1 µ l di 10 mM 2'-deossinucleoside 5'-trifosfati, 0,5 µ l di 20 primer avanti di Fun18Sf µM, 0,5 µ l di 20 primer inverso di ITS4R µM e 0,2 µ l di Taq DNA polimerasi.
- Eseguire reazioni in un termociclatore: denaturazione a 95 ° C per 3 min; 6 cicli di denaturazione (96 ° C, 30 s) ricottura (50 ° C, 45 s) ed estensione dell'iniettore (72 ° C, min 3); 20 cicli di denaturazione (96 ° C, 30 s), ricottura (50 ° C, 45 s) e di estensione dell'iniettore (72 ° C, 1 min); ed estensione dell'iniettore a 72 ° C per 10 min. mantenere le miscele di reazione a 4 ° C fino al passo successivo.
- Combinare che le reazioni di PCR triplicate purificano utilizzando un kit di purificazione di membrana a base di silice.
Nota: Questa procedura permette la rimozione di componenti PCR (primer, dNTP, enzimi, sali, ecc.) e altri contaminanti dai preparativi del DNA amplificati.- Combinare le tre reazioni per ogni campione (150 µ l totale) in provette per microcentrifuga da 1,5 mL sterile. Aggiungere buffer obbligatorio (5m guanidina-HCl, 30% isopropanolo) ad un volume di 5x (750 µ l) e mescolare la soluzione pipettando su e giù per dieci volte.
- Aggiungere 450 µ l della miscela di spin colonne poste in provette per la raccolta e centrifugare le provette a 17.900 x g per 30 s. scartare i filtrati. Aggiungere il restante µ l 450 alle colonne e centrifugare a 17.900 x g per 30 s a 22 ° C.
Nota: Le colonne di spin contengono una membrana di silice che permette per l'adsorbimento del DNA alle colonne. - Scartare i filtrati e aggiungere 750 µ l di tampone di lavaggio (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% etanolo) per le colonne di spin. Centrifugare le colonne a 17.900 x g per 30 s a 22 ° C.
Nota: Questo processo rimuove i contaminanti dalla reazione PCR di cui sopra. - Scartare il filtrato e centrifugare le colonne vuote a 17.900 x g per 1 min a 22 ° C.
Nota: Questo passaggio è quello di rimuovere qualsiasi residuo lavaggio tampone che potrebbe interferire con le applicazioni a valle. - Trasferire le colonne di spin per microcentrifuga da 1,5 mL sterile. 45 µ l di tampone di eluizione (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) e incubare le provette a temperatura ambiente per 5 min. centrifuga le colonne di spin a 17.900 x g per 1 min a 22 ° C.
- Utilizzare immediatamente il DNA eluito per i passaggi 4 e 5 o conservare a-20 ° C fino a che pronto per l'uso.
Nota: Gli ampliconi possono essere memorizzati per fino ad un anno a-20 ° C. Si raccomanda che, se archiviazione a lungo termine è necessario, DNA essere conservati a-80 ° C.
5. Verifica dell'amplificazione di ITS fungina usando l'elettroforesi del gel dell'agarosi
- Cast un 1% di agarosio gel contenente bromuro di etidio 1 µ g/mL. Sciogliere agarosio in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) 1x di ebollizione. Una volta che la soluzione è raffreddata a circa 50 ° C, aggiungere il bromuro di etidio e versare in gel il cast.
- Dopo il gel dell'agarosi è solidificato, immergere il gel in 1 x TAE e preparare gli ampliconi da caricare sul gel. 8 µ l di DNA amplificato, aggiungere 2 µ l di 5 x buffer di caricamento.
Nota: Questi volumi possono essere regolati a seconda della concentrazione del buffer di caricamento desiderato. - Caricare i campioni, tutti e 10 µ l, sul gel insieme con un DNA ladder per misure di riferimento. Esegua il gel a 75 V (6 V/cm) per circa 90 min e visualizzate le fasce, tipicamente osservati tra 750 e 1.000 paia di basi, usando ultravioletto luce (Vedi Figura 5).
