Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Toplama ve mesleki hava örnekleri çıkarma mantar DNA analizi için

doi: 10.3791/56730 Published: May 2, 2018

Summary

Bir ortam içerisinde mantar çeşitlilik belirleme iş sağlığı çalışmalarda sağlık tehlikeleri tanımlamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı DNA çekme--dan amplifikasyon ve sıralamanın mantar Its bölgeler için mesleki hava örnekleri açıklar. Bu yaklaşım geleneksel değerlendirme yöntemleri tarafından göz ardı edilebilir birçok mantar türleri algılar.

Abstract

Kültür ve mikroskopi tabanlı yaklaşımlar gibi mesleki ortamlarda mantar Etkilenmeler tanımlama geleneksel yöntemleri birçok türü dışlanması sonuçlandı çeşitli kısıtlamalar bulunmaktadır. Son yirmi yılda alanındaki gelişmeler iş sağlığı araştırmacılar mantar tehlikeleri tanımlamak için moleküler tabanlı yaklaşımlara açmak için açmıştır. Bu yöntemler geleneksel yöntemlerle tespit değil kapalı ve mesleki ortamlarda birçok türün algılama sonuçlandı. Genomik DNA ekstraksiyon, güçlendirme, sıralama ve taksonomik tanımlaması mantar iç hava içinde mantar çeşitlilik belirlemek için bir yaklaşım örnekleri bu protocol detayları Rondela (ITS) bölgeleri transkripsiyonu. Sıralama sonuçları algılanan veya kültür veya mikroskobu kullanarak tür seviyeye tespit etmek zordur birçok mantar türünün bulunması. Bu yöntemler mantar yükünün nicel ölçüleri sağlamak değil, onlar tehlike tanımlama için yeni bir yaklaşım sunuyoruz ve Genel türler zenginliği ve çeşitlilik mesleki bir ortam içerisinde belirlemek için kullanılan.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kapalı ve mesleki ortamlarda mantar Etkilenmeler Alerjik Sensitizasyonu ve astım1gibi solunum morbiditeler içinde sonuçlanabilir. Mantar tehlikeleri tanımlaması risk değerlendirilmesi ve işçi pozlama önlenmesi için önemlidir. Bu mantar tehlikeler kapalı kirlenme, açık hava saldırı veya mantar malzemeleri nakliyesi işçilerin mevcut2nerede alanlara neden çevre bozuklukları sonucu olabilir. Mantar değerlendirmek için yöntemler mikroskobik mantar sporları tanımlaması yanı sıra uygun kültür örnekleme dahil ettik. Bu yaklaşımlar çeşitli sınırlama vardır ve sık sık gözden kaçırmak için genel olarak mantar yük3katkıda birçok mantar türü. Kültür tabanlı yaklaşımlar sadece besin medyada ekili uygun bu mantar organizmalar ayırt edebilir. Mantar sporları türler düzeye mikroskobu ile tanımlayan benzer türleri Morfoloji paylaşımı sporlar tarafından şaşırmış. Her iki yöntem son derece analiz ve birçok kalan tanımlanamayan mantar türleri, belirlemek için mycologists bağlı.

Mesleki tehlike tanımlama ve pozlama Değerlendirmeler kullanılan mevcut metodolojiler üzerine geliştirmek için pek çok araştırmacı moleküler tabanlı teknolojileri kapatmış. Mikrobiyal çeşitlilik kapalı ve mesleki ortamlarda değerlendirmek için yaklaşımlar dayandırılmış mikroskobu ve uygun kültür3,4 gibi yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha geniş bir spektrum karşılaştı mantar türlerinin ortaya koymuştur ,5. Burada sunulan yöntem iş ortamları hava örnekleme ve potansiyel mantar tehlikeleri tanımlanması için genomik DNA ekstraksiyon açıklar. Tehlike tanımlama nükleer ribozomal iç kopya etmek rondela veya Its, mantarlar arasında değişkendir ve sık mantar türleri6,7ayırt etmek için kullanılmış olan bölgelerin sıralama tarafından gerçekleştirilir, 8,9. Birçok canlı türünün uygun kültür olarak tanımlanabilir Bazidyumlu mantarlar, türe ait bazı türler değildir gibi mesleki ayarlarında buldum ve mikroskobik ayırt etmek zordur. Bu mantarlar sıralama mantar Its bölgeleri3,4,10tarafından değerlendirildi kapalı ve mesleki ortamlarda yüksek göreli bolca gözlenmiştir. KENDİ sıralama içine kapalı ve mesleki ortamlar içinde karşılaşılan mantarlar çeşitliliği daha fazla bilgi sağlamıştır.

