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Environment

수집 및 곰 팡이 DNA의 분석에 대 한 직업 공기 샘플 추출

doi: 10.3791/56730 Published: May 2, 2018

Summary

환경 내에서 곰 팡이 다양성을 결정 하는 것은 건강 위험을 식별 하기 위해 산업 보건 연구에 활용 방법입니다. 이 프로토콜 설명 증폭 및 곰 팡이 지역의 시퀀싱에 대 한 직업 공기 샘플에서 DNA를 추출을 합니다. 이 이렇게 많은 곰 팡이 종 전통적인 평가 방법에 의해 간과 수 있습니다 감지 합니다.

Abstract

문화와 현미경-기반 접근, 같은 직업 환경에서 곰 팡이 노출 식별의 전통적인 방법에는 많은 종류의 배제에 결과가 여러 제한이. 지난 2 년간 분야에서 발전 산업 보건 연구원 곰 팡이 위험 식별에 대 한 분자-기반 접근법을 주도 했습니다. 이러한 방법은 전통적인 방법을 사용 하 여 발견 되지 않은 실내 및 산업 환경에서 많은 종류의 탐지에서 이어지고 있다. 공기 내 곰 팡이 다양성을 결정 하기 위한 접근 게놈 DNA 추출, 증폭, 시퀀싱, 및 내부 곰 팡이의 분류학 식별을 통해 샘플이 프로토콜 세부 스페이서 (ITS) 영역을 복사할 수 있습니다. 많은 곰 팡이 종 하지 감지 또는 문화 또는 현미경을 사용 하 여 종 수준으로 식별 하기 어려운의 검출에는 시퀀싱 결과. 이러한 방법 곰 팡이 부담의 정량적 측정을 제공 하지 않습니다, 그러나 그들은 위험 식별에 대 한 새로운 접근을 제공 하 고 전체 종 부유 및 다양성 직업 환경 내에서 결정 하는 데 사용 수 있습니다.

Introduction

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아니라 알레르기, 천식1를 포함 하 여 호흡기 morbidities 실내 및 산업 환경에서 곰 팡이 노출 될 수 있습니다. 곰 팡이 위험 식별 위험을 평가 하 고 작업자 노출 방지를 위해 중요 하다. 이 곰 팡이 위험 실내 오염, 실외 공기 침입, 또는 노동자는 존재2영역으로 곰 팡이 자료의 전송에서 발생 하는 환경 장애의 결과 수 있습니다. 뿐만 아니라 곰 팡이 포자의 미세한 식별 가능한 문화 샘플링 방법 곰 팡이 노출 평가를 포함 했다. 이러한 접근 방법은 몇 가지 제한 있고 전반적으로 곰 팡이 부담3에 기여 될 수 있는 많은 곰 팡이 종 종종 간과. 문화 기반 접근만 영양소 미디어에 재배 될 수 그 가능한 곰 팡이 균을 차별화할 수 있습니다. 현미경을 통해 종 수준으로 곰 팡이 포자를 식별 유사한 형태학을 공유 하는 포자에 의해 혼동 될 수 있습니다. 두 방법 모두 매우 mycologists 분석 하 고 많은 나머지 미확인으로 균 종 확인에 의존 하고있다.

직업 위험 식별 및 노출 평가에 사용 되는 기존의 방법론에 따라 개선 하기 위해 많은 연구 자들은 분자 기반 기술에 아닙니다. 시퀀싱-기반 접근 실내 및 산업 환경에서 미생물 다양성을 평가 하기 위한 현미경 등 가능한 문화3,4 방법에 비해 곰 팡이 발생의 광범위 한 스펙트럼을 계시 했다 ,5. 여기에 제시 된 방법 직업 환경의 공기 샘플링 및 잠재적인 균 위험 식별에 대 한 게놈 DNA의 추출에 설명 합니다. 위험 식별 핵 ribosomal 내부 베낀된 스페이서 또는 ITS, 버섯 중 매우 다양 하 고 일반적으로 곰 팡이 종6,7, 차별화 하는 데 사용 영역을 시퀀싱에 의해 수행 됩니다. 8,9. 많은 종 문 Basidiomycota에 속하는 일부 수 종 식별 가능한 문화에서 하지와 같은 직업 설정에서 발견 하 고 현미경으로 구분 하기가 어렵습니다. 이러한 버섯 시퀀싱 곰 팡이 그 지역3,,410평가 및 직업 환경에서 높은 관계 되는 풍부에 관찰 되었습니다. 그것의 시퀀싱 실내 및 산업 환경에서 발생 하는 버섯의 다양성에 더 큰 지식을 제공 하고있다.

