Summary
Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.
Abstract
Técnicas de propagação de cromatina foram amplamente utilizadas para avaliar a localização dinâmica de várias proteínas durante a gametogênese, particularmente para a espermatogênese. Essas técnicas permitem para visualização dos padrões de localização de DNA e proteína durante eventos meióticos como cromossomos homólogos emparelhamento, synapsis e DNA de reparação. Enquanto alguns protocolos têm sido descritos na literatura, técnicas de propagação de cromatina geral usando oócitos mamíferos prófase são limitadas e difícil devido a hora de início da meiose em ovários fetais. Em comparação, espermatócitos prófase podem ser coletados de ratos machos juvenis com rendimentos mais elevados, sem a necessidade de microdissection. No entanto, é difícil obter uma população sincronizada pura de células em estágios específicos devido à heterogeneidade das populações meiótica e pós meiótica de células germinativas do testículo de jovens e adulto. Para fases posteriores da meiose, é vantajoso para avaliar oócitos passando por meiose I (MI) ou meiose II (MII), porque grupos de oócitos maduros podem ser colhidos em ratos fêmeas adultos e estimulados a retomar a meiose em cultura. Aqui, métodos para preparações de cromatina meiótica espalhar usando oócitos dissecado de fetal, neonatal e adultos ovários são descritos com demonstrações em vídeo de acompanhamento. Eventos de missegregation cromossomo em oócitos mamíferos são frequentes, particularmente durante MI. Estas técnicas podem ser usadas para avaliar e caracterizar os efeitos de mutações diferentes ou exposições ambientais durante várias fases da oogénese. Como existem diferenças distintas entre a ovogênese e espermatogênese, as técnicas descritas dentro são de valor inestimáveis para aumentar nossa compreensão da oogénese mamíferos e as características sexualmente dimórficas de cromossomo e proteína dinâmica durante a meiose .
Introduction
Durante a espermatogênese, grandes ondas semisíncronas de meiose células germinativas são uma reposta rápida e continuamente, no testículo no início da puberdade e ao longo da vida adulta1. Em contraste com os machos, meiose em fêmeas é iniciada somente durante o desenvolvimento fetal. Após o nascimento, oócitos permanecem presos em um estágio de Dictióteno prolongada da prófase I com uma intacta vesícula germinal (GV; envelope nuclear) até a puberdade. No início da puberdade, um subconjunto de ovócitos ciclicamente são selecionados para sofrer o crescimento e maturação, marcando o início da retomada meiótica. Meiótica retomada em oócitos já crescidos manifesta-se pelo desaparecimento do GV em um processo conhecido como vesícula germinal avaria (GVBD). O oócito então sofre condensação cromossomo e segregação, seguido por extrusão de corpo polar. Oócitos tornar-se preso em cima de progressão para MII e são estimulados para completar a segunda e última divisão meiótica somente após a fertilização.
Fertilidade feminina é altamente dependente do sucesso da prófase meiótica eu progressão. Chave para isso é a formação de uma ligação física entre cromossomos homólogos, conhecido como o chiasmata, que é mediada pela reparação de quebras da cadeia dupla induzidas DNA (DSBs) através de de recombinação de cruzamento2. Este processo ocorre dentro do contexto de um andaime ricos em proteínas dinâmico, conhecido como o complexo de synaptonemáticos (SC) que se forma entre os cromossomos homólogos para facilitar sua sinapse3. A SC é uma estrutura tripartida do zipper-como que consiste de dois elementos laterais paralelos conectados por proteínas da região central que detém homologs juntos ao longo de reparo de ADN em curso. Antes da sinapse, precursores dos elementos laterais, chamados de elementos de axiais, formam-se entre irmã cromátides irmãs. Synaptonemáticos complexo proteínas tais como SYCP2 e SYCP3 formam elementos axiais que colocalize para os eixos de coesão cromátide-irmã durante a prófase inicial. Estes mais tarde serve como ligação locais para a proteína de filamento transversal, SYCP1, o que facilita a montagem do elemento central e sinapse entre homologs alinhado4. Em oócitos de rato, synapsis completa é indicado pela presença de 20 completamente sobreposição de trechos de SYCP3 e SYCP1, que podem ser visualizados usando cromatina espalhar os preparativos. Sinapse é concluído com a entrada no subestágio paquíteno, segundo o qual os crossovers maduros que estão destinados a chiasmata forma entre homologs estão decorados com mutL dímeros de homólogo (MLH1/3) para promover sua transformação precisos5,6 , 7. a manutenção estrutural dos complexos de cromossomos (SMC), incluindo cohesin, nà e o SMC5/6 complexos, são importantes para a regulação da dinâmica do cromossomo e estrutura em toda a meiose8,9, 10,11,12. Coletivamente, esses eventos garantir bi-orientação correta dos cromossomos homólogos para opostas polos do eixo após a desmontagem do SC.