Protokol yöntemleri toplamak, hulâsa ve bioaerosols dizi analizi için mantar Its bölgelerden yükseltmek için kullanılan ayrıntılarını tanımlamak burada. Bu yaklaşım hava parçacıkları toplamak mesleki güvenlik ve Sağlık (NIOSH) iki aşamalı Siklon sprey örnekleyici Ulusal Enstitüsü kullanır. Bu örneği bioaerosols ve ayrı solunabilir (≤4 µm aerodinamik çapı) toplamak için geliştirilmiştir ve solunabilir sigara (> 4 µm aerodinamik çapı) çoğu kapalı ortamlarda mantar organizmalar tanımlanması için sağlar parçacıklar işçi11tarafından inhale muhtemeldir. Siklon numune, dahil olmak üzere diğer hava numune parçacıklar solunabilir Aralık içinde toplamak için yeteneği var piyasada bulunan (< 4 µm) kullanarak filtre12,13. Buna ek olarak, NIOSH iki aşamalı Siklon sprey örnekleyici mantar türleri içine aşağı akım uygulamaları14için hemen işlenebilir tek kullanımlık, polipropilen borular üzerinde aerodinamik kendi çapı göre ayırır.

Genomik DNA ayıklanması ve mantar Its bölgeleri yükseltecek işlemlere bu protokol için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Memeli hücre, bakteri veya özellikle Mayalar15birçok ticari kitleri hedef olarak sunulan çıkarma yöntemleri mantar ve bakteri, genomik DNA'ın çıkarılması için özel olarak geliştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan astar mantar onun 1 ve onun 2 bölgeleri4,5genel onların kapsama göre seçilir. Bu bölgelerin sıralama çok banked ITS dizileri de dahil olmak üzere, karşılaştırma için o dizi onun 1 bölge, onun 2 bölge veya onun 1 ve onun 2 bölgeleri sağlar. Hava örnekleri mantar çeşitliliği bir kapalı ayarı bu yöntemleri gösterilir, Ascomycota ve Bazidyumlu mantarlar kültürlenebilen yerleştirilen dizileri yanı sıra diğer serileri gibi daha az baskın mantar kültürlenebilen için ait önemli sayıda açığa kullanarak toplanan Zygomycota. Bu yaklaşımı kullanarak tanımlanan mantar sıralarının geniş çeşitlilik ekimi veya mikroskobu gibi geleneksel tehlike tanımlama yöntemlerini kullanarak esir edilemeyen değil. Mantar Its bölgelerin sıralama mantar tehlikeleri tanımlamak ve daha iyi kapalı ve mesleki mantar pozlama anlamak için izin vermek için gelişmiş bir yöntem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. hazırlanması NIOSH aerosol örnekleyici

Not: NIOSH aerosol örnekleyici iki aşamalı Siklon sprey örnekleyiciyi iki örnekleme tüp ve politetrafloroetilin (PTFE) filtresi kullanarak bioaerosols toplar var.

  1. Montaj önce örnekleyiciyi dikkatle inceleyin. Emin olmak için örnekleyici zarar görmediğinden, yer ve rahat olarak tüm vidaları vardır ve sızdırmazlık bandı dikiş çevresinde oluşan iki tarafından kontrol yarıyı da olduğu gibi. Örnekleyici O-ring herhangi bir rumuz, çatlak ya da gözyaşı ve silikon yağı ile çok hafif bir kaplama vardır yok emin olmak için kontrol edin.
    Not: Sampler polistiren veya polipropilen üç parçalı filtre kaset 37 mm 3 µm PTFE filtre içerir.
    1. Selüloz veya plastik filtre destek yastığı (ile filtreler dahil) temel parça gridded yüzeye yerleştirerek filtre kaset montajı (bkz. şekil 1). Filtresini pensler toplama yüzü yukarı bakacak şekilde filtre filtre destek yastık üstüne koymak için kullanın.
    2. El ile veya pnömatik basın kullanarak filtre kaset kapatın. El kapatma hava filtresi kaçak ve toplama etkinliğini azaltmak izin verir. Halka şeklinde parça (uzantısı baca şapkası) ekleyin ve basın sıkı ve eşit olarak aşağı doğru itin. Uzantısı baca şapkası filtre üzerine yeterince sıkı hava filtresi kaçak değil emin olmak için bastırın.
      Not: Kaset top parçası örnekleme sırasında kullanılan ancak örnekleme işlemi tamamlandıktan sonra filtre kapağı için kaydedilmesi gerekir.
    3. Örnekleyiciyi üst üzerine monte kaset uygun ve mümkün olduğunca aşağı doğru itin. 19 mm (3/4 inç) bant filtre kaset ve örnekleyici filtre kaset tutmak için ve sızıntıları önlemek için yedek bir mühür çalışacak şekilde dış çevresindeki bir parçası sarın.
    4. Her tüp sıkıca ve tam olarak bu diplerinde kadar örnekleyici ve sızdırmazlık bandı her tüpün etrafında sarma sızıntıları karşı ikinci bir mühür gibi davranmaya canı cehenneme.
      Not: İlk tüp, 15 mL polipropilen boru, solunabilir parçacıklar bir aerodinamik çapı ile toplar > 4 µm. İkinci tüp, bir 1,5 mL polipropilen microcentrifuge tüp 1 ve 4 µm arasında solunabilir parçacıkları toplar. Kalan daha küçük parçacıklar, < 1 µm, PTFE üzerinde toplanan vardır (bkz. Şekil 2) filtre.
  2. NIOSH örnekleyici ile her kullanımdan önce kalibrasyon kavanoz aracılığıyla hava filtreleri farklılıkları olarak kalibre ve numune olarak değişen hava akımı neden olur.
    1. Bir kalibrasyon kavanoz kullanmak için küp 's radarı uygun filtre kaset ekleyebilir, örnekleyiciyi kavanoza yerleştirin ve kavanoz mühür.
    2. Kalibrasyon kavanoz kalibrasyon debimetre ve örnekleme pompa bağlayın. Akış ölçer açmak ve bir kaç dakika boyunca ısınmak sağlar. Akış ölçer her zaman akış ölçer ve örnekleyici kirletici önlemek için onun giriş bağlı bir filtre olması gerektiğini unutmayın.
    3. Örnekleme pompa açmak ve ısınmak ve stabilize etmek üzere birkaç dakika çalışmasına izin vermek.
    4. 3.5 L/dak doğru akış oranını ayarlamak için pompa ayarlayın.
      Not: NIOSH aerosol örnekleyici için akış hızı genellikle 3,5 L/dak için ayarlanır. Bu akış hızı örnekleyiciyi solunabilir parçacık örnekleme16ACGIH/ISO ölçütlerini uygundur. Diğer akış oranları farklı kesim boyutları istenen veya gürültü düzeyini azaltmak için ama farklı bir Debi kullandıysanız, sonra örnekleyiciyi artık solunabilir örnekleme kriterlere uygun ki farkında olmak kullanılabilir.
    5. Kalibrasyon sona erdiğinde, pompa ve debimetre kapatın.

