Summary
Bestemmelse af svampe mangfoldigheden inden for et miljø er en metode, der udnyttes i arbejdsmedicinske undersøgelser at identificere sundhedsmæssige farer. Denne protokol beskriver DNA-ekstraktion fra erhvervsmæssig Luftprøver til forstærkning og sekventering af svampe ITS regioner. Denne metode registrerer mange svampe arter, der kan blive overset af traditionelle beregningsmetoder.
Abstract
Traditionelle metoder til at identificere svampe engagementer i faglige miljøer, såsom kultur og mikroskopi-baserede tilgange, har flere begrænsninger, der har ført til udelukkelsen af mange arter. Fremskridt inden for området i de sidste to årtier har ført arbejdsmiljø forskere at henvende sig til molekylære-baserede tilgange til at identificere svampe farer. Disse metoder har ført til påvisning af mange arter inden for indendørs og faglige miljøer, der ikke har været påvist ved hjælp af traditionelle metoder. Denne protokol detaljer en fremgangsmåde til bestemmelse af svampe mangfoldighed inden for luft prøver gennem genomisk DNA-ekstraktion, forstærkning, sekventering og taksonomisk identifikation af svampe interne transskriberet spacer (ITS) regioner. Sekventering resultaterne i afsløring af mange svampe arter, der er enten ikke fundet eller vanskeligt at identificere arter niveau ved hjælp af kultur eller mikroskopi. Mens disse metoder ikke giver kvantitative foranstaltninger af svampe byrde, de tilbyder en ny tilgang til farlighedsidentifikation og kan bruges til at bestemme samlede arter rigdom og mangfoldighed i en erhvervsmæssig miljø.
Introduction
Svampe engagementer i indendørs og faglige miljøer kan resultere i respiratoriske morbiditet, herunder allergisk sensibilisering og astma1. Identifikation af svampe farer er vigtig for vurderingen af risikoen og forebygge arbejdstagernes eksponering. Disse svampe farer kan være et resultat af indendørs forurening, udendørs luft indbrud eller miljømæssige forstyrrelser, der resulterer i transporten af svampe materialer i områder, hvor arbejdstagerne er til stede2. Metoder til at vurdere svampe eksponering har inkluderet bæredygtig kultur prøveudtagning samt mikroskopisk identifikation af svampesporer. Disse tilgange har flere begrænsninger og ofte overser mange svampe arter, der kan bidrage til den samlede svampe byrde3. Kultur-baserede tilgange kan kun skelne de levedygtige fungal organismer, der kan dyrkes på næringsstof medier. At identificere svampesporer til artsniveau via mikroskopi kan blive forvirret af sporer deling lignende morfologier. Begge metoder er stærkt afhængige af mycologists til at analysere og identificere de svampe arter, med mange resterende uidentificerede.
For at forbedre eksisterende metoder, der anvendes i arbejdsskade identifikation og eksponering vurderinger, mange forskere har henvendt sig til molekylære-baserede teknologier. Sekventering-baserede metoder til vurdering af mikrobiel diversitet inden for indendørs og faglige miljøer har afsløret et bredere spektrum af svampe arter fundet i forhold til metoder som mikroskopi og levedygtige kultur3,4 ,5. Metoden præsenteres her beskriver luft prøvetagning af faglige miljøer og udvinding af genomisk DNA til identifikation af potentielle svampe farer. Fareidentifikation opnås ved sekventering nuklear ribosomale interne transskriberede spacer eller ITS, regioner, der er meget varierende blandt svampe og har været almindeligt brugt at differentiere svampe arter6,7, 8,9. Mange arter findes i erhvervsmæssig indstillinger, såsom nogle arter tilhører phylum Basidiomycota, ikke kan identificeres i levedygtige kultur og er vanskeligt at skelne mikroskopisk. Disse svampe er blevet observeret i høj relativ overflod inden for indendørs og faglige miljøer vurderet af sekventering svampe ITS regioner3,4,10. DENS sekventering har givet større viden i mangfoldigheden af svampe fundet inden for indendørs og faglige miljøer.
Protokollen beskrevet her detaljer metoderne, der anvendes til at indsamle, uddrage og forstærke svampe ITS områder fra bioaerosols til Sekvensanalyse. Denne metode udnytter det nationale Institut for Occupational Safety and Health (NIOSH) to-trins cyklon aerosol sampler at indsamle partikler i luften. Denne sampler blev udviklet til at indsamle bioaerosols og separat respirabelt (≤4 µm aerodynamisk diameter) og ikke-respirabelt (> 4 µm aerodynamisk diameter) partikler, der giver mulighed for identifikation af fungal organismer som indendørs miljøer, der er mest tilbøjelige til at blive indåndes af en arbejdstager11. Andre luft samplere, herunder cyklon samplere, er tilgængelige på markedet, som har mulighed for at indsamle partikler inden for respirabelt rækkevidde (< 4 µm) ved hjælp af filtre12,13. Derimod adskiller NIOSH to-trins cyklon aerosol sampler svampe arter baseret på deres aerodynamisk diameter til engangstændere, polypropylen rør, der umiddelbart kan behandles for downstream programmer14.
Processer til udvinding genomisk DNA og forstærke de svampe ITS regioner er beskrevet i denne protokol. Udvinding metoder præsenteret er blevet udviklet specielt til udvinding af genomisk DNA fra svampe og bakterier, som mange kommercielle kits målrette pattedyrceller, bakterier eller specifikt gær15. Primere anvendes i denne undersøgelse er udvalgt på grundlag af deres samlede dækning af både svampe dens 1 og dens 2 regioner4,5. Sekventering af disse regioner tillader til sammenligning af mange krænges ITS-sekvenser, herunder dem, denne sekvens regionen dens 1, dens 2 region eller både dens 1 og dens 2 regioner. De svampe mangfoldighed af Luftprøver indsamlet i en indendørs indstilling ved hjælp af disse metoder er vist, afslører et betydeligt antal sekvenser placeret i phyla Sæksvampe og Basidiomycota samt andre sekvenser tilhører mindre dominerende svampe phyla, som Zygomycota. Den brede mangfoldighed af svampe sekvenser identificeret ved hjælp af denne fremgangsmåde ville ikke blive fanget ved hjælp af traditionelle fare identifikation metoder som dyrkning og mikroskopi. Sekventering af svampe ITS områder giver en forbedret metode til at identificere svampe farer og giver mulighed for en bedre forståelse af indendørs og erhvervsmæssig svampe engagementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse NIOSH aerosol sampler
Bemærk: NIOSH aerosol sampler er en to-trins cyklon aerosol sampler, der indsamler bioaerosols ved hjælp af to stikprøver rør og en polytetrafluorethylen (PTFE) filter.
- Før montering, omhyggeligt inspicere sampler. Kontrollere sampler til at sikre, at det ikke er beskadiget, alle skruer er på plads og LUN og forsegling båndet rundt sømmen dannet af de to halvdele er intakt. Inspicere sampler O-ring til at sikre, at det ikke har nogen rifter, revner eller tårer og at det har et meget tyndt lag af silikone fedt.
Bemærk: Sampler indeholder en 37 mm 3 µm PTFE filter i en polystyren eller polypropylen tredelt filter kassette.- Samle filter kassetten ved at placere en cellulose eller plast filter støtte pad (inkluderet med filtrene) inddelte overfladen af den base stykke (Se fig. 1). Brug filter pincet til at sætte filter på toppen af filter støtte pad med den samling side opad.
- Forsegle filterkassetter ved hjælp af en manuel eller pneumatisk tryk. Hånd lukning vil tillade luft at lække omkring filteret og reducere samling effektivitet. Indsæt det ringformede stykke (forlængelse Røghætte), og bruge pressen til at skubbe det tæt og jævnt. Tryk ned udvidelse Røghætte på filteret stramt nok til at sikre luft ikke lække omkring filteret.
Bemærk: Det øverste stykke af kassetten er ikke bruges samtidig med prøveudtagning men skal gemmes for at dække filteret når prøveudtagning er fuldført. - Passer til de forsamlede kassette på toppen af sampler, og skub det så vidt muligt. Wrap et stykke 19 mm (3/4 tommer) tape omkring ydersiden af filter kassette og sampler at holde filter kassette på plads og at fungere som en backup sæl at forhindre lækager.
- Skru hver tube stramt og fuldt i sampler indtil det bunde og wrap forseglingstape omkring hvert rør til at fungere som en sekundær tætning mod lækager.
Bemærk: Den første tube, en 15 mL polypropylen tube, indsamler ikke-respirabelt partikler med en aerodynamisk diameter > 4 µm. Det andet rør, en 1,5 mL polypropylen microcentrifuge tube, indsamler respirabelt partikler mellem 1 og 4 µm. De resterende mindre partikler, < 1 µm, indsamles på PTFE filter (Se figur 2).
- Kalibrere luftstrømmen gennem NIOSH sampler med en kalibrering krukke før hver brug som forskelle i filtre og prøvetagere vil medføre luftstrømmen at variere.
- At bruge en kalibrering krukke, indsætte den jar Luer montering i toppen af filter kassette, placere sampler i krukken og forsegle krukken.
- Tilslut kalibrering krukke til en kalibrering flowmåler og prøvetagningspumpen. Tænd flowmåler og gør det muligt at varme op et par minutter. Bemærk at flowmåler altid skal have et filter, knyttet til sin indgang til at undgå kontaminering af flowmeteret og sampler.
- Tænd prøvetagningspumpen og gør det muligt at køre et par minutter til at varme op og stabilisere.
- Juster pumpen for at indstille den korrekte flow på 3,5 L/min.
Bemærk: Flowet for NIOSH aerosol sampler er normalt indstillet til 3,5 L/min. På denne strømningshastighed overholder sampler ACGIH/ISO kriterierne for respirabelt partikel prøveudtagning16. Andre strømningshastigheder kan bruges, hvis forskellige cut-off størrelser er ønsket eller for at reducere støjniveauet, men vær opmærksom på, at hvis en anden strømningshastighed er brugt, så sampler vil ikke længere i overensstemmelse med respirabelt prøveudtagning kriterier. - Når kalibreringen er afsluttet, slukke pumpen og flowmåler.
2. statisk og personlige aerosol prøveudtagning
- Oprette NIOSH aerosol sampler for enten personlige eller statisk prøvetagning.
Bemærk: Statisk prøvetagning refererer til ved hjælp af aerosol sampler, mens den er fastgjort til et stativ eller anden bedrift enhed (Se figur 3), som versus personlige prøveudtagning når sampler og pumpen er monteret på den person, der undersøges (Se figur 4).- For statiske område prøveudtagning, holde samplere så tæt som muligt på det specifikke område undersøges. Holde prøvetagere fra luft indsugningstragterne, værelse indgange og steder, der kan være i vejen for luftstrømmen.
Bemærk: Aerosol koncentrationer kan variere betydeligt over korte afstande, især hvis aerosol kilde er i værelse17. - Personlige prøvetagning, at angive sampler inden for personens vejrtrækning zone. Tillægger revers, skulder eller brystet sampler, og placere prøvetagningspumpen i taljen eller i en rygsæk.
Bemærk: Indåndingszonen er almindeligvis antages for at være en 30 cm halvkugle omkring en persons næse hvorfra størstedelen af luft er trukket under indånding17.
- For statiske område prøveudtagning, holde samplere så tæt som muligt på det specifikke område undersøges. Holde prøvetagere fra luft indsugningstragterne, værelse indgange og steder, der kan være i vejen for luftstrømmen.
- Sørg for at de sampler slanger er godt klar af sampler fjorde og at intet blokerer fjorde eller forstyrrer luftstrømmen i prøveudtagerens umiddelbare nærhed. Sampler slanger må ikke klemt eller snoet. Nogen blokering vil forårsage pumpen til at stoppe.
- Drej på pumperne. Efter et minut eller to, tjekke hvis pumperne kører stadig.
Bemærk: Adfærd luft prøvetagning for tidsperioder lige fra så lidt som 10 min til en fuld 8 h arbejdsskift, afhængigt af miljø10,18,19. Resultaterne præsenteres i figur 6 er repræsentant for en 60 min stikprøveperioden i en indendørs miljø. - Efter luft prøvetagning er afsluttet, indsamle prøven rør og filter. Fjern den forsegling tape, skru rør og cap dem. Placér tredje filter kassette over filteret. Opbevare prøver ved 4 ° C indtil klar til behandling.
3. udvinding af genomisk DNA fra Luftprøver
- Uddrag genomisk DNA (gDNA) fra hver fase af NIOSH BC251 sampler. Behandle luften prøvetagning indsamling rør og filtrere separat for at give mulighed for bestemmelse af respirabelt og ikke-respirabelt mikrobielle aerosoler i prøven.
Bemærk: Alternativt, de tre faser kan kombineres og udvundet hvis prøven inokulum er for lille.- I en klasse II biologiske sikkerhed kabinet eller laminar flow ren bænk, aseptisk fjerne filteret. Tør prøveudtagning kassetten ned med 70% ethanol og lirke prøveudtagning kassette åbne værktøjet en kassette-åbning. Bruge et filter løfter til at skubbe den filter og støtte pad opad. Forstå filteret ved hjælp af filteret pincet og placere det i en steril petriskål. Klippe filteret i 6 lige store stykker og læg dem i et 2 mL forstærket rør indeholdende 300 mg glasperler (0,2 - 0,5 mm).
- Placer røret indeholder filter i flydende nitrogen til 30 s og straks placerer det i en perle mill homogeniseringsapparat sat til 4,5 m/s for 30 s.
- Gentag trin 3.1.2 gange indtil filtret er makuleret. Små stykker af intakt filter kan forblive. Der tilsættes 0,5 mL lysisbuffer (4 M urinstof, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM ethylendiamintetra syre (EDTA), pH 7,4).
- Tilsættes 0,3 mL lysisbuffer til 15 mL og 1,5 mL luft sampler rør. Vortex tube for 10-15 s mens opretstående og derefter en anden 10-15 s inverteret. Overføre indholdet af hver tube til 2 mL forstærket rør indeholdende 300 mg glasperler.
Bemærk: De fleste af materiale indsamlet i hver sampler tube vil akkumulere nær toppen af røret. - Behandle alle rør i perle mill homogeniseringsapparat på 4,5 m/s for 30 s og centrifugeres dem på 20.000 x g i 1 minut ved 22 ° C. Overføre supernatanter til sterile 1,5 mL microcentrifuge rør og centrifugeres rør ved 20.000 x g igen i 1 min på 22 ° C. Gentag dette trin.
- Tilføj 30 µL lysis reagens (Se Tabel af materialer) til hver tube og inkuberes rør ved 37 ° C i 15 min.
- Der tilsættes 0,2 mL af binding buffer (10 M urinstof, 6 M guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100, pH 4,4) og proteinase K (100 µg/mL) til hver tube og inkuberes rør ved 70 ° C i 10 min. tilsættes 100 µL af isopropanol til hver tube.
- Overføre ekstrakt løsninger i glas fiber filter rør (700 µL kapacitet) placeret i 2 mL indsamling rør og centrifugeres indsamling rør på 20.000 x g for 30 s ved 22 ° C. Kassér indsamling rør og placere filter rør i nyt 2 mL indsamling rør.
- 0,5 mL hæmmer fjernelse buffer (5 M guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% ethanol) tilsættes til hvert rør og centrifugeres indsamling rør på 20.000 x g for 30 s ved 22 ° C. Kassér indsamling rør og placere filter rør i nyt 2 mL indsamling rør.
- 0,5 mL vaskebuffer (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% ethanol) tilsættes til hvert rør og centrifugeres indsamling rør på 20.000 x g for 30 s ved 22 ° C. Kassér indsamling rør og placere filter rør i nyt 2 mL indsamling rør. Gentag denne proces.
- Der centrifugeres indsamling rør på 20.000 x g for en yderligere 1 min ved 22 ° C til at fjerne enhver resterende wash buffer. Kassér indsamling rør og placere filter rør i ny indsamling rør.
- Tilføj 100 µL varm (≥70 ° C) eluering buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) til hver tube og inkuberes dem ved stuetemperatur i 1-2 min. Centrifuge indsamling rør på 20.000 x g for 30 s ved 22 ° C. Overføre de tomme filter rør til en sterile 1,5 mL microcentrifuge tube og ansøge igen eluater fra trin 3.8. Inkuber ved stuetemperatur i 1-2 min. Centrifuge på 20.000 x g for 30 s ved 22 ° C.
Bemærk: Eluater kan bruges umiddelbart for trin 4 eller opbevares ved-20 ° C indtil klar til brug. Genomisk DNA kan opbevares i op til et år ved-20 ° C. Det anbefales, at DNA opbevares ved-80 ° C, hvis langsigtede oplagring er nødvendig.
4. forstærkning af svampe ribosomale DNA
- Brug universelle svampe primere til at forstærke sin region 1 og 2 fra den udpakkede gDNA.
Bemærk: Til denne protokol, primeren parre Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') bruges til at give den største dækning af ITS regioner4,5. Andre primer sæt, som dem, der forstærker ITS1 eller ITS2 regioner alene, kan anvendes.- Oprette polymerase kædereaktion (PCR) for hver prøve i tredobbelt 50 µL reaktioner i sterile 0,5 mL PCR rør eller 96-brønd PCR plader som følger: 5 µL af uddraget skabelon DNA (fra trin 3), 33.3 µL PCR grade vand, 5 µL af 10 x PCR buffer , 1,5 µL af 50 mM MgCl2, 1 µL af 10 mM 2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates, 0,5 µL af 20 µM Fun18Sf fremad primer, 0,5 µL af 20 µM ITS4R omvendt primer og 0,2 µL af Taq DNA polymerase.
- Udføre reaktioner i en termisk cycler: denaturering ved 95 ° C i 3 min. 6 cyklusser af denaturering (96 ° C, 30 s) udglødning (50 ° C, 45 s) og primer forlængelse (72 ° C, 3 min); 20 cyklusser af denaturering (96 ° C, 30 s), udglødning (50 ° C, 45 s), og primer forlængelse (72 ° C, 1 min); og primer udvidelse ved 72 ° C i 10 min. holde reaktion blandinger ved 4 ° C indtil næste skridt.
- Kombiner de tredobbelt PCR reaktioner rense bruger en silica membranbaseret rensning kit.
Bemærk: Denne procedure giver mulighed for fjernelse af PCR komponenter (primere, dNTP'er, enzymer, salte, osv.) og andre forurenende stoffer fra de amplificerede DNA præparater.- Kombinere de tre reaktioner for hver prøve (150 µL samlede) i sterile 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilføj binding buffer (5 M guanidin-HCl, 30% isopropanol) på en 5 x volumen (750 µL) og bland løsningen af pipettering op og ned 10 gange.
- Tilføje 450 µL af blandingen til spin kolonner placeret i indsamling rør og centrifugeres rør på 17,900 x g i 30 s. kassere Filtraterne. Tilføje de resterende 450 µL til kolonnerne og centrifugeres ved 17,900 x g for 30 s ved 22 ° C.
Bemærk: Spin kolonner indeholder en silica membran, der giver mulighed for adsorption af DNA til kolonnerne. - Kassér Filtraterne og tilføje 750 µL vask buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% ethanol) til kolonnerne spin. Centrifugeres kolonner på 17,900 x g for 30 s ved 22 ° C.
Bemærk: Denne proces fjerner de forurenende stoffer fra PCR reaktionen nævnt ovenfor. - Kassér filtratet samles og centrifugeres de tomme kolonner på 17,900 x g i 1 minut ved 22 ° C.
Bemærk: Dette trin er at fjerne enhver resterende vask buffer, der kan forstyrre downstream applikationer. - Overføre spin kolonner til sterile 1,5 mL microcentrifuge rør. Tilføje 45 µL af eluering buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,5), og der inkuberes rør ved stuetemperatur i 5 min. Centrifuge kolonnerne spin på 17,900 x g i 1 minut ved 22 ° C.
- Bruge eluted DNA straks til trin 4 og 5 eller opbevares ved-20 ° C indtil klar til brug.
Bemærk: Amplikoner kan opbevares i op til et år ved-20 ° C. Det anbefales, at DNA opbevares ved-80 ° C, hvis langsigtede oplagring er nødvendig.
5. efterprøvning af svampe ITS forstærkning ved hjælp af Agarosen gelelektroforese
- Støbt en 1% Agarosen gel indeholdende 1 µg/mL ethidiumbromid. Opløse Agarosen i kogende 1 x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer. Når løsningen er afkølet til ca. 50 ° C, tilføje ethidiumbromid og hæld i gel stemmer.
- Når Agarosen gelen er størknet, fordybe gel i 1 x TAE og forberede amplikoner indlæses på gelen. 8 µL af amplificerede DNA, Føj 2 µL af 5 x loading bufferen.
Bemærk: Disse diskenheder kan justeres afhængigt af koncentrationen af ønskede loading bufferen. - Indlæse prøver, alle 10 µL på gelen sammen med en DNA ladder for størrelse reference. Kør gelen på 75 V (6 V/cm) for ca. 90 min. og visualisere bands, typisk ses mellem 750 og 1.000 basepar, ved hjælp af ultraviolet lys (Se figur 5).
6. sekvensering og analyse af svampe ITS regioner
- Sekvens udpakkede gDNA eller forstærket svampe ITS regioner og analysere sekvenser ved hjælp af aktuelle og relevante metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arter distribution i et miljø kan vurderes ved hjælp af relative forekomst af fastsættelsen af antallet af kloner af hver OTU identificeret i Luftprøver. Figur 6 er en krone diagram, der repræsenterer arternes taksonomisk placeret inden for en indendørs miljø efter 60 min i luften prøvetagning. Det kan konstateres, at miljøet indeholder en bred vifte af arter i to store svampe phyla, Sæksvampe og Basidiomycota, samt arter tilhører phylum Zygomycota (Rhizopus microsporus). Traditionelle metoder til vurdering er forudindtaget mod Sæksvampe arter, da mange Basidiomycota ikke bestemmelse eller kan ikke differentieres ved hjælp af mikroskopi-baserede metoder. Sekventering af svampe ITS regioner giver mulighed for påvisning af talrige svampe arter, specielt nogle Basidiomycota, der ofte går uopdaget. Analyse af dette miljø viser 68% af de svampe sekvenser identificeret tilhørte Basidiomycota med de fleste af dem placeret i rækkefølgen Polyporales.
Den taksonomiske data opnået ved sekventering-baserede tilgange kan bruges til at bestemme den taksonomiske mangfoldighed inden for et miljø. Mangfoldighed indekser, som dem præsenteret i tabel 1, bestemme, hvordan rige miljøet er, som beskriver antallet arter, der er identificeret i hver prøve, samt hvordan forskellige miljøet er, som tager hensyn til antallet af arter og overfloden af hver. Tabel 1 viser de Chao 1 rigdom indekser og Shannon diversitet indeks for to indendørs miljøer. Indeksene viser højere rigdom og mangfoldighed i airconditionerede miljøer i forhold til fordampning køler miljøer. Også inkluderet er Bray-Curtis forskellighed koefficienter. Disse beskriver hvordan ulige prøver inden for miljøet er med hensyn til de arter, der er identificeret inden for hver enkelt prøve. Prøver inden for begge de miljøer, der er beskrevet i tabel 1 er yderst ulige på 98% og 97% for air condition og fordampning køler miljøer, henholdsvis.
Figur 1: skematisk fremstilling af en tredelt filter kassette forsamling. Filter kassette består af tre stykker: en top eller cap stykke (fjorden), en forlængelse kåbe og en base stykke (outlet). En støtte pad og filter er placeret på den base stykke inddelte overflade. Udvidelse Røghætte er derefter forseglet på soklen ved hjælp af en manuel eller pneumatisk tryk. Til brug med NIOSH bioaerosol cyklon sampler, det øverste stykke er slap under prøvetagningen og derefter erstattes for opbevaring og transport. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk fremstilling af NIOSH bioaerosol cyklon sampler. NIOSH cyklon aerosol sampler samler luftbårne partikler ved at trække luft ind sampler gennem fjorden, og frembringe en cyklon, at indskud partikler på væggen af prøveglassene. Luften er først trukket ind i en 15 mL polypropylen tube, hvor store partikler (> 4 µm) indsamle på væggene i røret. Luft derefter strømmer ud af den første tube og er trukket ind i en 1,5 mL microcentrifuge tube, hvor mindre partikler (1 til 4 µm) indsamle. De resterende partikler (< 1 µm) indsamle på en PTFE filter som luften er trukket ud af sampler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: eksempel på en statisk sampler set-up. Billedet viser samplere konfigureret til statiske område prøveudtagning. NIOSH prøvetagere er sat op til indsamle 40 inches (102 cm) og 60 inches (152 cm) fra gulvet, der repræsenterer heights af en siddende og stående voksen, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: eksempel på en personlig sampler forsamling. Billedet illustrerer en NIOSH sampler båret på en rygsæk af en individuel. Parameteren sampler og magt er placeret på stropperne af pack mens prøvetagningspumpen ligger i rygsækken, selv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: eksempel på en Agarosen gel visualisere forstærkes dens DNA fra Luftprøver. Billedet viser DNA bands mellem 750 og 1.000 basepar. Disse bands repræsenterer forstærket svampe ITS områder fra udpakkede Luftprøver. Regionerne varierer i størrelse afhængigt af arter oprindelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: eksempel krone diagram præsenterer taksonomisk placeret svampe arter identificeret inden for en indendørs miljø. Krone diagram skildrer den relative forekomst af svampe arter fundet i 4 prøver indsamlet fra hjem efter en 60 min air stikprøveperioden med NIOSH bioaerosol cyklon sampler. 68% af de arter, der er identificeret, tilhører phylum Basidiomycota med den resterende tilhører Sæksvampe (33%) og Zygomycota (1%). De mest udbredte ITS-sekvenser i dette miljø tilhørte rækkefølgen Polyporales og blev identificeret som Phanerodontia chrysosporium og Gelatoporia dichroa. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Chao-1 rigdom | Shannon mangfoldighed | Bray-Curtis afstand | |
| middelværdi (min, max) | middelværdi (min, max) | middelværdi (min, max) | |
| Air condition (n = 9) | 33.86 (15,0, 102,0) | 1,39 (0,68, 2,51) | 0.9778 (0.8313, 1,00) |
| Fordampning køler (n = 10) | 25.46 (12,5, 49,5) | 1.10 (0,50, 1,72) | 0.9624 (0.3804, 1,00) |
Tabel 1: eksempeldata præsenterer mangfoldighed og arter rigdom indekser sammenligne indendørs miljøer. Tabellen viser Chao 1 rigdom indeks (antal arter pr. prøve), Shannon diversitet indeks (antal arter) og overflod af hver og Bray-Curtis forskellighed koefficienter (hvordan ulige arter distribution er mellem prøver på en skala fra 0 - 1). Disse data viser højere rigdom og mangfoldighed i airconditionerede miljøer og høj forskellighed blandt prøver i begge miljøer. Denne tabel er ændret fra citroner mfl. 10 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestemmelse af svampe mangfoldigheden inden for en erhvervsmæssig miljø ved hjælp af sekventering-baserede tilgange har forbedret svampe farevurderingen identifikation og eksponering. Ved hjælp af denne fremgangsmåde har tilladt til påvisning af mange yderligere svampe arter, der er ofte ikke registreret bruger kultur eller mikroskopi-baserede metoder til vurdering. En metode for prøveudtagning bioaerosols fra arbejdspladsen og indendørs miljøer og udvinding af genomisk DNA fra Luftprøver for dens forstærkning og sekventering præsenteres her. Bestemmelse af svampe mangfoldighed ved hjælp af disse metoder er meget afhængig: (1) vellykket og komplet udvinding af genomisk DNA fra luften prøver, (2) forstærkning af gDNA med primere, der giver mulighed for sammenligning af den forstærkede sin sekvenser til krænges sekvenser i de database og begrænse forstærkning bias, og (3) korrekt taksonomisk identifikation af sekvenser i databaserne.
