Summary
Женских млекопитающих как известно ошибкам, особенно благодаря missegregation хромосомы. Эта рукопись описывает методы подготовки хроматина распространения для мыши профаза, метафазы I и II-поставил ооцитов. Эти основные методы позволяют для изучения хроматина прыгните белков и морфология хромосомы во всем млекопитающих женских.
Abstract
Хроматин распространение методы были широко используется для оценки Динамическая локализация различных белков во время гаметогенеза, особенно для сперматогенеза. Эти методы позволяют для визуализации белков и ДНК локализации шаблонов во время meiotic событий, таких как гомологичные хромосомы сопряжения, ремонт синапса и ДНК. Хотя несколько протоколов были описаны в литературе, общие хроматина распространения методов с использованием яйцеклетки млекопитающих профаза являются ограниченными и сложной ввиду сроков возбуждения мейоза в плода яичников. В сравнении профаза сперматоцитах могут быть собраны из несовершеннолетних самцов мышей с более высокой урожайности без необходимости microdissection. Однако трудно получить чистый синхронизированные популяция клеток на определенных этапах вследствие неоднородности населения meiotic и пост meiotic зародышевых клеток семенников несовершеннолетних и взрослых. Для более поздних стадиях мейоза это выгодно для оценки ооцитов, претерпевает мейоз I (MI) или мейоз II (МИИ), потому что группы зрелых яйцеклеток могут быть собраны из взрослых самок мышей и стимулировали возобновить мейоза в культуре. Здесь методы подготовки meiotic хроматина распространения, с помощью ооциты расчлененный от плода, новорожденных и взрослых яичников описаны с сопровождающим видео демонстрации. Хромосоме млекопитающих ооцитов missegregation события являются частыми, особенно во время ми. Эти методы могут использоваться для оценить и охарактеризовать последствия различных мутаций или экологического воздействия различных этапах женских. Как существуют явные различия между женских и сперматогенез, методы, описанные в рамках имеют неоценимое значение для увеличения нашего понимания млекопитающих женских и сексуально диморфных особенности динамики хромосомы и белков во время мейоза .
Introduction
В ходе сперматогенеза большие полусинхронные волны meiotic зародышевые клетки быстро и непрерывно пополняется в яички в начале полового созревания и во взрослой жизни1. В отличие от мужчин мейоза у самок инициируется исключительно во время внутриутробного развития. После рождения, ооциты остаются арестованных в длительной dictyate стадии профазе I с нетронутыми Жерминаль везикул (GV; ядерная оболочка) до полового созревания. В начале полового созревания подмножество яйцеклетки циклически выбираются пройти роста и созревания, маркировка начало meiotic возобновления. Meiotic возобновления в взрослой ооциты проявляется исчезновение GV в процессе, известном как Жерминаль везикул разбивка (GVBD). Яйцеклетка затем подвергается конденсация хромосом и сегрегации, следуют экструзии полярного тельца. Ооциты стать арестован по прогрессии к MII и стимулируются завершить второй и последний meiotic отделе только после оплодотворения.
Женскую плодовитость сильно зависит от успеха meiotic профаза я прогрессии. Ключом к этому является формирование физической связи между гомологичных хромосом, известны как chiasmata, которые при посредничестве ремонт индуцированных разрывы двойной нити ДНК (DSBs) через кроссовер рекомбинации2. Этот процесс происходит в контексте динамических богатых белком эшафот, известный как синаптонемного комплекса (SC), который формирует между гомологичных хромосом для облегчения их Синапсис3. СК является молния как трехсторонняя структура состоит из двух параллельных боковых элементов, соединены центрального региона белки, содержащий гомолог вместе на протяжении текущей репарации ДНК. До синапса прекурсоров боковых элементов, называемых осевой элементами, образуют между сестра chromatids. Белков синаптонемного комплекса таких как SYCP2 и SYCP3 образуют осевой элементы, которые colocalize сестра хроматиды сплоченности осям во время ранних профаза. Позже в качестве привязки сайтов для поперечной нити белка, SYCP1, которая облегчает центральным элементом Ассамблеи и синапса между унифицированных гомолог4. В ооцитов мыши полный Синапсис обозначается присутствие 20 полностью что перекрывающиеся участки SYCP3 и SYCP1, которые могут быть визуализированы с помощью хроматина распространение препаратов. Синапсис завершена после вступления в pachytene substage, whereby Зрелые кроссоверы, которые предназначены для chiasmata формы между гомолог украшены димеры mutL гомолога (MLH1/3) для содействия их точная обработка5,6 , 7. структурные поддержание хромосом (SMC) комплексов, включая Когезин, condensin и комплекс, СМТ5/6 имеют важное значение для регулирования хромосома динамики и структуры всей мейоз8,9, 10,,1112. В совокупности эти события обеспечить надлежащего би направленности гомологичных хромосом против поляков шпинделя после разборки SC.