2. statik ve kişisel aerosol örnekleme

  1. NIOSH aerosol örnekleyici ya kişisel veya statik alan örnekleme için ayarlayın.
    Not: Bir tripod veya holding cihaza bağlı iken aerosol örnekleyici kullanarak statik örnekleme anlamına gelir (ne zaman örnekleme kişisel karşı (bkz. şekil 4) okudu kişi örnekleyici ve pompa monte edilmiş olarak, bkz. şekil 3).
    1. Statik alan örnekleme için belirli alandaki mümkün olduğunca yakın numune okudu tutmak. Numune hava girişleri, Oda girişlerinde ve hava akımı yolunda olabilir yerlerde uzak tutmak.
      Not: özellikle aerosol kaynak Oda17' ise Aerosol konsantrasyonları önemli ölçüde kısa mesafelerde bile değişebilir.
    2. Kişisel örnekleme için kişinin nefes bölgedeki örnekleyici ayarlayın. Yaka, omuz veya göğüs örnekleyiciyi ekleyebilir ve örnekleme pompanın bel veya bir sırt çantası içinde getirin.
      Not: Nefes bölge sık hava çoğunluğu inhalasyon17sırasında çizilen bir kişinin burun çevreleyen bir 30 cm Yarımküre olduğu varsayılır.
  2. Boru örnekleyici örnekleyici alıcılar uzak ve hiçbir şey alıcılar engellemekte veya hava akımı ile örnekleyici engel olun. Boru örnekleyici müstehcen veya sıkışmak gerekir değil. Herhangi bir tıkanıklık durdurmak pompa neden olur.
  3. Pompalar üzerinde açın. Bir ya da iki dakika sonra pompalar hala çalışıp çalışmadığını kontrol edin.
    Not: Kuralları hava bağlı olarak çevre10,18,19tam 8 h çalışma vardiyası için 10 dk kadar arasında değişen dönemleri için örnekleme. Şekil 6 ' da sunulan bir 60 dk örnekleme döneminden kapalı bir ortamda temsilcisi sonuçlarıdır.
  4. Hava örnekleme tamamlandıktan sonra örnek borular ve filtrenin toplamak. Sızdırmazlık bandı çıkarın, tüpler sökün ve onları kap. Yer süzgeci kaset filtre üzerinden üçüncü parçası. İşleme için hazır kadar örnekleri 4 ° C'de depolayın.

