Summary
Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.
Abstract
Chromatin verbreitete Techniken haben am meisten benutzt, die dynamische Lokalisierung verschiedener Proteine während der Gametogenese, insbesondere für die Spermatogenese zu beurteilen. Diese Techniken ermöglichen für die Visualisierung von Protein- und DNA-Lokalisierung Muster bei meiotische Veranstaltungen wie homologe Chromosom Paarung, Synapsis und DNA zu reparieren. Während einige Protokolle in der Literatur beschrieben wurden, sind allgemeine Chromatin verbreitete Techniken mit Säugetieren Prophase Eizellen begrenzt und schwierig aufgrund des Zeitpunkts der Meiose Initiation in fetalen Ovarien. Im Vergleich dazu können Jugendliche männliche Mäuse mit höheren Erträgen ohne Mikrodissektion Prophase Spermatozyten abgeholt werden. Es ist jedoch schwierig, eine reine synchronisierte Population von Zellen in bestimmten Phasen aufgrund der Heterogenität der meiotischen und Post-meiotische Keim-Zell-Populationen in den Jugendlichen und Erwachsenen Hoden zu erhalten. Für die späteren Phasen der Meiose ist es vorteilhaft, die Eizellen durchläuft Meiose I (MI) oder Meiose II (MII), weil Gruppen von reifen Eizellen können von Erwachsenen weiblichen Mäusen gesammelt und wieder Meiose in Kultur angeregt zu beurteilen. Hier Methoden für meiotische Chromatin verteilt Vorbereitungen mit Eizellen seziert von fötale, neonatale und Erwachsenen Eierstöcke sind beschrieben mit dem dazugehörigen video-Demonstrationen. Chromosom Missegregation Veranstaltungen in Säugetieren Eizellen sind häufig, besonders während MI. Diese Techniken können verwendet werden, zu bewerten und zu charakterisieren, die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen oder Umwelteinflüsse während der verschiedenen Stadien der Oogenese. Da gibt es deutliche Unterschiede zwischen Oogenese und Spermatogenese, sind die Techniken beschrieben wurden, innerhalb von unschätzbarem Wert für unser Verständnis von Säugetieren Oogenese und sexuell dimorphen Eigenschaften des Chromosoms und Protein Dynamik während der Meiose zu erhöhen .
Introduction
Während der Spermatogenese werden große halbsynchrone Wellen der meiotischen Keimzellen in den Hoden zu Beginn der Pubertät und im gesamten Erwachsenenalter1schnell und kontinuierlich aufgefüllt. Im Gegensatz zu den Männchen wird Meiose bei den Weibchen nur während der fetalen Entwicklung eingeleitet. Nach der Geburt, Eizellen bleiben verhaftet in einem längeren Dictyate Stadium der Prophase I mit einer intakten Germinal Vesicle (GV; Kernhülle) bis zur Pubertät. Zu Beginn der Pubertät eine Teilmenge der Eizellen werden zyklisch ausgewählt, um Wachstum und Reifung, Kennzeichnung der Einleitung der meiotischen Wiederaufnahme zu unterziehen. Meiotische Wiederaufnahme in ausgewachsene Eizellen manifestiert sich durch das Verschwinden der GV in einem Prozeß bekannt als Germinal Vesicle Aufschlüsselung (GVBD). Die Eizelle wird dann Chromosom Kondensation und Segregation, gefolgt von Polkörperchen Extrusion. Eizellen werden bei der Progression zu MII verhaftet und stimuliert die zweite und letzte meiotische Teilung nur nach der Befruchtung abgeschlossen.
Weibliche Fruchtbarkeit hängt stark von dem Erfolg der meiotischen Prophase ich fortschreiten. Der Schlüssel hierzu ist eine physische Verbindung zwischen Homologen Chromosomen bekannt als Chiasmata, die durch Reparatur der induzierten DNA-Doppelstrang Brüchen (DSB) über Crossover Rekombination2vermittelt wird. Dieser Vorgang erfolgt im Rahmen der dynamischen eiweißreichen leski bekannt als des synaptonemalen Komplexes (SC), die zwischen Homologen Chromosomen zur Erleichterung ihrer Synapsis3bildet. Der SC ist ein Reißverschluss dreigliedrige Struktur, die besteht aus zwei parallelen seitlichen Elementen verbunden durch Zentralregion Proteine, die homologe zusammen in der gesamten laufenden DNA-Reparatur hält. Vor der Synapsis bilden Vorstufen von den seitlichen Elementen, genannt axiale Elemente zwischen Schwester Chromatiden. Synaptonemalen Komplex Proteine wie SYCP2 und SYCP3 bilden axiale Elemente, die zu den Achsen der Schwester Chromatids Zusammenhalt während der frühen Prophase colocalize. Diese später dienen als Bindungsstellen für die transversale Filament-Protein, SYCP1, das zentrale Element Montage und Synapsis zwischen ausgerichteten homologe4erleichtert. Maus Eizellen ist komplette Synapsis durch die Anwesenheit von 20 komplett entnehmen Sie bitte, dass überlappende SYCP3 und SYCP1 Strecken, die visualisiert werden können, mithilfe von Chromatin Zubereitungen verbreiten. SYNAPSIS ist bei Eintritt in die Pachytene Unterphase abgeschlossen wobei Reife Frequenzweichen, die in Form Chiasmata zwischen homologen bestimmt sind mit MutL Homolog (MLH1/3) Dimere Förderung ihre präzise Verarbeitung5,6 verziert sind , 7. Bauunterhaltung der Chromosomen (SMC) komplexe, einschließlich Cohesin, condensin und die SMC5/6-Komplex, sind wichtig für die Regulierung des Chromosoms Dynamik und Struktur im gesamten Meiose8,9, 10,11,12. Gemeinsam sorgen diese Ereignisse korrekte Bi-Ausrichtung der Homologen Chromosomen an den gegnerischen Spindel Polen nach Demontage des SC.
Die meiotische Zellzyklus ist ein leistungsfähiges Modell, die Rollen der verschiedenen Proteine im Genom Wartung aufgrund der programmierten Induktion und anschließende Reparatur der DNA DSB zu untersuchen. Säugetier-Meiose ist darüber hinaus auch eine relevante Modell für die Untersuchung von epigenetischen Modifikationen und Prägung13. Jedoch ist es technisch schwierig, bewerten diese Ereignisse während weibliche Meiose stattfindet in fetalen und neonatalen Eierstöcke bei Säugetieren (Abbildung 1). In 5 Subverteiler teilbar Prophase: Leptonema, Zygonema, Pachynema, Diplonema und Dictyate. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren und zu unterscheiden zwischen fetalen und neonatalen Eierstöcke und Hoden (Abbildung 2). Adaptiert von zuvor beschriebenen Methoden, diese Handschrift auch beschreibt ein Protokoll (Schritt 1) mit video-Demonstration für die Vorbereitung der weiblichen meiotischen Prophase ich Chromatin breitet sich14,15,16,17 . Verbindung mit Immunolabelling, wie beschrieben in Schritte 6 und 7, dieses Protokoll ermöglicht detaillierte mikroskopische Analyse der Prophase ich Ereignisse in Eizellen.
Oogenese ist fehleranfällig und Chromosom Missegregation Ereignisse während der ersten meiotischen Teilung stellen die häufigste Quelle der genetischen Krankheit Nachkommen18,19. In diesem Manuskript (Protokoll (Schritt 2) beschreiben wir ein Protokoll, in dem grundiert Eierstöcke von Erwachsenen weiblichen Mäusen Reife GV inszeniert Eizellen entnommen sind. Unterstützende Bedingungen werden ausgewachsene Eizellen luteinisierendes Hormon-unabhängigen Wiederaufnahme der Meiose nach Isolation und Kultur20unterzogen. Nach meiotische Wiederaufnahme Eizellen durch Meiose ich Fortschritt, dann in Metaphase II zu verhaften. Eizellen bleiben in Metaphase II, verhaftet, wenn befruchtet. In den Schritten 2 – 5 passen wir uns zuvor aufgezeichneten Protokolle mit video-Demonstration zu beschreiben, wie zu sammeln, Kultur und Chromatin verteilt Vorbereitungen21MI und MII Eizellen vorbereiten. Dieser Chromatin Verbreitung Technik ermöglicht eine klare Immunolabelling der Proteine Chromosomen zugeordnet. Darüber hinaus dieses Protokoll kann auch zur Unterscheidung zwischen bivalenten und einwertigen Chromosomen und lösen weitere einzelne Schwester Chromatiden Bewertung der Eizelle Diploidie zu erleichtern. Daher kann dieses Protokoll neben enthüllt Lokalisierung Muster der meiotischen Proteine, auch als ein unschätzbares Werkzeug für die Aufklärung der Ursachen von Chromosom Missegregation während MI und MII dienen.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt. Experimente wurden an Wildtyp C57BL/6J Mäusen durchgeführt.
1. Ernte fetale oder neonatale Eierstöcke und Vorbereitung der Prophase Chromatin breitet sich
- Embryonen im 14,5 – 19,5 Tage Post-Coitum (Dpc) extrahieren Opfern Sie die trächtige Weibchen durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien.
Hinweis: Überspringen Sie Schritt 1.3 für postnatale Tag 1 – 5 Eierstöcke. Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung der meiotischen Prophase Bühnen in verschiedenen Altersstufen der embryonalen und postnatale bereichert. - Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit sterile Schere, so dass eine v-förmige Öffnung. Aus der mütterlichen Gebärmutter Horn zu sezieren Sie, trennen Sie die Embryonen aus der Plazenta und transferieren Sie die Embryonen in 35 mm Petrischalen mit 3 mL vorgewärmten 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C.
Hinweis: Ein Fliptop-Inkubator bei 37 ° C einstellen kann verwendet werden, um Temperatur zu halten. Darüber hinaus kann eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eierstock Manipulation verwendet werden. - Mit 3,5-Zoll-Chirurgische Scheren Embryonen oder Welpen über Enthauptung nach IACUC Richtlinien zu opfern. Legen Sie enthauptet Embryonen oder Welpen in vorgewärmten PBS vor weiteren Dissektion.
- Sezieren eines Embryos oder Welpen gleichzeitig in einer separaten 35 mm Petrischale mit 3 mL vorgewärmten PBS bei 37 ° C. Fahren Sie durch Schnitt entlang der ventralen Mittellinie von der hinteren Hälfte des Embryos, entlang der vorderen Hälfte unter die Vorderbeine und direkt oberhalb der hinteren Gliedmaßen und Rute wie in Abbildung 2A-Bbeschrieben.
- Öffnen Sie den Bauch mit 3,5-Zoll-chirurgische Schere. Mit feinen Spitzen Pinzette zu verdrängen oder entfernen Sie die Leber und Schleifen des Darms, die Eierstöcke in einer neuen 35 mm Petrischale mit 3 mL vorgewärmten PBS bei 37 ° C aussetzen (siehe Guide in Abbildung 2 b). Die Eierstöcke befinden sich direkt unterhalb und hinter der Niere in Richtung der hinteren Wand der Bauchhöhle (Abb. 2 b–C). Ein Leitfaden für die Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Keimdrüsen wird in Abb. 2Dbereitgestellt.
Hinweis: Für optimale Bedingungen schnell zu sezieren, die Eierstöcke nach trächtige Weibchen geopfert wird. - Entfernen Sie beide Eierstöcke von jedem weiblichen Fetus mit einer feinen Spitze Pinzetten unter einer Dissektion Umfang und in einer Uhrgläser oder separate Brunnen von Multi-Well Platte mit 0,5 bis 1,0 mL vorgewärmten PBS und pflegen bei 37 ° C.
- Legen Sie jedes Paar der Eierstöcke in 0,5 mL Hypo-Extraktionspuffer (17 mM Trinatrium Citrat Dihydrat, 50 mM Saccharose, 5 mM EDTA, 0,5 mM DVB-t, 30 mM Tris-HCl, Proteasehemmer, pH 8,2) in einem sauberen Uhrglas oder ein kleiner Brunnen von einem 9-Well-Platte, und achten Sie auf die Eierstöcke Comp Tauchen vollständig. Inkubieren Sie mindestens 15 min lang, aber nicht mehr als 30 min.
Hinweis: Hypo-Extraktionspuffer frisch machen und innerhalb von 2 h von DVB-t-Zusatz verwenden. - Während der Inkubation mit einem hydrophobe Barriere Pap-Stift zeichnen Sie zwei 22 x 22 mm2 Quadrate auf ein sauberes Glas 25 x 75 mm2, 1 mm dicken Mikroskop-Objektträger, wie in Abbildung 3Agezeigt.
Hinweis: Folien können rechtzeitig vorbereitet werden. - Pipette 45 – 50 µL 100 mM Saccharose in eine saubere Folie und ein paar Eierstöcke bis zum Tropfen zu übertragen.
- Mit den Spitzen enden von zwei 27 G Nadeln, necken Sie die Eierstöcke auseinander um Zellen in die Saccharoselösung zu lösen. Mit der Pinzette große Stücke von Eierstock entfernen und sorgfältig pipette Saccharoselösung um Zellen zu verteilen.
- Platz 40 µL Fixativ Lösung (1 % Paraformaldehyd (PFA), 0,2 % Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien), pH 9.2) in jedes Quadrat der vorbereitete Folie. Mit einem 200 µl Pipettenspitze Fixativ Lösung gleichmäßig über die Oberfläche der Folie.
- Pipette 20 µL des Saccharose-Mix auf jedes Quadrat von der Folie, die das Fixiermittel enthalten.
Hinweis: Dies entspricht mit ein paar Eierstöcke pro Folie. - Inkubieren Sie die Folien in einer geschlossenen feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur.
Hinweis: Die Übernachtung Inkubation reichen um (12-15 Stunden) bei Raumtemperatur. - Öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Folien vollständig an der Luft trocknen.
- Objektträger in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,4 % Netzmittel-PBS-Lösung waschen (siehe Tabelle der Materialien) für 2 min an der Luft trocknen, und fahren Sie mit Immunolabelling-Protokoll (Schritt 6).
Hinweis: Es kann möglich sein, die Folien bei-80 ° C für die spätere Verwendung zu speichern, aber dies variiert je nach Protein des Interesses. Gehen Sie für ein optimales Ergebnis sofort auf das Immunolabelling-Protokoll (Schritt 6).
2. Metaphase ich Eizellenentnahme
- Um die Anzahl der antrale Follikel von jeder Maus isoliert zu maximieren, intraperitoneal injizieren Sie geschlechtsreif Jungfrau weibliche Mäuse mit 5 IU trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG, auch bekannt als equine Chorion-Gonadotropin (EKG)).
Hinweis: Für optimale Eizelle Ertrag sollte Mäuse 1 bis 3 Monate alt, sein wie die Anzahl der Eizellen geerntet mit zunehmendem Alter abnimmt. Zur Vorbereitung der PMSG lösen Sie Flasche 5.000 IU in 100 mL sterilen PBS (5 U/0.1 mL) Store in Einweg-Aliquote von 600 µL bei-20 ° C auf. - Bereiten Sie nach 44 – 48 h Kollektion Medium, minimale wesentliche Mittel alpha (MEMα) Mittel ergänzt mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS) und 3 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Sterilisieren Sie Medien durch einen 0,2 µm-Poren-Filter. Dekantieren Sie 2,5 mL MEMα/BSA/FBS in eine Glasschale per Mausklick Mittel- und warm auf 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.
Hinweis: Andere Sammlung und Kulturmedien, die im Handel erhältlichen (M2 und M16) sind auch allgemein verwendet.
Achtung: Wir empfehlen entfernen Kultur Gerichte aus dem 5 % CO2 Inkubator, eine zu einem Zeitpunkt für begrenzte Dauer Umgebungsluft Belichtung während der Manipulation Schritte zu minimieren. - Die Mäuse durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien zu opfern.
- Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit steriler Schere, wodurch eine große v-förmige Öffnung. Mit Pinzette, verdrängen Sie Darm in Richtung des Kopfes von der Maus. Suchen Sie jedes uterine Horn; die Eierstöcke sind proximal zu den Brustkorb präsentieren. Halten Sie die Eileiter mit feinen Zangen und schneiden Sie das Fett Superior der Eierstöcke mit Dissektion Schere (Abbildung 4). Weiterhin halten die Eileiter und den Eierstock aus der Bursa und in Sammlung Schale mit MEMα/BSA/FBS Medium mit einem anderen Satz von feinen Pinzetten freisetzen.
Hinweis: Wie in Schritt 1 ist es unerlässlich, die Eierstöcke bei 37 ° C zu halten und zu pflegen um 5 % CO2. Ein Fliptop-Inkubator bis zu 5 % CO2 Mix angeschlossen kann verwendet werden, um optimale Wartung der Temperatur- und CO2 -Konzentration zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eizelle Manipulation verwendet werden. - Mit einer 1 mL Spritze mit einem 27-Gauge-Nadel (oder ähnlicher Größe), Cumulus Eizelle komplexe lösen, indem manuell Durchbohrung der großen antrale Follikel.
- Sammeln Sie während der Beobachtung durch ein Mikroskop Dissektion, GV inszeniert Eizellen mit einer Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare oder einer handbetriebenen Mikrometer-Spritze (Abbildung 5). Sammeln Sie nur Eizellen, die freigegeben werden von antrale Follikel. GV Eizellen haben einen Durchmesser von ca. 90 µm. GV Eizellen können 2-3 Schichten von Granulosa Zellen umgeben sein, und haben einen Durchmesser von rund 200 µm.
- Kultur der Eizellen in einem sauberen Uhrglas oder ein 9-Well-Platte mit MEMα/BSA/FBS Medium für 6 h, Metaphase zu erreichen ich bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.
- Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
3. Metaphase II (MII) Eizellenentnahme
- Zur Maximierung der Oozyten isoliert von jeder Maus Spritzen Sie intraperitoneal geschlechtsreif Jungfrau weibliche Mäuse mit 5 IU der PMSG. Nach 44 – 48 h intraperitoneale Injektion mit 5 IU humanes Choriongonadotropin (hCG).
Hinweis: Für optimale Eizelle Ertrag sollte Mäuse 1 bis 3 Monate alt, sein wie die Anzahl der Eizellen geerntet mit zunehmendem Alter abnimmt. Um hCG vorzubereiten, lösen eine Flasche 10.000 U in 200 mL PBS (5 U/0.1 mL). Speichern Sie in Einweg-Aliquote von 600 µL bei-20 ° C. - Bereiten Sie nach 12 bis 14 Uhr MEMα/BSA/FBS Kollektion Medium, wie oben in Schritt 2.2 beschrieben.
- Die Mäuse durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung nach IACUC Richtlinien zu opfern.
- Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit steriler Schere, wodurch eine große v-förmige Öffnung. Mit Pinzette, verdrängen Sie Darm in Richtung des Kopfes von der Maus. Suchen Sie jedes uterine Horn, die Eierstöcke sind proximal zu den Brustkorb präsentieren. Halten Sie die Eileiter mit feinen Zangen und schneiden Sie das Fett Superior der Eierstöcke mit Dissektion Schere (Abbildung 4). Dann entfernen Sie den Eierstock und Eileiter und legen in Sammlung Schale mit MEMα/BSA/FBS Medium.
Hinweis: Wie in den Schritten 1 und 2 ist es unerlässlich, die Eierstöcke bei 37 ° C zu halten und zu pflegen um 5 % CO2. Ein Fliptop-Inkubator bis zu 5 % CO2 Mix angeschlossen kann verwendet werden, um optimale Wartung der Temperatur- und CO2 -Konzentration zu ermöglichen. Darüber hinaus sollte eine Temperatur geregelt-Glas-Bühne auch, Temperatur während der Eizelle Manipulation verwendet werden. - Mit Hilfe einer 1 mL Spritze mit einem 27 G (oder ähnlicher Größe) oder scharfe Pinzette, reißen ein Loch in der Ampulle des Eileiters, die MII Eizellen freizugeben.
Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht zu beschädigen die Eizellen in der Ampulle. Der Ampulle erscheint geschwollen und durchscheinend, derart, dass die Eizellen sichtbar (Abbildung 4 sind). - Ernten Sie MII Eizellen aus der Ampulle des Eileiters in eine neue Schale mit Sammlung Medium mit einer Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare oder einer handbetriebenen Mikrometer-Spritze (Abbildung 5).
- Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
(4) Eizelle Entblößung und Zona Pellucida entfernen
- Bereiten Sie 300 IU/mL von Hyaluronidase in MEMα Medium ergänzt mit 3 mg/mL BSA zu Eizellen der umgebenden Kumuluszellen (2,5 mL/Maus) in ein Uhrglas und halten bei 37 ° C, 5 % CO2zu entblößen.
Hinweis: Hyaluronidase Wirksamkeit sinkt stark nach 1 h der Vorbereitung. Für MII Eizellen ist Hyaluronidase Behandlung nicht erforderlich. - Setzen Sie Eizelle-Cumulus Zelle komplexe bis 300 IU/mL von Hyaluronidase in MEMα/BSA 3 min um Eizellen der umgebenden Kumuluszellen entblößen aus.
Achtung: Überschreiten Sie 3 min Exposition gegenüber Hyaluronidase, nicht, da es die Eizellen schädigen. - Waschen Sie die Eizellen, transfer Eizellen zu einem frischen erwärmt MEMα/BSA mittlere Schüssel. Mit einem kleinen Mund betriebene Glaspipette oder Kapillare (etwas größer als der Durchmesser der Eizelle, die etwa 90 µm), pipette die komplexe oben und unten, um die Kumuluszellen vollständig zu lösen. Lassen Sie die Eizellen in den Inkubator zu erholen, während der Vorbereitung für den nächsten Schritt.
- Warmen sauren Tyrode-Lösung, MEMα/BSA und Waymouths Medien auf 37 ° C (500 µL/Maus). Platz 300 µL in jede Vertiefung der kleine 9-Brunnen Glasplatten.
- Entfernen Sie die Zona Pellucida (ZP) übertragen Sie 5 – 10 Eizellen in Tyrode Lösung. Setzen Sie die Eizellen für nur 30-45 s, um die Lösung.
Hinweis: Zu wenig Kontakt mit der Lösung wird nicht die ZP vollständig entfernen, die die Eizellen platzen und Chromosomen Ausbreitung verhindert. Zu viel Belastung beschädigt und die Eizelle zu töten. ZP auflösen unter die Dissektion Mikroskop beobachten kann helfen bei der Optimierung der Belichtungszeit.
Achtung: Mit frischen Tyrode-Lösung ist kritisch, da seine Funktion mit dem Alter abnimmt. Verwenden Sie einen frischen Brunnen Tyrode Lösung für jede Gruppe von Eizellen behandelt, um gleichmäßige Verdauung der ZP zu gewährleisten. - Sofort nach dem ZP entfernen waschen Sie die Eizellen durch die Übertragung in erwärmten MEMα/BSA/FBS Medium. Wiederholen Sie dies waschen.
Hinweis: Achten Sie bei der Übertragung von Eizellen leicht zusammenkleben und auf die Glaspipette oder Kapillare folgenden entfernen von der ZP. Vornässen der Glaspipette oder Kapillare in Waymouths Mediums werden Eizellen zusammenkleben minimieren. - Und die Eizellen wieder für 30 Minuten in Waymouth Medium bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator.
- Fahren Sie mit Schritt 5 fort.
5. MI und MII Eizelle Chromatin Spreads
- Zeichnen Sie mit einem PAP-Stift, ein 11 x 44 mm2 Rechteck auf der Glas-Folie, wie in Abbildung 6Agezeigt.
- Beschichten die Folie mit einer dünnen Schicht Fixativ (1 % Paraformaldehyd, 0,2 % Triton X 100 H2O, pH 9.2) durch Pipettieren 100 µL Fixativ auf der Folie und die Folie hin und her schaukeln. Tippen Sie auf die Folie um loszuwerden überschüssige Fixiermittel.
- Zwischen 5 bis 10 Eizellen mit einer kleinen Mund Pipette Nadel mit als wenig Medien wie möglich holen Sie ab und ziehen Sie die Nadel in einer Linie über die Fixiermittel-beschichtete Folie während der Hinterlegung der Eizellen von 1 cm oberhalb der Folie in die Fixativ Lösung. Führen Sie diesen Schritt mit einer Dissektion Mikroskop um sicherzustellen, dass die Eizellen hinterlegt worden sind und dass sie platzen, haben.
Hinweis: Die Eizellen sollte sofort auf der Folie platzen. Die Höhe, bei der die Eizellen sind, hinterlegt Auswirkungen der Grad des Chromatins zu verbreiten. Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 6 für weitere Details zu sehen. - Inkubieren Sie Folien bei Raumtemperatur in einer geschlossenen Kammer befeuchtete über Nacht erlauben das Chromatin zu halten.
- Die Folien vollständig an der Luft trocknen lassen und abspülen Folien in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,4 % Netzmittel-H2O, pH 8.0.
- Fahren Sie mit Schritt 6 fort.
(6) Immunolabelling
- Bereiten Sie die Antikörper-Verdünnungspuffer (ADB) in Tabelle 1beschrieben.
- Bereiten Sie zwei Coplin Gläser mit 50 mL Waschlösung Puffer (WB) (10 % ADB in PBS verdünnt) und einem Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB und 0,05 % Reinigungslösung (z.B.50 mL WB 250 µL 10 % Waschmittel hinzufügen).
- Waschen Sie die Folien, die in Abschnitt 1 und 5 dieses Protokolls für 10 min in einem Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB vorbereitet wurden.
Achtung: Nicht lassen Sie die Folien, die zu jedem Zeitpunkt während der Immunolabelling trocknen. - Waschen Sie die Objektträger für 10 min in der Coplin Glas mit 50 mL WB und 0,05 % Lauge. Waschen Sie die Folien in den verbleibenden Coplin JAR-Datei mit 50 mL WB-Lösung für 10 min.
- Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit und Cover Folie mit 100 µL der ausgewählten Primärantikörper in ADB verdünnt. Bei 4 ° C über Nacht in einer geschlossenen feuchten Kammer inkubieren.
Hinweis: Inkubation kann verkürzt werden, um 2 bis 3 Stunden bei 37 ° C. Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z.B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken. - Spülen Sie Folien in einem Coplin Glas mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-PBS-Lösung, pH 8.0.
- Wiederholen Sie die Schritte 6,2 bis 6,5.
- Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit und Cover Folie mit 100 µL der ausgewählten Sekundärantikörper in ADB verdünnt. Inkubieren Sie Folien 1 bis 2 Stunden bei 37 ° C in einer geschlossenen feuchten Kammer.
- Waschen Sie Objektträger 2 Mal für 10 min in Coplin Gläser mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-PBS-Lösung, pH 8.0.
- Waschen Sie Objektträger 2 Mal für 5 min in Coplin Gläser mit 50 mL 0,2 % Netzmittel-H2O Lösung, pH 8.0.
7. Montage Folien
- Für Prophase Chromatin Spreads vorbereitet in Schritt 2, hinzufügen 100 µL Eindeckmedium mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Für MI und MII Chromatin breitet sich bereit in Schritt 5, fügen 50 µL Eindeckmedium mit DAPI (1.5µg / mL). Tupfen Sie entfernt überschüssige Flüssigkeit.
- Ein 22 x 60 mm-Deckglas darauf legen und mit klaren Nagellack versiegeln. Speichern Sie in einer Folie Box bei 4 ° C oder-20 ° C bis zur Bewertung per Fluoreszenz-Mikroskopie.
Hinweis: Tippen Sie leicht auf Deckglas, um überschüssige Eindeckmedium vor der Versiegelung mit Nagellack zu entfernen.
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Representative Results
Wir haben zwei Techniken zur Visualisierung und Bewertung meiotische Chromosomen in Eizellen beschrieben. Die erste Technik ist gesorgt, in Richtung Prophase Fortschreiten in embryonalen und neonatale Eierstöcke beurteilen. Prophase Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen sind unglaublich wertvoll für zahlreiche dynamische Prozesse während der Meiose, einschließlich Chromosom Paarung, Synapsis visualisieren und desynapsis, homologe Rekombination und epigenetische Chromosom Umbau. Hier zeigten wir den Nutzen dieser Methode für robuste Visualisierung und Quantitative Analyse der Crossover-Formation in Eizellen von C57BL/6J Embryonen geerntet (Abb. 3 b und 3 C). Für Zellen in der Pachytene Unterphase zu bereichern, waren Mausembryonen 18,5 Dpc (Abbildung 1) abrufbar. Zwei wesentliche Merkmale davon Pachytene Unterphase der Prophase die Vollendung der Synapsis zwischen Homologen und der Bildung von mindestens einem MLH1/3-Positive Crossover pro paar Homolog. Komplette Synapsis zwischen homologen manifestiert sich durch die Anwesenheit von 20 überlappende SYCP3 und SYCP1 erstreckt. Crossover-Formation in Wildtyp Eizellen zu charakterisieren wir Immunolabeled Prophase Chromatin Vorbereitungen mit Antikörpern, die SYCP3, SYCP1 und MLH1 erkennen zu verbreiten, und DNA mit DAPI gefärbt. Abbildung 3 b zeigt ein repräsentatives Bild einer Pachytene Bühne Eizelle, die durch die Anwesenheit von 27 MLH1 Brennpunkte verteilt entlang 20 komplett montierte SC Strukturen belegt ist. Die durchschnittliche Anzahl der MLH1-positiven Frequenzweichen in Wildtyp Eizellen erkannt wurde 24 ±3 (Abbildung 3 C, N = 15 Eizellen). Abbildung 3D zeigt SMC6 bereichert in der Chromosomenregion Heterochromatin (PCH) Region und entlang dem Chromosom Arme und MLH1 Brennpunkte verteilt entlang der SC im Pachytene Stadium. Abbildung 3E zeigt eine Pachytene inszeniert Eizelle wo die Chromosom Ausbreitung Vorbereitung war suboptimal und einzelnen Chromosomen sind ununterscheidbar, genaue Beurteilung der SYCP3, SMC6 und MLH1 zu verhindern. Suboptimale Chromosom Spreads können beobachtet werden, wann Inkubation der Eierstöcke bei Hypo-Extraktionspuffer zu lang oder nicht lang genug ist.
Die zweite Technik beschrieben lässt sich beurteilen, Chromatin Morphologie in Eizellen nach meiotische Wiederaufnahme (Abb. 6 b-D). Protein-Lokalisierung sowie Diploidie, kann leicht beurteilt werden, mögliche Fehlerursachen Chromosom Abtrennung auszusetzen. Abbildung 6 zeigt ein MI Eizelle zeigt 20 Chromosomen und klare Zentromer und Chromosomenregion Heterochromatin Färbung. Abbildung 6 ist ein gezoomten Bild wo Topoisomerase IIα (TOPOII) entlang dem Chromosom Arme und der PCH gesehen werden kann. Abbildung 6 zeigt ein MII Eizelle wo gekoppelten Schwester Chromatiden von Chromosom und Zentromer Morphologie unterschieden werden können. Häufige Fehler beim Versuch diese Technik zu sehen sind Eizellen nicht platzen nach dem Loslassen in der PFA-beschichtete Folie sowie Chromosomen zu weit auseinander (Abb. 6E–F) zu verbreiten. Wenn die ZP nicht vollständig entfernt wird, bleibt die Chromosomen mit der Spindel verbunden, wie in Abbildung 6dargestellt. Wenn die Eizellen zu hoch aus der PFA-beschichtete Folie gelöscht werden, können die Chromosomen zu weit auseinander, wie dargestellt in Abbildung 6Fverteilt werden.
Abbildung 1: meiotischen Prophase Timeline bei weiblichen embryonalen und frühkindlichen Entwicklung. Blaue Konturen zeigen Populationen von spezifischen Prophase Sub Bühne Keimzellen (Leptotän, Zygotene, Pachytene und Diplotene/Dictyate Phasen) während der embryonalen und frühkindlichen Entwicklung beobachtet. Erhöhung der dunkelblaue Farbe zeigt den Zeitpunkt, an dem die spezifische Prophase Sub Bühne häufiger wird. Diese Zahl wurde von Referenz2angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Eierstock-Extraktion aus Embryonen und Neugeborenen weiblichen Welpen. (A, B) Der erste Schnitt (1) erfolgt über die Vorderbeine des Embryos an der Kopf/Hals-Kreuzung sofort nach Entnahme aus dem mütterlichen uterinen Horn zu enthaupten. Der zweite Schnitt (2) erfolgt entlang der ventralen Mittellinie von der hinteren Hälfte des Embryos, gefolgt von Einschnitte entlang der vorderen Hälfte unter die Vorderbeine (3). Eine Reporterin für Entfernung der hinteren Gliedmaßen und Rute (4) erfolgt. (A) frontale Ansicht schematische Darstellung der Dissektion Kürzungen für die Isolierung der Eierstöcke von weiblichen Welpen. (B) Seite Ansicht schematische Darstellung der Dissektion Kürzungen für die Isolierung der Eierstöcke mit relativen Positionen der inneren Organe. Regionen in Licht rot dargestellt sind Leber und Darm, die während der Präparation entfernt werden. Die Hinterwand und die zugeordneten Organe sind im Licht blau gezeigt. Diese Region umfasst die Eierstöcke, die zu den minderwertigen Polen der Nieren am oberen Rand der Gebärmutter Horn befestigt sind. (C) Frontal schematische Darstellung der dorsalen Wand des Embryos nach Entfernung der Leber und Darm. (D) schematische Darstellung der morphologischen Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Keimdrüsen bei ca. 15 – 18 Dpc. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: repräsentative Prophase Chromatin verteilt Vorbereitungen. (A) Glas schieben Schaltplan für Prophase Chromatin Vorbereitungen zu verbreiten. Schwarze Quadrat Konturen darstellen flüssige Blocker Stift Konturen. (B, C) Repräsentative Bilder und Quantifizierung der Crossover-Formation in Wildtyp Pachytene Bühne Eizellen mit Prophase Chromatin verteilt Zubereitungsmethoden in Schritt 1 beschrieben. (B) Chromatin Spreads wurden mit fromC57BL/6J Mausembryonen isoliert Eierstöcke bei 18,5 Dpc durchgeführt. Chromatin Spreads waren Immunolabeled mit Antikörpern gegen den SC seitlichen Element SYCP3 (rot), und der SC Zentralelement Protein SYCP1 (Magenta), MLH1 (grün, Crossover-Event-Marker) und DAPI (blau, DNA). Maßstabsleiste = 10 µm. (C) Dot-Plot zählt 15 Pachytene Bühne Chromatin gewonnenen Verbreitung MLH1 Brennpunkte Vorbereitungen. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. (D, E) Vergleich der optimale (D) und suboptimale (E) Prophase Vorbereitungen, bzw. zu verbreiten. Chromatin Spreads waren Immunolabeled mit Antikörpern gegen SMC6 (rot), MLH1 (grün) und SYCP3 (blau). Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Erwachsenen Eierstock. Dieses Diagramm zeigt die Anatomie der erwachsenen Maus Eierstock, Gebärmutter, Eileiter und Ampulle. Maus Eierstöcke sollte durch sorgfältige Schnitt Bänder verbinden die Eierstöcke mit den minderwertigen Polen der Nieren und der hinteren Wand des Bauches entfernt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Bilder von Mund-betrieben Glaspipette, Glas-Kapillare und handbetrieben Mikrometer-Spritze für die Eizelle Manipulation verwendet. (A) Glas Pipette Eizelle Manipulator besteht aus den folgenden Komponenten in der Reihenfolge: Mundstück, Latex Schläuche (3,2 mm Innendurchmesser (ID) x 6,4 mm Außendurchmesser (OD)), 1 mL Pipettenspitze, Latex Schlauch (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) und Glas Pasteurpipette. Am Ende des Glases, die Pasteurpipette über einer Flamme erwärmt ist und am Ende gezogen, um eine feine Spitze Ende (Abbildung 5A1) erstellen. (B) Glas Kapillare Eizelle Manipulator setzt sich zusammen aus den folgenden Komponenten in der Reihenfolge: Mundstück, 0,45 µm-Filter (optional), Latex Schlauch (3,2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL Pipettenspitze, Latex Schlauch (6,4 mm ID x 11,1 mm OD) und 70 µl Glas Kapillare. Glas-Kapillarröhrchen werden beheizt über eine Flamme in der Mitte und zog in entgegengesetzte Richtungen, zwei Kapillaren mit feinen Spitzen enden (Abb. 5 b1) zu erstellen. (C) die handbetriebene Mikrometer-Spritze besteht aus folgenden Komponenten nacheinander: Mitutoyo 150-208 Mikrometer Kopf (mittlerer Größe, 0-1 "reichen, 0.001" Graduierung), 5 mL Spritze, Latex Schlauch (3,2 mm ID x 6,4 mm OD), 1 mL Pipettenspitze Latex Schlauch (6,4 mm ID x 11,1 mm OD), 1 mL Pipettenspitze und eine 83 x 0,5 mm2 Gel laden Spitze. Mitutoyo-150-208-Mikrometer-Kopf wird fest in der 5 mL-Spritze (Abbildung 51) eingefügt. Tipp ist (Abbildung 52) schneiden Sie um sicherzustellen, dass die Gel-laden-Tipp sicher, die Anschluss 1-mL-Pipette befestigt ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: repräsentative Metaphase I und II Eizelle Chromatin verteilt Vorbereitungen. (A) schieben Schaltplan für Metaphase I und II Eizelle Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen. Eizellen (Kreise) über Mund-betrieben Glaspipette oder Kapillare in einer geraden Linie (nach dem Pfeil) freigegeben. Schwarzes Rechteck Umriss darstellt flüssige Blocker Stift Gliederung. (B, C) Optimale Metaphase ich Chromatin verteilt Vorbereitung. Metaphase ich Chromosomen wurden gebeizt mit DAPI (blau, DNA) und Immunolabeled für CEN (grüne, Kinetochor/Zentromer Markierung). Skalieren Sie Bars = 10 µm. (B) Antikörper gegen Histone H4 (di-Methyl K20, Tri Methyl K20) wurden verwendet, um die Chromosomenregion Heterochromatin (PCH) beschriften. (C) Antikörper gegen Topoisomerase IIα (TOPOII) wurden verwendet, um die PCH und Chromosom Achsen beschriften. (D) optimale Metaphase II Chromatin verteilt Vorbereitung. Metaphase II Chromosomen wurden gebeizt mit DAPI (blau, DNA) und Immunolabeled für CEN (grün) und Histon H4 (di-Methyl-K20, Tri-Methyl K20) um den PCH zu beschriften. Maßstabsleiste: 10µm. (E, F) schlechte Metaphase ich Chromatin verteilt Vorbereitungen. Chromosomen wurden mit DAPI (blau, DNA), und Immunolabeled für CEN (grün) und die meiotische Cohesin Komponente, REC8 gefärbt. Skalieren von Balken = 10 µm (E) eine Eizelle, die nicht nach Freigabe in PFA-beschichtete Folie platzen. (F) Chromosomen, die zu weit auseinander waren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Artikel | Betrag | Endkonzentration |
| 1 X PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3 % (w/V) |
| Pferd-Serum | 5 mL | 10 % (V/V) |
| 10 % Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien) mit PBS-Puffer |
250 ΜL | 0,05 % (V/V) |
Tabelle 1: Antikörper Verdünnung Puffer (ADB) Rezept. Lagern Sie ADB bei 4 ° C oder frieren Sie Bestände bei-20 ° C ein, wenn größere Mengen machen. ADB kontaminiert werden können, so stellen Sie sicher gute aseptische Techniken dienen und die Lösung für Kontamination vor jeder Benutzung zu beurteilen. Kleinere Aliquote ADB können auch vorbereitet werden, um Verunreinigungen zu minimieren.
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Discussion
Chromatin Ausbreitung Vorbereitungen erlauben Forschern, weiblichen Säugetieren Meiose und die dynamische Lokalisierung von Proteinen, chronologisch zu studieren. Die embryonalen und neonatale Chromatin-Spreads ermöglichen genaue Analyse von Veranstaltungen das ganze meiotischen Prophase. Metaphase I und Metaphase II Chromatin Spreads können verwendet werden, um einzelne Schwester unterscheiden Chromatiden von Schwestern und gepaarten Homologen Chromosomen gepaart sowie Diploidie zu beurteilen. Im Vergleich dazu, kann das hier beschriebene Protokoll vorteilhaft sein im Vergleich zum gesamten Eizelle Immunolabelling, die häufig hohe Konzentrationen von Hintergrundsignal produziert, die die Auflösung der Chromatin-gebundene Proteine abnimmt. Darüber hinaus repräsentieren Chromatin verbreitete Techniken eine attraktive Alternative zum live Cell Imaging, erfordern einen großen Aufwand an Zeit und Spezialausrüstung.
Embryonalen und neonatale Eierstöcke können schwierig sein zu finden und extrahieren. Es wird empfohlen, sorgfältig Extrahieren aller anderen Organe und Material neben den Nieren in einer separaten Schüssel mit PBS vor auf der Suche nach den Eierstöcken, und ein frisches Gericht von PBS für jedes Embryo/Pup (Abb. 2 b). Wenn der Embryo/Welpe männlich ist, wird der Hoden durch die Röhrchen Bildung sowie den Speicherort der die Keimdrüsen (Abb. 2D) unterscheidbar sein. Wie männliche Embryonen entwickeln, werden die Hoden zum Penis, immer größer und Oval geformte absteigen.
Die Eizelle Chromatin verbreitete Technik erfordert die Beherrschung der Eizellenentnahme und Manipulation mit Mund betriebene Glaspipette oder Kapillare. Es wird empfohlen, üben, kontrollieren die Mund-Pipette vor der Durchführung dieses Protokolls. Ziehen die richtige Größe Glas Pipette/Kapillare für Sammlung und Entblößung Eizellen erhöht Chancen auf Erfolg und Effizienz durch Minimierung der Zeit, die Eizellen außerhalb des Inkubators ebenso wie in der Tyrode-Lösung sind. Richtige Timing für die ZP Entfernung ist extrem wichtig für den Erfolg dieser Methode. Wenn die Eizellen für eine unzureichende Menge an Zeit in Tyrode Lösung inkubiert werden, wird die ZP nicht vollständig entfernt werden. Dadurch wird verhindert, dass die Eizellen platzen effizient auf der Folie, wie in Abbildung 6Egesehen werden kann. Jedoch wenn die Eizellen in Tyrodes-Lösung zu lang ausgebrütet werden, werden Eizellqualität und nachgelagerten Immunfluoreszenz Färbung ernsthaft gefährdet. Wir empfehlen, gerade die Eizellen unter dem Mikroskop, die genaue Zeit bestimmen die ZP in Tyrode Lösung löst. Tyrode Lösung nur 5 – 10 Eizellen gleichzeitig hinzufügen, minimieren Sie übermäßige Sonnenbestrahlung. Wenn die Eizellen zu hoch über der PFA-beschichtete Folie freigegeben sind, können die Chromosomen zu weit auseinander (Abb. 6F) verteilt werden. Optimale Ergebnisse werden gefunden, wenn Eizellen 1 cm oberhalb der Folie freigegeben werden. Andere Ergebnisse behindern können unter anderem längere Zeit verringerten CO2 -Konzentration in der Luft während Eizelle Manipulation Schritte. Dies bewirkt pH-Wert Schwankungen in den Medien, die Eizellqualität abträglich sind, und zeichnet sich durch progressive Farbwechsel der Medien von Orange-rot bis Pink. Die Pufferkapazität des Mediums auch abnimmt mit der Zeit; Daher empfehlen wir nicht, dass (4 ° C) mit Medien, die länger als 1 Woche gespeichert werden. M2 Medium, die nicht mehr CO2 gepuffert werden, wird häufig als Alternative verwendet.
Eine Beschränkung auf Chromatin verteilt Vorbereitungen ist das Fehlen der Visualisierung des Chromatins im systemeigenen Rahmen der Zelle. Zellulares Material außerhalb der Kern kann nicht visualisiert werden und Spindel Bildung kann nicht bewertet werden. Daher können andere Methoden Oogenese neben Chromatin ausbreitet, wie ganze Eizelle Immunolabelling nach Monastrol Behandlung zu bewerten, die Bi-polar Spindel in einem Monopolares Spindel22zusammenbricht. Dies ermöglicht Schwester Chromatiden im Rahmen der Zelle bewertet werden. Gemeinsam können die hier beschriebenen Methoden Chromatin verteilt leicht zur Beurteilung der Morphologie und Chromosom Diploidie Chromatin während Oogenese in neuartige mutierten und transgenen Mausmodellen angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), g.h. und j.h.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
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