Meiotic клеточный цикл представляет собой мощный модель для изучения роли различных белков в геном обслуживания благодаря запрограммированных индукции и последующего ремонта DSBs ДНК. Кроме того у млекопитающих мейоз является также соответствующую модель для изучения импринтинг13и эпигеномные изменения. Однако технически трудно оценить эти события во время женского мейоз, который проходит в яичниках плода и новорожденного в млекопитающих (рис. 1). Я можно разделить на 5 подэтажи профаза: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema и dictyate. Здесь мы опишем, как изолировать и различие между плода и новорожденного яичников и яичек (рис. 2). Адаптировано из описанных ранее методов, этот манускрипт также излагаются с видео демонстрации для подготовки женщин meiotic профаза протокол (шаг 1) я хроматина распространяется14,,1516,17 . В сочетании с immunolabelling, как описано в шагах 6-7, этот протокол позволяет подробный анализ микроскопических профаза я события в ооцитов.
Женских ошибок – хромосомы missegregation события во время первого дивизиона meiotic представляют собой наиболее распространенным источником генетических заболеваний в потомстве18,19. В этой рукописи (протокол шаг 2) мы описываем протокол, в котором зрелых яйцеклеток, GV-поставил извлекаются из загрунтовать яичников взрослых самок мышей. При благоприятных условиях взрослой ооциты проходят лютеинизирующего гормона независимые возобновление после изоляции и культуры20мейоз. После возобновления meiotic ооциты прогресс через мейоз я, а затем арестовать на метафазы II. Ооциты остаются арестованных в метафазы II, если оплодотворенной. В шагах 2-5 мы адаптируем сообщалось ранее протоколов с видео демонстрации для описания как собирать, культуры и подготовиться хроматина распространения подготовку21ми и MII ооцитов. Этот хроматина, распространение техника позволяет ясно immunolabelling белков, связанные с хромосомами. Кроме того, этот протокол может также использоваться для различения двухвалентные и однолистных хромосом и далее может решить один сестра chromatids для облегчения оценки плоидности ооцитов. Таким образом Помимо выявления локализации шаблонов meiotic белков, этот протокол может также служить бесценным инструментом для выяснения возможных причин возникновения missegregation хромосомы во время ми и MII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Джона Хопкинса. Были проведены эксперименты на мышах одичал тип C57BL/6J.
1. уборка урожая плода или новорожденного яичников и подготовка профаза Chromatin спреды
- Для извлечения эмбрионов на 14,5-19,5 дней пост coitum (dpc) пожертвовать беременные самки через шейки матки вывих или CO2 удушение согласно рекомендациям IACUC.
Примечание: Для послеродового день 1 – 5 яичников, перейдите к шагу 1.3. На рисунке 1 представлены этапы meiotic профаза, обогащенный в разновозрастных эмбриональных и послеродовой. - Откройте abdominopelvic полости, используя стерильными ножницами, что делает V-образный открытия. Вскрыть из материнской рога матки, разделения эмбрионов из плаценты и переноса эмбрионов в Петри 35 мм, содержащие 3 мл подогретым 1 x Натрий-фосфатный буфер (PBS) при 37 ° C.
Примечание: Fliptop инкубатор набор при 37 ° C может использоваться для поддержания температуры. Кроме того Температура регулируется стекло этапе может также использоваться для поддержания температуры во время завязи манипуляции. - С 3,5-дюймовый хирургические ножницы Пожертвуйте эмбрионов или детенышей через обезглавливание согласно рекомендациям IACUC. Место обезглавленное эмбрионов или детенышей в PBS подогретым до дальнейшего рассечение.
- Вскрыть одного эмбриона или щенка в то время в отдельном 35 мм Петри, содержащие 3 мл подогретым PBS при 37 ° C. Осуществляться путем разрезания вдоль вентральной midline задней половины эмбриона, вдоль передней половины под Передние конечности и непосредственно над задних конечностей и хвост, как указано на рисунке 2A–B.
- Откройте живота, используя Ножницы хирургические 3,5 дюйма. С помощью щипцов, острым концом сместить или удалить печень и петель кишечника, подвергая яичников в новом 35 мм Петри, содержащие 3 мл подогретым PBS при 37 ° C (см. руководство в Рисунок 2B). Яичники расположены непосредственно под и за почек к задней стенки брюшной полости (рис. 2B–C). В 2D рисунокпредоставляется руководство для различения мужские и женские гонады.
Примечание: Для оптимальных условий, быстро анализировать вне яичников после того, как жертву беременных женщин. - Удалите оба яичников из каждого женского плода с помощью пары изящных наконечником щипцы под объем диссекции и место в очках смотреть или отдельных скважин многоскважинных пластины содержащий 0,5-1,0 мл подогретым PBS и поддерживать при 37 ° C.