3. çıkarma genomik DNA'ın hava örnekleri

  1. Genomik DNA (gDNA) NIOSH BC251 örnekleyici her aşamasından ayıklayın. Koleksiyon tüpler örnekleme hava işlemek ve ayrı ayrı tayin edilmesi solunabilir ve solunabilir mikrobiyal aerosoller örnek izin vermek için filtre.
    Not: Alternatif olarak, üç aşamada olabilir kombine ve örnek inoculum çok küçük ise ayıklanır.
    1. Bir sınıf II biyolojik Emanet kabine veya laminar akım temiz tezgah, aseptik filtreyi kaldırın. Örnekleme kaset % 70 etanol ve meraklı örnekleme kaset açık bir kaset-açılış aracı kullanarak kullanarak Sil. Filtre ve destek yastığı yukarı itmek için bir filtre lifter kullanın. Filtre forseps kullanarak filtre kavramak ve içinde steril petri kabına yerleştirin. Filtrenin 6 eşit parçalar halinde kesilmiş ve 300 mg cam boncuk (0,2 - 0,5 mm) içeren bir takviye 2 mL tüp içinde koyun.
    2. 30 için sıvı azot filtre içeren tüp yer s ve hemen 4,5 m/s 30 için ayarlanan bir boncuk değirmen homogenizer yere koyun s.
    3. Filtre rendelenmiş kadar 3.1.2 bir veya iki kez tekrarlayın. Küçük parçalar halinde olduğu gibi filtre kalabilir. 0.5 mL lizis arabellek (4 M üre, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), pH 7,4) ekleyin.
    4. Lizis arabelleği 0.3 mL 15 mL ve 1,5 mL hava örnekleyici tüpler için ekleyin. Girdap 10-15 için tüp dik iken ve daha sonra başka bir 10-15 leri ters. Her tüpün içeriğini 300 mg cam boncuk içeren 2 takviyeli mL tüpler için aktarmak.
      Not: Her örnekleyici tüpte toplanan malzeme çoğunu tüp üst kısmında birikir.
    5. Boncuk değirmen homogenizer 4,5 m/s 30 s ve santrifüj için tüm tüplerde işlemek 20.000 x g 22 ° C'de 1 dk. için de onları Supernatants steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler için aktarmak ve 20.000 x g 22 ° C'de 1 dk. için tekrar de tüpler santrifüj kapasitesi Bu adımı yineleyin.
  2. 30 µL lizis reaktif ekleyin (görmek Malzemeler tabloher boru ve tüpler için 15dk 37 ° C'de kuluçkaya için).
  3. Bağlama arabellek (10 M üre, 6 M guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, %20 Triton X-100, pH 4.4) 0.2 mL ekleyin ve İndinavir K (100 µg/her boru ve tüpler için 10 dk. eklemek 100 µL her tüp isopropanol, 70 ° C'de kuluçkaya mL).
  4. Cam elyaf filtre tüpler (700 µL kapasite) 2 mL koleksiyonu tüplerde yerleştirilir içine özü çözümleri transfer ve 20.000 x g 30 için de koleksiyon tüpler santrifüj kapasitesi s 22 ° C'de Koleksiyon tüpler atın ve filtre tüpler yeni 2 mL koleksiyonu tüpler içine yerleştirin.
  5. İnhibitörü kaldırma arabellek (5 M guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6,6, % 38 etanol) 0.5 mL her tüpün ekleyin ve 20.000 x g 30 için de koleksiyon tüpler santrifüj kapasitesi s 22 ° C'de Koleksiyon tüpler atın ve filtre tüpler yeni 2 mL koleksiyonu tüpler içine yerleştirin.
  6. Yıkama arabellek (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, % 80'i etanol) 0.5 mL her tüpün ekleyin ve 20.000 x g 30 için de koleksiyon tüpler santrifüj kapasitesi s 22 ° C'de Koleksiyon tüpler atın ve filtre tüpler yeni 2 mL koleksiyonu tüpler içine yerleştirin. Bu işlemi yineleyin.
  7. 20.000 x g 22 ° C'de herhangi bir kalıntı yıkama arabellek kaldırmak için ek bir 1 dk. için de koleksiyon tüpler santrifüj kapasitesi. Koleksiyon tüpler atın ve filtre tüpler yeni koleksiyon tüpler içine yerleştirin.
  8. Eklemek 100 µL sıcak (≥70 ° C) elüsyon arabelleğe (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) her tüp ve onları 1-2 dk. santrifüj için oda sıcaklığında 20.000 x g 30 için de koleksiyon tüpler kuluçkaya s 22 ° C'de Boş filtre tüpler bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve eluates 3,8 adımından yeniden uygulayın. 1-2 dk. santrifüj 20.000 x g 30 için de oda sıcaklığında kuluçkaya s 22 ° C'de
    NOT etmek-Ebilmek var kullanılmış Eluates hemen için adım 4 ya da saklı-20 ° c kadar kullanıma hazır. Genomik DNA için depolanan-20 ° C'de bir yıl kadar Uzun süreli depolama gerekirse DNA-80 ° C'de depolanması önerilir.