프로토콜 여기 세부 정보 수집, 추출, 시퀀스 분석 bioaerosols에서 곰 팡이 ITS 영역 증폭 하는 데 사용 되는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 공기에서 입자를 수집 직업 안전과 건강 (NIOSH) 2 단계 사이 클론 졸 샘플러의 국립 연구소를 활용 합니다. 이 샘플러 bioaerosols 그리고 분리 호흡 (≤4 µ m 공기 역학적 직경)를 수집 하기 위해 개발 되었습니다 및 비 호흡 (> 4 µ m 공기 역학적 직경) 대부분은 실내 환경에서 곰 팡이 생물의 식별을 위해 수 입자 작업자11에 의해 흡입 있을 것. 입자가 호흡 범위 내에서 수집 하는 능력을가지고 시장에 다른 공기 샘플러를 사이 클론 샘플러를 포함 하 여 사용할 수 있습니다 (< 4 µ m)12,13필터를 사용 하 여. 반면, NIOSH 2 단계 사이 클론 졸 샘플러 다운스트림 응용 프로그램14즉시 처리 될 수 있는 일회용, 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들의 공기 역학적 직경에 따라 균 종을 분리 합니다.

게놈 DNA를 추출 하 고 곰 팡이 ITS 영역 증폭의 프로세스가이 프로토콜에 자세히 나와 있습니다. 많은 상용 키트 포유류 세포, 박테리아, 또는 특히 효 모15를 대상으로 추출 방법론 제시에서 균 류, 박테리아, genomic DNA 추출 위해 특별히 개발 되었습니다. 이 연구에 사용 된 뇌관은 곰 팡이 1와 그것의 2 지역4,5의 그들의 전체 범위에 따라 선택 됩니다. 이 지역의 시퀀싱 수 있습니다 그들을 포함 하 여 많은 은행된 ITS 시퀀스의 비교에 대 한 시퀀스의 1 지역, 그것의 2 지역, 또는 그것의 1와 그것의 2 지역. 공기 샘플의 곰 팡이 다양성 Ascomycota 그리고 Basidiomycota는 문의에 배치 하는 시퀀스와 같은 덜 지배적인 균 phyla에 속하는 다른 시퀀스의 상당한 수를 공개 이러한 방법을 표시 됩니다를 사용 하는 실내 설정에서 수집 Zygomycota입니다. 이 접근을 사용 하 여 식별 하는 곰 팡이 시퀀스의 광범위 한 다양성 재배 또는 현미경 같은 전통적인 위험 식별 방법론을 사용 하 여 캡처되지 않습니다 것입니다. 곰 팡이 영역의 시퀀싱 곰 팡이 위험을 식별 하 고 실내 및 산업 균 노출의 더 나은 이해를 허용 하는 향상 된 방법을 제공 합니다.

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Protocol

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1. 준비 NIOSH 졸 샘플러

참고: NIOSH 졸 샘플러 bioaerosols 두 샘플링 튜브와 소계 (PTFE) 필터를 사용 하 여 수집 하는 2 단계 사이 클론 졸 샘플러가입니다.