O ciclo celular meiótico é um poderoso modelo para examinar os papéis de várias proteínas na manutenção do genoma devido a indução programada e subsequente reparação de DNA DSBs. Além disso, a meiose mamíferos é também um modelo relevante para o estudo das alterações epigenéticas e imprinting genômico13. No entanto, é tecnicamente difícil de avaliar esses eventos durante a meiose feminina, que terá lugar nos ovários fetais e Neonatais em mamíferos (Figura 1). Prófase, que pode ser dividida em 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e Dictióteno. Aqui, descrevemos como isolar e distinguir entre fetais e Neonatais ovários e testículos (Figura 2). Adaptado de métodos anteriormente descritos, este manuscrito também descreve um protocolo (etapa 1), com vídeo de demonstração para a preparação da prófase meiótica feminino eu cromatina espalha14,15,16,17 . Quando acoplado com encontrava, como descrito nos passos 6-7, este protocolo permite análise microscópica detalhada da prófase eu eventos em oócitos.
A ovogênese é propenso a erros e eventos de missegregation do cromossomo durante a primeira divisão meiótica representam a fonte mais comum de doença genética na descendência18,19. Este manuscrito (etapa 2 do protocolo), descrevemos um protocolo no qual oócitos maduros GV-encenado são extraídos aprontados ovários de camundongos fêmeas adultos. Sob condições de apoia, já crescidos oócitos submeter-se independente de hormônio luteinizante retomada da meiose após isolamento e cultura20. Após retomada meiótica, oócitos progridem através da meiose, em seguida, prendam na metáfase II. Oócitos permanecem presos em metáfase II, a não ser fertilizado. Nas etapas 2 a 5, adaptamo-nos protocolos anteriormente relatados com vídeo de demonstração para descrever como coletar, cultura e preparar MI e MII oócitos por cromatina espalhar preparações21. Esta cromatina espalhando técnica permite encontrava clara de proteínas associadas com cromossomos. Além disso, esse protocolo também pode ser usado para distinguir entre cromossomos bivalentes e univalentes e ainda mais pode resolver a única irmã cromátides irmãs para facilitar a avaliação da ploidia de ovócitos. Portanto, além de revelar os padrões de localização de proteínas meióticas, esse protocolo também pode servir como uma ferramenta inestimável para elucidar as causas potenciais de missegregation do cromossomo durante MI e MII.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Johns Hopkins. Experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem.
1. colheita de ovários Fetal ou Neonatal e preparação da prófase cromatina se espalha
- Para extrair os embriões em 14,5 – 19,5 dias post-coitum (dpc) sacrificar as fêmeas grávidas através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.
Nota: Para os ovários de 1 – 5 dia pós-natal, pule para a etapa 1.3. A Figura 1 resume as fases de prófase meiótica enriquecidas em diferentes idades embrionárias e pós-natal. - Abra a cavidade abdominopelvic usando uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Dissecar para fora o corno uterino materno, separar os embriões da placenta e transferir os embriões em 35mm placas de Petri contendo 3 mL de pré-aquecido 1x salino de tampão fosfato (PBS) a 37 ° C.
Nota: Uma incubadora fliptop definir a 37 ° C pode ser usada para manter a temperatura. Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também pode ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do ovário. - Com uma tesoura cirúrgica de 3,5 polegadas, sacrifica embriões ou filhotes através de decapitação de acordo com as diretrizes IACUC. Coloque embriões decapitados ou filhotes em PBS pré-aquecido antes da dissecação mais.
- Dissecar um embrião ou filhote de cada vez em um prato de petri 35mm separado contendo 3 mL de PBS pré-aquecido a 37 ° C. Prossiga por corte ao longo da linha mediana ventral da parte posterior do embrião, ao longo da metade anterior abaixo os membros dianteiros e diretamente acima do-patas e cauda, conforme descrito na Figura 2A–B.
- Abra o abdômen com uma tesoura cirúrgica de 3,5 polegadas. Usando pinças de ponta fina deslocar ou remover o fígado e loops de intestino, expondo os ovários em um prato de petri 35mm nova contendo 3 mL de PBS pré-aquecido a 37 ° C (consulte guia Figura 2B). Os ovários estão localizados imediatamente abaixo e atrás do rim em direção à parede posterior da cavidade peritoneal (Fig. 2B-C). Um guia para a diferenciação entre machos e fêmeas gônadas é fornecido na Figura 2D.
Nota: Para condições ideais, rapidamente disse para fora dos ovários após a fêmea grávida é sacrificada. - Remover os dois ovários de cada feto feminino usando um par de pinças de ponta fina sob um escopo de dissecação e coloque em vidros de um relógio ou poços separados de um poço multi placa contendo 0,5 a 1,0 mL de PBS pré-aquecido e mantêm a 37 ° C.