4. mantar ribozomal DNA amplifikasyon

  1. Evrensel mantar astar kendi bölgeleri 1 ve 2 den hulâsa gDNA yükseltmek için kullanın.
    Not: Bu iletişim kuralı için astar çifti Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') Its bölgeleri4,5en büyük kapsama sağlamak için kullanılır. O da tek başına, ITS1 ve ITS2 bölgeleri yükseltmek gibi diğer astar kümeleri kullanılabilir.
    1. Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) steril 0.5 mL PCR tüpleri veya 96-şey PCR plakaları onaylatılacak 50 µL reaksiyonlarda her örnek için aşağıdaki gibi ayarlayın: ayıklanan şablonu DNA (Adım 3), 5 µL 33,3 µL PCR sınıf su, 10 x PCR arabelleği 5 µL , 50 mm MgCl21.5 µL, 10 mM 2'-deoxynucleoside 5'-trifosfatlar arasında 1 µL, 0.5 µL 20 µM Fun18Sf ileri astar, 0.5 µL 20 µM ITS4R ters astar ve Taq DNA polimeraz 0.2 µL.
    2. Reaksiyonlar bir termal cycler gerçekleştirmek: denatürasyon 95 ° c 3 dakika; denatürasyon 6 döngüleri (96 ° C, 30 s) tavlama (50 ° C, 45 s) ve astar uzantısı (72 ° C, 3 dk); denatürasyon 20 döngüleri (96 ° C, 30 s), tavlama (50 ° C, 45 s) ve astar uzantısı (72 ° C, 1 dk); ve astar uzantısı için 10 dk. 72 ° C'de reaksiyon karışımları 4 ° C'de sonraki adım kadar.
  2. Silis zar bazlı arıtma seti kullanarak onaylatılacak PCR reaksiyonları arındırmak birleştirin.
    Not: Bu yordam PCR bileşenleri (astar, dNTPs, enzimler, tuzları, vb) ve diğer kirletici güçlendirilmiş DNA hazırlıklar üzerinden kaldırılması için izin verir.
    1. Her örnek (150 µL toplam) steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler için üç reaksiyonlar birleştirin. Bağlama arabellek (5 M guanidin-HCl, % 30 isopropanol) 5 x birimi (750 µL) ve yukarı ve aşağı on kat pipetting tarafından çözüm karıştırın.
    2. 450 µL sütunlar koleksiyonu tüplerde yerleştirilen spin ve tüpler 17,900 x g, 30 s. atmak için filtrates santrifüj kapasitesi için karışımı ekleyin. Kalan 450 µL için sütunları ekleyin ve santrifüj kapasitesi 30 17,900 x g, s 22 ° C'de
      Not: Sütunlar için DNA adsorpsiyon için izin veren bir silika membran spin sütunlar içerir.
    3. Filtrates atmak ve 750 µL çamaşır arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, % 80'i etanol) spin sütunları ekleyin. 17,900 x g 30 için sütunları santrifüj kapasitesi s 22 ° C'de
      Not: Bu işlem yukarıda belirtilen PCR reaksiyon kirleticileri kaldırır.
    4. Filtrate atmak ve 17,900 x g 22 ° C'de 1 dk. için de boş sütunlar santrifüj kapasitesi
      Not: Bu adım aşağı akım uygulamaları ile girişime neden olabilir arabellek yıkama herhangi bir kalıntı kaldırmaktır.
    5. Spin sütunları steril 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer. 45 µL elüsyon arabelleği (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dk. santrifüj tüpleri 17,900 x g 22 ° C'de 1 dk. için spin sütunları kuluçkaya
    6. Eluted DNA hemen adım 4 ve 5 için kullanmak veya kullanım için hazır kadar-20 ° C'de depolayın.
      Not:-Ebilmek var olmak stok amplicons için-20 ° C'de bir yıl kadar Uzun süreli depolama gerekirse DNA-80 ° C'de depolanması önerilir.

5. özel Jel Elektroforez kullanarak mantar Its amplifikasyon doğrulanması

  1. Döküm % 1'özel jel içeren 1 µg/mL arasında etidyum bromür. Özel 1 x Tris-asetat-EDTA (TAE) arabellek kaynar çözülür. Çözüm yaklaşık 50 ° C soğuduktan sonra etidyum bromür ekleyin ve döküm jel dökün.
  2. Özel jel katılaşmış sonra 1 jel bırakın x TAE ve amplicons üzerinde jel yüklenebilmesi için hazırlamak. İçin 8 µL güçlendirilmiş DNA'ın arabellek yükleme x 5 2 µL ekleyin.
    Not: Bu birimlere istenen yükleme arabellek konsantrasyonu bağlı olarak ayarlanabilir.
  3. Örnekleri, jel ile birlikte bir DNA merdiven boyutu başvuru için üzerine tüm 10 µL yükleyin. Jel 75 V at koşmak (6 V/cm) yaklaşık 90 dk için ve genellikle 750 arasında görülen bantları, görselleştirmek ve 1000 baz çifti, ultraviyole kullanarak ışık (bkz şekil 5).