- Место каждой пары яичников в буфере гипо добыча 0,5 мл (17 мм тринатрия цитрат дигидрат, сахароза 50 мм, 5 мм ЭДТА, 0.5 мм DTT, 30 мм трис-HCl, ингибитор протеазы, рН 8,2) в чистый смотреть стекла или небольшой колодец 9-Ну плиты, убедившись погрузить comp яичников letely. Инкубируйте для по крайней мере 15 минут, но не более 30 мин.
Примечание: Сделать свежий гипо извлечения буфер и использовать в течение 2 ч DTT сложения. - Во время инкубации, с помощью пера Пап гидрофобный барьер привлечь двух квадратов2 22 x 22 мм на чистые стекла 25 x 75 мм2, 1 мм толщиной микроскопа, как показано на рисунке 3A.
Примечание: Слайдов может быть подготовлен заранее. - Пипетка 45 – 50 мкл 100 мм сахарозы на чистый слайд и передачи одной пары яичников на падение.
- Используя острые концы двух игл 27 G, дразнить яичников отдельно выпустить клетки в раствор сахарозы. Пинцетом удалите большие куски завязи и тщательно Пипетка раствора сахарозы для разгона клетки.
- Место 40 мкл фиксирующие раствора (1% параформальдегида (PFA), 0,2% моющего средства (см. Таблицу материалы), pH 9,2) в каждый квадрат подготовленных слайдов. С 200 мкл кончиком пипетки равномерно фиксирующие раствор по поверхности слайда.
- Пипетка 20 мкл mix сахароза на площади каждый слайд, содержащий фиксатором.
Примечание: Это приравнивается к с помощью одной пары яичников на слайд. - Инкубируйте слайды в закрытой камере влажного на ночь при комнатной температуре.
Примечание: Ночь инкубации может колебаться вокруг (12-15 часов) при комнатной температуре. - Откройте крышку камеры и позволяют слайды высохнуть полностью.
- Вымойте слайды в Coplin jar, содержащий 50 мл раствора смачивающий агент PBS 0,4% (см. Таблицу материалы) для 2 мин, воздух сухой и приступить к immunolabelling протоколу (шаг 6).
Примечание: Это может быть возможно хранить слайды при температуре-80 ° C для последующего использования, но это зависит от протеина интереса. Для получения оптимальных результатов немедленно приступить к immunolabelling протоколу (шаг 6).
2. метафаза я ооцитов коллекции
- Чтобы увеличить количество полостная фолликулов, изолированный от каждой мыши, внутрибрюшинно придать девственной половозрелых самок мышей с 5 МЕ гонадотропина сыворотки беременных Маре (ГСЖК, также известный как коневодство хорионического гонадотропина (ЭКГ)).
Примечание: Для оптимальной ооцитов урожайности, мышей должна быть 1 до 3 месяцев, как количество яйцеклеток собирают уменьшается с возрастом. Чтобы подготовить ГСЖК, Растворите бутылка 5000 МЕ в 100 мл стерильного PBS (5 мл U/0.1) магазина в одноразовых аликвоты 600 мкл при-20 ° C. - После 44 – 48 ч Подготовьте сборник средних, минимум основных средних альфа (MEMα) средний дополнена 5% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 3 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА; MEMΑ/BSA/FBS). Стерилизуйте СМИ через поры фильтра 0,2 мкм. Декант 2,5 мл MEMα/BSA/FBS средних в одно стекло блюдо на мышь и теплой до 37 ° C в 5% CO2 инкубатора.
Примечание: Другие коллекции и культуры средств массовой информации, которые являются коммерчески доступных (м2 и M16), также часто используются.
Внимание: Мы рекомендуем удаление культуры блюда из 5% CO2 инкубатора, один в то время на ограниченный срок для сведения к минимуму воздействия окружающего воздуха во время манипуляции шаги. - Пожертвуйте мышей через шейки матки вывих или CO2 удушение согласно рекомендациям IACUC.
- Откройте abdominopelvic полости, используя стерильными ножницами, делая большие открытия V-образный. С помощью щипцов, вытеснить кишечника к голове мыши. Найдите каждый рога матки; Яичники присутствуют проксимальнее грудной клетки. Провести маточных труб с тонкой щипцами и сократить жира Улучшенный яичника, Рассечение ножницами (рис. 4). Продолжать проводить маточных труб и с другим набором тонкой щипцов выпустить завязи от Бурсы и место в коллекции блюдо, содержащие MEMα/BSA/FBS среднего.
Примечание: Как и в шаге 1, важно чтобы сохранить яичников при 37 ° C и на 5% CO2. Fliptop инкубатор, подключили к 5% CO2 микс может использоваться для оптимального поддержания температуры и CO2 уровней. Кроме того Температура регулируется стекло этапе следует также использовать для поддержания температуры во время манипуляции ооцитов. - С помощью 1 мл шприца с 27-иглы (или аналогичного размера), освободить кучевые ооцитов комплексы, вручную проколов большая полостная фолликулов.
- Наблюдая через микроскоп рассечение, собирайте GV-поставил яйцеклеток с помощью пипетки приводом рот стекла или капиллярной или ручные микрометр шприц (рис. 5). Только Соберите ооцитов, которые выпускаются от полостная фолликулов. Ооциты GV имеют диаметр около 90 µm. GV яйцеклеток может быть окружена 2-3 слоя клеток гранулезы и имеют диаметр около 200 мкм.
- Культура яйцеклеток в чистой смотреть стекла или 9-Ну пластины, содержащие MEMα/BSA/FBS среднего за 6 ч до метафазы I при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора.
- Перейдите к шагу 4.
3. метафазы II (MII) яйцеклетки коллекция
- Чтобы максимизировать ооцитов, изолированных от каждой мыши, внутрибрюшинно придать девственной половозрелых самок мышей с 5 МЕ ГСЖК. После 44 – 48 ч внутрибрюшинно, придать с 5 ед хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).
Примечание: Для оптимальной ооцитов урожайности, мышей должна быть 1 до 3 месяцев, как количество яйцеклеток собирают уменьшается с возрастом. Чтобы подготовить ХГЧ, распустить бутылку 10,000 U в 200 мл PBS (5 мл U/0.1). Хранить в одноразовых аликвоты 600 мкл при-20 ° C. - После 12-14 часов Подготовьте MEMα/BSA/FBS коллекции средний, как описано в шаге 2.2, выше.
- Пожертвуйте мышей через шейки матки вывих или CO2 удушение согласно рекомендациям IACUC.
- Откройте abdominopelvic полости, используя стерильными ножницами, делая большие открытия V-образный. С помощью щипцов, вытеснить кишечника к голове мыши. Найдите каждый рога матки, яичников присутствуют проксимальнее грудной клетки. Провести маточных труб с тонкой щипцами и сократить жира Улучшенный яичника, Рассечение ножницами (рис. 4). Затем удалите яичников и маточных труб и место в коллекции блюдо, содержащие MEMα/BSA/FBS среднего.
Примечание: Как и шаги 1 и 2, важно чтобы сохранить яичников при 37 ° C и на 5% CO2. Fliptop инкубатор, подключили к 5% CO2 микс может использоваться для оптимального поддержания температуры и CO2 уровней. Кроме того Температура регулируется стекло этапе следует также использовать для поддержания температуры во время манипуляции ооцитов. - С помощью 1 мл шприц с 27 G (или аналогичного размера) или острые щипцы, слезоточивый дыру в ампула маточных труб выпустить MII ооцитов.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить яйцеклеток в ампула. Ампула появится опухшие и полупрозрачные, ооциты являются видимыми (рис. 4). - Урожай MII ооциты от ампула маточных труб в новое блюдо с коллекции носитель с помощью пипетки приводом рот стекла или капиллярной или ручные микрометр шприц (рис. 5).
- Перейдите к шагу 4.
4. яйцеклетка уничтожив и удаление вителлинового
- Подготовка 300 МЕ/мл гиалуронидазы в MEMα среде, дополненный 3 мг/мл BSA чтобы оголять ооциты окружающих отель cumulus клетки (2,5 мл/мыши) в часы стекло и держать при 37 ° C, 5% CO2.
Примечание: Гиалуронидаза эффективность резко уменьшается после 1 h подготовки. Для MII ооцитов гиалуронидаза лечение не требуется. - Разоблачить яйцеклетки кучевые клеток комплексов до 300 МЕ/мл гиалуронидазы в MEMα/BSA 3 мин чтобы оголять ооциты окружающих отель cumulus клетки.
Предупреждение: Не превышать 3 мин подверженности гиалуронидазы, как это может повредить яйцеклеток. - Мыть яйцеклеток, ооцитов передать свежие утепленные MEMα/BSA средних блюдо. С помощью пипетки маленький рот действовали стекла или капиллярные (немного больше, чем диаметр ооцитов, который составляет приблизительно 90 мкм), Пипетка комплексы вверх и вниз, чтобы полностью отделить кучевые клетки. Разрешить ооциты восстановить в инкубаторе при подготовке к следующему шагу.
- Теплый раствор кислой Tyrode, MEMα/BSA и Waymouth в СМИ до 37 ° C (500 мкл/мышь). Место 300 мкл в каждой скважине малых 9-Ну стеклянные пластины.
- Чтобы удалить вителлинового (ZP) передачи 5 – 10 яйцеклеток в Tyrode и решение. Разоблачить яйцеклеток для только 30-45 s в решение.
Примечание: Слишком мало воздействия решения не будет удалять ZP полностью, который предотвратит ооциты от разрыва и хромосомы от распространения. Слишком много воздействием ущерб и убить ооцитов. Наблюдая ZP растворяются под микроскопом диссекции может помочь в оптимизации времени экспозиции.
Предупреждение: Использование свежей Tyrode решения важно, как его функция уменьшается с возрастом. Используйте свежие хорошо Tyrode решения для каждой группы яйцеклеток, лечение для обеспечения единообразного пищеварение ZP. - Сразу же после удаления ZP мыть яйцеклеток путем передачи в подогретый среднего MEMα/BSA/FBS. Повторите этот шаг мыть.
Примечание: Будьте внимательны при передаче, как ооцитов легко слипаются и стеклянной пипетки или капиллярной следующие удаление ZP. Предварительное смачивание пипеткой стекло или капилляр в Waymouth в среде сведет к минимуму ооцитов, вставляя вместе. - Передача и позволяют яйцеклеток для восстановления на 30 минут в Waymouth в среде при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора.
- Перейдите к шагу 5.
5. ми и MII ооцитов Chromatin спреды
- С помощью пера пап, нарисуйте прямоугольник2 11 x 44 мм на слайде стекла, как показано на рисунке 6A.
- Слой слайд с тонким слоем фиксатором (параформальдегида 1%, 0,2% Тритон-X 100 H2O, pH 9,2) закупорить 100 мкл фиксатором на слайд и тряся слайд взад и вперед. Нажмите на слайд, чтобы избавиться от избыточных фиксатором.
- Подобрать между 5-10 яйцеклеток с небольшой рот пипеткой иглой с как мало средств массовой информации как можно скорее и перетащите иглы в линии через фиксатор покрытием слайд во время сдачи ооциты от 1 см выше слайд в фиксирующие решение. Выполните этот шаг, с помощью микроскопа диссекции для обеспечения что сдали яйцеклеток и что они имеют взрыв.
Примечание: Яйцеклеток должны немедленно ворвались на слайде. Высота, на которой находятся яйцеклеток на хранение влияние степени распространения хроматина. Представитель результаты на рисунке 6 для получения более подробной информации. - Инкубируйте слайды при комнатной температуре в закрытой камере увлажненные на ночь, чтобы позволить хроматина присоединиться.
- Разрешить слайды для воздушно-сухой полностью и промойте слайды в опарник Coplin содержащие 50 мл 0,4% смачивающий агент H2O, рН 8,0.
- Перейдите к шагу 6.
6. Immunolabelling
- Подготовьте буфере разбавления антитела (АБР), описаны в таблице 1.
- Подготовьте две банки Coplin, содержащие 50 мл промывочного раствора буфера (ВБ) (10% АБР разводят в PBS) и один Coplin jar, содержащий 50 мл ВБ и 0,05% раствором моющего средства (например, 250 мкл 10% моющего средства до 50 мл ВБ).
- Вымойте слайды, которые были подготовлены в разделе 1 и 5 настоящего Протокола, для 10 минут в один jar Coplin, содержащих 50 мл ВБ.
Предупреждение: Не позволяйте слайды сухой в любой момент во время immunolabelling. - Вымойте слайды для 10 минут в Coplin горшок содержащие 50 мл ВБ и 0,05% раствором моющего средства. Затем вымойте слайды в оставшихся Coplin jar, содержащий 50 мл раствора ВБ для 10 мин.
- Кран избыток жидкости и крышка слайд с 100 мкл отдельных первичных антител, разбавленных в ADB. Инкубируйте на 4 ° C на ночь в закрытой камере влажный.
Примечание: Инкубационный может быть сокращен до 2-3 ч при 37 ° C. Использование меньшего количества антител (например, 50 мкл), покрывая слайд с coverslip или парафина. - Промойте слайды в Coplin jar, содержащий 50 мл 0,2% раствора смачивающий агент PBS, рН 8.0.
- Повторите шаги с 6,2 до 6,5.
- Кран избыток жидкости и крышка слайд с 100 мкл отдельных вторичных антител, разбавленных в ADB. Инкубируйте слайды 1 до 2 часов при 37 ° C в закрытой камере, влажный.
- Вымойте слайды 2 раза по 10 мин в банки Coplin, содержащие 50 мл 0,2% раствора смачивающий агент PBS, рН 8.0.
- Вымойте слайды 2 раза по 5 минут в банки Coplin, содержащие 50 мл 0,2% раствора смачивающий агент H2O, рН 8.0.
7. Монтаж слайды
- Для профаза хроматина спреды подготовлен на шаге 2, добавить 100 мкл монтажа носитель, содержащий 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / мл). Для ми и MII хроматина распространяет подготовленный в шаге 5, 50 мкл монтажа носитель, содержащий DAPI (1.5µg / мл). Аккуратно промокните прочь лишнюю жидкость.
- Место 22 мм х 60 мм coverslip на вершине и печать с четкой лак. Хранить в ящике слайд при 4 ° С или 20 ° C до оценки через микроскопии флуоресцирования.
Примечание: Нажмите слегка на крышку выскальзования избавиться от избыточного монтажа средних до запечатывания с ногтей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы описали два методы визуализации и оценки meiotic хромосом яйцеклетки. Первый метод закреплено к оценке профаза прогрессии в яичниках эмбрионов и новорожденных. Профаза хроматина распространение препараты являются невероятно ценным для визуализации многочисленные динамических процессов во время мейоза, включая хромосомы, сопряжения, синапса и desynapsis, гомологичная рекомбинация и эпигеномные хромосома ремоделирования. Здесь, мы продемонстрировали полезность этого метода для надежной визуализации и количественный анализ формирования кроссовер в ооцитов, добываемых из C57BL/6J эмбрионов (рис. 3Б и 3 C). Для обогащения для ячеек в pachytene substage, зародышей мыши были извлечены на 18,5 dpc (рис. 1). Два крупных клейма из pachytene substage профаза являются завершение синапса между гомолог и формирования по крайней мере один MLH1/3-позитивных кроссовер на пару гомолога. Полный синапса между гомолог проявляется наличием 20 перекрытия SYCP3 и SYCP1 участков. Характеризовать кроссовер формирования в одичал тип ооциты мы полученных профаза хроматина распространение препаратов с использованием антител, которые обнаружить SYCP3, SYCP1 и MLH1 и окрашенных ДНК с помощью DAPI. Рисунок 3B изображает образ представителя ооцитов стадии pachytene, который подтверждается наличие очагов 27 MLH1 распределены вдоль 20 полностью собранный SC структур. Среднее количество MLH1-положительных кроссоверы, обнаруженные в одичал тип ооцитов был 24 ±3 (рис. 3 C, N = 15 яйцеклеток). 3D рисунок показывает SMC6, обогащенный в регионе pericentromeric гетерохроматина (PCH) и вдоль хромосомы оружия и MLH1 очагов распределены вдоль SC на стадии pachytene. 3E рисунок изображает pachytene устроили ооцитов, где подготовка распространение хромосомы субоптимальных и отдельные хромосомы неразличимы, предотвращая точной оценки SYCP3, SMC6 и MLH1. Субоптимальных хромосома спреды могут наблюдаться при инкубации яичников в буфере гипо добыча достаточно слишком долго или не на долго.
Второй метод, описанный может использоваться для оценки морфологии хроматина в яйцеклеток после возобновления meiotic (Рисунок 6B-D). Локализация белка, а также плоидности, могут легко быть оценены, подвергая потенциальных причин ошибок сегрегации хромосомы. Рисунок 6B изображает ми ооцитов, показаны 20 хромосом и ясно центромер и pericentromeric гетерохроматина пятнать. Рисунок 6 c это увеличенное изображение, где топоизомеразы IIα (TOPOII) можно увидеть вдоль хромосомы оружия и PCH. Рисунок 6 d изображает MII ооцитов где паре сестры chromatids можно отличить по хромосоме и центромер морфологии. Распространенные ошибки при попытке эту технику включают ооцитов, не разрывая когда выпущен на слайд PFA-покрытием, а также хромосомы, распространяя слишком далеко друг от друга (рис. 6E–F). Если ЗП не удаляется полностью, хромосомы останется связанные со шпинделем, как показано на рисунке 6E. Если яйцеклеток, слишком высоко исключаются из PFA-покрытием слайд, хромосом может распространяться слишком далеко друг от друга, как показано на рисунке 6F.
Рисунок 1: временная шкала Meiotic профаза во время женского развития эмбриона и неонатальной. Синий контуры указывают популяций конкретных профаза подэтапе зародышевых клеток (leptotene, zygotene, pachytene и diplotene/dictyate этапов) наблюдается во время развития эмбриона и новорожденных. Увеличение темно-синий цвет указывает сроки, когда конкретные профаза подэтапе становится более обильные. Эта цифра была адаптирована из ссылка2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: яичник извлечения эмбрионов и новорожденных женского щенков. (А, Б) Первый отрезок (1) делается выше передних конечностей обезглавить эмбриона на стыке головы и шеи сразу после извлечения из материнской рога матки. Второй разрез (2) производится вдоль вентральной midline задней половины эмбрионов, следуют разрезами вдоль передней половины ниже Передние конечности (3). Окончательный монтаж производится для удаления задних конечностей и хвост (4). (A) лобной представление схема рассечение сокращений для изоляции яичников от женского щенков. (B) сторона мнение схема рассечение сокращений для изоляции яичников с относительное положение внутренних органов. Регионы, показано в свете красной включают печени и кишечника, которые удаляются в процессе вскрытия. Дорсальная стены и ассоциированных органов приведены в свет синий. Этот регион включает в себя функции яичников, которые прикреплены к нижнего полюса почки в верхней части рога матки. (C) фронтальная Схематический вид дорсальная стенка эмбриона, после удаления печени и кишечника. (D) схематическое представление морфологические различия между мужские и женские гонады в приблизительно 15 – 18 dpc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель профаза хроматина распространение препаратов. (A) стекла слайд схема для профаза хроматина распространения препаратов. Черный квадратные очертания представляют собой жидкие блокатор перо контуры. (B, C) Представитель изображения и количественной оценки формирования кроссовер в одичал тип pachytene стадии яйцеклеток с использованием профаза хроматина распространения методов подготовки, описанные в шаге 1. (B) Chromatin спреды были проведены с использованием изолированных зародышей мыши fromC57BL/6J яичников на 18,5 dpc. Хроматин спреды были полученных с антитела против белков боковой элемент SC SYCP3 (красный) и белка центральный элемент SC SYCP1 (пурпурный), MLH1 (зеленый, кроссовер события маркер) и DAPI (синий, ДНК). Шкалы бар = 10 мкм. (C) точка участок MLH1 очагов графов, полученные от 15 pachytene стадии хроматина распространение препаратов. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. (D, E) сравнение оптимального (D) и субоптимальных (E) профаза распространение препаратов, соответственно. Хроматин спреды были полученных с антителами против SMC6 (красный), MLH1 (зеленый) и SYCP3 (синий). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: схема взрослых яичник. Эта диаграмма изображает анатомию взрослых мыши яичников, маточных труб, ампула и матки. Яичники мыши должны быть удалены путем тщательного разрез связок, соединяющий яичников нижнего полюса почки, и задней стенки живота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: изображения пипеткой приводом рот стекла, стеклянные капиллярные и ручные микрометр шприц используется для манипуляции ооцитов. (A) манипулятор яйцеклетки пипетку стекло состоит из следующих компонентов в последовательности: рот кусок, латекс труб (3,2 мм внутренний диаметр (ID) x 6.4 мм Наружный диаметр (OD)), наконечник пипетки 1 мл, латекс труб (ID 6,4 мм x 11.1 mm OD) и стеклянная пипетка Пастера. К концу стекла, которую пипетка Пастера были нагревают на огне и конце вытащил для создания острым концом конца (1рис. 5A). (B) манипулятор капиллярного ооцитов стекло состоит из следующих компонентов в последовательности: рот кусок, 0,45 мкм фильтром (опционально), латекс труб (ID 3,2 мм x 6.4 мм OD), 1 мл наконечник пипетки, латекс труб (ID 6,4 мм x 11.1 mm OD) и 70 мкл капиллярной стекла. Стеклянные капиллярные трубки нагревают на огне в центре и тянут в противоположных направлениях для создания двух капилляров с тонкой наконечником концами (1Рисунок 5B). (C) ручные микрометр шприц состоит из следующих компонентов в последовательности: Mitutoyo 150-208 микрометра голову (средний размер, 0-1» диапазон, 0,001" градации), шприц 5 мл, латекс труб (ID 3,2 мм x 6.4 мм OD), 1 мл кончиком пипетки, латекс труб (ID 6,4 мм x 11.1 mm OD), 1 мл наконечник пипетки и кончик загрузки гель2 83 х 0,5 мм. Глава 150-208-микрометров Mitutoyo надежно вставлен в шприц 5 мл (1рис. 5 c). Чтобы убедиться, что кончик загрузки гель крепится надежно, соединительные 1 мл пипеткой оконечности режется (рис. 5 c2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: представитель метафазы I и II ооцитов хроматина распространение препаратов. (A) слайд схема метафазы I и II ооцитов хроматина распространение препаратов. Ооциты (круги) выпущен через дозатор работает рот стекла или капиллярной в прямой линии (после стрелки). Черный прямоугольник наброски представляет собой жидкий блокатор перо наброски. (B, C) Оптимальное метафаза я хроматина распространения подготовки. Метафаза я хромосом окрашивали DAPI (синий, ДНК) и полученных за ЕКС (зеленый, Кинетохор/центромер маркер). Масштаб баров = 10 мкм. (B) антител против гистона H4 (ди метил К20, tri метил К20) использовались для обозначения pericentromeric гетерохроматина (PCH). (C) антител против топоизомеразы IIα (TOPOII) были использованы для метки оси PCH и хромосомы. (D) оптимальное метафазы II хроматина распространение подготовки. Хромосом метафазы II окрашивали DAPI (синий, ДНК) и полученных ЕКС (зеленый) и гистонов H4 (К20 ди метил, tri метил К20) для обозначения PCH. Линейки: 10µm. (E, F) бедных метафаза я хроматина распространение препаратов. Хромосом окрашивали DAPI (синий, ДНК) и полученных за ЕКС (зеленый) и компонент meiotic когезинов, REC8. Масштаб баров = 10 мкм (E) яйцеклетки, что сделал не взрыв после освобождения слайд PFA-покрытием. (F) хромосом, которые распространились слишком далеко друг от друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Элемент | Сумма | Конечная концентрация |
| ПБС | 50 мл | 1 x |
| BSA | 1.5g | 3% (w/v) |
| Лошадь сыворотки | 5 мл | 10% (v/v) |
| 10% моющего средства (см. Таблица материалов) в PBS |
250 МКЛ | 0,05% (v/v) |
Таблица 1: Рецепт буфера (АБР) разбавления антитела. Хранить при 4 ° C АБР или заморозить запасы на 20 ° C, если делать больших количествах. АБР могут быть загрязнены, поэтому убедитесь, что хороший асептических методов используются и оценить решение для загрязнения до каждого использования. Меньшие аликвоты АБР также может быть готовы свести к минимуму загрязнение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хроматина распространение препаратов позволяют исследователям хронологически изучения женского млекопитающих мейоз и динамическая локализация белков, участвующих. Эмбрионов и новорожденных хроматина спреды позволяют тщательный анализ событий в течение meiotic профаза. Метафазы I и метафазы II хроматина спреды может использоваться для различения одной сестрой chromatids от паре сестры и паре гомологичных хромосом, а также оценить плоидности. Для сравнения протокол, описанные здесь может быть выгодным по сравнению с всего ооцитов immunolabelling, который часто производит высокий уровень фонового сигнала, который уменьшает резолюции хроматина прыгните белков. Кроме того методы распространения хроматина представляют собой привлекательную альтернативу для клеток изображений, который требует больших затрат времени и специализированного оборудования.