  1. 어셈블리, 전에 조심 스럽게 샘플러를 검사 합니다. 그것을 보장 하기 위해 샘플러 손상 되지 않은, 장소 및 아늑한, 모든 나사가 및 경계선 주변 씰링 테이프는 2에 의해 형성 된 반쪽은 그대로. 샘플러 어떤 흠, 균열 또는 눈물 그리고 그것이 실리콘 그리스의 매우 가벼운 코팅 있지 않습니다 있도록 O-ring를 검사 합니다.
    참고: 샘플러는 폴리스 티 렌 또는 폴 리 프로필 렌 3 종 필터 카세트에서 37 m m 3 µ m PTFE 필터를 포함합니다.
    1. 기본 조각의 gridded 표면에 셀 루 로스 또는 플라스틱 필터 지원 패드 (필터 포함)을 배치 하 여 필터 카세트를 조립 ( 그림 1참조). 필터 집게를 사용 하 여 컬렉션 면이 필터 지원 패드 위에 필터를 넣어.
    2. 수동 또는 공 압 프레스를 사용 하 여 필터 카세트 인감. 손 폐쇄 공기 필터 주위 누출 하 수집 효율을 줄일 수 있습니다. 고리 모양의 조각 (확장 물통)를 삽입 하 고 언론을 사용 하 여 단단히 그리고 균등 하 게 그것을 밀어. 필터 주위 공기 누설 하지 않는 수 있도록 충분히 단단히 필터에 확장 물통 아래로 누릅니다.
      참고: 카세트의 상단 부분 샘플링 하는 동안 사용 되지 않습니다 하지만 샘플링 완료 되 면 필터를 저장 한다.
    3. 샘플러의 위에 조립된 카세트를 맞게 하 고 최대한 그것을 밀어. 외부 필터 카세트와 샘플러에에서 필터 카세트를 개최 하 고 누출을 방지 하기 위해 백업 인감 역할에 19mm (3/4 인치) 테이프의 조각을 래핑하십시오.
    4. 누수에 대 한 보조 인감 역할을 밖으로 바닥까지 샘플러 포장 바다 표범 어업 테이프 각 관 주위에 각 관을 단단히 하 고 완전히 나사.
      참고: 첫 번째 튜브, 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브의 공기 역학적 직경 비 호흡 입자를 수집 > 4 µ m. 두 번째 튜브 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 1 및 4 µ m 사이 호흡 입자를 수집합니다. 나머지 작은 입자, < 1 µ m, PTFE에 수집 되어 필터 ( 그림 2참조).
  2. 각 사용 하기 전에 보정 항아리와 NIOSH 샘플러를 통해 공기를 보정 필터 및 시료에서 차이 다를 공기를 발생할 것입니다.
    1. 교정 항아리를 사용 하려면 필터 카세트의 상단에 항아리의 루어 피팅 삽입, 샘플러, 항아리에 놓고 항아리를 밀봉 합니다.
    2. 샘플링 펌프 캘리브레이션 유량 계를 교정 항아리를 연결 합니다. 유량 계를 켜고 몇 분 동안 따뜻하게 수 있습니다. 참고 흐름 미터 항상 흐름 미터와 샘플러 오염 방지의 입구에 연결 된 필터를가지고 있어야 합니다.
    3. 샘플링 펌프를 켜고 따뜻하게 안정 하는 몇 분 동안 실행할 수 있도록.
    4. 조정 펌프 3.5 L/min에서 올바른 흐름 속도 설정 합니다.
      참고: NIOSH 졸 샘플러 유량 3.5 L/min 일반적으로 설정 됩니다. 이 흐름 속도, 샘플러 호흡 입자 샘플링16ACGIH/ISO 기준에 따릅니다. 다른 흐름 레이트 다른 잘라 크기는 원하는 또는 소음 수준을 줄일 수 있지만 유의 다른 흐름 율을 사용 하는 경우 다음 샘플러는 더 이상 준수 호흡 샘플링 기준 하는 경우 사용할 수 없습니다.
    5. 교정 끝나면 펌프와 유량을 끄십시오.

2. 정적 및 개인 졸 샘플링

  1. 어느 개인 또는 정적 영역 샘플링에 대 한 NIOSH 졸 샘플러를 설정 합니다.
    참고: 정적 샘플링은 삼각대 또는 다른 저장 장치에 연결 하는 동안에 어로 졸 샘플러를 사용 하 여 (그림 3참조), 개인 때 샘플링 대 샘플러와 펌프는 ( 그림 4참조) 공부 되 고 사람에 탑재.
    1. 정적 지역 샘플링에 대 한 계속 샘플러 특정 지역에 가능한 가깝게 공부 되 고. 공기 인 레트, 방 입구 및 공기 흐름의 경로에 있을 수 있는 장소에서 시료를 유지.
      참고: 졸 농도가 달라질 수 있습니다 상당히 짧은 거리에도 졸 소스 방17에 있는 경우에 특히.
    2. 개인 샘플링에 대 한 사용자의 호흡 영역 내 샘플러를 설정 합니다. 옷 깃, 어깨 또는 가슴, 샘플러를 부착 하 고 허리에서 또는 가방에 샘플링 펌프를 놓습니다.
      참고: 호흡 영역은 주변 사람의 코는 대부분 공기의 흡입17동안 그려집니다 30 cm 반구로 일반적으로 간주 됩니다.
  2. 튜브 샘플러 샘플러 후미의 잘 분명 하다 고 아무것도 방해 인 레트는 또는 샘플러에 공기 흐름에 방해가 있는지 확인 합니다. 튜브 샘플러 슬쩍 하거나 눌릴 해야 합니다 하지. 어떤 막힘 펌프를 중지 하면 됩니다.
  3. 펌프를 켭니다. 2 분 후 펌프 실행 중인 경우 확인 합니다.
    참고: 행위 환경10,,1819에 따라 전체 8 h 작업 교대 10 분 만큼 적은에서 배열 하는 기간에 대 한 샘플링 공기. 그림 6 에 제시 하는 결과 실내 환경에서 60 분 샘플링 기간의 대표.
  4. 공기 샘플링 완료 샘플 튜브와 필터를 수집 합니다. 봉인 테이프를 제거 하 고 나사 튜브, 그들 모자. 장소 필터에 필터 카세트의 세 번째 작품. 처리를 위해 준비 될 때까지 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

3. 공기 샘플에서 게놈 DNA 추출

  1. NIOSH BC251 샘플러의 각 단계에서 게놈 DNA (gDNA)를 추출 합니다. 샘플링 컬렉션 튜브 공기를 처리 하 고 샘플에서 호흡 및 호흡 비 미생물 졸의 결정에 대 한 수 있도록 별도로 필터링.
    참고: 또는, 3 단계 수 수 결합 하 고 샘플 inoculum 너무 작으면 추출.
    1. 클래스 II 생물 안전 캐비닛 또는 층 흐름 클린 벤치, aseptically 필터를 제거 합니다. 70% 에탄올과 지레 샘플링 카세트 카세트 오프닝 도구를 사용 하 여 열을 사용 하 여 샘플링 카세트를 닦아냅니다. 필터 기중 장치를 사용 하 여 필터 및 지원 패드를 위쪽으로 밀어. 잡고 집게를 필터를 사용 하 여 필터 멸 균 페 트리 접시에 놓습니다. 6 동일한 조각으로 필터를 잘라내어 300 mg 유리 구슬 (0.2-0.5 m m)를 포함 하는 강화 2 mL 튜브에 넣어.
    2. 30에 대 한 액체 질소에 필터를 포함 하는 튜브를 놓고 s 고 즉시에 4.5 m/s 30 설정 비드 밀 균질 화기 s.
    3. 반복 단계 3.1.2 번 필터 났습니다. 그대로 필터의 작은 조각에 남아 있을 수 있습니다. 세포의 용 해 버퍼 (4 M 요소, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), pH 7.4) 0.5 mL를 추가 합니다.
    4. 15 mL와 1.5 mL 공기 샘플러 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 0.3 mL를 추가 합니다. 와 10-15에 대 한 관 동 직 립 하면서 s와 다른 10-15 s 반전. 300 mg 유리 구슬을 포함 하는 강화 2 mL 튜브 각 튜브의 내용을 전송.
      참고: 각 샘플러 튜브에 수집 된 자료의 대부분은 튜브의 상단 부근에 축적 됩니다.
    5. 모든 튜브 비드 밀 균질 화기 4.5 m/s로 30 s와 원심 분리기에서에서 처리 그들 20000 x g 22 ° c.에 1 분에서 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브 supernatants 전송 및 22 ° c.에 1 분 동안 다시 20000 x g에서 튜브 원심 이 단계를 반복 합니다.
  2. 30 µ L 세포 시 약의 추가 ( 재료의 표참조) 각 튜브와 튜브 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
  3. 바인딩 버퍼 (10 M 요소, 6 M guanidine-HCl, 10 mM Tris HCl, 20% 트라이 톤 X-100, pH 4.4)의 0.2 mL를 추가 하 고 성분을 K (100 µ g/mL) 각 튜브와 튜브 각 튜브에 소 프로 파 놀의 10 분 추가 100 µ L 70 ° C에서 품 어.
  4. 유리 섬유 필터 튜브 (700 µ L 용량) 2 mL 컬렉션 튜브에 배치 추출 솔루션을 전송 하 고 20000 x g 30에 컬렉션 튜브 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소.
  5. 각 튜브를 억제제 제거 버퍼 (5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris HCl, pH 6.6, 38% 에탄올) 0.5 mL를 추가 하 고 컬렉션 튜브 30 20000 x g에서 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소.
  6. 각 튜브를 워시 버퍼 (20 m m NaCl, 2 mM Tris HCl, pH 7.5, 80% 에탄올) 0.5 mL를 추가 하 고 컬렉션 튜브 30 20000 x g에서 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소. 이 프로세스를 반복 합니다.
  7. 모든 잔여 워시 버퍼를 제거 하려면 22 ° C에 추가 1 분에 대 한 20000 x g에서 컬렉션 튜브 원심 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 컬렉션 튜브 필터 튜브를 배치.
  8. 추가 100 µ L를 각 튜브 (≥70 ° C) 차입 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 8.5) 따뜻하고 컬렉션 튜브 20000 x g 30에 1-2 분 원심 분리기에 대 한 실내 온도에 그들을 품 어 22 ° c.에 s Microcentrifuge 살 균 1.5 mL 튜브에 빈 필터 튜브를 전송 하 고 다시 단계 3.8에서에서 있다를 적용 합니다. 20000 x g 30에 1-2 분 원심 분리기에 대 한 실 온에서 품 어 22 ° c.에 s
    참고: 있다 사용할 수 있습니다 즉시 단계 4 또는 사용할 준비가 될 때까지-20 ° C에서 저장에 대 한. Genomic DNA에 저장 될 수 있다-20 ° c.에서 1 년까지 장기 보관이 필요한 경우 DNA-80 ° C에 저장 되는 것이 좋습니다.

4입니다. 곰 팡이 ribosomal DNA의 증폭

  1. 보편적인 곰 팡이 프라이 머를 사용 하 여 그것의 지구 1와 2에서 추출한 gDNA 증폭.
    참고:이 프로토콜에 대 한 뇌관 쌍 Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')는 지역4,5의 가장 큰 범위를 제공 하는 데 사용 됩니다. 혼자 ITS1 또는 ITS2 영역을 증폭 하는 다른 뇌관 세트를 사용할 수 있습니다.
    1. 살 균 0.5 mL PCR 튜브 또는 96-잘 PCR 접시 triplicate 50 µ L 반응에서 각 샘플에 대 한 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 다음과 같이 설정: 5 µ L (3 단계)에서 추출 된 템플릿 DNA의 PCR 학년 물의 33.3 µ L, 10 x PCR 버퍼의 5 µ L 50 mM MgCl2의 1.5 µ L, 10 m m 2'-deoxynucleoside 5'-된의 1 µ L, 20 µ M Fun18Sf 앞으로 뇌관의 0.5 µ L, 20 µ M ITS4R 역 뇌관의 0.5 µ L 및 Taq DNA 중 합 효소의 0.2 µ L.
    2. 반응 열 cycler에서 수행: 3 분;에 대 한 95 ° C에서 변성 변성의 6 주기 (96 ° C, 30 s) 어 닐 링 (50 ° C, 45 s) 및 뇌관 연장 (72 ° C, 3 분); 변성의 20 주기 (96 ° C, 30 s), 어 닐 링 (50 ° C, 45 s), 및 뇌관 연장 (72 ° C, 1 분); 그리고 10 분을 위한 72 ° C에 뇌관 연장 다음 단계까지 4 ° C에서 반응 혼합물을 유지.
  2. 결합 triplicate PCR 반응 실리 카 멤브레인 기반 정화 키트를 사용 하 여 정화.
    참고:이 절차는 PCR 구성 요소 (프라이 머, dNTPs, 효소, 소금, ) 및 증폭 된 DNA 준비에서 다른 오염 물질의 제거에 대 한 수 있습니다.
    1. 각 샘플 (총 150 µ L) 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 대 한 세 가지 반응 결합. 5 배 볼륨 (750 µ L)에서 바인딩 버퍼 (5 M guanidine-HCl, 30% 소 프로 파 놀)을 추가 하 고 10 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 혼합.
    2. 열 컬렉션 튜브에 배치 스핀 하 원심 17,900 x g에서 튜브 30 s. 삭제는 filtrates 혼합물의 450 µ L를 추가 합니다. 열에 나머지 450 µ L을 추가 하 고 30 17,900 x g에서 원심 22 ° c.에 s
      참고: 스핀 열 열에 DNA의 흡착에 대 한 허용 하는 실리 카 멤브레인을 포함 됩니다.
    3. filtrates을 삭제 하 고 스핀 열에 750 µ L 세척 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 80% 에탄올)를 추가 합니다. 원심 17,900 x g 30에 열 22 ° c.에 s
      참고:이 과정은 위에서 언급 한 PCR 반응에서 오염 물질을 제거 합니다.
    4. 여과 액을 폐기 하 고 원심 17,900 x g 22 ° c.에 1 분 동안에 빈 열
      참고:이 단계는 모든 잔여 세척 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 수 있는 버퍼를 제거 하는.
    5. 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 회전 열을 전송 합니다. 차입 버퍼 (10 mM Tris Cl, pH 8.5)의 45 µ L을 추가 하 고 5 분 원심 분리기에 대 한 실 온에서 튜브 17,900 x g 22 ° c.에 1 분 동안에 스핀 열을 품 어
    6. 단계 4와 5 단계 eluted DNA를 즉시 사용 하는 방법 또는 사용에 대 한 준비까지-20 ° C에서 저장.
      참고:는 amplicons 저장할 수 있습니다-20 ° c.에서 1 년까지 장기 보관이 필요한 경우 DNA-80 ° C에 저장 되는 것이 좋습니다.