6. sıralama ve mantar Its bölgeleri analizi

  1. Ayıklanan gDNA veya güçlendirilmiş mantar Its bölgelerde sıra ve mevcut ve uygun yöntemlerle dizileri çözümleyebilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir ortam içerisinde tür Dağıtım hava örnekleri içinde tanımlanan her OTU klonları sayısı belirlenerek göreli bereket kullanarak tespit edilebilir. Şekil 6 hava örnekleme 60 dk takip kapalı bir ortam içerisinde taksonomik yerleştirilen türler temsil eden bir Kronu grafiğidir. Çevre türler içinde iki büyük mantar kültürlenebilen, Ascomycota ve Bazidyumlu mantarlar gibi türler türe Zygomycota (Rhizopus microsporus) ait çeşitli içerir görülebilmektedir. Birçok Bazidyumlu mantarlar culturable değildir veya mikroskobu tabanlı yöntemleri kullanarak ayırt edemez gibi geleneksel yöntemlerle değerlendirme Ascomycota türler doğru önyargılı vardır. Sıralama mantar Its bölgelerin tespiti çok sayıda mantar türleri, için sık sık undetected gitmek özellikle bazı Bazidyumlu mantarlar, sağlar. Bu ortam analizini tespit mantar dizileri % 68'i Bazidyumlu mantarlar için sipariş Polyporales çoğu ait olduğunu gösterir.

Taksonomik veri sıralama tabanlı yaklaşımlar kullanarak elde bir ortam içerisinde taksonomik çeşitlilik belirlemek için kullanılabilir. Çeşitlilik endeksi, bu tablo 1'de sunulan gibi ne kadar zengin, her örnekte tanımlanan türlerinin sayısı açıklayan ortamıdır yanı sıra nasıl farklı çevre, hangi türlerin sayısı ve bolluğu dikkate alır olduğunu belirlemek Her. Tablo 1 Chao 1 zenginlik endeksleri ve Shannon çeşitlilik endeksleri iki kapalı ortamlar için gösterir. İndisler daha yüksek zenginlik ve klimalı ortamlarda buharlaşma serin ortamlara göre çeşitlilik gösterir. Ayrıca Bray-Curtis dagilimini katsayıları bulunmaktadır. Bunlar ortamında nasıl birbirine benzemeyen örnekleri tarif her örnek içinde tanımlanan türler ile ilgili olarak. Her ikisi de tablo 1'de açıklanan ortamlar içinde örnekleri sırasıyla % 98 ve %97 klima ve Evaporatif serin ortamlar, için son derece farklı.

Figure 1
Şekil 1: üç parçalı filtre kaset derleme şematik gösterim. Filtre kaset üç adet oluşur: bir üst veya cap parça (giriş), bir uzantısı baca şapkası ve temel parça (çıkış). Bir destek yastık ve filtre temel parça gridded yüzeyine yerleştirilir. Uzantısı baca şapkası daha sonra el ile veya pnömatik basın kullanarak Bankası kilitlendi. NIOSH bioaerosol Siklon örnekleyici ile kullanmak, en iyi parça örnekleme sırasında bıraktığı yerden ve sonra depolama ve taşıma için değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: NIOSH bioaerosol Siklon örnekleyici şematik gösterimi. NIOSH Siklon sprey örnekleyici hava partikül hava örnekleyici ile giriş içine çizerek ve parçacıklar örnek tüpler duvara mevduat bir siklon üreten toplar. Büyük hava polipropilen 15 mL tüp içine, ilk çizilmiş parçacıklar (> 4 µm) tüp duvarlarında toplamak. Sonra hava dışarı ilk tüp akar ve 1.5 mL microcentrifuge tüp içine nerede toplamak daha küçük parçacıklar (1-4 µm) çizilir. Kalan parçacıklar (< 1 µm) hava örnekleyici dışarı çizildiğinde PTFE filtre toplamak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: örnek bir statik örnekleyici tuzak. Görüntü numune statik alan örnekleme için kurmak gösterir. NIOSH numune toplamak 40 inç (102 cm) kadar ve 60 inç (152 cm) yerden, bir oturma ve ayakta yetişkin, yükseklikleri sırasıyla temsil eden ayarlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: bir kişisel örnekleyici derleme örneği. Görüntü üzerinde bir sırt çantası bir birey tarafından giyilen bir NIOSH örneği gösterir. Örnekleyici ve güç anahtarı örnekleme pompa sırt çantası içinde bulunduğu varken paketi kayışları üzerinde bulunur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: örnek bir özel jel görselleştirmenin güçlendirilmiş Its DNA hava örnekleri. Görüntü DNA bantları 750 ve 1000 baz çifti arasındaki gösterir. Bu bantların ayıklanan hava örnekleri güçlendirilmiş mantar Its bölgeleri temsil eder. KENDİ bölgeleri boyutu türlerin kökeni bağlı olarak değişir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: örnek Kronu grafik sunmak taksonomik mantar türleri içinde kapalı bir ortam tespit yerleştirilen. Kronu grafik 4 örnekleri evlerde 60 dk hava örnekleme döneminden sonra NIOSH bioaerosol Siklon örnekleyici ile toplanan bulunan mantar türlerinin göreli bereket gösteriyor. tanımlanan türler % 68'i şube Bazidyumlu mantarlar Ascomycota (% 33) ve Zygomycota (% 1) kalan mensup ait. Bu ortamda en bol ITS dizileri ve siparişe Polyporales ait Phanerodontia chrysosporium ve Gelatoporia dichroatespit edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Chao-1 zenginliği Shannon çeşitlilik Bray-Curtis mesafe
(MIN, max) demek (MIN, max) demek (MIN, max) demek
Klima (n = 9) 33.86 (15,0, 102.0) 1.39 (0.68, 2,51) 0.9778 (0.8313, 1.00)
Evaporatif soğutucu (n = 10) 25.46 (12,5, 49,5) 1.10 (0,50, 1.72) 0.9624 (0.3804, 1.00)