Эмбриональные и неонатальной яичников может быть трудно найти и извлечь. Мы рекомендуем тщательно извлечение всех других органов и материала помимо почки в отдельную посуду, содержащие PBS до поиска для яичников и используя свежие блюдо PBS для каждого эмбриона/щенка (рис. 2B). Если щенок эмбриона мужского пола, яички будет distinguishable формирования трубочку, а также расположение гонады (Рисунок 2D). Как развивать мужской эмбрионов, яички будет спустимся к пенис становится больше и овальной формы.
Яйцеклетка хроматина распространение техника требует мастерства сбора яйцеклеток и манипуляции с помощью пипетки приводом рот стекла или капиллярной. Мы рекомендуем, практикующих, контролируя рот пипеткой перед выполнением настоящего Протокола. Потянув правильный размер стекла пипеткой/капилляра для коллекции и уничтожив ооциты увеличит шансы успеха и эффективности путем минимизации времени ооциты находятся за пределами инкубатора, а также решение Tyrode. Правильное время для удаления ZP чрезвычайно важно для успеха этого метода. Если яйцеклеток инкубируют в Tyrode и решение для недостаточное количество времени, ЗП не удаляется полностью. Это предотвращает разрыва эффективно на слайде, как можно увидеть в рисунке 6Eяйцеклеток. Однако если яйцеклеток инкубируют в Tyrode и решение слишком долго, качество ооцитов и ниже по течению иммунофлюоресценции пятнать будут серьезно подорваны. Мы рекомендуем смотреть яйцеклеток под микроскопом для определения точного времени ZP растворяется в Tyrode и решение. Добавить только 5 – 10 яйцеклеток в то время в Tyrode и решение позволит свести к минимуму чрезмерного воздействия. Если яйцеклеток выпускаются слишком высоко над слайд PFA-покрытием, хромосом может распространяться слишком далеко друг от друга (рис. 6F). Оптимальные результаты находятся когда ооциты выпускаются 1 см выше слайд. Другие факторы, которые могут помешать результаты включают длительное воздействие на снижение уровня CO2 в атмосферном воздухе во время манипуляции шаги ооцитов. Это вызывает колебания рН в средствах массовой информации, которые наносят ущерб качество ооцитов и очевидной прогрессивного цвет изменение средств массовой информации от оранжево красных до розового. Буферизации способности средств массовой информации также уменьшается с течением времени; Таким образом мы не рекомендуем с помощью средств массовой информации, которая была храниться (4 ° C) для больше чем 1 неделю. Средний м2, которая не требует CO2 для буферизации, обычно используется в качестве альтернативы.
Ограничение распространения хроматина подготовку является отсутствие визуализации хроматина в собственном контексте ячейки. Не могут быть визуализированы клеточного материала вне ядра и шпинделя формирования не могут быть оценены. Таким образом другие методы могут использоваться для оценки женских помимо хроматина спреды, например весь ооцитов immunolabelling после monastrol лечения, который разрушается Би Полярный шпинделя в моно Полярный шпинделя22. Это позволяет сестра chromatids следует оценивать в контексте ячейки. Коллективно описанные здесь методы хроматина распространения легко может применяться для оценки морфологии и хромосомы плоидности хроматина в женских моделей Роман трансгенных и мутантных мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIGMS (R01GM11755) для P.W.J и обучения Грант стипендий от Института национального рака (НИЗ) (CA009110) Г.Х. и. г.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