6. sequenziamento e analisi delle regioni ITS fungine
- Sequenziare il gDNA estratto o regioni ITS fungine amplificate e analizzare le sequenze utilizzando metodi attuali e appropriati.
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Representative Results
La distribuzione delle specie all'interno di un ambiente può essere valutata mediante la determinazione del numero di cloni di ogni OTU identificato nei campioni di aria abbondanza relativa. Nella figura 6 è un grafico di corona che rappresenta la specie tassonomicamente posizionata all'interno di un ambiente interno dopo 60 min di campionamento dell'aria. Si può osservare che l'ambiente contiene una varietà di specie all'interno di due principali phyla fungoso, Ascomycota e Basidiomycota, come pure le specie appartenenti al phylum Zygomycota (Microsporus del rhizopus). I metodi tradizionali di valutazione sono prevenuti verso specie di Ascomycota, come molti Basidiomycota non sono coltivabili o non possono essere differenziati utilizzando metodi basati su microscopia. Sequenziamento delle regioni ITS fungine consente il rilevamento di numerose specie fungine, in particolare alcuni Basidiomycota, che spesso passate inosservate. L'analisi di questo ambiente Mostra 68% delle sequenze fungine identificate appartenuto al Basidiomycota con la maggior parte di loro posizionati nell'ordine Polyporales.
I dati tassonomici ottenuti utilizzando approcci basati sulla sequenza consente di determinare la diversità tassonomica all'interno di un ambiente. Indici di diversità, come quelli presentati nella tabella 1, determinano quanto sia ricca l'ambiente è, che descrive il numero di specie identificate in ogni campione, come pure diversi come l'ambiente è, che tiene conto del numero di specie e l'abbondanza di ogni. La tabella 1 Mostra gli indici di ricchezza di Chao 1 e Shannon indici di diversità per due ambienti interni. Gli indici indicano maggiore ricchezza e la diversità in ambienti climatizzati rispetto agli ambienti raffreddatore evaporativi. Sono inclusi anche i coefficienti di dissomiglianza di Bray-Curtis. Questi descrivono come dissimili campioni all'interno dell'ambiente sono per quanto riguarda le specie identificate all'interno di ogni campione. I campioni all'interno di entrambi gli ambienti descritti nella tabella 1 sono altamente dissimili al 98% e 97% per il condizionatore d'aria e ambienti di dispositivo di raffreddamento evaporativi, rispettivamente.
Figura 1: rappresentazione schematica di un assembly di cassetta filtro tre pezzi. Il cassetto dei filtri è costituito da tre pezzi: un pezzo superiore o cap (in entrata), un cappuccio di estensione e un pezzo di base (in uscita). Un supporto pad e filtro sono posti sulla superficie del pezzo base quadrettata. Il camino di estensione viene quindi sigillato sulla base utilizzando una pressa manuale o pneumatica. Per l'utilizzo con il campionatore di ciclone di bioaerosol NIOSH, il pezzo superiore è stato interrotto durante il campionamento e viene poi sostituito per stoccaggio e trasporto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentazione schematica del campionatore di ciclone di bioaerosol NIOSH. Il campionatore di aerosol di ciclone NIOSH raccoglie particolato disperso nell'aria disegnando aria nel campionatore attraverso l'entrata, e producendo un ciclone che depositi di particelle sulla parete dei tubi campione. L'aria viene aspirata in primo luogo in una provetta da 15 mL in polipropilene, dove grandi particelle (> 4 µm) raccogliere sulle pareti del tubo. Aria quindi fuoriesce il primo tubo e viene disegnato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, dove raccolgono le particelle più piccole (da 1 a 4 µm). Le rimanenti particelle (< 1 µm) raccogliere su un filtro PTFE, come l'aria viene aspirata fuori il campionatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: esempio di un set-up statico campionatore. L'immagine illustra Campionatori per campionamento area statica. I campionatori NIOSH sono impostati fino a raccogliere 40 pollici (102 cm) e 60 pollici (152 cm) dal pavimento, con altezze di una seduta e in piedi adulto, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: esempio di assemblaggio campionatore personale. L'immagine illustra un campionatore NIOSH indossato su uno zaino di un individuo. Il campionatore e power switch sono situate le cinghie del pack mentre la pompa di campionamento si trova all'interno dello zaino stesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: esempio di un gel di agarosio visualizing amplificato ITS DNA dai campioni d'aria. L'immagine mostra le bande di DNA tra 750 e 1.000 paia di basi. Queste bande rappresentano regioni ITS fungine amplificate dai campioni di aria estratta. SUE regioni variano nelle dimensioni a seconda dell'origine della specie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: corona esempio grafico che presenta collocato tassonomicamente specie fungine identificato all'interno di un ambiente interno. Il grafico di Krona raffigura l'abbondanza relativa delle specie fungine presenti in 4 campioni raccolti da case in seguito ad un periodo di campionamento di aria 60 min con il campionatore di ciclone di bioaerosol NIOSH. 68% delle specie identificate appartengono al phylum Basidiomycota con il rimanente appartenente al Ascomycota (33%) e Zygomycota (1%). Le sequenze ITS più abbondante in questo ambiente appartenevano all'ordine Polyporales e sono state identificate come Phanerodontia chrysosporium e Gelatoporia dichroa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Ricchezza di Chao-1 | Diversità di Shannon | Distanza di Bray-Curtis | |
| media (min, max) | media (min, max) | media (min, max) | |
| Condizionatore d'aria (n = 9) | 33.86 (15,0, 102.0) | 1.39 (0,68, 2,51) | 0.9778 (0.8313, 1.00) |
| Dispositivo di raffreddamento evaporativo (n = 10) | 25,46 (12.5, 49,5) | 1.10 (0.50, 1.72) | 0.9624 (0.3804, 1.00) |
Tabella 1: dati di esempio che presenta diversità e specie indici di ricchezza confronto tra ambienti interni. La tabella mostra Chao 1 ricchezza indici (numero di specie per campione), gli indici di diversità di Shannon (numero di specie) e abbondanza di ciascuno e coefficienti di dissomiglianza di Bray-Curtis (come dissimile la distribuzione delle specie è tra i campioni su una scala di 0 - 1). Questi dati dimostrano maggiore ricchezza e la diversità in ambienti climatizzati e alta dissomiglianza tra i campioni in entrambi gli ambienti. Questa tabella è stata modificata da limoni et al. 10 con il permesso della Royal Society of Chemistry.
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Discussion
Determinare la diversità fungina all'interno di un ambiente di lavoro utilizzando approcci basati su sequenziamento è migliorata individuazione ed esposizione di pericolosità fungine. Utilizzando questo approccio ha permesso per la rilevazione di molte altre specie fungine che spesso non vengono rilevati utilizzando metodi basati su microscopia di valutazione o di cultura. Qui viene presentato un metodo per campionamento bioaerosols da ambienti professionali e coperto e l'estrazione del DNA genomico dai campioni d'aria per la sua amplificazione e sequenziamento. Determinazioni della diversità fungina utilizzando questi metodi è fortemente dipendente: (1) successo e completa estrazione di DNA genomic dall'aria campioni, (2) amplificazione dei gDNA con gli iniettori che consentono il confronto tra l'amplificato sue sequenze di virata sequenze nelle polarizzazioni di amplificazione database e limite e (3) corretta identificazione tassonomica delle sequenze all'interno del database.
Estrazione del DNA genomico successo si basa sulle metodologie di estrazione e i reattivi utilizzati in uno studio. Come è indicato nel protocollo, un sacco del bioaerosols e altre particelle biologiche e non biologiche raccolti nelle fasi tubo del campionatore bistadio ciclone NIOSH raccogliere nella parte superiore del tubo. È molto importante che i tubi con attenzione essere aperto quando si aggiunge il tampone di lisi per non perdere alcun particolato e che essere agitati con Vortex in un modo che permette per tutto il particolato a cadere nel buffer di lisi (lato destro in alto e testa in giù). È anche importante che il filtro sia attentamente gestiti con metodi asettici da non per interrompere qualsiasi bioaerosols che avete raccolto sulla superficie prima dell'estrazione o introdurre DNA contaminante. È stato dimostrato che esiste una grande quantità di variazione tra molti dei commercialmente disponibili genomic del DNA estrazione Kit15. Alcuni pregiudizi di procedure di estrazione verso specifiche specie fungine e risultato nel DNA variabile produce20. Se il rendimento del DNA estrazione seguente è basso, più repliche di reazione di PCR possono essere eseguite. Non solo le rese di estrazione variano, ma molti dei kit contribuiscono una notevole quantità di contaminazione microbica del DNA. Per questo motivo, è importante includere controlli adeguati durante tutta la procedura per identificare e rimuovere potenziali contaminanti di reagente dall'analisi.
SUA amplificazione è un altro passaggio fondamentale del protocollo. Le metodologie di estrazione utilizzate possono variare nella loro capacità di rimuovere inibitori della PCR da campioni ambientali. Questo è particolarmente inquietante con campioni di polvere ambientale21. Amplificazione di PCR dei campioni estratti utilizzando il metodo presentato qui ha esibito alcuni inibizione PCR dopo l'aggiunta di 10 mg di polvere15. Sebbene l'inibizione PCR è di maggiore interesse in campioni di polvere ambientale, ancora dovrebbe essere una considerazione quando amplificare il DNA estratto dai campioni d'aria per la determinazione diversità fungina. Il set utilizzato in questo metodo di primer PCR fornisce una copertura delle regioni ITS 2 sia il suo 1. In questo modo per il confronto a molte delle sequenze inserite nei database di sequenza. Come con la procedura di estrazione, molti pregiudizi di amplificazione e primer sono stati descritti in precedenza22. Il numero di copie del genoma fungine dimensioni e gene potrebbe anche influenzare la sua amplificazione23. Questi pregiudizi dovrebbero tener conto quando si interpretano i dati di sequenza risultante. Identificazione tassonomica delle sue sequenze è forse il componente più critico di questo metodo. È importante mantenere criteri di identificazione coerente. La capacità di identificare le sequenze è dipenda sulle sequenze incassate nei database. Molte sequenze non possono essere identificati a livello di specie. Avere criteri specifici quando si effettuano identificazioni tassonomiche basati su sequenze sopraelevate, come percentuale identità tagli, è critico per mantenere i set di dati coerente da studio a Studio.
Rispetto agli approcci tradizionali, estrazione e sequenziamento DNA fungoso dai campioni d'aria professionale fornisce una rappresentazione più completa della diversità fungina all'interno di un ambiente. Oltre alle limitazioni discusse sopra, si deve constatare che i risultati di questi tipi di analisi sono semi-quantitativi a differenza di cultura, spora conteggi o PCR quantitativa24 che può produrre dati quantitativi. Sequenziazione di dati può essere utilizzato per determinare la relativa abbondanza per campione, nonché calcolare le metriche di diversità fungina. Questi metodi possono essere utilizzati in combinazione con altri metodi, come la qPCR, per avere più dati quantificabili. I set di dati creato utilizzando questi approcci utilizzabile negli studi di medicina del lavoro per ottenere una migliore comprensione dei rischi fungine in ambienti di lavoro specifici. Lo sviluppo più standardizzati sono necessari per meglio caratterizzare e confrontare studi basati su sequenziamento della diversità fungina approcci di selezione estrazione e primer.
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Disclosures
Le risultanze e le conclusioni in questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dell'Istituto nazionale per salute e sicurezza sul lavoro, centri per controllo e la prevenzione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un accordo tra agenzie tra NIOSH e NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
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