Tablo 1: örnek veri çeşitlilik ve türlerin zenginliği endeksleri kapalı ortamlarda karşılaştırma sunma. Chao 1 zenginlik Endeksi (örnek başına türlerinin sayısı), Shannon çeşitlilik endeksleri (türlerinin sayısı) ve her bolluk ve Bray-Curtis dagilimini katsayıları tablo gösterir (nasıl farklı türler dağılımın 0 - ölçekli örnekler arasında olduğu 1). Bu veriler daha yüksek zenginlik ve klimalı ortamlarda ve her iki ortamda örnekleri arasında yüksek dagilimini çeşitlilik göstermektedir. Bu tablo limon ve arkdeğiştirildi. 10 Royal Society kimya izniyle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dayandırılmış yaklaşımlar kullanarak bir iş ortamı içinde mantar çeşitlilik belirleme mantar tehlike tanımlama ve pozlama değerlendirme geliştirdi. Bu yaklaşımı kullanarak kültür veya değerlendirme mikroskobu tabanlı yöntemleri kullanarak algılanır çoğu zaman birçok ek mantar türü algılama için izin verdi. Bioaerosols mesleki ve kapalı ortamları ve genomik DNA çekme--dan onun amplifikasyon ve sıralama için hava örnekleri örnekleme yöntemi burada sunulmaktadır. Tespitler mantar çeşitliliğin bu yöntemleri kullanarak son derece bağımlı: (1) başarılı ve tam genomik DNA ekstraksiyon havadan örnekler, (2) gDNA ile güçlendirilmiş karşılaştırılması için banked için kendi sıralarını izin astar amplifikasyon sıraları veritabanı ve limit amplifikasyon önyargıları ve veritabanları içinde dizileri (3) doğru taksonomik tanımlaması.

Başarılı genomik DNA ekstraksiyon çıkarma yöntemleri ve Kimyasalları bir çalışmada istihdam güvenen. Protokolünde bahsedilen, bioaerosols ve diğer biyolojik ve biyolojik olmayan partikül NIOSH iki aşamalı Siklon örnekleyici tüp aşamalı olarak toplanan bir sürü toplamak tüp üst kısmında. Tüpler herhangi bir partikül kaybetmemek için lizis tampon eklerken dikkatli bir şekilde açılması ve vortexed lizis arabellek (sağ tarafı yukarı ve baş aşağı) içine düşmek tüm partikül için izin veren bir şekilde olmaları çok önemli. Ayrıca filtre dikkatli olmak önemlidir yüzeyi ayıklama önce toplanan veya bulaşıcı DNA tanıtmak herhangi bir bioaerosols bozmaya değil aseptik yöntemlerle ele. Varyasyon birçok ticari olarak mevcut genomik DNA ekstraksiyon kitleri15arasında büyük miktarda olduğu kanıtlanmıştır. Bazı çıkarma yordamları önyargı belirli mantar türleri ve değişen DNA sonucu doğru20verir. Ayıklama takip DNA verim düşükse, daha yüksek PCR reaksiyon çoğaltır gerçekleştirilebilir. Sadece ayıklama verimleri birbirinden farklıdır ama birçok kitleri mikrobiyal DNA kirlenme önemli bir miktar katkıda bulunmak. Bu nedenle, belirlemek ve analizi potansiyel reaktif kirletici kaldırmak için bu yordamı boyunca uygun denetimleri eklemek önemlidir.