5. 곰 팡이 증폭 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 확인

  1. 캐스트는 1 %agarose 젤 포함 1 µ g/mL ethidium 평범한 사람. 분해 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼 x 1을 끓는 agarose. 솔루션이 약 50 ° C에 냉각 하 고, 일단 ethidium 평범한 사람을 추가 하 고 주조 하는 젤으로 부 어.
  2. Agarose 젤은 경화 후 담가 1에서 젤 x TAE 젤에 적재 될 amplicons 준비. 증폭 된 DNA의 8 µ L, 버퍼 로드 x 5의 2 µ L 추가 합니다.
    참고: 이러한 볼륨 원하는 로딩 버퍼의 농도 따라 조정할 수 있습니다.
  3. 샘플, 크기 기준에 대 한 DNA 사다리와 함께 젤에 모든 10 µ L을 로드 합니다. 75 V에서 젤을 실행 (6 V/cm) 대략 90 분 및 밴드, 일반적으로 750 사이 본을 시각화 하 고 자외선을 사용 하 여 1, 000의 기본적인 쌍 라이트 ( 그림 5참조).

6. 시퀀싱 및 곰 팡이 영역의 분석

  1. Sequence gDNA 추출된 또는 곰 팡이 ITS 영역 증폭된 하 고 현재 하 고 적절 한 방법을 사용 하 여 시퀀스 분석.

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Representative Results

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종 배포 환경 내에서 관계 되는 풍부의 공기 샘플에서 확인 된 각 OTU 클론의 수를 결정 하 여 평가 될 수 있습니다. 그림 6 는 공기 샘플링의 60 분에 따라 실내 환경 내에서 배치 taxonomically 종 대표 크로나 차트입니다. 그것은 종 문 Zygomycota (Rhizopus microsporus)에 속하는 두 개의 주요 곰 팡이 문의 Ascomycota Basidiomycota, 내 종의 다양 한 환경에 포함 되어 있음을 관찰할 수 있습니다. 평가의 전통적인 방법으로 많은 Basidiomycota culturable 또는 현미경 기반 방법을 사용 하 여 분화 될 수 없다 Ascomycota 종으로 바이어스는. 곰 팡이 지역의 시퀀싱 수많은 균 종, 특히 일부 Basidiomycota, 자주 들 키 지 않고가 감지 할 수 있습니다. 이 환경의 분석 확인 곰 팡이 시퀀스의 68% 소유는 Basidiomycota 순서 Polyporales에 그들의 대부분과 함께 보여줍니다.

시퀀싱-기반 접근을 사용 하 여 얻은 분류학 데이터 환경 내에서 분류학 다양성을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 표 1에 제시 등 다양성 지표 결정 뿐만 아니라 얼마나 다양 한 환경입니다, 종 수와 풍요의 계정에 소요 얼마나 부자 환경 이다는 각 샘플에서 확인 된 종의 수에 설명 합니다. 각. 표 1 두 개의 실내 환경에 대 한 다양성 인덱스 차오 1 풍부한 인덱스와 섀 넌 보여준다. 인덱스가 더 높은 풍부 함과 다양성 증발 냉각기 환경에 비해 에어컨된 환경에서 나타냅니다. 브 레이 커티스 비슷하지 계수는 또한 포함 됩니다. 이러한 환경 내에서 지정 샘플 설명 각 샘플 내에서 확인 된 종에 관한 있습니다. 두 표 1에 설명 된 환경 내에서 샘플은 각각 98%, 97% 에어컨 및 증발 냉각기 환경에 매우 비슷하지.

Figure 1
그림 1: 3 종 필터 카세트 어셈블리의 도식 대표. 필터 카세트 3 개 구성: 상단 또는 모자 조각 (입구), 확장 물통 및 기본 조각 (콘센트). 지원 패드 및 필터 기본 조각의 gridded 표면에 배치 됩니다. 확장 물통 다음 수동 또는 공 압 프레스를 사용 하 여 자료에 밀봉 된다. NIOSH bioaerosol 사이 클론 샘플러와 함께 사용 하기 위해 상단 부분 샘플링 동안 중단 하 고 저장과 수송에 대 한 대체 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: NIOSH bioaerosol 사이 클론 샘플러의 도식 대표. NIOSH 사이 클론 졸 샘플러는 입구를 통해 샘플러에 공기 샘플 튜브의 벽에 입자를 예금 하는 사이 클론을 생산 여 공중 미 립 자를 수집 합니다. 어디 큰 공기 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 먼저 그려진 입자 (> 4 µ m) 튜브의 벽에 수집. 다음 첫 번째 튜브 흐르는 공기와 그려집니다 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 작은 입자 (1 ~ 4 µ m) 수집. 나머지 입자 (< 1 µ m) 수집 PTFE 필터에 공기 견본집에서 그려집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 정적 샘플러 설정의 예. 이미지 정적 영역 샘플링에 대 한 설정 하는 샘플을 보여 줍니다. NIOSH 샘플러 설정 됩니다 수집 40 인치 (102 cm) 및 60 인치 (152cm) 바닥에서 앉아와 서 성인의 높이 각각 나타내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 개인 샘플러 어셈블리의 예. 이미지는 개인 배낭에 착용 NIOSH 샘플러를 보여 줍니다. 샘플러와 전원 스위치는 샘플링 펌프 자체 배낭 내에 있는 동안 팩의 결박에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 예제는 agarose 젤 시각화의 공기 견본에서 그것의 DNA 증폭. 이미지는 750 / 1000 기본 쌍 사이의 DNA 밴드를 보여줍니다. 이러한 밴드 추출된 공기 샘플에서 증폭 된 곰 팡이 영역을 나타냅니다. 그것의 지역 종 기원에 따라서 크기에서 변화 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 실내 환경 내에서 식별 하는 곰 팡이 종 배치 taxonomically 예제 크로나 차트 제시. 크로나 차트 NIOSH bioaerosol 사이 클론 샘플러와 함께 60 분 공기 샘플링 기간 뒤 가정에서 수집 된 4 샘플에서 발견 하는 균 종의 관계 되는 풍부를 보여준다. 종 확인의 68% 나머지 속하는 Ascomycota (33%)와 Zygomycota (1%)와 문 Basidiomycota에 속한다. 이 환경에서 가장 풍부한 ITS 시퀀스 순서 Polyporales에 속한 고 Phanerodontia chrysosporium Gelatoporia dichroa로 확인 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

차오 1 풍부 섀 넌 다양성 브 레이 커티스 거리
(최소, 최대)를 의미 (최소, 최대)를 의미 (최소, 최대)를 의미
에 어 컨디셔너 (n = 9) (15.0, 102.0) 33.86 1.39 (0.68, 2.51) 0.9778 (0.8313, 1.00)
증발 냉각기 (n = 10) 25.46 (12.5, 49.5) 1.10 (0.50, 1.72) 0.9624 (0.3804, 1.00)

표 1: 예제 데이터 제시 다양성 및 종 부유 인덱스 실내 환경 비교. 차오 1 풍부한 인덱스 (샘플 당 종의 수), 논 다양성 지 수 (종 수)과 각각의 풍요로 움 그리고 브 레이 커티스 비슷하지 계수 표 (지정 종 분포는 0-규모 샘플 사이 1). 이러한 데이터 더 높은 풍부 함과 다양성 공기 환경 및 두 환경 모두에서 샘플 중 높은 호환성을 보여 줍니다. 이 테이블은 레몬 에서 수정 되었습니다. 화학의 왕 사회 허가 10 .

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Discussion

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시퀀싱 기반 방법을 사용 하 여 직업 환경 내에서 곰 팡이 다양성을 결정 하는 것은 곰 팡이 위험 식별 및 노출 평가 개선 했다. 이 방법을 사용 하는 많은 종의 추가 곰 팡이 종종 문화 또는 평가의 현미경-기반 메서드를 사용 하 여 검색 검색에 대 한 허용 했다. 직업 및 실내 환경 및 그것의 증폭 및 시퀀싱에 대 한 공기 샘플에서 게놈 DNA 추출에서 bioaerosols 샘플링 하는 방법은 여기에 제공 됩니다. 이러한 방법을 사용 하 여 곰 팡이 다양성의 결정은 높게에 지: (1) 성공 하 고 완전 한 genomic DNA에서에서 추출 공기 샘플링, 틀에 그 시퀀스는 증폭의 비교에 대 한 허용 하는 뇌관으로 gDNA의 확대 (2) 데이터베이스 및 한도 확대 편견, 및 (3) 올바른 분류학 식별 데이터베이스 내에서 시퀀스의 시퀀스입니다.

게놈 DNA 추출은 추출 방법론 및 연구에 사용 하는 시 약에 의존. 프로토콜에 언급은 튜브의 상단에 있는 bioaerosols 그리고 다른 생물과 비 생물 입자 NIOSH 2 단계 사이 클론 샘플러의 관 단계에서 수집 된의 많은 수집 합니다. 튜브 잃을 모든 입자를 세포의 용 해 버퍼를 추가 하는 경우에 신중 하 게 열 수 및 그들은 세포의 용 해 버퍼 (오른쪽 고 거꾸로 다운)으로을에 모든 미 립 자에 대 한 허용 하는 방식으로 vortexed 될 매우 중요 하다. 그것은 또한 필터 신중 하 게 될 중요 한 이전 추출 표면에 수집 하거나 오염 DNA 소개 bioaerosols 중단을 무 균 메서드를 사용 하 여 처리. 그것은 상업적으로 사용 가능한 게놈 DNA 추출 키트15의 많은 사이 변이의 다량은 입증 되었습니다. 특정 균 종 및 결과 다양 한 DNA에 일부 추출 절차 바이어스20을생성합니다. 다음 추출 DNA 수율 낮은 경우 높은 PCR 반응 복제를 수행할 수 있습니다. 뿐만 아니라 추출 수율 변화, 그러나 많은 키트의 상당한 양의 미생물 DNA 오염 기여. 이러한 이유로, 그것은 식별 하 고 분석에서 잠재적인 시 오염 물질을 제거 하는 절차를 통해 적절 한 컨트롤을 포함 하는 것이 중요.

그 증폭 프로토콜의 또 다른 중요 한 단계입니다. 사용 하는 추출 방법론 환경 샘플에서 PCR 억제제를 제거 하는 그들의 기능에서 달라질 수 있습니다. 이것은 특히 환경 먼지 샘플21염려 이다. 여기에 제시 된 방법을 사용 하 여 추출 하는 샘플의 PCR 증폭 먼지15의 10 밀리 그램의 추가 후 일부 PCR 저해 전시. PCR 저해 환경 먼지 샘플의 가장 큰 관심사의 이더라도, 곰 팡이 다양성을 결정 하기 위한 공기 샘플에서 추출한 DNA를 증폭 하는 때 아직도 고려 되어야 합니다. 이 방법에 사용 된 설정 PCR 뇌관의 1와 그것의 2 지역 범위를 제공 합니다. 시퀀스 시퀀스 데이터베이스에 배치의 많은 비교 가능 합니다. 추출 프로시저와 마찬가지로 많은 증폭 및 뇌관 편견 이전 기술된22되었습니다. 균 게놈 크기와 유전자 복사 번호를의 증폭23에 또한 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 편견 결과 시퀀스 데이터를 해석할 때 고려 사항으로 취해야 한다. 그 시퀀스의 분류학 식별 아마도이 방법의 가장 중요 한 구성 요소입니다. 그것은 식별 기준 일관성을 유지 해야 합니다. 해당 시퀀스를 식별 하는 기능 데이터베이스에 틀 시퀀스에 따라 달라 집니다. 많은 시퀀스 종 수준으로 확인 될 수 없습니다. 때 분류학 식별 비율 정체성 차단 같은 은행된 시퀀스에 따라 특정 기준을 갖는 것은 일관 된 연구에서 연구 데이터 집합 유지 중요 합니다.

전통적인 평가 방식에 비해, 추출 및 직업 공기 샘플에서 곰 팡이 DNA 시퀀싱 환경 내에서 곰 팡이 다양성의 더 완전 한 표현을 수 있습니다. 위에서 설명한 제한 이외에 그것은 이러한 유형의 분석의 결과 반 문화, 포자 수, 또는 양이 많은 PCR24 양적 데이터를 얻을 수 있습니다 달리 양적 주목 해야 합니다. 샘플 당 관계 되는 풍부를 결정 하 고 곰 팡이 다양성 통계 계산 시퀀싱 데이터를 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 함께에서 정량, 같은 다른 방법으로 더 많은 정량 데이터를 사용할 수 있습니다. 이러한 방법을 사용 하 여 만든 데이터 집합 특정 직업 환경에서 곰 팡이 위험의 더 나은 이해를 얻기 위해 산업 보건 연구에 사용할 수 있습니다. 더 표준화 된 추출 및 뇌관 선택의 접근은 더 나은 특성 및 곰 팡이 다양성의 시퀀싱 기반 연구를 비교 하는 데 필요한 개발.

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Disclosures

결과 및 결론은이 보고서에는 작가 이며 반드시 질병 관리 및 예방에 대 한 직업 안전 및 건강, 센터에 대 한 국립 연구소의 공식적인 위치를 대표 하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 NIOSH와 NIEHS (AES12007001-1-0-6) 사이 부처간의 합의 의해 부분에서 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler NIOSH BC251 The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-373 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096 15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width McMaster-Carr 76505A1 sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm SKC Inc. 225-3LF 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm EMD Millipore FSLW03700 Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps Fisher Scientific 09-753-50 filter forceps
Model 502 Precision PanaPress PanaVise 502 pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape McMaster-Carr 76455A21 19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large SKC Inc. 225-112 calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump SKC Inc. 224-PCXR4 sampling pump
Mass Flowmeter 4140 TSI Inc. 4140 flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit Roche Diagnostics 11796828001 Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps Fisher Scientific 15340162 2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm Sigma-Aldrich G1277 glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163 bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X Sigma-Aldrich C8740 lysis reagent
Platinum Taq polymerase Invitrogen 10966-018 Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix Invitrogen 18427-088 10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo Fisher B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder Thermo Fisher 10488-085 DNA ladder

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References

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수집 및 곰 팡이 DNA의 분석에 대 한 직업 공기 샘플 추출
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Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).More

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).

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