Summary
Oogenesen i pattedyr er kendt for at være fejlbehæftet, især på grund af kromosom missegregation. Dette manuskript beskriver kromatin spredes forberedelse metoder til mus prophase, metafase I og II-iscenesatte oocyter. Disse grundlæggende teknikker giver mulighed for undersøgelse af kromatin-bundet proteiner og kromosom morfologi i hele pattedyr oogenesen.
Abstract
Kromatin udbredelsen teknikker har været meget anvendt til at vurdere den dynamiske lokalisering af forskellige proteiner under gametogenesis, især for spermatogenesen. Disse teknikker giver mulighed for visualisering af proteiner og DNA lokalisering mønstre under meiotiske begivenheder såsom homologe kromosom parring, synapsis og DNA reparation. Mens nogle protokoller er blevet beskrevet i litteraturen, er generelle kromatin udbredelsen teknikker ved hjælp af pattedyr prophase oocyter begrænset og vanskelig på grund af timingen af meiose indledning i føtal æggestokke. I sammenligning, kan prophase spermatocytes afhentes fra unge mandlige mus med højere udbytter uden behov for microdissection. Det er imidlertid vanskeligt at opnå en ren synkroniserede befolkning af celler på bestemte stadier på grund af heterogenitet af meiotiske og post meiotiske kønscelle befolkninger i de unge og voksne testis. I senere faser af meiose er det fordelagtigt at vurdere oocyter gennemgår meiose jeg (MI) eller meiose II (MII), fordi grupper af modne oocyter kan indsamles fra voksne hunmus og stimuleres til at genoptage meiose i kultur. Her, metoder til meiotiske kromatin sprede præparater ved hjælp af oocytter dissekeret fra fostrets, neonatal og voksne æggestokkene er beskrevet med ledsagende video demonstrationer. Kromosom missegregation begivenheder i pattedyr oocyter er hyppige, især under MI. Disse teknikker kan bruges til at vurdere og karakterisere effekten af forskellige mutationer eller miljømæssige eksponeringer under forskellige faser af oogenesen. Som der er tydelige forskelle mellem oogenesen og spermatogenesen, er de teknikker, der er beskrevet inden for uvurderligt for at øge vores forståelse af pattedyr oogenesen og kromosom og protein dynamics seksuelt dimorfe funktioner under meiose .
Introduction
Under spermatogenesen, er store semisynkron bølger af meiotiske kønsceller hurtigt og kontinuerligt genopfyldes i testiklerne i starten af puberteten og hele voksenlivet1. I modsætning til mænd initieres meiose hos kvinder alene i løbet af fostrets udvikling. Efter fødslen, oocyter fortsat arresteret i en langvarig dictyate fase af prophase jeg med en intakt germinale vesikel (GV; nukleare kuvert) indtil puberteten. Ved begyndelsen af puberteten vælges en delmængde af oocytter cyklisk underkastes vækst og modning, markerer indledningen af meiotiske genoptagelse. Meiotiske genoptagelse i fuldt udvokset oocyter er manifesteret ved forsvinden af GV i en proces kendt som germinale vesikel opdeling (GVBD). Oocyt derefter gennemgår kromosom kondens og segregation, efterfulgt af polar body ekstrudering. Oocytter blive pågrebet progression til MII og er stimuleret til at fuldføre den anden og sidste meiotiske deling kun efter befrugtningen.
Kvindelige frugtbarhed er stærkt afhængige af succesen af meiotiske prophase jeg progression. Nøglen til dette er dannelsen af en fysisk sammenhæng mellem homologe kromosomer kendt som chiasmata, hvilket er medieret af reparation af inducerede DNA dobbeltstrenget pauser (DSBs) via crossover rekombination2. Denne proces sker i forbindelse med en dynamisk protein-rige stillads kendt som synaptonemal complex (SC), der danner mellem homologe kromosomer at lette deres synapsis3. SC er en lynlås-lignende tredelte struktur, der består af to parallelle laterale elementer forbundet af centrale region proteiner der holder homologs sammen i hele igangværende DNA reparation. Før synapsis danner prækursorer af de laterale elementer, kaldet aksial elementer, mellem Søster kromatider. Synaptonemal komplekse proteiner som SYCP2 og SYCP3 udgør aksial elementer, der colocalize til søster-chromatid samhørighed akser under tidlige prophase. Disse senere fungere som bindende websteder for tværgående filament protein, SYCP1, der letter centrale element forsamling og synapsis mellem justeret homologs4. I mus oocytter, er komplet synapsis indiceret ved tilstedeværelsen af 20 helt overlappende SYCP3 og SYCP1 strækninger, som kan visualiseres ved hjælp af kromatin sprede præparater. Synapsis er afsluttet træder i pachytene underniveau, hvorved modne delefiltre, der er bestemt til form chiasmata mellem homologs er dekoreret med mutL homolog (MLH1/3) dimerer at fremme deres korrekte behandling5,6 , 7. den strukturelle vedligeholdelse af kromosomer (SMC) komplekser, herunder cohesin, condensin og SMC5/6 komplekse, er vigtig for reguleringen af kromosom dynamik og struktur i hele meiose8,9, 10,11,12. Kollektivt, sikre disse begivenheder ordentlig bi-orientering af homologe kromosomer til modsatrettede spindel polakker efter afmontering af Overvågningsudvalgets
Meiotiske cellecyklus er en kraftfuld model til at undersøge forskellige proteiner i genom vedligeholdelse på grund af den programmerede induktion og efterfølgende reparation af DNA DSBs roller. Derudover er pattedyr meiose også en relevant model for studiet af epigenetiske ændringer og prægning13. Men, det er teknisk vanskeligt at vurdere disse begivenheder under kvindelige meiose, der foregår i føtal og neonatal æggestokkene hos pattedyr (figur 1). Prophase jeg kan opdeles i 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema og dictyate. Heri, beskriver vi hvordan man isolere og skelne mellem fostrets og neonatal æggestokke og testikler (figur 2). Tilpasset fra tidligere beskrevne metoder, dette manuskript også skitserer en protokol (trin 1) med video demonstration for forberedelse af kvindelige meiotiske prophase jeg kromatin spreder14,15,16,17 . Når kombineret med immunolabelling, som beskrevet i trin 6-7, denne protokol giver mulighed for detaljeret mikroskopisk analyse af prophase jeg begivenheder i oocytter.
Oogenesen er fejlbehæftet, og kromosom missegregation begivenheder i løbet af den første meiotiske deling repræsenterer den mest almindelige kilde til genetisk sygdom i afkom18,19. I dette manuskript (protokol trin 2) beskriver vi en protokol, hvor modne GV-iscenesatte oocyter er udvundet fra PRIMES æggestokkene af voksne hunmus. Betingelser, støttende gennemgå fuldt udvokset oocyter luteiniserende hormon-uafhængige genoptagelse af meiose efter isolation og kultur20. Efter meiotiske genoptagelse, oocyter fremskridt gennem meiose, derefter anholde på metafase II. Oocytter fortsat arresteret på metafase II, medmindre befrugtet. I trin 2 – 5, tilpasser vi tidligere rapporteret protokoller med video demonstration at beskrive, hvordan at indsamle, kultur og forberede kromatin sprede præparater21MI og MII oocyter. Denne kromatin spredning teknik giver mulighed for klare immunolabelling af proteiner tilknyttet kromosomer. Desuden, denne protokol kan også bruges til at skelne mellem bivalent og univalent kromosomer, og kan yderligere løse enkelt Søster kromatider at lette vurderingen af oocyt Ploidi. Derfor, ud over afslørende lokalisering mønstre af meiotiske proteiner, denne protokol kan også tjene som et uvurderligt værktøj for belyse mulige årsager til kromosom missegregation under MI og MII.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Johns Hopkins University. Forsøgene blev udført på wild-type C57BL/6J mus.
1. høst føtal eller Neonatal æggestokke og forberedelse af Prophase kromatin spreder
- For at udtrække embryoner på 14,5-19,5 dage ofre post-coitum (dpc) de drægtige hundyr via cervikal dislokation eller CO2 kvælning ifølge IACUC retningslinjer.
Bemærk: For postnatal dag 1 – 5 æggestokkene Spring til trin 1.3. Figur 1 opsummerer meiotiske prophase stadier beriget på forskellige embryonale og postnatal aldre. - Åbn abdominopelvic hulrum ved hjælp af steril saks, gør en V-formet åbning. Dissekere ud i moderens livmoder horn, adskille embryoner fra moderkagen og overføre embryoner til 35 mm petriskåle, der indeholder 3 mL pre varmede 1 x fosfat buffer saltvand (PBS) ved 37 ° C.
Bemærk: En fliptop inkubator, indstillet på 37 ° C kan bruges til at opretholde temperaturen. En temperatur reguleret glas fase kan desuden også bruges til at opretholde temperaturen under æggestokken manipulation. - Med 3,5 tommer kirurgisk saks, ofre fostre eller unger via halshugning efter IACUC retningslinjer. Sted fostre eller unger i pre varmede PBS før yderligere dissektion.
- Dissekere en embryo eller pup ad gangen i en separat 35 mm petriskål indeholder 3 mL af pre varmede PBS ved 37 ° C. Fortsætte ved at skære langs den ventrale midterlinjen af den bageste halvdel af embryonet, langs den forreste halvdel under forbens og direkte over hind-lemmer og hale som skitseret i figur 2A-B.
- Åbn maven bruger 3,5 tommer kirurgisk saks. Ved hjælp af fine spids pincet fortrænge eller fjerne leveren og sløjfer af tarm, udsætter æggestokkene i en ny 35 mm petriskål indeholder 3 mL af pre varmede PBS ved 37 ° C (Se vejledning i figur 2B). Æggestokkene er placeret umiddelbart under og bag nyre mod den bageste væg af bughulen (figur 2B-C). En guide til at skelne mellem mandlige og kvindelige gonaderne tilbydes i figur 2D.
Bemærk: For optimal betingelser, hurtigt dissekere ud æggestokkene efter gravid kvinde er ofret. - Fjerne begge æggestokke fra hver kvindelige fosteret ved hjælp af en fin spids pincet under en dissektion anvendelsesområde og sted i en watch briller eller separate brønde i en multi godt plade indeholdende 0,5 til 1,0 mL pre varmede PBS og vedligeholde ved 37 ° C.
- Placer hvert par af æggestokkene i 0,5 mL hypo-udvinding buffer (17 mM Trinatriumcitrat dihydrat, 50 mM saccharose, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, protease inhibitor, pH 8,2) i en ren urglas eller et lille godt af en 9-godt plade, og sørg for at nedsænke æggestokkene comp printeren. Inkuber i mindst 15 min., men ikke mere end 30 min.
Bemærk: Gøre hypo-ekstraktionsbuffer frisk og brug inden for 2 h af DTT tilsætning. - Under inkubation, ved hjælp af en hydrofobe barriere PAP pen, skal du trække to 22 x 22 mm2 pladser på et rent glas 25 x 75 mm2, 1 mm tyk objektglas, som vist i figur 3A.
Bemærk: Dias kan være forberedt i god tid. - Afpipetteres 45 – 50 µL af 100 mM saccharose på en ren dias og overføre et par af æggestokkene til drop.
- Bruger de skarpe ender af to 27 G nåle, drille æggestokkene fra hinanden for at frigive celler i en rørsukkeropløsning. Med pincet, fjerne store stykker af æggestokken og omhyggeligt afpipetteres rørsukkeropløsning for at sprede celler.
- Sted 40 µL af Fikseringsvæske løsning (1% PARAFORMALDEHYD (PFA), 0,2% vaskemiddel (Se Tabel af materialer), pH 9.2) i hvert kvadrat i den forberedte dias. Med en 200 µl pipette tip, Fikseringsvæske løsningen jævnt fordelt over dias overflade.
- Med pipette overfoeres 20 µL af saccharose mix på hver kvadratet på det dias, der indeholder fiksativ.
Bemærk: Dette svarer til at bruge et par af æggestokkene pr. slide. - Glassene inkuberes i et lukket fugtigt kammer natten over ved stuetemperatur.
Bemærk: I natten inkubation kan spænde omkring (12-15 timer) ved stuetemperatur. - Åbn kammer låget og tillade dias til at lufttørre helt.
- Vaske dias i en Coplin krukke indeholdende 50 mL 0,4% befugtningsmiddel-PBS løsning (Se Tabel af materialer) i 2 min., lufttørre, og Fortsæt til immunolabelling protokol (trin 6).
Bemærk: Det kan være muligt at gemme dias ved-80 ° C til senere brug, men dette varierer afhængigt af protein af interesse. For optimale resultater gå straks til immunolabelling protokol (trin 6).
2. metafase jeg oocyt samling
- For at maksimere antallet af antral follikler isoleret fra hver mus, intraperitoneal injicere kønsmodne jomfru hunmus med 5 IU af gravide mare serum gonadotropin (PMSG, også kendt som equine chorion gonadotropin (EKG)).
Bemærk: For optimal oocyt udbytte, mus bør være 1 til 3 måneders alderen, som antallet af oocytter høstet vil falde med alderen. For at forberede PMSG, opløse flaske på 5.000 IE i 100 mL steril PBS (5 U/0.1 mL) butik i engangsbrug delprøver af 600 µL ved-20 ° C. - Efter 44-48 h, forberede samling medium, minimum afgørende medium alpha (MEMα) medium suppleret med 5% føtal bovint serum (FBS) og 3 mg/mL bovint serumalbumin (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilisere medier gennem et 0,2 µm pore filter. Dekanteres 2,5 mL af MEMα/BSA/FBS medium i et glasskål pr. mus og varme til 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
Bemærk: Andre samling og kultur medier, der er kommercielt tilgængelige (M2 og M16) er også almindeligt anvendt.
Advarsel: Anbefales det at fjerne kultur retter fra 5% CO2 rugemaskinen, en ad gangen for begrænset varighed at minimere luften eksponering under manipulation trin. - Ofre mus via cervikal dislokation eller CO2 kvælning ifølge IACUC retningslinjer.
- Åbn abdominopelvic hulrum ved hjælp af steril saks, gør en stor V-formet åbning. Brug af pincet, fortrænge tarmene mod lederen af musen. Find hver uterin horn; æggestokkene er præsentere proksimalt for brystkassen. Hold ovidukten med fine pincet og skære det fedt superior til æggestokkene ved hjælp af dissektion saks (figur 4). Fortsætte med at holde ovidukten, og med et andet sæt af fine pincet frigivelse æggestokken fra bursa og sted i samling skål indeholdende MEMα/BSA/FBS medium.
Bemærk: Som i trin 1 er det bydende nødvendigt at holde æggestokkene ved 37 ° C og holdes ved 5% CO2. En fliptop inkubator hooked op til 5% CO2 mix kan bruges til at give mulighed for optimal vedligeholdelse af temperatur og CO2 niveauer. Derudover bør en temperatur reguleret glas fase også anvendes til at opretholde temperatur under oocyt manipulation. - Ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 27-gauge kanyle (eller lignende størrelse), frigive cumulus oocyt komplekser af manuelt punktering store antral follikler.
- Mens observere gennem en dissektion mikroskop, indsamle GV-iscenesatte oocyter ved hjælp af en mund-drevet glas pipette eller kapillær eller en håndbetjent mikrometer-sprøjte (figur 5). Kun indsamle oocytter, der frigives fra antral follikler. GV oocyter har en diameter på cirka 90 µm. GV oocyter kan være omgivet af 2-3 lag af granulosa-celler, og har en samlet diameter på omkring 200 µm.
- Kultur oocyter i en ren urglas eller en 9-godt plade der indeholder MEMα/BSA/FBS medium for 6 h at nå metafase jeg ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Fortsæt til trin 4.
3. metafase II (MII) oocyt samling
- For at maksimere oocyter isoleret fra hver mus, intraperitoneal injicere kønsmodne jomfru hunmus med 5 IU af PMSG. Efter 44-48 h, intraperitoneal injicere med 5 IU af humant choriongonadotropin (hCG).
Bemærk: For optimal oocyt udbytte, mus bør være 1 til 3 måneders alderen, som antallet af oocytter høstet vil falde med alderen. For at forberede hCG, opløse en flaske af 10.000 U i 200 mL PBS (5 U/0.1 mL). Lagre i engangsbrug delprøver af 600 µL ved-20 ° C. - Efter 12-14 timer, forberede MEMα/BSA/FBS samling medium, som beskrevet i trin 2.2, ovenfor.
- Ofre mus via cervikal dislokation eller CO2 kvælning ifølge IACUC retningslinjer.
- Åbn abdominopelvic hulrum ved hjælp af steril saks, gør en stor V-formet åbning. Brug af pincet, fortrænge tarmene mod lederen af musen. Find hver uterin horn, æggestokkene er præsentere proksimalt for brystkassen. Hold ovidukten med fine pincet og skære det fedt superior til æggestokkene ved hjælp af dissektion saks (figur 4). Derefter fjerne æggestokken og oviduct og placere i samling skål indeholdende MEMα/BSA/FBS medium.
Bemærk: Som i trin 1 og 2 er det bydende nødvendigt at holde æggestokkene ved 37 ° C og holdes ved 5% CO2. En fliptop inkubator hooked op til 5% CO2 mix kan bruges til at give mulighed for optimal vedligeholdelse af temperatur og CO2 niveauer. Derudover bør en temperatur reguleret glas fase også anvendes til at opretholde temperatur under oocyt manipulation. - Ved hjælp af en 1 mL sprøjte med en 27 G (eller lignende størrelse) eller skarpe pincet, rive hul i ampulla af oviduct at frigive MII oocyter.
Bemærk: Pas på ikke at beskadige oocyter i ampulla. Ampulla vises hævede og gennemskinnelige sådan at oocyter er synlige (figur 4). - Høst MII oocytter fra ampulla af oviduct i en ny skål med samling medium ved hjælp af en mund-drevet glas pipette eller kapillær eller en håndbetjent mikrometer-sprøjte (figur 5).
- Fortsæt til trin 4.
4. oocyt ribbe og Zona Pellucida fjernelse
- Forberede 300 IU/mL af hyaluronidase i MEMα medium suppleret med 3 mg/mL BSA til denude oocyter af omgivende cumulus celler (2,5 mL/mus) i et urglas, og holde ved 37 ° C, 5% CO2.
Bemærk: Hyaluronidase effekten falder kraftigt efter 1 h af forberedelse. For MII oocytter er hyaluronidase behandling ikke påkrævet. - Udsætte oocyt-cumulus celle komplekser til 300 IU/mL af hyaluronidase i MEMα/BSA i 3 min. til denude oocyter af omgivende cumulus celler.
Forsigtig: Må ikke overstige 3 min eksponering til hyaluronidase, da det vil skade oocyter. - Til vask af oocytter, overføre oocytter til en frisk varmede MEMα/BSA medium skål. Ved hjælp af en lille mund-drevet glas pipette eller kapillær (lidt større end diameteren af oocyt, som er ca 90 µm), afpipetteres komplekser op og ned for at helt frigøre cumulus celler. Tillad oocyter at inddrive i rugemaskinen mens forberedelserne til det næste trin.
- Varm sure Tyrode løsning, MEMα/BSA og Waymouths medier til 37 ° C (500 µL/mus). Sted 300 µL i hver brønd af små 9-godt glasplader.
- Hvis du vil fjerne zona pellucida (ZP) overføres 5 – 10 oocytter til Tyrodes løsning. Udsætte oocyter for kun 30-45 s til løsningen.
Bemærk: For lidt eksponering til løsningen vil ikke fjerne ZP helt, som vil forhindre oocytter fra brister og kromosomer fra spredning. For meget eksponering vil skade og dræbe oocyt. Ser ZP opløses mikroskopet dissektion kan støtte i at optimere eksponeringstid.
Advarsel: Ved hjælp af friske Tyrode løsning er kritisk, som dets funktion forringes med alderen. Brug et frisk godt af Tyrodes løsning for hver gruppe af oocytter behandlet for at sikre ensartet fordøjelse af ZP. - Umiddelbart efter ZP fjernelse, skal du vaske oocyter ved at overføre til varmede MEMα/BSA/FBS medium. Gentag trinnet vask.
Bemærk: Vær forsigtig ved overførsel, som oocyter vil let holde sammen og glas pipette eller kapillær følgende fjernelse af ZP. Pre befugtning glas pipette eller kapillær i Waymouth's medium vil minimere oocyter stikning sammen. - Overføre og tillade oocyter at inddrive i 30 minutter i Waymouth's medium ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Fortsæt til trin 5.
5. MI og MII oocyt kromatin opslag
- Ved hjælp af en PAP pen, tegne en 11 x 44 mm2 rektangel på glas dias som vist i figur 6A.
- Coat dias med et tyndt lag af fiksativ (1% PARAFORMALDEHYD, 0,2% Triton-X 100 i H2O, pH 9.2) når der afpipetteres 100 µL af fiksativ i diaset og vuggende dias frem og tilbage. Tryk på diaset for at slippe af med overskydende fiksativ.
- Afhente mellem 5-10 oocyter med en lille mund pipette nål med som lille medier som muligt og træk nålen i en linje på tværs af fiksativ-belagt slide mens deponering oocytter fra 1 cm over dias i Fikseringsvæske løsning. Udføre dette trin, ved hjælp af en dissektion mikroskop til at sikre, at oocyter er blevet deponeret og at de har brast.
Bemærk: Oocyter bør brast straks på diaset. Den højde hvor oocyter er deponeret indvirkning graden af kromatin spredning. Se repræsentative resultater i figur 6 for yderligere oplysninger. - Inkuber dias ved stuetemperatur i et lukket befugtet kammer natten at tillade kromatin til at overholde.
- Tillad dias til at lufttørre helt og skyl dias i en Coplin krukke indeholdende 50 mL 0,4% befugtningsmiddel-H2O, pH 8,0.
- Fortsæt til trin 6.
6. Immunolabelling
- Forberede antistof fortynding buffer (ADB) er beskrevet i tabel 1.
- Forbered to Coplin krukker der indeholder 50 mL stødpudeopløsning vask (WB) (10% ADB fortyndes i PBS) og en Coplin jar indeholder 50 mL WB og 0,05% rengøringsmiddel (f.eks.tilføje 250 µL af 10% vaskemiddel til 50 mL WB).
- Vask de dias, der blev udarbejdet i afsnit 1 og 5 i denne protokol for 10 min i en Coplin jar indeholder 50 mL af WB.
Forsigtig: Lad ikke slides tør på noget tidspunkt under immunolabelling. - Vask dias i 10 min i Coplin jar indeholder 50 mL WB og 0,05% rengøringsmiddel. Derefter vask dias i den resterende Coplin jar indeholder 50 mL af WB løsning i 10 min.
- Tryk væk overskydende væske og dække diaset med 100 µL af udvalgte primære antistoffer fortyndet i ADB. Der inkuberes ved 4 ° C natten over i et lukket fugtigt kammer.
Bemærk: Inkubation kan afkortes til 2 til 3 timer ved 37 ° C. Bruge mindre mængder af antistof (fx, 50 µL) ved at dække dias med en coverslip eller parafilm. - Skyl dias i en Coplin krukke indeholdende 50 mL 0,2% befugtningsmiddel-PBS løsning, pH 8,0.
- Gentag trin 6.2 til 6,5.
- Tryk væk overskydende væske og dække diaset med 100 µL af udvalgte sekundære antistoffer fortyndet i ADB. Inkuber dias 1 til 2 timer ved 37 ° C i et lukket fugtigt kammer.
- Vask dias 2 gange i 10 min i Coplin krukker indeholdende 50 mL 0,2% befugtningsmiddel-PBS løsning, pH 8,0.
- Vask dias 2 gange for 5 min i Coplin krukker indeholdende 50 mL 0,2% befugtningsmiddel-H2O løsning, pH 8,0.
7. montering dias
- For prophase kromatin breder sig parat i trin 2, tilføje 100 µL af montering medium indeholdende 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). For MI og MII kromatin breder sig parat i trin 5, tilsæt 50 µL af montering medium indeholdende DAPI (1.5µg / mL). Forsigtigt skamplet væk overskydende væske.
- Placere en 22 mm x 60 mm coverslip ovenpå og forsegle med klar neglelak. Gemme et dias boksen ved 4 ° C eller -20 ° C indtil vurdering via Fluorescens mikroskopi.
Bemærk: Tryk let på cover slip at slippe af med overskydende montering medium før forsegling med neglelak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har beskrevet to teknikker til visualisering og vurdere meiotiske kromosomer i oocytter. Den første teknik er dækket mod vurdere prophase progression i embryonale og neonatal æggestokke. Prophase kromatin spredning præparater er utrolig værdifuld til at visualisere mange dynamiske processer under meiose, herunder kromosom parring, synapsis og desynapsis, homologe rekombination, og epigenetiske kromosom remodellering. Her, vi har vist nytten af denne metode til robust visualisering og kvantitativ analyse af crossover dannelse i oocyter høstet fra C57BL/6J embryoner (figur 3B og 3 C). For at berige for celler i pachytene underniveau, blev mus embryoner hentet på 18,5 dpc (figur 1). To store kendetegnende for pachytene underniveau af prophase jeg er færdiggørelsen af synapsis mellem homologs og dannelsen af mindst én MLH1/3-positive crossover pr. homolog par. Komplet synapsis mellem homologs er manifesteret ved tilstedeværelsen af 20 overlappende SYCP3 og SYCP1 strækninger. At karakterisere crossover dannelse i wild-type oocyter vi immunolabeled prophase kromatin spredt præparater ved hjælp af antistoffer, der registrerer SYCP3, SYCP1 og MLH1, og farves DNA ved hjælp af DAPI. Figur 3B skildrer et repræsentativt billede af en pachytene fase oocyt, som fremgår af tilstedeværelsen af 27 MLH1 foci fordelt langs 20 færdigsamlet SC strukturer. Det gennemsnitlige antal MLH1-positive delefiltre opdaget i wild-type oocyter var 24 ±3 (figur 3 C, N = 15 oocyter). Figur 3D viser SMC6 beriget i regionen pericentromeric heterochromatin (PCH) og langs kromosom arme og MLH1 foci fordelt langs SC i pachytene fase. Figur 3E skildrer en pachytene iscenesat oocyt hvor kromosom spredes forberedelse var optimale og individuelle kromosomer er umulig at skelne, at forebygge nøjagtig vurdering af SYCP3, SMC6 og MLH1. Sub-optimale kromosom spreads kan observeres når inkubation af æggestokkene i hypo-udvinding buffer er for længe eller ikke for længe nok.
Den anden teknik beskrevet kan bruges til at vurdere kromatin morfologi i oocyter efter meiotiske genoptagelse (fig. 6B-D). Protein lokalisering, samt Ploidi, kan let blive vurderet, eksponere potentielle årsager til kromosom segregation fejl. Figur 6B skildrer en MI oocyt viser 20 kromosomer og klare centromer og pericentromeric heterochromatin farvning. Figur 6 c er en zoomet billede hvor topoisomerase IIα (TOPOII) kan ses langs kromosom arme og PCH. Figur 6D skildrer en MII oocyt hvor forbundne Søster kromatider kan skelnes på kromosom og centromer morfologi. Almindelige fejl set når du forsøger denne teknik omfatter oocyter ikke brister når udgivet i diaset PFA-belagt samt kromosomer breder sig alt for langt fra hinanden (figur 6E-F). Hvis ZP ikke fjernes helt, forbliver kromosomerne knyttet til spindel, som vist i figur 6E. Hvis oocyter er faldet for højt fra PFA-belagt slide, kan kromosomerne spredt alt for langt fra hinanden som afbilledet i figur 6F.
Figur 1: meiotiske prophase tidslinjen under kvindelige embryonale og neonatal udvikling. Blå konturer angiver populationer af bestemte prophase sub fase kønsceller (leptotene, zygotene, pachytene og diplotene/dictyate stadier) observeret under embryonale og neonatal udvikling. Stigende mørkeblå farve angiver timingen på som specifikke prophase sub etape bliver mere rigelige. Dette tal blev tilpasset fra reference2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: æggestokken udvinding fra embryoner og neonatal kvindelige unger. (A, B) Den første skæring (1) er lavet over forbens at halshugge embryoet i hoved og hals krydset straks efter hentning fra moderens livmoder horn. Den anden skæres (2) er foretaget langs den ventrale midterlinjen af den bageste halvdel af embryonet, efterfulgt af indsnit langs den forreste halvdel under forbens (3). En final cut er lavet til fjernelse hind lemmer og hale (4). (A) Frontal Se skematisk af dissektion nedskæringer for isolation af æggestokke fra kvindelige unger. (B) Side Se skematisk af dissektion nedskæringer for isolation af æggestokkene med relative placering af indre organer. Regioner vist i lys rød omfatter lever og tarme, der er fjernet under dissektion. Den dorsale væg og tilknyttede organer er vist i lys blå. Dette område omfatter æggestokkene, som er knyttet til de ringere poler af nyrerne på toppen af den uterine horn. (C) Frontal skematisk oversigt over dorsale mur af fosteret efter fjernelse af lever og tarme. (D) skematisk gengivelse af morfologiske forskelle mellem mandlige og kvindelige gonaderne på ca 15-18 dpc. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant prophase kromatin sprede præparater. (A) glas skub skematisk for prophase kromatin spredt præparater. Sort firkantet konturer repræsenterer flydende blocker pen konturer. (B, C) Repræsentative billeder og kvantificering af crossover dannelse i wild-type pachytene fase oocyter ved hjælp af prophase kromatin spredes forberedelse metoder beskrevet i trin 1. (B) kromatin spreads blev udført ved hjælp af æggestokkene fromC57BL/6J mus embryoner isoleret på 18,5 dpc. Kromatin spreads var immunolabeled med antistoffer mod SC laterale element protein SYCP3 (rød) og SC centrale element protein SYCP1 (magenta), MLH1 (grøn, crossover begivenhed markør) og DAPI (blå, DNA). Skalalinjen = 10 µm. (C) Dot plot af MLH1 foci tæller fremstillet af 15 pachytene fase kromatin sprede præparater. Fejllinjer udgør standardafvigelse. (D, E) sammenligning af optimal (D) og sub-optimale (E) prophase sprede præparater, henholdsvis. Kromatin spreads var immunolabeled med antistoffer mod SMC6 (rød), MLH1 (grøn), og SYCP3 (blå). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk diagram over voksen æggestokken. Dette diagram viser anatomi af voksen mus æggestok, oviduct, ampulla og livmoderen. Musen æggestokkene bør fjernes ved omhyggelig indsnit i ledbånd tilslutning æggestokkene til nyrerne ringere poler, og den bageste væg af maven. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: billeder af mund-drevet glas pipette, glas kapillær og håndkraft mikrometer-sprøjten bruges til oocyt manipulation. (A) glas pipette oocyt manipulator består af følgende komponenter i rækkefølge: mundstykke, latex tubing (3,2 mm indre diameter (ID) x 6,4 mm ydre diameter (OD)), 1 mL pipette tip, latex tubing (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) og glas Pasteur pipette. Slutningen af glasset Pasteur pipette er blevet opvarmet over en flamme og slutningen trukket til at skabe en fin spids ende (figur 5A1). (B) glas kapillær oocyt manipulator består af følgende komponenter i rækkefølge: mundstykke, 0,45 µm filter (valgfrit), latex tubing (3,2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL pipette tip, latex tubing (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) og 70 µl glas kapillær. Glas kapillarrør er opvarmet over en flamme på center og trak i modsatte retninger for at oprette to kapillærer med fine tippes ender (figur 5B1). (C) de hånddrevne mikrometer-sprøjte består af følgende komponenter i rækkefølge: Mitutoyo 150-208 mikrometer hoved (mellemste størrelse, 0-1 "range, 0,001" graduering), 5 mL sprøjte, latex tubing (3,2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL pipette tip, latex tubing (6,4 mm ID x 11,1 mm OD), 1 mL pipette tip og en 83 x 0,5 mm2 gel ladning tip. Mitutoyo 150-208 mikrometer hoved er fast indsat i 5 mL sprøjte (figur 5 c1). For at sikre gel ladning tip er fastgjort forsvarligt, forbinder 1 mL pipette er tip skåret (figur 5 c2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentative metafase I og II oocyt kromatin sprede præparater. (A) Slide skematisk for metafase I og II oocyt kromatin spredning præparater. Oocyter (cirkler) udgivet via mund-drevet glas pipette eller kapillær i en lige linje (efter pilen). Sort rektangel disposition repræsenterer flydende blocker blyant skitse. (B, C) Optimal metafase jeg kromatin spredes forberedelse. Metafase jeg kromosomerne er farvet med DAPI (blå, DNA), og immunolabeled for CEN (grøn, kinetochore/centromer markør). Skalere barer = 10 µm. (B) antistoffer mod Histon H4 (di methyl K20, tri-methyl K20) blev brugt til at mærke pericentromeric heterochromatin (PCH). (C) antistoffer mod Topoisomerase IIα (TOPOII) blev brugt til at mærke PCH og kromosom akserne. (D) Optimal metafase II kromatin spredes forberedelse. Metafase II kromosomerne er farvet med DAPI (blå, DNA), og immunolabeled for CEN (grøn) og Histon H4 (di-methyl K20, tri-methyl K20) at mærke PCH. Skalalinjen: 10µm. (E, F) fattige metafase jeg kromatin sprede præparater. Kromosomerne er farvet med DAPI (blå, DNA), og immunolabeled for CEN (grøn) og komponenten meiotiske cohesin, REC8. Skalere barer = 10 µm (E) en oocyt, der ikke briste ved udgivelse på PFA-belagt slide. (F) kromosomer, der var spredt for langt fra hinanden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Varen | Beløb | Endelig koncentration |
1 x PBS | 50 mL | 1 x |
BSA | 1,5 g | 3% (w/v) |
Hest Serum | 5 mL | 10% (v/v) |
10% vaskemiddel (Se Tabel over materialer) i PBS |
250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabel 1: Antistof fortynding buffer (ADB) opskrift. Gemme ADB ved 4 ° C eller fryse bestande ved-20 ° C, hvis lave større mængder. ADB kan blive forurenet, så sørg for god aseptisk teknik anvendes og vurdere løsning for kontaminering inden hver anvendelse. Mindre delprøver af ADB kan også være parat til at minimere forurening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kromatin spredning præparater giver forskere at kronologisk studere kvindelige pattedyr meiose og den dynamiske lokalisering af proteiner involveret. Embryonale og neonatal kromatin opslag giver mulighed for tæt analyse af hændelser i hele meiotiske prophase. Metafase jeg og metafase II kromatin spreads kan bruges til at skelne enkelt Søster kromatider fra parret søstre og parret homologe kromosomer, samt vurdere Ploidi. Til sammenligning, kan den protokol, der er beskrevet her være fordelagtigt i forhold til hele oocyt immunolabelling, som hyppigt producerer høje niveauer af baggrunden signal, der reducerer opløsningen af kromatin-bundet proteiner. Derudover repræsenterer kromatin udbredelsen teknikker et attraktivt alternativ til live-celle billeddannelse, som kræver en stor investering af tid og specialudstyr.
Embryonale og neonatal æggestokkene kan være vanskeligt at lokalisere og uddrag. Vi anbefaler omhyggeligt udvinder alle andre organer og materiale ud over nyrerne i en separat skål indeholdende PBS før søger æggestokkene, og ved hjælp af en frisk skål af PBS for hver embryo/hvalp (figur 2B). Hvis fosteret/pup er mand, vil testiklerne skelnes ved tubulus dannelse samt placeringen af gonaderne (figur 2D). Som mandlige embryoner udvikler, vil testiklerne ned over penis, at blive større og ovale.
Oocyt kromatin sprede teknik kræver beherskelse af oocyt samling og manipulation ved hjælp af mund-drevet glas pipette eller kapillær. Vi anbefaler, at øve kontrollere munden pipette før du udfører denne protokol. Trække den korrekte størrelse glas pipette/kapillær for samling og ribbe oocyter vil øge chancerne for succes og effektivitet ved at minimere den tid oocyter er uden for inkubator såvel som i den Tyrode løsning. Rigtige timing for ZP fjernelse er ekstremt vigtigt for succes i denne metode. Hvis oocyter inkuberes i Tyrodes løsning i en utilstrækkelig mængde af tid, vil ZP ikke blive fjernet helt. Dette forhindrer oocytter fra sprængningen effektivt på diaset, som kan ses i figur 6E. Men hvis oocyter inkuberes i Tyrodes løsning for længe, oocyt kvalitet og downstream immunofluorescens farvning vil blive alvorligt kompromitteret. Vi anbefaler at se oocyter under et mikroskop for at fastslå det nøjagtige tidspunkt for ZP opløses i Tyrodes løsning. Tilføje kun 5-10 oocyter ad gangen til Tyrodes løsning vil minimere overdreven udsættelse. Hvis oocyter udsættes for højt over den PFA-belagt slide, sprede kromosomerne kan alt for langt fra hinanden (figur 6F). Optimale resultater er fundet når oocyter er udgivet 1 cm over diaset. Andre faktorer, der kan hindre resultater omfatter langvarig udsættelse for nedsat CO2 niveauer i luften under oocyt manipulation trin. Dette forårsager pH udsving i de medier, der er skadelige for oocyt kvalitet, og det fremgår af gradvise farveændring af medierne af orange-rød til lyserød. Medierne stødpudeevne også aftager over tid; Derfor, vi anbefaler ikke brug af medier, der har været gemt (4 ° C) i mere end 1 uge. M2 medium, som ikke kræver CO2 til bufferlagres, er almindeligt anvendt som et alternativ.
En begrænsning til kromatin sprede præparater er manglen på visualisering af kromatin indfødte inden for cellen. Cellulært materiale uden for kernen kan visualiseres og spindel dannelse ikke kan vurderes. Derfor kan andre metoder bruges til at vurdere oogenesen ud over kromatin spreads, som hele oocyt immunolabelling efter monastrol behandling, som kollapser den bi-polar spindel i en mono-polar spindel22. Dette giver mulighed for Søster kromatider skal vurderes inden for rammerne af cellen. Kollektivt, kan kromatin sprede metoder beskrevet her nemt anvendes til at vurdere kromatin morfologi og kromosom Ploidi hele oogenesen i romanen transgene og mutant musen modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIGMS (R01GM11755) til P.W.J og af en uddannelse grant stipendium fra National Cancer Institute (NIH) (CA009110) til Niels og J.H.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
Fine forceps | VWR | 300-050 | |
Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
Clear nail polish | Amazon | N/A | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
Observer Z1 | Zeiss | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
- Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
- Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
- Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
- Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
- Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
- Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413 (2014).
- Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
- Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
- Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
- Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
- Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
- Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).