- Coloque cada par de ovários em 0,5 mL hipo-solução tampão (17mm citrato trissódico dihidratado, sacarose 50 mM, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inibidor de protease, pH 8,2) em um vidro de relógio limpo ou um pequeno poço de uma placa de 9-bem, certificando-se de imergir o comp de ovários activaçã. Incube durante pelo menos 15 minutos, mas não mais de 30 min.
Nota: Fazer hipo-solução tampão fresco e usar até 2 horas após a adição de TDT. - Durante a incubação, usando uma barreira hidrofóbica PAP caneta, desenhe dois quadrados de2 22 x 22 mm em um vidro limpo 25 x 75 mm2, 1mm espessura de microscópio como mostrado na Figura 3A.
Nota: Os Slides podem ser preparados antes do tempo. - Pipetar 45 a 50 µ l de sacarose 100 mM numa lâmina limpa e um par de ovários de transferência para a gota.
- Usando as extremidades afiadas de duas agulhas 27 G, arreliar os ovários separados para liberar as células para a solução de sacarose. Com a pinça, Retire pedaços grandes de ovário e pipetar cuidadosamente a solução de sacarose para dispersar as células.
- Lugar de 40 µ l de solução fixador (1% paraformaldeído (PFA), 0,2% de detergente (veja Tabela de materiais), pH 9,2) em cada quadrado do slide preparado. Com uma ponta de pipeta 200 µ l, espalhe a solução fixador uniformemente sobre a superfície do slide.
- Pipete 20 µ l da mistura de sacarose para cada Praça do slide contendo o fixador.
Observação: Isso equivale a usar um par de ovários por slide. - Incube os slides em uma câmara fechada e úmido durante a noite em temperatura ambiente.
Nota: A incubação durante a noite pode variar em torno de (12-15 hrs) à temperatura ambiente. - Abra a tampa da câmara e permitir que os slides secar completamente.
- Lave os slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de solução de PBS agente umectante 0,4% (ver Tabela de materiais) por 2 min, secar ao ar e proceder ao protocolo encontrava (etapa 6).
Nota: Pode ser possível armazenar as lâminas a-80 ° C para uso posterior, mas isso varia dependendo da proteína de interesse. Para obter melhores resultados imediatamente no protocolo encontrava (etapa 6).
2. metáfase eu oócito coleção
- Para maximizar o número de folículos antrais isoladas de cada mouse, intraperitonealmente injete camundongos fêmeas virgens sexualmente maduros com 5 UI de gonadotrofina de soro de égua grávida (PMSG, também conhecido como equinos gonadotrofina coriônica (eCG)).
Nota: Para o rendimento ideal do oócito, ratos devem ser 1 a 3 meses de idade, como o número de oócitos colhidos irá diminuir com a idade. Para preparar a PMSG, dissolver garrafa de 5.000 UI em 100 mL de PBS estéril (5ml de U/0.1) loja alíquotas de uso único de 600 µ l a-20 ° C. - Depois de 44 – 48 h, prepare o suporte de coleção, mínimo essencial médio alfa (MEMα) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 3 mg/mL albumina de soro bovino (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Esterilize a mídia através de um filtro de poro de 0,2 µm. Decante a 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS médio em um prato de vidro por rato e aquecido a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .
Nota: Outros coleção e meios de cultura que estão comercialmente disponíveis (M2 e M16) também são comumente usados.
Atenção: Recomendamos retirar pratos de cultura 5% CO2 incubadora uma em uma hora de duração limitada minimizar a exposição de ar ambiente durante as etapas de manipulação. - Sacrifica os ratos através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.
- Abra a cavidade abdominopelvic com uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Usando fórceps, deslocar os intestinos na direcção da cabeça do rato. Localize cada corno uterino; os ovários são apresentar proximal para a caixa torácica. Segure o oviduto com pinça fina e cortar a gordura superior para o ovário usando tesouras de dissecação (Figura 4). Continue a segurar o oviduto e com outro conjunto de pinças bem libertar o ovário da bursa e coloque no prato de coleção contendo meio de MEMα/BSA/FBS.
Nota: Como na etapa 1, é imperativo a manter os ovários a 37 ° C e em 5% CO2. Uma incubadora de fliptop ligada a 5% CO2 mistura pode ser usada para permitir a manutenção ideal de temperatura e os níveis de CO2 . Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também deve ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do oócito. - Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha de calibre 27 (ou tamanho similar), liberar complexos de cumulus oócito por punção manualmente os grandes folículos antrais.
- Observando-se através de um microscópio de dissecação, recolha ovócitos GV-encenado utilizando uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar ou uma manual micrômetro-seringa (Figura 5). Apenas recolha ovócitos que são liberados de folículos antrais. Ovócitos GV tem um diâmetro de aproximadamente 90 µm. ovócitos GV pode ser rodeados por 2-3 camadas de células da granulosa e ter um diâmetro total de cerca de 200 µm.
- Cultura de oócitos em um vidro de relógio limpo ou uma placa de 9 contendo meio de FBS/MEMα/BSA para 6 h chegar a metáfase eu a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .
- Prossiga para a etapa 4.
3. metáfase II (MII) oócito coleção
- Para maximizar os oócitos isolados de cada mouse, intraperitonealmente injete camundongos fêmeas virgens sexualmente maduros com 5 IU de PMSG. Depois de 44 – 48 h, injete intraperitonealmente com 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG).
Nota: Para o rendimento ideal do oócito, ratos devem ser 1 a 3 meses de idade, como o número de oócitos colhidos irá diminuir com a idade. Para preparar o hCG, dissolver uma garrafa de 10.000 U em 200 mL de PBS (5ml de U/0.1). Armazenar em alíquotas de uso único de 600 µ l a-20 ° C. - Após 12-14 hrs, prepare o suporte de coleção de MEMα/BSA/FBS, conforme descrito no passo 2.2, acima.
- Sacrifica os ratos através do deslocamento cervical ou CO2 asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.
- Abra a cavidade abdominopelvic com uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Usando fórceps, deslocar os intestinos na direcção da cabeça do rato. Localize cada corno uterino, os ovários estão presentes proximal para a caixa torácica. Segure o oviduto com pinça fina e cortar a gordura superior para o ovário usando tesouras de dissecação (Figura 4). Em seguida, remover o ovário e o oviduto e coloque no prato de coleção contendo meio de MEMα/BSA/FBS.
Nota: Como nas etapas 1 e 2, é imperativo a manter os ovários a 37 ° C e em 5% CO2. Uma incubadora de fliptop ligada a 5% CO2 mistura pode ser usada para permitir a manutenção ideal de temperatura e os níveis de CO2 . Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também deve ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do oócito. - Usando uma seringa de 1 mL com um 27 G (ou tamanho similar) ou fórceps em ponto, abrir um buraco da ampola do oviduto para liberar os oócitos MII.
Nota: Tenha cuidado para não danificar os oócitos na ampola. A ampola aparecerá inchadas e translúcido, tal que os oócitos são visíveis (Figura 4). - Colheita MII oócitos da ampola do oviduto para uma nova placa com meio de coleção usando uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar ou uma manual micrômetro-seringa (Figura 5).
- Prossiga para a etapa 4.
4. oócito desnudamento e remoção da Zona pelúcida
- Prepare 300 UI/mL de hialuronidase em meio MEMα suplementado com 3 mg/mL BSA para DDE oócitos de em torno de células do cumulus (2.5 mL/mouse) em um vidro de relógio e manter a 37 ° C, 5% de CO2.
Nota: Eficácia de hialuronidase diminui acentuadamente após 1h de preparação. Para oócitos MII, hialuronidase tratamento não é necessário. - Expor a complexos de célula cumulus-oócito a 300 UI/mL de hialuronidase em MEMα/BSA para 3 min para DDE oócitos de em torno de células do cumulus.
Cuidado: Não exceda 3 min exposição a hialuronidase, que danificará os ovócitos. - Para lavar os oócitos, transferência de oócitos para um fresco aquecido prato médio MEMα/BSA. Usando uma pipeta de vidro pequena boca-operado ou capilar (um pouco maior que o diâmetro do ovócito, que é aproximadamente 90 µm), pipetar os complexos acima e para baixo para separar completamente as células do cumulus. Permitir que os oócitos recuperar na incubadora, enquanto se prepara para a próxima etapa.
- Aquecer a solução do ácido Tyrode, MEMα/BSA e mídia do Waymouth a 37 ° C (500 µ l/mouse). Lugar de 300 µ l em cada poço de placas de vidro 9-bem pequeno.
- Para remover a zona pelúcida (ZP) transferi oócitos de 5 – 10 para solução de Tyrode. Expor os oócitos para apenas 30-45 s para a solução.
Nota: Muito pouca exposição à solução não irá remover o ZP completamente, que impedirá os oócitos estourando e cromossomos de espalhar. Demasiada exposição irá danificar e matar o oócito. Assistindo o dissolver ZP sob o microscópio de dissecação pode auxiliar na otimização do tempo de exposição.
Cuidado: Usando a solução de Tyrode fresco é fundamental, como sua função declina com a idade. Uso um bem fresco de solução de Tyrode para cada grupo de oócitos tratados para garantir a digestão uniforme da ZP. - Imediatamente após a remoção de ZP, lave os oócitos pela transferência para aquecido médio MEMα/BSA/FBS. Repita essa etapa de lavagem.
Nota: Tenha cuidado ao transferir, como oócitos facilmente vão ficar juntos e a pipeta de vidro ou remoção seguinte capilar da ZP. Pre-molhando a pipeta de vidro ou capilar em meio do Waymouth minimizará oócitos coladas. - Transferência e permitir que os oócitos recuperar durante 30 minutos no meio do Waymouth a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 .
- Prossiga para a etapa 5.
5. MI e MII oócito cromatina Spreads
- Usando uma caneta PAP, desenhe um retângulo de2 de 11 x 44 mm sobre a lâmina de vidro, como mostrado na figura 6A.
- Revestir o slide com uma fina camada de fixador (1% paraformaldeído, 0,2% Triton-X100 em H2O, pH 9,2) por Pipetar 100 µ l de fixador para o slide e balançando o slide e para trás. Toque o slide para se livrar do excesso fixador.
- Buscar entre 5-10 ovócitos com uma agulha de pipeta de boca pequena com como pouco mídia quanto possível e arraste a agulha em linha através do slide fixador-revestido enquanto depositando os oócitos de 1 cm acima do slide na solução de fixador. Execute esta etapa usando um microscópio de dissecação para garantir que os oócitos foram depositados e que eles tem estourado.
Nota: Os oócitos devem estourar imediatamente no slide. A altura em que os oócitos são depositados impacto o grau da cromatina se espalhando. Ver resultados representativos na Figura 6 para mais detalhes. - Incube à temperatura ambiente em uma câmara fechada umidificada durante a noite para permitir que a cromatina aderir.
- Permitir que os slides secar completamente e enxágue slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de 0,4% agente umectante-H2O, pH 8.0.
- Prossiga para a etapa 6.
6. encontrava
- Prepare o tampão de diluição de anticorpo (ADB) descrito na tabela 1.
- Preparar duas Coplin frascos contendo 50 mL de solução-tampão (WB) lavagem (10% ADB diluído em PBS) e uma jarra de Coplin contendo solução de detergente WB e 0,05% 50 mL (por exemplo, adicionar 250 µ l de 10% de detergente para 50ml WB).
- Lave os slides que foram preparados em seção 1 e 5 do presente protocolo por 10 min em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de WB.
Atenção: Não seque os slides em qualquer ponto durante a encontrava. - Lave os slides para 10 min no Coplin frasco contendo 50 mL WB e 0,05% de solução de detergente. Em seguida, lave os slides no restante Coplin frasco contendo 50 mL de solução de WB por 10 min.
- Toque fora slide excesso de líquido e a tampa com 100 µ l de anticorpos primários selecionados diluído em ADB. Incube a 4 ° C durante a noite em uma câmara fechada e úmida.
Nota: A incubação pode ser encurtada para 2 a 3 horas a 37 ° C. Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm. - Lave os slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-PBS, pH 8.0.
- Repita as etapas de 6,2 a 6,5.
- Toque fora slide excesso de líquido e a tampa com 100 µ l de anticorpos secundários selecionados diluído em ADB. Incubar 1 a 2 horas a 37 ° C em uma câmara fechada e úmida.
- Lave slides 2 vezes por 10 min em Coplin frascos contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-PBS, pH 8.0.
- Lave slides 2 vezes por 5 min em Coplin frascos contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-H2O, pH 8.0.
7. montagem slides
- Para prófase cromatina se espalha preparada no passo 2, adicionar 100 µ l de meio de montagem, contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Para MI e MII cromatina se espalha preparado no passo 5, adicionar 50 µ l de meio de montagem contendo DAPI (1.5µg / mL). Delicadamente borre fora excesso de líquido.
- Coloque uma lamela de 22 x 60 mm na parte superior e selar com esmaltes claros. Armazenar em uma caixa de slides em 4 ° C ou a-20 ° C até avaliação através de microscopia de fluorescência.
Nota: Toque levemente no deslizamento da tampa para livrar-se de meio de montagem em excesso antes de vedação com esmalte.
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Representative Results
Descrevemos duas técnicas para visualizar e avaliar os cromossomos meióticos em oócitos. A primeira técnica é servida para avaliar a progressão da prófase em ovários embrionários e Neonatais. Prófase cromatina propagação preparações são incrivelmente valiosas para a visualização de numerosos processos dinâmicos durante a meiose, incluindo cromossomo emparelhamento, synapsis e desynapsis, recombinação homóloga e epigenético cromossomo remodelação. Aqui, temos demonstrado a utilidade desse método para visualização robusta e análise quantitativa da formação de cruzamento em oócitos colhidos C57BL/6J embriões (Figura 3B e 3C). Para enriquecer para as células do subestágio paquíteno, embriões de rato foram recuperados em 18,5 dpc (Figura 1). Duas principais características do subestágio paquíteno da prófase I são a conclusão da sinapse entre homologs e a formação de pelo menos um crossover MLH1/3-positivo por par homólogo. Synapsis completa entre homologs manifesta-se pela presença de 20 SYCP3 se sobrepõem e se estende SYCP1. Para caracterizar a formação de cruzamento em oócitos selvagem-tipo nós cromatina de prófase immunolabeled espalhar preparações usando anticorpos que detectam, SYCP3, SYCP1 e MLH1 e manchado de DNA usando DAPI. Figura 3B retrata uma imagem representativa de um oócito de estágio de paquíteno, que é evidenciado pela presença de 27 MLH1 focos, distribuídos ao longo de 20 estruturas de SC totalmente montadas. O número médio de crossovers MLH1-positivo detectado em oócitos de tipo selvagem foi de 24 ± 3 (Figura 3 C, N = 15 oócitos). Figura 3D mostra SMC6 enriquecido na região de heterocromatina (PCH) pericentromeric e ao longo dos braços do cromossoma e focos MLH1 distribuídos ao longo da SC na fase de paquíteno. Figura 3E retrata um oócito paquíteno encenado onde a preparação de propagação do cromossomo estava abaixo do ideal e cromossomos individuais são indistinguíveis, impedindo uma avaliação exacta dos SYCP3, SMC6 e MLH1. Propagações de cromossomo sub-ótimo podem ser observadas quando incubação dos ovários em hipo-solução tampão é por muito tempo ou não por muito tempo suficiente.
A segunda técnica descrita pode ser usada para avaliar a morfologia de cromatina em oócitos após reinício meiótico (Figura 6B-D). A localização da proteína, bem como a ploidia, pode ser facilmente avaliada, expondo as possíveis causas de erros de segregação do cromossomo. Figura 6B retrata um oócito MI mostrando 20 cromossomos e claro Centrómero e pericentromeric heterocromatina coloração. Figura 6 é uma imagem ampliada onde topoisomerase IIα (TOPOII) pode ser visto ao longo dos braços do cromossomo e o PCH. A Figura 6 mostra um oócito MII onde irmã emparelhada cromátides irmãs podem ser distinguidos por morfologia de cromossomos e o centrômero. Erros comuns vistos ao tentar esta técnica incluem oócitos não estourando quando lançado para o slide de PFA revestido, bem como cromossomos se espalhando muito distantes uma da outra (Figura 6E–F). Se o ZP não é removido completamente, os cromossomos permanecerá associados ao fuso, como mostrado na Figura 6E. Se os oócitos são descartados muito alto no slide PFA revestido de, os cromossomos podem ser afastados também como está representada na Figura 6F.
Figura 1: cronograma de prófase meiótica durante o desenvolvimento embrionário e neonatal feminino. Contornos azuis indicam as populações específicas prófase sub fase de pilhas de germe (leptóteno, zygote, paquíteno e diplóteno/Dictióteno estágios) observadas durante o desenvolvimento embrionário e neonatal. Aumentando a cor azul escuro indica o momento em que o estágio de prófase específico sub torna-se mais abundante. Esta figura era adaptada de referência2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: extração de ovário de embriões e Neonatais filhotes fêmeas. (A, B) O primeiro corte (1) é feito acima os membros dianteiros para decapitar o embrião na junção da cabeça/pescoço imediatamente após a recuperação do corno uterino materno. O segundo corte (2) é feito ao longo da linha mediana ventral da parte posterior do embrião, seguido por incisões ao longo da metade anterior abaixo os membros dianteiros (3). Um corte final é feito para a remoção, as patas e cauda (4). (A) esquema de vista Frontal dos cortes de dissecação para isolamento de ovários de filhotes fêmeas. (B) esquema de vista de lado de dissecação cortes para isolamento dos ovários com posições relativas dos órgãos internos. Regiões mostradas a luz vermelhas incluem o fígado e intestinos, que são removidos durante a dissecção. A parede dorsal e órgãos associados são mostrados na luz azuis. Esta região inclui os ovários, que estão conectados para os polos inferiores dos rins na parte superior da trompa uterina. (C) Vista Frontal esquemática da parede dorsal do embrião após a remoção do fígado e intestinos. (D) representação esquemática das diferenças morfológicas entre machos e fêmeas gônadas em aproximadamente 15 – 18 dpc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: cromatina prófase representante espalhar preparações. (A) vidro deslize esquemático para cromatina prófase espalhar os preparativos. Contornos quadrados pretos representam bloqueador líquido caneta contornos. (B, C) Imagens representativas e quantificação da formação de cruzamento em oócitos de estágio de paquíteno selvagem-tipo usando cromatina prófase difundir métodos de preparação descritos na etapa 1. Propagações de cromatina (B) foram realizadas usando embriões do rato fromC57BL/6J isolados de ovários em 18,5 dpc. Propagações de cromatina foram immunolabeled com anticorpos contra a proteína do elemento lateral SC SYCP3 (vermelho) e a proteína de elemento central do SC SYCP1 (magenta), MLH1 (verde, marcador de evento crossover) e DAPI (azul, DNA). Barra de escala = 10 µm. (C) parcela do ponto dos focos MLH1 contagens obtidas 15 cromatina de estágio de paquíteno espalhar os preparativos. Barras de erro representam o desvio padrão. (D, E) comparação do ideal (D) e abaixo do ideal (E) prófase espalhar preparações, respectivamente. Propagações de cromatina foram immunolabeled com anticorpos contra SMC6 (vermelho), MLH1 (verde) e SYCP3 (azul). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: diagrama esquemático do ovário adulto. Este diagrama mostra a anatomia do ovário de rato adulto, oviduto, útero e ampola. Ovários de mouse devem ser removidos por cuidadosa incisão dos ligamentos conectando os ovários para os polos inferiores dos rins e a parede posterior do abdome. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagens de pipeta de vidro boca-operado, capilar de vidro e manual micrômetro-seringa usada para manipulação do oócito. (A) o manipulador de oócito de pipeta de vidro é composto dos seguintes componentes na sequência: a boca, tubo de látex (3,2 mm diâmetro interno (ID) x diâmetro exterior de 6,4 mm (OD)), ponta da pipeta de 1 mL, tubo de látex (ID de 6,4 mm x 11,1 mm OD) e vidro pipeta Pasteur. A extremidade do vidro pipeta Pasteur foi aquecida por uma chama e a puxou para criar uma ponta de ponta fina (Figura 5A1). (B) o manipulador do oócito capilar de vidro é composto dos seguintes componentes em sequência: parte de boca, filtro de 0,45 µm (opcional), tubo de látex (ID de 3,2 mm x 6,4 mm OD), ponta da pipeta de 1 mL, tubo de látex (ID de 6,4 mm x 11,1 mm OD) e 70 µ l capilar de vidro. Os tubos capilares de vidro são aquecidos com uma chama no centro e puxados em direções opostas para criar dois capilares com extremidades de ponta fina (Figura 5B1). (C) a micrômetro manual-seringa é composta dos seguintes componentes na sequência: cabeça de 150-208 micrômetro Mitutoyo (médio tamanho, 0-1 "variam, 0,001" formatura), seringa de 5 mL, tubo de látex (ID de 3,2 mm x 6,4 mm OD), ponta da pipeta de 1 mL, tubo de látex (ID de 6,4 mm x 11,1 mm OD), ponta da pipeta de 1 mL e 83 x 0.5 mm2 gel de carregamento na ponta. A cabeça de 150-208 micrômetro Mitutoyo é firmemente inserida a seringa de 5 mL (5 figura1). Para garantir que a ponta de carga do gel é fixada firmemente, a pipeta de 1ml a ligação ponta é cortada (5 figura2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: representante metáfase I e cromatina do oócito II espalhar os preparativos. (A) Slide esquemático para metáfase I e II oócito cromatina propagação preparações. Oócitos (círculos) lançados através de uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar em linha reta (seguindo a seta). Contorno do retângulo preto representa o contorno de caneta bloqueador líquido. (B, C) Metáfase ideal eu preparação de cromatina espalhada. Metáfase eu cromossomos estavam manchados com DAPI (azul, DNA) e immunolabeled ao CEN (verde, marcador de cinetócoro/Centrómero). Barras de escala = 10 µm. (B) anticorpos contra histona H4 (di metil K20, tri metil K20) era usado para rotular heterochromatin pericentromeric (PCH). (C) anticorpos contra Topoisomerase IIα (TOPOII) foram usados para rotular os eixos PCH e cromossomo. (D) cromatina de ideal metáfase II propagação de preparação. Cromossomos de metafase II foram corados com DAPI (azul, DNA) e immunolabeled ao CEN (verde) e histona H4 (di-metil K20, tri-metil K20) para rotular o PCH. Barra de escala: 10... (E, F) pobre metáfase eu cromatina espalhar os preparativos. Cromossomos estavam manchados com DAPI (azul, DNA) e immunolabeled ao CEN (verde) e o componente cohesin meiótica, REC8. Barras de escala = 10 µm (E) um oócito que não me desfiz após a liberação para slide PFA revestido. (F) cromossomos que estavam afastados também. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Item de | Quantidade | Concentração final |
| 1X PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (p/v) |
| Soro de cavalo | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% de detergente (veja Tabela de materiais) em PBS |
250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabela 1: Receita do anticorpo diluição amortecedor (ADB). Armazenar o ADB a 4 ° C ou congelar ações a-20 ° C, se tornando maiores quantidades. ADB podem ser contaminados, então certifique-se de boas técnicas de assepsia são utilizadas e avaliar a solução para a contaminação antes de cada utilização. Alíquotas menores do ADB também podem ser preparadas para minimizar a contaminação.
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Discussion
Preparações de propagação de cromatina permitem aos pesquisadores estudar cronologicamente fêmea mamífera meiose e a localização dinâmica das proteínas envolvidas. Os spreads de cromatina embrionário e neonatal permitem a análise detalhada dos eventos durante a prófase meiótica. Metáfase I e metáfase II propagações de cromatina podem ser usadas para distinguir a única irmã cromátides irmãs de emparelhado irmãs e cromossomos homólogos emparelhados, bem como avaliar a ploidia. Em comparação, o protocolo descrito aqui pode ser vantajoso em relação ao oócito inteira encontrava, que frequentemente produz altos níveis de sinal de fundo que diminui a resolução das proteínas da cromatina-limite. Além disso, técnicas de propagação de cromatina representam uma alternativa atraente para a imagem latente da viver-pilha, que exige um grande investimento de tempo e equipamentos especializados.
Os ovários embrionários e Neonatais podem ser difíceis de localizar e extrair. Recomendamos extrair cuidadosamente todos os outros órgãos e material além dos rins em um prato separado contendo PBS antes procurando os ovários e usando um prato fresco de PBS para cada embrião/filhote de cachorro (Figura 2B). Se o embrião/filhote é masculino, o testículo será distinguível pela formação do túbulo, bem como a localização das gônadas (Figura 2D). Como o desenvolvem de embriões masculinos, os testículos descerá para o pênis, tornando-se maiores e de forma oval.
O oócito cromatina espalhar técnica exige mestria da coleção do oócito e manipulação usando pipeta de vidro boca-operado ou capilar. Recomendamos que praticando controlando a pipeta de boca antes de realizar este protocolo. Puxando o tamanho apropriado pipeta/capilar de vidro para coleta e desnudamento oócitos aumentará as chances de sucesso e eficiência, minimizando o tempo de oócitos são fora da incubadora, bem como na solução de Tyrode. Timing correto para a remoção de ZP é extremamente importante para o sucesso deste método. Se os oócitos são incubados em solução de Tyrode para uma quantidade insuficiente de tempo, o ZP não será completamente removido. Isso impede que os oócitos estourando eficientemente no slide, como pode ser visto na Figura 6E. No entanto, se os oócitos são incubados em solução de Tyrode por muito tempo, qualidade do ovócito e mancha a jusante da imunofluorescência estará severamente comprometidos. Recomendamos que assistindo os oócitos sob um microscópio para determinar a hora exata da ZP dissolve-se na solução de Tyrode. Adicionando apenas 5-10 de oócitos em um momento a solução de Tyrode irá minimizar a exposição excessiva. Se os oócitos são liberados muito acima do slide PFA revestido, os cromossomos podem ser espalhados muito distantes uma da outra (Figura 6F). Óptimos resultados são encontrados quando os oócitos são liberados 1 cm acima do slide. Outros fatores que podem prejudicar os resultados incluem a exposição prolongada à diminuição dos níveis de2 CO no ar ambiente durante as etapas de manipulação do oócito. Isto faz com que as flutuações de pH em meios de comunicação que são prejudiciais para a qualidade do oócito e manifesta-se pela mudança de cor progressiva dos meios de comunicação de vermelho-alaranjado para rosa. A capacidade tampão da mídia também diminui ao longo do tempo; Portanto, não recomendamos usar meios de comunicação que tem sido armazenado (4 ° C) por mais de 1 semana. Médio do m2, que não necessitam de CO2 para ser armazenada em buffer, é comumente usado como uma alternativa.
Uma limitação à cromatina espalhar preparações é a falta de visualização da cromatina dentro do contexto nativo da célula. Material celular fora do núcleo não pode ser visualizado e formação do eixo não pode ser avaliada. Portanto, outros métodos podem ser usados para avaliar a ovogênese além de propagações de cromatina, como todo ovócito encontrava após o tratamento de monastrol, que recolhe o eixo bipolar em uma mono-polar eixo22. Isso permite que a irmã cromátides irmãs para ser avaliado no contexto da célula. Coletivamente, os métodos de cromatina espalhado aqui descritos facilmente podem ser aplicados para avaliar a ploidia de morfologia e cromossomo cromatina durante a ovogênese em modelos do rato transgénico e mutantes novela.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J e por uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para G.H. e J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
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