Vellykket genomisk DNA-ekstraktion er afhængige af udvinding metoder og reagenser, der anvendes i en undersøgelse. Som det nævnes i protokollen, indsamle en masse af bioaerosols og andre biologiske og ikke-biologiske partikler indsamlet i tube faser af NIOSH to-trins cyklon sampler øverst i røret. Det er meget vigtigt at rør forsigtigt åbnes når du tilføjer lysisbuffer for ikke at miste nogen partikler og at de skal vortexed på en måde, der giver mulighed for alle partikler til at falde i lysisbuffer (højre side op og hovedet ned). Det er også vigtigt, at filteret er omhyggeligt håndteres ved hjælp af aseptisk metoder for ikke for at forstyrre nogen bioaerosols, der har indsamlet på overfladen før udvinding eller indføre kontaminerende DNA. Det er blevet påvist, at der er en stor mængde variation mellem mange af de kommercielt tilgængelige genomisk DNA udvinding kits15. Nogle ekstraktion procedurer bias mod specifikke svampe arter og resultere i varierende DNA udbytter20. Hvis DNA udbyttet efter ekstraktion er lav, kan højere PCR reaktion replikater udføres. Ikke kun gøre udvinding udbytter varierer, men mange af kits bidrage en betydelig mængde af mikrobielle DNA forurening. Derfor er det vigtigt at medtage ordentlig kontrol i hele proceduren for at identificere og fjerne potentielle reagens forureninger fra analysen.
DENS forstærkning er et kritisk skridt i protokollen. De anvendte udvinding metoder kan variere i deres evne til at fjerne PCR hæmmere fra de miljøprøver. Dette er især bekymrende med miljømæssige støv prøver21. PCR-amplifikation af prøver udvundet ved hjælp af den metode, der præsenteres her udstillet nogle PCR hæmning efter tilsætning af 10 mg støv15. Selvom PCR hæmning er af største bekymring i miljømæssig støv prøver, skal det stadig være en overvejelse, når forstærke DNA ekstraheret fra Luftprøver til bestemmelse af svampe mangfoldighed. PCR primer der anvendes i denne metode giver dækning af både dens 1 og dens 2 regioner. Dette giver mulighed for sammenligning på mange af de sekvenser, placeres i de rækkefølge databaser. Som med ekstraktionsmetode har mange forstærkning og primer bias været tidligere beskrevet22. Svampe genom størrelse og gen kopi antallet kunne også påvirke dens forstærkning23. Disse afvigelser burde tages i betragtning ved fortolkningen af de deraf følgende sekvens data. Taksonomisk identifikation af dets sekvenser er måske den mest kritiske komponent i denne metode. Det er vigtigt at holde identifikation kriterier konsekvent. Evnen til at identificere sin sekvenser er afhængige af de sekvenser, der er opsparet i databaserne. Mange sekvenser kan ikke identificeres til artsniveau. At have specifikke kriterier, når de foretager taksonomiske identifikationer baseret på krænges sekvenser, som procentdel identitet cutoffs, er kritisk for holde datasæt konsekvent fra undersøgelse til undersøgelse.
Sammenlignet med traditionelle vurdering tilgange, giver udvinding og sekventering svampe DNA fra erhvervsmæssig Luftprøver et mere komplet repræsentation af svampe mangfoldighed inden for et miljø. Ud over begrænsninger diskuteret ovenfor, skal det bemærkes, at resultaterne af disse typer af analyser er semi-kvantitative i modsætning til kultur, spore tæller eller kvantitativ PCR24 , der kan give kvantitative data. Sequencing data kan bruges til at bestemme relativ overflod pr. sample samt beregne svampe mangfoldighed målinger. Disse metoder kan bruges sammen med andre metoder, som qPCR, at få flere kvantificerbare data. De datasæt, der er oprettet ved hjælp af disse metoder kan bruges i arbejdsmedicinske undersøgelser for at få en bedre forståelse af svampe risici i specifikke faglige miljøer. Udvikle mere standardiseret tilgange til udvinding og primer udvalg er nødvendige for at bedre karakterisere og sammenligne sekventering-baserede undersøgelser af svampe mangfoldighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Resultaterne og konklusionerne i denne rapport er dem af forfatterne og nødvendigvis repræsenterer ikke den officielle holdning af det nationale Institut for arbejdsmiljø og sundhed, Centers for Disease Control og forebyggelse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet i en del af en tværinstitutionelle aftale mellem NIOSH og NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
