Summary
L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.
Abstract
Techniques d’étalement de la chromatine ont été largement utilisés pour évaluer la localisation dynamique de diverses protéines lors de la gamétogenèse, particulièrement pour la spermatogenèse. Ces techniques permettent pour la visualisation de protéines et de profils d’ADN localisation lors d’événements méiotiques comme les chromosomes homologues, appariement, Synapse et ADN de réparation. Tandis que quelques protocoles ont été décrits dans la littérature, les techniques d’étalement de chromatine générales à l’aide d’ovocytes chez les mammifères de la prophase sont limitées et difficiles en raison du calendrier de l’initiation de la méiose dans les ovaires foetaux. En comparaison, les spermatocytes de prophase peuvent être collectées de souris mâles juvéniles avec des rendements plus élevés sans nécessiter de microdissection. Toutefois, il est difficile d’obtenir une population pure synchronisée des cellules à des étapes spécifiques en raison de l’hétérogénéité des populations de cellules germinales méiotiques et après méiose dans les testicules juvéniles et adultes. Pour les étapes ultérieures de la méiose, il est avantageux d’évaluer en cours de la méiose I (MI) ou la méiose II (MII), parce que les groupes des ovocytes matures peuvent être prélevés dans des souris femelles adultes et stimulés pour reprendre la méiose dans la culture des ovocytes. Ici, méthodes pour les préparations de chromatine méiotique répartie à l’aide d’ovocytes disséqué de foetale, néonatale et ovaires adultes sont décrits avec des démonstrations vidéo d’accompagnement. Événements missegregation chromosomes dans des ovocytes de mammifères sont fréquentes, en particulier au cours de la MI. Ces techniques permettent d’évaluer et de caractériser les effets de mutations différentes ou des expositions environnementales au cours des différentes étapes de l’ovogenèse. Qu’il sont a des différences distinctes entre l’ovogenèse et la spermatogenèse, les techniques décrites dans sont inestimables pour accroître notre compréhension de l’ovogenèse chez les mammifères et les fonctionnalités présente un dimorphisme sexuel de la dynamique du chromosome et protéines au cours de la méiose .
Introduction
Au cours de la spermatogenèse, grosses vagues semi-synchrone des cellules germinales méiotiques sont rapidement et continuellement réapprovisionnés dans les testicules au début de la puberté et tout au long de l’âge adulte1. Contrairement aux hommes, la méiose chez les femelles est initiée uniquement pendant le développement du foetus. Après la naissance, les ovocytes restent arrêtées dans un stade de dictyate prolongé de la prophase I avec une vésicule germinale intacte (GV ; enveloppe nucléaire) jusqu'à la puberté. Au début de la puberté, un sous-ensemble d’ovocytes sont cycliquement choisis pour subir la croissance et la maturation, marquant le début de reprise méiotique. Méiotique reprise dans les ovocytes adulte se manifeste par la disparition de la GV dans un processus appelé vésicule germinale ventilation (GVBD). L’ovocyte subit alors la condensation des chromosomes et ségrégation, suivi par extrusion de globule polaire. Les ovocytes deviennent arrêtés à progression au PPFI et sont stimulés pour compléter la deuxième et dernière division méiotique seulement après la fécondation.
La fertilité féminine est fortement tributaire de la réussite de la prophase méiotique j’ai progression. Clé c’est la formation d’une liaison physique entre les chromosomes homologues appelés les chiasmas, médiée par la réparation des induits ADN double brins (CDB) par l’intermédiaire de crossover recombinaison2. Ce processus se produit dans le cadre d’un échafaudage de riches en protéines dynamique appelé complexe synaptonémal (CS) qui se forme entre les chromosomes homologues afin de faciliter leur synapsis3. Le SC est une fermeture à glissière-comme structure tripartite qui se compose de deux éléments latéraux parallèles reliées par des protéines de la région du centre qui détient homologues ensemble tout au long de la réparation de l’ADN en cours. Avant synapsis, précurseurs des éléments latéraux, appelés éléments axiales, forment entre sœur chromatides. Complexe synaptonémal protéines telles que SYCP2 et SYCP3 forment des éléments axiaux qui sont colocalisées pour les axes de la cohésion des chromatides au cours du début de la prophase. Plus tard service accepteurs pour la protéine de filament transversal, SYCP1, ce qui facilite l’assemblage de l’élément central et synapsis entre homologues alignés4. Dans les ovocytes de souris, synapsis complet est indiqué par la présence de 20 complètement chevauchement des tronçons SYCP3 et SYCP1, qui peuvent être visualisées à l’aide de la chromatine propager des préparations. Synapsis est terminé dès l’entrée dans le sous-étage pachytène, par lequel des véhicules multisegments matures qui sont destinés à des chiasmas forme entre homologues sont décorées avec mutL dimères d’homologue (MLH1/3) pour promouvoir leur traitement exact5,6 , 7. l’entretien structurel des complexes de chromosomes (SMC), y compris cohesin, condensin et la SMC5/6 complexes, sont importants pour la régulation de la dynamique des chromosomes et la structure tout au long de la méiose8,9, 10,11,12. Collectivement, ces événements s’assurer bi-orientation correcte des chromosomes homologues à lutter contre les pôles du fuseau après démontage de la SC.
La méiose des cellules est un modèle puissant afin d’examiner les rôles de diverses protéines dans maintenance du génome en raison de l’induction programmée et la réparation ultérieure des ADN CDB. En outre, la méiose chez les mammifères est également un modèle pertinent pour l’étude des modifications épigénétiques et l’empreinte13. Toutefois, il est techniquement difficile d’évaluer ces événements au cours de la méiose femelle, qui se déroule dans les ovaires foetales et néonatales chez les mammifères (Figure 1). Je peux être divisé en 5 sous-stades la prophase : leptonema, du zygotène, pachytène, diplonema et dictyate. Ici, nous décrivons comment isoler et faire la distinction entre fœtales et néonatales des ovaires et des testicules (Figure 2). Adapté de méthodes précédemment décrites, ce manuscrit présente également un protocole (étape 1) avec la vidéo de démonstration pour la préparation de la prophase méiotique femelle je la chromatine propage14,15,16,17 . Lorsqu’il est couplé avec l’immunomarquage, tel que décrit dans les étapes 6 et 7, ce protocole permet une analyse microscopique détaillée de la prophase I événements dans les ovocytes.
L’ovogenèse est sujette aux erreurs et événements de missegregation de chromosomes au cours de la première division méiotique représentent la source la plus fréquente des maladies génétiques dans la descendance18,19. Dans ce manuscrit (étape 2 du protocole), les auteurs décrivent un protocole dans lequel des ovocytes matures étagée de GV sont extraites apprêtées ovaires de souris femelles adultes. Dans des conditions favorables, ovocytes adulte subissent une hormone lutéinisante indépendante reprise de la méiose suite d’isolement et la culture20. La reprise méiotique, ovocytes progressant grâce à la méiose I, puis arrêtent à la métaphase II. Ovocytes restent arrêtées lors de la métaphase II, sauf s’il est fécondé. Dans les étapes 2 à 5, nous adaptons protocoles rapportés antérieurement avec la vidéo de démonstration pour décrire comment collecter, culture et préparer la chromatine se propager préparations21ovocytes MI et MII. Cette chromatine diffusion technique permet clairement immunomarquage des protéines associées aux chromosomes. En outre, ce protocole permet également de distinguer les chromosomes bivalents et vaccin monovalents et peut encore résoudre seule sœur chromatides à faciliter l’appréciation de la ploïdie de l’ovocyte. Par conséquent, en plus de révéler des modèles de localisation des protéines méiotiques, ce protocole peut également servir un outil inestimable pour élucider les causes potentielles de missegregation de chromosomes au cours de la MI et MII.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Johns Hopkins. Des expériences ont été effectuées sur des souris C57BL/6J de type sauvage.
1. récolte des ovaires foetales ou néonatales et préparation de la Prophase chromatine se propage
- Pour extraire les embryons à 14,5 – 19,5 jours post-coitum (dpc) sacrifier les femelles enceintes par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC.
Remarque : Pour les ovaires de 1 à 5 jours après la naissance, passez à l’étape 1.3. La figure 1 résume les étapes de la prophase méiotique enrichis à différents âges embryonnaires et postnatals. - Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faire une ouverture en forme de V. Disséquer sur la corne utérine maternelle, séparer les embryons de placenta et transfert des embryons dans 35 mm plats de Pétri contenant 3 mL de préchauffé 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) à 37 ° C.
Remarque : Un incubateur fliptop fixé à 37 ° C peut être utilisé pour maintenir la température. En outre, un verre translucide de température régulée peut également servir pour maintenir la température au cours de la manipulation de l’ovaire. - Avec des ciseaux chirurgicaux de 3,5 pouces, sacrifier des embryons ou des chiots par l’intermédiaire de décapitation selon les lignes directrices IACUC. Placer les embryons décapités ou petits dans du PBS préchauffé avant dissection plue.
- Disséquer un embryon ou un chiot à un moment dans un séparé 35 mm boîte de Pétri contenant 3 mL de PBS préchauffé à 37 ° C. Aller de l’avant en coupant le long de la ligne ventrale médiane de la moitié postérieure de l’embryon, le long de la moitié antérieure sous les pattes avant et directement au-dessus des membres postérieurs et queue comme indiqué dans la Figure 2 a–B.
- Ouvrir l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux de 3,5 pouces. À l’aide de pinces à pointe fine de déplacer ou de supprimer le foie et les anses de l’intestin, exposant ainsi les ovaires dans un nouveau 35 mm boîte de Pétri contenant 3 mL de PBS préchauffé à 37 ° C (voir le guide Figure2 b). Les ovaires sont situés immédiatement en dessous et derrière le rein vers la paroi postérieure de la cavité péritonéale (Figure 2 b–C). Un guide pour différencier les gonades mâles et femelles est fourni à la Figure 2D.
Remarque : Pour des conditions optimales, rapidement disséquer des ovaires après que femelle gravide est sacrifiée. - Retirer les deux ovaires de chaque fœtus féminins à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine sous une étendue de la dissection et l’endroit dans un verres de montre ou puits séparés d’un puits multiples plaque contenant 0,5 à 1,0 mL de PBS préchauffé et maintiennent à 37 ° C.
- Placer chaque paire d’ovaires dans 0,5 mL de tampon hypo-extraction (17 mM citrate trisodique dihydraté, saccharose 50 mM, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inhibiteur de la protéase, pH 8,2) dans un verre de montre propre ou un petit puits d’une plaque de 9 puits, en veillant à immerger la maquette des ovaires complè. Incuber pendant au moins 15 minutes, mais pas plus de 30 min.
Remarque : Faire tampon hypo-extraction douce et utiliser moins de 2 h d’addition de TNT. - Durant l’incubation, à l’aide d’un stylo PAP barrière hydrophobe, dessinez deux carrés de2 22 x 22 mm sur un verre propre 25 x 75 mm2, lame de microscope une épaisseur de 1 mm comme illustré à la Figure 3 a.
NOTE : Diapositives peuvent être préparés en avance. - Distribuer 45 – 50 µL de saccharose de 100 mM sur une lame propre et transférer une paire d’ovaires à la baisse.
- En utilisant les extrémités pointues des deux aiguilles 27 G, taquiner les ovaires part pour libérer les cellules dans la solution de saccharose. Avec une pince, enlevez les gros morceaux de l’ovaire et soigneusement Pipeter une solution de saccharose pour disperser les cellules.
- Place 40 µL de solution de fixation (paraformaldéhyde à 1 % (PFA), 0,2 % de détergent (voir Table des matières), pH 9,2) dans chaque carré de la diapositive préparée. Avec une pointe de pipette 200 µl, étendre la solution fixateur uniformément sur la surface de glissement.
- Pipeter 20 µL du mélange sur chaque carré de la diapositive contenant le fixateur saccharose.
Remarque : Cela équivaut à utiliser une paire d’ovaires par lame. - Incuber les lames dans une chambre humide fermée du jour au lendemain à la température ambiante.
Remarque : L’incubation pendant la nuit peut varier autour (12-15 h) à la température ambiante. - Ouvrez le couvercle de la chambre et laisser les lames sécher complètement à l’air.
- Les lames dans une coloration contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,4 % (voir la Table des matières) pendant 2 min, sécher à l’air et procéder au protocole d’immunomarquage (étape 6).
Remarque : Il peut être possible de stocker les lames à-80 ° C pour une utilisation ultérieure, mais cela varie en fonction de la protéine d’intérêt. Pour des résultats optimaux, procéder immédiatement au protocole immunomarquage (étape 6).
2. métaphase Je collecte des ovocytes
- Afin de maximiser le nombre de follicules antraux isolée de chaque souris, injecter par voie intrapéritonéale des souris femelles sexuellement matures vierges 5 UI de la gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG, également connu sous le nom équine gonadotrophine chorionique (eCG)).
Remarque : Pour un rendement optimal d’ovocytes, souris doivent être 1 à 3 mois d’âge, puisque le nombre d’ovocytes récoltés diminuerait avec l’âge. Pour préparer la PMSG, dissoudre la bouteille de 5 000 UI dans 100 mL du PBS stérile (5 mL de U/0.1) grand magasin à usage unique aliquotes de 600 µL à-20 ° C. - Après 44 – 48 h, préparer, média de collecte minimale indispensable moyen alpha (MEMα) additionné à 5 % sérum fœtal (SVF) et 3 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA ; MEMΑ/BSA/FBS). Stériliser les médias à travers un filtre de pores de 0,2 µm. Décanter 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS moyen dans un plat en verre par souris et chaud à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
Remarque : Autres collection et milieux de culture qui sont commercialement disponibles (M2 et M16) sont aussi couramment utilisés.
ATTENTION : Nous vous conseillons d’enlever Pétri de l’incubateur de2 CO 5 % un à la fois pour une durée limitée afin de minimiser l’exposition à l’air ambiant pendant les étapes de manipulation. - Sacrifier les souris par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC.
- Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faisant une large ouverture en forme de V. À l’aide de pinces, supplanter les intestins vers la tête de la souris. Localisez chaque corne utérine ; les ovaires sont présenter proximale à la cage thoracique. Maintenez l’oviducte avec une pince fine et couper la matière grasse supérieure à l’ovaire à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 4). Continuez à tenir l’oviducte et une autre série de fines pinces libèrent l’ovaire de la bourse et la place dans plat de collection contenant le support MEMα/BSA/FBS.
Remarque : Comme à l’étape 1, il est impératif de maintenir les ovaires à 37 ° C et maintenir à 5 % de CO2. Un incubateur de fliptop relié à 5 % CO2 mélange peut être utilisé pour permettre un entretien optimal de la température et les niveaux de CO2 . En outre, un stade de verre température réglementée devrait aussi servir pour maintenir la température au cours de la manipulation des ovocytes. - À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 27 (ou de taille similaire), libérer des complexes ovocytes cumulus manuellement perforera les gros follicules antrums.
- Tout en observant à travers un microscope à dissection, recueillir les ovocytes GV-mise en scène en utilisant une pipette de verre bouche-exploité ou capillaire ou une main micromètre-seringue (Figure 5). Ne recueillir que les ovocytes qui sont libérés des follicules antrums. Les ovocytes GV ont un diamètre d’environ 90 µm. les ovocytes GV peut être entourés par 2 ou 3 couches de cellules de la granulosa et ont un diamètre total de près de 200 µm.
- Culture des ovocytes dans un verre de montre propre ou une plaque de 9 puits contenant le support MEMα/BSA/FBS pendant 6 h atteindre la métaphase I, à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
- Passez à l’étape 4.
3. métaphase II (MII) ovocyte Collection
- Afin de maximiser les ovocytes prélevés chaque souris, injecter par voie intrapéritonéale des souris femelles sexuellement matures vierges 5 UI de PMSG. Après 44 – 48 h, injecter par voie intrapéritonéale avec 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG).
Remarque : Pour un rendement optimal d’ovocytes, souris doivent être 1 à 3 mois d’âge, puisque le nombre d’ovocytes récoltés diminuerait avec l’âge. Pour préparer le hCG, dissoudre une bouteille de 10 000 U dans 200 mL de PBS (5 mL de U/0.1). Enregistrez dans parties aliquotes à usage unique de 600 µL à-20 ° C. - Après 12 à 14 heures, préparer le milieu MEMα/BSA/FBS de collection, comme indiqué au point 2.2, ci-dessus.
- Sacrifier les souris par dislocation cervicale ou CO2 asphyxie selon les lignes directrices IACUC.
- Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faisant une large ouverture en forme de V. À l’aide de pinces, supplanter les intestins vers la tête de la souris. Localisez chaque corne utérine, les ovaires sont présents proximale à la cage thoracique. Maintenez l’oviducte avec une pince fine et couper la matière grasse supérieure à l’ovaire à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 4). Puis enlever l’ovaire et l’oviducte et le placer dans le plat de collection contenant le support MEMα/BSA/FBS.
NOTE : Tout comme aux étapes 1 et 2, il est impératif de maintenir les ovaires à 37 ° C et maintenir à 5 % de CO2. Un incubateur de fliptop relié à 5 % CO2 mélange peut être utilisé pour permettre un entretien optimal de la température et les niveaux de CO2 . En outre, un stade de verre température réglementée devrait aussi servir pour maintenir la température au cours de la manipulation des ovocytes. - À l’aide d’une seringue de 1 mL avec un 27 G (ou taille similaire) ou dièse forceps, une brèche dans l’ampoule de l’oviducte de libérer les ovocytes MII.
NOTE : Veillez à ne pas endommager les ovocytes dans l’ampoule. L’ampoule apparaît enflée et translucides tels que les ovocytes sont visibles (Figure 4). - Récolte des ovocytes MII de l’ampoule de l’oviducte dans une autre boite avec support de collection utilisant une pipette de verre bouche-exploité ou capillaire ou une main micromètre-seringue (Figure 5).
- Passez à l’étape 4.
4. ovocyte dépouillant et le retrait de la zone pellucide
- Préparer 300 UI/mL d’hyaluronidase dans additionné MEMα à 3 mg/mL de BSA à DDE ovocytes de qui entoure les cellules du cumulus (2,5 mL/souris) dans un verre de montre et garder à 37 ° C, 5 % de CO2.
Remarque : L’efficacité Hyaluronidase diminue brusquement après 1 h de préparation. Pour les ovocytes MII, traitement de l’hyaluronidase n’est pas exigé. - Exposer des complexes de cellules de cumulus-ovocytes à 300 UI/mL d’hyaluronidase dans MEMα/BSA pendant 3 min à la DDE des ovocytes de qui entoure les cellules du cumulus.
ATTENTION : Ne dépassez pas 3 min exposition à hyaluronidase, car il endommagerait les ovocytes. - Pour laver les ovocytes, transférez les ovocytes dans un plat de moyen MEMα/BSA chauffé fraîche. À l’aide d’une pipette en verre de commande bouche petite ou capillaire (légèrement plus grand que le diamètre de l’ovocyte, qui est environ 90 µm), déposer les complexes vers le haut et vers le bas pour détacher complètement les cellules du cumulus. Laissez les ovocytes à récupérer dans l’incubateur tout en préparant l’étape suivante.
- Solution acide Tyrode chaud, MEMα/BSA et médias de Waymouth à 37 ° C (500 µL/souris). Place 300 µL à chaque puits de plaques de verre de 9 puits petites.
- Pour supprimer la zone pellucide (ZP) transférer 5 à 10 ovocytes dans une solution de Tyrode. Exposer les ovocytes pour seulement 30-45 s à la solution.
NOTE : Trop peu d’exposition à la solution ne supprime pas la ZP complètement, les ovocytes qui empêchera l’éclatement et de chromosomes de se propager. Une exposition excessive endommagerait et tuer l’ovocyte. Je regarde la dissolution du ZP sous le microscope à dissection peut aider dans l’optimisation du temps d’exposition.
ATTENTION : À l’aide d’une solution de Tyrode frais est essentiel, que sa fonction diminue avec l’âge. Utiliser un puits frais de solution Tyrode pour chaque groupe d’ovocytes traitée pour assurer une digestion uniforme de la ZP. - Immédiatement après le retrait de la ZP, laver les ovocytes en transférant dans un milieu MEMα/BSA/FBS chauffé. Répétez cette étape de lavage.
Remarque : Soyez prudent lors du transfert, comme les ovocytes seront collent facilement et à la pipette en verre ou capillaire après le retrait de la ZP. Prémouillage la pipette en verre ou capillaire dans un milieu de Waymouth minimisera les ovocytes collées entre elles. - Transfert et laisser les ovocytes à récupérer pendant 30 minutes dans un milieu de Waymouth à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
- Passez à l’étape 5.
5. MI et MII ovocyte chromatine tartinades
- À l’aide d’un stylo PAP, dessinez un rectangle de2 de 11 x 44 mm sur la lame de verre comme sur la Figure 6 a.
- Recouvrir la lame avec une fine couche de fixateur (paraformaldéhyde à 1 %, 0,2 % Triton X 100 H2O, pH 9,2) par la pipette 100 µL de fixateur sur le toboggan et bascule la culasse en arrière. Cliquez sur la diapositive pour se débarrasser de l’excès fixateur.
- Faites glisser l’aiguille en ligne sur la diapositive de fixateur-enduit tout en déposant les ovocytes de 1 cm au-dessus de la lame dans la solution de fixation et relever entre 5 à 10 ovocytes avec une aiguille de pipette petite bouche avec comme support de peu que possible. Effectuez cette étape à l’aide d’un microscope à dissection pour s’assurer que les ovocytes ont été déposés et qu’ils ont fait irruption.
Remarque : Les ovocytes éclatera immédiatement sur la diapositive. La hauteur à laquelle les ovocytes sont déposés incidence du degré de diffusion de chromatine. Voir résultats représentatifs dans la Figure 6 pour plus de détails. - Incuber les lames dans une chambre humidifiée fermée pendant la nuit pour permettre à la chromatine d’adhérer à température ambiante.
- Laisser les lames à sécher complètement et rincer les lames dans une coloration contenant 50 mL de 0,4 % agent mouillant-H2O, pH 8,0.
- Passez à l’étape 6.
6. immunomarquage
- Préparer le tampon de dilution d’anticorps (ADB) décrit dans le tableau 1.
- Préparer deux Jarres Coplin contenant 50 mL de solution tampon (WB) de lavage (10 % ADB dilué dans du PBS) et une coloration contenant 50 mL de solution détergente WB et 0,05 % (par exemple, ajouter 250 µL de 10 % de détergent dans 50 mL WB).
- Laver les diapositives qui ont été établis à l’article 1 et 5 du présent Protocole pendant 10 min dans une coloration contenant 50 mL de WB.
ATTENTION : Ne laissez pas les diapositives sécher à tout moment au cours de l’immunomarquage. - Laver les lames pendant 10 min dans le Coplin jar contenant 50 mL WB et 0,05 % solution détergente. Ensuite, laver les lames dans le restant de Coplin contenant 50 mL de solution de WB pendant 10 min.
- Robinet hors diapositive excès de liquide et le couvercle avec 100 µL de certains anticorps primaires dilué dans ADB. Incuber à 4 ° C durant la nuit dans une chambre humide fermée.
Remarque : L’Incubation peut être abrégée en 2 à 3 heures à 37 ° C. Utiliser les petites quantités d’anticorps (par exemple, 50 µL) en couvrant la lame avec une lamelle ou parafilm. - Rincer les lames dans une coloration contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,2 %, pH 8,0.
- Répétez les étapes 6.2 et 6.5.
- Robinet hors diapositive excès de liquide et le couvercle avec 100 µL de certains Anticorps secondaires dilué dans ADB. Incuber les lames 1 à 2 heures à 37 ° C dans une chambre humide fermée.
- Les lames 2 fois pendant 10 min dans des Jarres Coplin contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-PBS de 0,2 %, pH 8,0.
- Les lames 2 fois pendant 5 min dans des Jarres Coplin contenant 50 mL de solution d’agent mouillant-H2O de 0,2 %, pH 8,0.
7. montage diapositives
- Pour les tartinades de chromatine prophase préparés à l’étape 2, ajouter 100 µL de milieu de montage contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Pour MI et MII la chromatine propage préparés en étape 5, ajouter 50 µL de milieu de montage contenant DAPI (1.5µg / mL). Éponger doucement le liquide en excès à l’extérieur.
- Placez une lamelle de 22 mm x 60 mm sur le dessus et sceller avec du vernis à ongles transparent. Conserver dans une boîte de glissière à 4 ° C ou -20 ° C jusqu'à l’évaluation par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence.
NOTE : Touchez légèrement sur la lamelle couvre-objet pour débarrasser du milieu de montage excédentaire avant scellement avec vernis à ongles.
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Representative Results
Nous avons décrit les deux techniques de visualisation et d’évaluer les chromosomes méiotiques dans les ovocytes. La première technique est pris en compte pour évaluer la progression de la prophase dans les ovaires embryonnaires et néonatales. La prophase chromatine propagation préparations sont extrêmement précieuses pour la visualisation de nombreux processus dynamiques au cours de la méiose, y compris les appariements, Synapse et désynapsis, la recombinaison homologue et remodelage épigénétique chromosome. Ici, nous avons démontré l’utilité de cette méthode pour la visualisation robuste et analyse quantitative de la formation de crossover dans les ovocytes récoltés sur des embryons de C57BL/6J (Figure 3 b et 3C). Pour enrichir des cellules dans le sous-étage pachytène, des embryons de souris ont été récupérées au dpc 18,5 (Figure 1). Deux grandes caractéristiques de la sous-stade pachytène de la prophase I sont l’achèvement de la synapsis entre homologues et la formation d’au moins un crossover MLH1/3 positives par paire homologue. Synapsis complet entre homologues se manifeste par la présence de 20 qui se chevauchent de SYCP3 et SYCP1 s’étend. Pour caractériser la formation de crossover dans les ovocytes sauvage nous immunomarquées la prophase la chromatine se propager des préparations à l’aide d’anticorps détectant les SYCP3, SYCP1 et MLH1 et l’ADN à l’aide de DAPI coloré. Figure 3 b dépeint une image représentative d’un ovocyte de stade pachytène, qui se manifeste par la présence de 27 foyers MLH1 répartis le long de 20 structures de SC entièrement assemblés. Le nombre moyen de véhicules multisegments de MLH1 positifs détectés dans des ovocytes de type sauvage a été 24 ± 3 (Figure 3 C, N = 15 ovocytes). Figure 3D montre SMC6 enrichi à la région de péricentromérique hétérochromatine (PCH) et le long des bras du chromosome et MLH1 foyers répartis le long de la SC au stade pachytène. 3E figure dépeint un ovocyte pachytène mise en scène où la préparation de propagation du chromosome est sous-optimal et chromosomes individuels sont indiscernables, empêchant une évaluation précise de SYCP3, SMC6 et MLH1. Étalements de chromosomes sous-optimaux peuvent être observées quand l’incubation des ovaires dans le tampon d’extraction de l’hypo est trop longtemps ou pas longtemps assez.
La deuxième technique décrite permet d’évaluer la morphologie de la chromatine dans les ovocytes suite reprise méiotique (Figure 6 b-D). Localisation des protéines, mais aussi de ploïdie, peut facilement être évalué, exposer les causes potentielles d’erreurs de ségrégation chromosomique. Figure 6 b représente un ovocyte MI montrant 20 chromosomes et centromère et coloration d’hétérochromatine péricentromérique clairs. La figure 6 est une image zoomée où topoisomérase IIα (TOPOII) sont visibles le long des bras chromosomiques et la PCH. La figure 6 illustre un ovocyte MII où sœur appariée chromatides se distingués par la morphologie des chromosomes et le centromère. Erreurs communes vus lors d’une tentative de cette technique incluent les ovocytes ne pas éclater en relâchant sur le toboggan revêtu PFA, ainsi que chromosomes propagation trop éloignés (Figure 6E–F). Si la ZP n’est pas complètement enlevée, les chromosomes restera associés à la broche, comme illustré à la Figure 6E. Si les ovocytes sont supprimés trop haut de la lame revêtu PFA, les chromosomes peuvent être propagées trop éloignés comme l’illustre la Figure 6F.
Figure 1 : chronologie de la prophase méiotique lors de développement embryonnaire et néonatal femelle. Des contours bleus indiquent les populations de prophase spécifique étape sous les cellules germinales (leptotène, zygotène, pachytène et stade diplotène/dictyate) observées durant le développement embryonnaire et néonatal. Augmentation de couleur bleu foncé indique le moment où la scène sous la prophase spécifique devient plus abondante. Ce chiffre est une adaptation de référence2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : extraction à partir d’embryons et néonatales chiots femelles ovaire. (A, B) La première coupe (1) est présentée ci-dessus les membres antérieurs de décapiter l’embryon à la jonction tête/cou immédiatement lors de la lecture de la corne utérine maternelle. La deuxième coupe (2) se faite le long de la ligne ventrale médiane de la moitié postérieure de l’embryon, suivie d’incisions le long de la moitié antérieure sous les pattes avant (3). Une coupe finale est faite pour enlever les pattes et la queue (4). (A) schéma de vue frontale des découpes de dissection pour l’isolement des ovaires de la femelles chiots. (B) schéma de vue côté des coupes de dissection pour l’isolement des ovaires avec des positions relatives des organes internes. Les régions illustrées à la lumière rouges sont le foie et les intestins, qui sont éliminées au cours de la dissection. La paroi dorsale et les organes connexes figurent dans la lumière bleues. Cette région comprend les ovaires, qui sont attachés aux pôles inférieurs des reins en haut de la corne utérine. (C) Frontal vue schématique de la paroi dorsale de l’embryon après ablation du foie et des intestins. (D) représentation schématique des différences morphologiques entre les gonades mâles et femelles à environ 15-18 dpc. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : chromatine prophase représentatives réparties préparations. Verre (A) Glissez le schéma pour la propagation de la chromatine prophase préparations. Contours carrés noirs représentent bloqueur liquide stylo contours. (B, C) Images représentatives et quantification de formation crossover dans les ovocytes de stade pachytène sauvage à l’aide de la chromatine prophase répandre les méthodes de préparation décrits à l’étape 1. Se propage de la chromatine (B) ont été effectués avec des ovaires des embryons de souris fromC57BL/6J isolés à 18,5 dpc. Tartinades de chromatine ont été immunomarquées avec des anticorps dirigés contre la protéine élément latéral de SC SYCP3 (rouge) et de la protéine d’élément central SC SYCP1 (magenta), MLH1 (marqueur d’événement du filtre vert,) et DAPI (bleu, ADN). Echelle = parcelle 10 µm. (C) Dot des foyers MLH1 ceux obtenus de chromatine de stade pachytène 15 répandre des préparations. Barres d’erreur représentent déviation standard. (D, E) Comparaison d’optimale (D) et la prophase sous-optimal (E) répandre des préparations, respectivement. Tartinades de chromatine ont été immunomarquées avec des anticorps contre MLH1 SMC6 (rouge), (vert) et SYCP3 (bleu). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : schéma de principe d’ovaire adulte. Ce diagramme décrit l’anatomie de l’ovaire de la souris adulte, oviducte, ampoule et l’utérus. Ovaires de souris doivent être retirés par incision minutieuse des ligaments reliant les ovaires aux pôles inférieurs des reins et la paroi postérieure de l’abdomen. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images de pipette en verre fonctionnant sur bouche, verre capillaire et manuelles micromètre-seringue utilisée pour la manipulation des ovocytes. (A) le manipulateur d’ovocyte de pipette de verre se compose des éléments suivants dans l’ordre : embout buccal, tube en latex (3,2 mm de diamètre interne (ID) x 6,4 mm de diamètre extérieur (OD)), de pipette 1 mL, tube en latex (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) et verre pipette Pasteur. L’extrémité du verre pipette Pasteur a été chauffé au-dessus d’une flamme et l’a tiré pour créer un bout pointu (Figure 5 a1). (B) le manipulateur d’ovocyte capillaire de verre se compose des éléments suivants dans l’ordre : embout buccal, filtre de 0,45 µm (facultatif), tube en latex (ID de 3,2 mm x 6,4 mm OD), pointe de pipette de 1 mL, tube en latex (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) et 70 µl capillaire de verre. Les tubes capillaires de verre sont chauffés au-dessus d’une flamme au centre et a tiré dans des directions opposées pour créer deux capillaires avec des extrémités à pointe fines (Figure 5 b1). (C) la micromètre-seringue manuelle est composée des éléments suivants dans l’ordre : tête 150-208 micromètre Mitutoyo (moyenne taille, 0-1 « rang, 0,001" graduation), seringue de 5 mL, tube en latex (ID de 3,2 mm x 6,4 mm OD), pointe de pipette de 1 mL, tube en latex (6,4 mm ID x 11,1 mm OD), pointe de pipette de 1 mL et une pointe de chargement 83 x 0,5 mm2 gel. La tête de 150-208 micromètre Mitutoyo est bien insérée dans la seringue de 5 mL (5 de la Figure1). Afin d’assurer que la pointe de chargement de gel est solidement fixés, la pipette 1 mL raccordement bout est coupé (Figure 5,2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : représentant métaphase I et II ovocyte chromatine répandre préparations. (A) Slide schématique de métaphase I et II ovocyte chromatine propagation préparations. Ovocytes (cercles) libérés par la pipette en verre bouche-exploité ou capillaire en ligne droite (suivant la flèche). Contour du rectangle noir représente bloqueur liquide stylo plan. (B, C) Optimal métaphase I préparation de la chromatine se propager. Métaphase I chromosomes ont été colorées au DAPI (bleu, ADN) et immunomarquées pour CEN (vert, marqueur du kinétochore/centromère). Barreaux de l’échelle = 10 µm. (B) des anticorps contre l’Histone H4 (di méthyl K20, tri méthyl K20) ont été utilisés pour étiqueter l’hétérochromatine péricentromérique (PCH). (C) anticorps contre la topoisomérase IIα (TOPOII) ont été utilisés pour étiqueter les axes PCH et chromosome. (D) chromatine II métaphase optimale étaler la préparation. Chromosomes en métaphase II ont été colorées au DAPI (bleu, ADN) et immunomarquées pour CEN (vert) et de l’Histone H4 (di-méthyl K20, tri-méthyl K20) d’étiqueter la PCH. Echelle : 10µm. (E, F) métaphase pauvre je la chromatine propager des préparations. Chromosomes ont été colorées avec le DAPI (bleu, ADN) et immunomarquées pour CEN (vert) et le composant cohesin méiotique, REC8. Barreaux de l’échelle = 10 µm (E) un ovocyte qui a fait pas éclater leur libération sur la glissière revêtu PFA. (F) des Chromosomes qui ont été écartées trop loin. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Ordre du jour | Montant | Concentration finale |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3 % (p/v) |
| Sérum de cheval | 5 mL | 10 % (v/v) |
| 10 % de détergent (voir Table des matières) dans du PBS |
250 ΜL | 0,05 % (v/v) |
Tableau 1 : Recette de tampon (ADB) anticorps dilution. Stocker l’ADB à 4 ° C ou congeler à-20 ° C, les stocks si faire de plus grandes quantités. Banque asiatique de développement peuvent être contaminés, assurez-vous de bonnes techniques d’asepsie sont utilisés et évaluer la solution pour la contamination avant chaque utilisation. Petites parties aliquotes de ADB peuvent également être préparés pour minimiser la contamination.
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Discussion
Préparations de propagation de la chromatine permettent aux chercheurs d’étudier par ordre chronologique la méiose mammifère femelle et la localisation dynamique des protéines impliquées. Les spreads de chromatine embryonnaires et néonatales permettent une analyse attentive des événements tout au long de la prophase méiotique. Métaphase I et métaphase II la chromatine se propage peut servir à distinguer l’unique sœur chromatides de jumelé de sœurs et paires de chromosomes homologues, ainsi qu’évaluer la ploïdie. Par comparaison, le protocole décrit ici peut être avantageux par rapport à l’ensemble ovocyte immunomarquage, qui produit souvent des niveaux élevés de signal de fond qui réduit la résolution des protéines liées à la chromatine. De plus, les techniques d’étalement de la chromatine représentent une alternative intéressante à l’imagerie de cellules vivantes, qui nécessite un investissement important de temps et d’équipement spécialisé.
Ovaires embryonnaires et néonatales peuvent être difficiles à localiser et extraire. Il est recommandé d’extraire soigneusement tous les autres organes et matériel sans compter que les reins dans un plat séparé contenant PBS avant la recherche pour les ovaires et d’utiliser un plat frais de PBS pour chaque embryon/pup (Figure 2 b). Si l’embryon/du chiot est de sexe masculin, les testicules seront reconnaissables par la formation de tubules ainsi que l’emplacement des gonades (Figure 2D). Avec développement des embryons mâles, les testicules descendra vers le pénis, de plus en plus grand et ovale.
L’ovocyte technique de chromatine propagation nécessite maîtrise de la collecte des ovocytes et manipulation à l’aide de la pipette en verre bouche-exploité ou capillaire. Nous vous recommandons de pratiquer contrôlant la pipette de bouche avant d’effectuer ce protocole. Tirant la taille appropriée pipette/capillaire de verre pour collecte et dépouillant les ovocytes augmentera les chances de réussite et d’efficacité en réduisant au minimum les temps d’ovocytes sont à l’extérieur de l’incubateur, aussi bien que dans une solution de Tyrode. Bon timing pour l’enlèvement de la ZP est extrêmement important pour la réussite de cette méthode. Si les ovocytes sont incubés dans une solution de Tyrode pour une durée insuffisante, la ZP ne sera pas complètement supprimé. Cela empêche les ovocytes d’éclatement efficacement sur la diapositive, comme peut être vu dans la Figure 6E. Toutefois, si les ovocytes sont incubés dans une solution de Tyrode pendant trop longtemps, qualité ovocytaire et en aval par immunofluorescence souillant seront gravement compromises. Nous vous recommandons de regarder les ovocytes sous microscope pour déterminer l’heure exacte de la ZP se dissout dans une solution de Tyrode. Ajoutant seulement 5 à 10 ovocytes à la fois à une solution de Tyrode réduira au minimum l’exposition excessive. Si les ovocytes sont libérés trop élevé au-dessus de la diapositive revêtu PFA, les chromosomes peuvent être propagées trop éloignés (Figure 6F). Des résultats optimaux sont trouvent les ovocytes sont libérés 1 cm au-dessus de la diapositive. D’autres facteurs qui peuvent entraver les résultats comprennent une exposition prolongée à des niveaux réduits de2 CO dans l’air ambiant pendant les étapes de manipulation d’ovocyte. Cela entraîne des fluctuations de pH dans les médias qui nuisent à la qualité de l’ovocyte et ressort par le changement de couleur progressif des médias de rouge-orange au rose. Le pouvoir tampon des médias aussi diminue avec le temps ; par conséquent, nous ne recommandons pas en utilisant les médias qui a été stocké (4 ° C) pendant plus de 1 semaine. Moyen de m2, ce qui ne nécessite pas de CO2 à être mis en mémoire tampon, est couramment utilisé comme une alternative.
Une limitation aux préparations de la chromatine se propager est l’absence de visualisation de la chromatine dans le contexte autochtone de la cellule. Matériel cellulaire à l’extérieur du noyau ne peut pas être visualisé et axe formation ne peut être évaluée. Par conséquent, autres méthodes peuvent servir à évaluer l’ovogenèse outre des spreads de chromatine, comme tout ovocyte immunomarquage après un traitement monastrol, qui s’écroule l’axe bipolaire dans une broche monopolaire22. Cela permet à sœur chromatides à évaluer dans le cadre de la cellule. Collectivement, les méthodes de la chromatine se propager décrites ici peuvent facilement être appliquées afin d’évaluer la ploïdie de la morphologie et du chromosome chromatine tout au long de l’ovogenèse chez des modèles de souris transgéniques et mutant roman.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIGM (R01GM11755) à P.W.J et une bourse de subvention de formation de l’Institut National de Cancer (NIH) (CA009110) à G.H. et J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