ONUN amplifikasyon Protokolü'nün başka bir önemli adımdır. Kullanılan ayıklama metodolojisi yeteneklerini PCR inhibitörleri çevre örneklerinden kaldırmak için değişebilir. Özellikle çevresel toz örnekleri21ile ilgili bu. Burada sunulan yöntemiyle çıkarılan örneklerin PCR güçlendirme toz15bazı PCR inhibisyonu 10 mg ilavesi sonra sergiledi. PCR inhibisyon çevresel toz örneklerinde en büyük endişe kaynağı olsa da, hala ne zaman mantar çeşitlilik belirlenmesi için hava örnekleri çıkarılan DNA yükseltecek bir göz olması gerektiği. Bu yöntemde kullanılan ayarla PCR astar Its 1 ve onun 2 bölgeleri kapsama alanı sağlar. Bu karşılaştırma için birçok sıralarının sıra veritabanlarında yerleştirilir sağlar. Ayıklama işlemde olduğu gibi birçok güçlendirme ve astar önyargıları yukarıda açıklanan22olmuştur. Mantar genom büyüklüğü ve Gen kopya numarası da onun amplifikasyon23etkiler. Bu önyargıları Sonuç dizisi verileri yorumlarken dikkate alınmalıdır. KENDİ sıralarının taksonomik kimlik belki bu yöntem en kritik bileşenidir. Bu tanımlama ölçütleri tutarlı tutmak önemlidir. ONUN dizileri tanımlama yeteneği veritabanlarında banked dizileri bağlıdır. Çok dizileri türler seviyeye tanımlanamıyor. Taksonomik tanımlamaları banked sıraları, yüzde kimlik cutoffs gibi temel yaparken belirli bir ölçüte sahip veri kümelerini çalışma çalışma tutarlı tutmak için önemlidir.

Geleneksel değerlendirme yaklaşımları için karşılaştırıldığında, ayıklanması ve mesleki hava örneklerinden mantar DNA Sekanslama mantar çeşitliliğin bir ortam içerisinde daha kapsamlı bir gösterimini sağlar. Yukarıda açıklanan sınırlamalar yanı sıra, bu tür analizleri sonuçlarını kültür, spor sayar veya Nicel veri getirebilecek kantitatif PCR24 farklı olarak yarı kantitatif belirtmek gerekir. Veri sıralama örnek başına göreli bereket belirlemek hem de mantar çeşitlilik ölçümlerini hesaplayabilmesi için kullanılabilir. Bu yöntemler birlikte qPCR gibi diğer yöntemleri ile daha fazla ölçülebilir veri almak için kullanılabilir. Bu yaklaşımlar kullanılarak oluşturulan veri kümeleri iş sağlığı çalışmalarda belirli iş ortamlarında mantar tehlikeler daha iyi anlamak için kullanılabilir. Çıkarma ve astar seçimi yaklaşımlar daha iyi karakterize ve mantar çeşitlilik-dayandırılmış çalışmaların karşılaştırmak için gerekli olan daha standart geliştirme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bulgular ve sonuçlar bu raporda yazarlar vardır ve dün resmi konumunu Ulusal Enstitüsü mesleki güvenlik ve sağlık, merkezleri hastalık kontrol ve Önleme için yapıldı.

Acknowledgments

Bu eser kısmen NIOSH ve NIEHS (AES12007001-1-0-6) arasında bir kurumlararası anlaşma tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler NIOSH BC251 The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-373 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096 15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width McMaster-Carr 76505A1 sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm SKC Inc. 225-3LF 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm EMD Millipore FSLW03700 Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps Fisher Scientific 09-753-50 filter forceps
Model 502 Precision PanaPress PanaVise 502 pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape McMaster-Carr 76455A21 19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large SKC Inc. 225-112 calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump SKC Inc. 224-PCXR4 sampling pump
Mass Flowmeter 4140 TSI Inc. 4140 flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit Roche Diagnostics 11796828001 Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps Fisher Scientific 15340162 2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm Sigma-Aldrich G1277 glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163 bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X Sigma-Aldrich C8740 lysis reagent
Platinum Taq polymerase Invitrogen 10966-018 Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix Invitrogen 18427-088 10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo Fisher B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder Thermo Fisher 10488-085 DNA ladder

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119, (6), 748-756 (2011).
  2. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14, (4), 285-293 (2017).
  3. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. (2016).
  4. Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74, (1), 233-244 (2008).
  5. Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16, (1), 33-43 (2014).
  6. Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
  7. Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84, (1), 165-175 (2013).
  8. Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9, (6), e97629 (2014).
  9. Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7, (7), e40863 (2012).
  10. Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. (2017).
  11. Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13, (12), 3321-3328 (2011).
  12. Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11, (12), D215-D219 (2014).
  13. Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10, (3), e0120308 (2015).
  14. Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8, (11), 1136-1142 (2006).
  15. Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14, (3), 766-774 (2012).
  16. ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
  17. Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. CRC Press. (2005).
  18. Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13, (10), D159-D165 (2016).
  19. Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
  20. Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75, (16), 5428-5433 (2009).
  21. Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7, (4), 311-318 (2005).
  22. Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
  23. Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61, (7), 2798-2801 (1995).
  24. Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49, (8), 829-833 (2007).
Toplama ve mesleki hava örnekleri çıkarma mantar DNA analizi için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).More

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter