Summary
포유류에서 oogenesis 오류가, 특히 염색체 missegregation 인 것으로 알려져 있다. 이 원고 chromatin 확산 마우스 의향에 대 한 준비 방법에 설명 합니다 분열 I 및 II 준비 oocytes. 이러한 기본 기술을 chromatin-바인딩 단백질 및 포유류 oogenesis 전체 염색체 형태학 연구에 대 한 수 있습니다.
Abstract
Chromatin 확산 기법 gametogenesis spermatogenesis 위해 특히 동안 다양 한 단백질의 동적 지역화를 평가 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 이러한 기술을 synapsis 및 DNA 복구 동종 염색체, 페어링 등 meiotic 이벤트 기간 동안 단백질 및 DNA 지역화 패턴의 시각화 하실 수 있습니다. 문학에서 몇 가지 프로토콜 설명 되었습니다, 포유류 의향 oocytes를 사용 하 여 일반 chromatin 확산 기술을 제한 하 고 태아 난소에서 감수 분열 개시의 타이밍 때문에 어려운 있습니다. 비교에서는, 의향 spermatocytes 기정을 위한 필요 없이 더 높은 수익률을 젊은 남성 쥐에서 수집할 수 있습니다. 그러나, 특정 단계 청소년 및 성인 고환에 meiotic 및 포스트 meiotic 생식 세포 인구의 때문에 셀의 순수한 동기화 된 인구를 어렵습니다. 감수 분열의 후기, oocytes 성숙한 oocytes의 그룹의 성인 여성 쥐에서 수집 하 고 문화 감수 분열 재개를 자극 수 있기 때문에 내가 (미) 또는 감수 분열 II (MII), 감수 분열을 겪고을 평가에 유리 하다. 여기, oocytes를 사용 하 여 확산 meiotic chromatin 준비 방법에서 태아, 신생아 해 부와 성인 난소 동반 비디오 데모와 함께 설명 되어 있습니다. 염색체 missegregation 이벤트 포유류 oocytes에는 자주, 특히 미 중입니다. 이러한 기술 평가 oogenesis의 다양 한 단계 다른 돌연변이 또는 환경 노출의 효과 특성을 사용할 수 있습니다. 내 설명은 감수 분열 동안 염색체 단백질 역학의 성적으로 동종이 형 기능과 포유류 oogenesis의 우리의 이해를 증가 하는 귀중 한 oogenesis spermatogenesis 사이 뚜렷한 차이가 있기 때문에, .
Introduction
Spermatogenesis, 동안 meiotic 세균 세포의 큰 반동기 파도 신속 하 고 지속적으로 충만 한 사춘기와 성인 기1에 걸쳐 발병에 고환에. 남성, 달리 여성에서 감수 분열은 태아 개발 중 유일 하 게 시작 됩니다. 출생, 다음 oocytes 체포 의향의 장기간된 dictyate 단계에 남아 나는 그대로 germinal 소포 (GV; 핵 봉투) 사춘기까지. 사춘기의 개시에 oocytes의 하위 집합을 성장과 성숙, meiotic 재개의 개시를 표시 주기적으로 선택 됩니다. Meiotic 재개 가득 oocytes에서 germinal 기 쇠 약 (GVBD)로 알려진 프로세스에서 GV의 실종에 의해 명시 됩니다. oocyte는 염색체 응축 및 분리, 극 지 몸 밀어 남에 의해 다음 다음 겪 습. Oocytes는 MII 진행 시 체포 되 고 수정 후에 두 번째 그리고 마지막 meiotic 부문 완료 자극.
여성 불 임은 매우 meiotic 의향의 성공에 따라 달라 집니다 내가 진행. 이 핵심은 동종 염색체 크로스 오버 재결합2를 통해 유발된 DNA 이중 가닥 틈 (DSBs)의 수리에 의해 중재 chiasmata로 알려진 사이의 물리적 링크의 형성 이다. 이 프로세스는 동적 단백질이 풍부한 비 계 라고 자신의 synapsis3촉진 하기 위하여 상 동 염색체 사이 형성 하는 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 컨텍스트 내에서 발생 합니다. 사우스 캐롤라이나 지퍼 처럼 노사 정 구조 이다 중앙 지역 단백질에 의해 연결 된 2 개의 병렬 측면 요소 구성 된 지속적인 DNA 수리에 걸쳐 함께 homologs를 보유 하 고. Synapsis, 이전 축 요소 라는 측면 요소의 선구자 형성 자매 사이 chromatids. SYCP2 및 SYCP3 같은 synaptonemal 복잡 한 단백질 초기 의향 동안 자매 chromatid 결합 축에 colocalize 축 요소를 형성 합니다. 나중에 이러한 역할을 가로 필 라 멘 트 단백질, SYCP1, 중앙 요소 어셈블리 및 정렬된 homologs4사이 synapsis 용이 대 한 사이트를 바인딩. 마우스 oocytes에서 완전 한 synapsis 표시 됩니다 20의 존재에 의해 완전히 겹치는 chromatin를 사용 하 여 구상 될 수 있다 SYCP3와 SYCP1 뻗어 확산 준비. Synapsis는 pachytene substage, 그것에 의하여 homologs 사이의 양식 chiasmata 운명 성숙한 크로스 꾸며져 홍보 그들의 정확한 처리5,6 mutL 체 (MLH1/3) 이합체에 진입 시 완료 , 7. cohesin, condensin, 및 SMC5/6 복잡 한, 포함 하는 염색체 (SMC) 단지의 구조 유지 염색체 역학 및 감수 분열8,9, 전체 구조 규제에 대 한 중요 하다 10,,1112. 이러한 이벤트는 사우스의 해체 다음 스핀 들 극 반대를 상 동 염색체의 올바른 bi 방향을 보장 하는
Meiotic 세포 주기 프로그램된 유도 및 DNA DSBs의 후속 수리 유지 보수 게놈에서에서 다양 한 단백질의 역할을 검사 하는 강력한 모델입니다. 또한, 포유류 감수 분열 후 성적인 수정 및 각 인13의 연구에 대 한 관련 모델 이기도합니다. 그러나, 포유류 (그림 1) 태아 및 신생아 난소에서 여성 감수 분열 동안 이러한 이벤트를 평가 하기 위해 기술적으로 어렵습니다. 의향 나 5 substages로 나눌 수 있습니다: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema 및 dictyate. 여기, 우리가 격리 태아 및 신생아 난소와 고환 (그림 2) 사이 구별 하는 방법을 설명 합니다. 앞에서 설명한 방법에서 적응이 원고 또한 프로토콜 (1 단계) 여성 meiotic 의향의 준비에 대 한 비디오 데모와 함께 설명 난 chromatin 확산14,,1516,17 . 6-7 단계에 설명 된 대로 immunolabelling와 결합 하면이 프로토콜 사용 의향의 상세한 현미경 분석 나 oocytes에서 이벤트.
Oogenesis 오류가, 이며 첫 번째 meiotic 부문 중 염색체 missegregation 이벤트 자손18,19에서 유전자 질환의 가장 일반적인 소스를 나타냅니다. 이 원고 (프로토콜 단계 2), 우리는 성숙한 GV 준비 oocytes 성인 여성 쥐의 끝났다 난소에서 추출 되는 프로토콜을 설명 합니다. 지원 조건 가득 oocytes 고립과 문화20다음 감수 분열의 황 호르몬 독립 재개를 받 다. Meiotic 재개 다음 oocytes 감수 분열을 통해 진행, 다음 분열 II에 체포. . 을 수정 하지 않는 한 oocytes 유지 분열 II에서 체포 단계 2-5, 우리가 이전에 보고 된 프로토콜, 문화를 수집 하 고 chromatin 확산 준비21MI와 MII oocytes를 준비 하는 방법을 설명 하는 비디오 데모와 함께 적응. 기술 확산이 chromatin 염색체와 관련 된 단백질의 명확한 immunolabelling 수 있습니다. 또한,이와 일가 염색체 사이 구별 하는 데 사용 수 프로토콜과 단일 자매 해결 더 수 oocyte ploidy의 평가 촉진 하기 위하여 chromatids. 따라서, meiotic 단백질의 지 방화 패턴을 공개, 뿐만 아니라이 프로토콜 수 역할도 elucidating MI와 MII 동안 염색체 missegregation의 잠재적인 원인에 대 한 귀중 한 도구.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다. 야생-타입 C57BL/6J 쥐에 실험을 수행 했다.
1. 확산 수확 태아 또는 신생아 난소와 의향 Chromatin의 준비
- 14.5-19.5 일 배아 추출 게시물-coitum (dpc) 자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 임신 여성을 희생.
참고: 출생 후 하루 1-5 난소에 대 한 1.3 단계로 건너뜁니다. 그림 1 에 다른 배아 및 출생 연령대에 농축 meiotic 의향 단계 요약 되어 있습니다. - 살 균가 위, V 자형 오프닝 만들기를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 어머니 자 궁 경적 밖으로 dissect, 태아는 태에서 분리 하 고 35mm 페 트리 요리 미리 데워 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° c.에 x의 3 mL에 배아를 전송
참고: fliptop 인큐베이터 37 ° C에서 설정 온도 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 무대 또한 난소 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. - 3.5 인치 수술가 위, 배아 또는 IACUC 지침에 따라 잘린 통해 새끼를 희생. 더 절 개 전에 미리 데워 공영에 잘린된 배아 또는 새끼를 배치 합니다.
- 37 ° c.에 미리 데워 공영 3 mL를 포함 하는 별도 35 mm 페 트리 접시에 한 번에 하나의 배아 또는 강아지 해 부 앞 발 아래 앞쪽 절반 바로 위에 뒷 다리 사지 및 꼬리 그림 2A-B에 명시 된에 따라 배아의 후부 절반의 복 부 정중 선 따라 절단 하 여 진행 합니다.
- 3.5 인치 수술가 위를 사용 하 여 복 부를 엽니다. 뾰족한 집게를 사용 하 여 치환 하거나 간, 창 자, 37 ° C에 미리 데워 공영 3 mL를 포함 하는 새로운 35mm 페 트리 접시에 난소를 노출의 루프를 제거 ( 그림 2B에 설명서 참조). 난소와 복 막 구멍 (그림 2B-C)의 후부 벽 쪽으로 신장 뒤에 바로 아래 있습니다. 남성과 여성의 생식 기 사이 차별에 대 한 가이드는 그림 차원에서 제공 됩니다.
참고: 최적의 조건에 대 한 신속 하 게 해 부 난소 밖으로 후 임신 여성 희생 이다. - 절 개 범위 및 시계 안경에서 뾰족한 집게의 쌍을 사용 하 여 각 여성 태아에서 양쪽 난소를 제거 하거나 멀티 잘의 별도 우물 접시 미리 따뜻하게 PBS의 0.5 ~ 1.0 mL를 포함 하 고 37 ° c.에 유지
- 깨끗 한 시계 유리 또는 난소 comp를 담가 9-잘 접시의 작은 우물에서 0.5 mL hypo-추출 버퍼 (17mm trisodium 시트르산이 수화물, 50mm 자당, 5 mM EDTA, 0.5 m m DTT, 30 mM Tris HCl, 프로 테아 제 억제 물, pH 8.2)에 난소의 각 쌍을 배치 letely입니다. 적어도 15 분, 하지만 더 이상 30 분 품 어.
참고: 포 추출 버퍼 신선한 만들고 DTT 추가의 2 시간 이내에 사용. - 그림 3A와 같이 부 화, 소수 성 장벽을 PAP 펜을 사용 하는 동안 깨끗 한 유리 25 x 75 m m2, 1 m m 두께 현미경 슬라이드 22 x 22 m m2 사각형을 그립니다.
참고: 슬라이드 미리 준비 될 수 있습니다. - 깨끗 한 슬라이드에 100mm 자당의 45-50 µ L 플라스틱 하 고 드롭 난소의 한 쌍을 전송.
- 자당 솔루션에 셀 출시 떨어져 난소를 애타게 두 27 G 바늘의 날카로운 끝을 사용 하 여. 집게, 난소의 큰 조각을 제거 하 고 신중 하 게 플라스틱 셀 분산 자당 솔루션.
- 통 솔루션의 장소 40 µ L (1 %paraformaldehyde (PFA), 0.2% 세제 ( 재료의 표참조), pH 9.2) 준비 된 슬라이드의 각 광장으로. 200 µ l 피 펫 팁, 슬라이드 표면 통 솔루션을 균등 하 게 확산.
- 20 µ L 자당 믹스에는 정착 액을 포함 하는 슬라이드의 각 사각형의 플라스틱
참고:이 슬라이드 당 난소의 한 쌍을 사용 하는 것 같습니다. - 하룻밤 실 온에서 닫힌 습 챔버에서 슬라이드를 품 어.
참고: 야간 보육 주위 배열할 수 있다 (12-15 시간) 실내 온도에. - 챔버 뚜껑 열고 슬라이드 완전히 건조 허용 합니다.
- 씻어 0.4% 일로 에이전트-PBS 솔루션 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드 2 분, 건조 한 공기 및 immunolabelling 프로토콜 (6 단계)로 이동 ( 재료의 표참조).
참고: 나중 사용을 위해-80 ° C에서 슬라이드를 저장할 수 있습니다 하지만 이것은 관심사의 단백질에 따라 다릅니다. 최적의 결과 대 한 immunolabelling 프로토콜 (6 단계)로 즉시 이동 합니다.
2. 분열 나 Oocyte 컬렉션
- 각 마우스에서 격리 antral 낭의 수를 최대화 하려면 intraperitoneally 임신 암 말의 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG, 일컬어 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG))의 5 IU와 성적으로 성숙한 처녀 여성 쥐를 주사.
참고: 최적의 oocyte 수율에 대 한 쥐 해야 1 ~ 3 개월, oocytes 수확의 수 나이로 줄일 것 이다. -20 ° c.에 600 µ L의 단일 사용 aliquots에 살 균 PBS (5 U/0.1 mL) 저장소의 100 ml에서 5000 IU의 병 해산 PMSG를 준비 하려면 - 44-48 h 후 준비 컬렉션 매체, 최소 필수 중간 알파 (MEMα) 매체 3 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 MEMΑ/BSA/FBS). 0.2 µ m 기 공 필터를 통해 미디어를 소독. MEMα/BSA/FBS 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에 따뜻하고 마우스 당 한 유리 그릇에 중간의 2.5 mL을 가만히 따르다.
참고: 다른 수집 및 상용 (m 2와 M16)는 문화 미디어도 자주 사용 됩니다.
주의: 조작 단계 동안 주변 공기 노출을 최소화 하기 위해 제한 된 기간 동안 한 번에 하나는 5% CO2 배양 기에서 문화 요리를 제거 것이 좋습니다. - 자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 쥐를 희생.
- 큰 V 자형 여 만드는 살 균가 위를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 집게를 사용 하 여 창 자를 마우스의 머리 쪽으로 치환. 각 자 궁 경적을;를 찾습니다 난소는 흉 곽에 인접 제시 됩니다. 좋은 집게와는 수 란 관을 보유 하 고 해 부가 위 (그림 4)를 사용 하 여 난소에 지방 등을 잘라. 수 란 관, 그리고 좋은 집게의 또 다른 세트 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 컬렉션 접시로 부르사와 장소에서 난소 릴리스 계속.
참고: 1 단계에서 그것은 37 ° C에서 난소를 유지 하 고 5% CO2에 유지 하는 것이 필수적. 5% CO2 혼합 연결 fliptop 인큐베이터 온도 CO2 레벨의 최적의 유지 보수를 위해 수 있도록 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 단계 또한 oocyte 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용 한다. - 수동으로 큰 antral 낭을 puncturing 의해 적 운 oocyte 단지 릴리스 27 게이지 바늘 (또는 비슷한 크기), 1 mL 주사기를 사용 하 여.
- 해 부 현미경을 통해 관찰 하는 동안 GV 준비 oocytes 입 운영 하는 유리 피 펫 또는 모 세관, 또는 수동 마이크로미터-주사기 (그림 5)를 사용 하 여 수집 합니다. 만 antral 낭에서 출시 된 oocytes를 수집 합니다. GV oocytes 약 90의 직경이 있다 µ m. GV oocytes granulosa 셀의 2-3 층으로 둘러싸여 있을 수 있고 약 200 µ m의 총 직경.
- 깨끗 한 시계 유리 또는 분열에 도달 6 h에 대 한 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 9-잘 접시에 oocytes를 문화 나 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서.
- 4 단계로 진행 합니다.
3. 분열 II (MII) Oocyte 컬렉션
- Oocytes 각 마우스에서 분리를 최대화 하기 위해 intraperitoneally PMSG의 5 IU와 성적으로 성숙한 처녀 여성 쥐를 주사. 44-48 h 후 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 5 IU와 주사 intraperitoneally.
참고: 최적의 oocyte 수율에 대 한 쥐 해야 1 ~ 3 개월, oocytes 수확의 수 나이로 줄일 것 이다. HCG를 준비 하려면 10000 U 200 mL PBS의 병 해산 (5 U/0.1 mL). -20 ° c.에 600 µ L의 단일 사용 aliquots에 저장 - 12-14 시간 후 2.2, 단계에서 설명한 것 처럼 MEMα/BSA/FBS 컬렉션 매체를 준비 합니다.
- 자 궁 경관 탈 구 또는 IACUC 지침에 따라 CO2 질을 통해 쥐를 희생.
- 큰 V 자형 여 만드는 살 균가 위를 사용 하 여 abdominopelvic 구멍을 엽니다. 집게를 사용 하 여 창 자를 마우스의 머리 쪽으로 치환. 각 자 궁 경적을 찾습니다, 그리고 난소 근 흉 곽에 제시 됩니다. 좋은 집게와는 수 란 관을 보유 하 고 해 부가 위 (그림 4)를 사용 하 여 난소에 지방 등을 잘라. 다음 난소와 수 란 관을 제거 하 고 MEMα/BSA/FBS 매체를 포함 하는 컬렉션 접시에 놓습니다.
참고: 단계 1과 2에서 그것은 37 ° C에서 난소를 유지 하 고 5% CO2에 유지 하는 것이 필수적. 5% CO2 혼합 연결 fliptop 인큐베이터 온도 CO2 레벨의 최적의 유지 보수를 위해 수 있도록 사용할 수 있습니다. 또한, 온도 통제 유리 단계 또한 oocyte 조작 하는 동안 온도 유지 하기 위해 사용 한다. - 1 mL 주사기 27 G와 함께 (또는 비슷한 크기)를 사용 하 여 또는 날카로운 집게, MII oocytes를 해제 수 란 관의 ampulla에 구멍을 찢 어.
주: 수는 ampulla에 oocytes를 손상 하지 않도록 주의 하십시오. ampulla가 나타납니다 부 어 반투명 되도록 oocytes는 표시 (그림 4). - 입 식 유리 피 펫 또는 모 세관, 또는 수동 마이크로미터-주사기 (그림 5)를 사용 하 여 컬렉션 매체와 새로운 그릇에는 수 란 관의 ampulla에서 MII oocytes를 수확.
- 4 단계로 진행 합니다.
4. oocyte Denuding 및 Zona Pellucida 제거
- 보충 3 mg/mL BSA 주변 적 운 세포 (2.5 mL/마우스)는 시계 유리, 37 ° C, 5% CO2에서 계속의 oocytes를 발가 벗기다 MEMα 매체에 hyaluronidase의 300 IU/mL를 준비 합니다.
참고: Hyaluronidase 효능 준비의 1 시간 후 급격히 감소합니다. MII oocytes hyaluronidase 치료 필요 하지 않습니다. - Oocyte-적 운 세포 단지 주변 적 운 세포의 oocytes를 발가 벗기다를 3 분 MEMα/BSA에 hyaluronidase의 300 IU/mL를 노출 합니다.
주의: 그것에 oocytes를 손상 것 이다 hyaluronidase, 노출 3 분을 초과 하지 마십시오. - Oocytes는 세척, 신선한 oocytes 전송 MEMα/BSA 중간 접시를 따뜻하게 합니다. 작은 입 운영 하는 유리 피 펫 또는 모 세관 (oocyte는 대략 90 µ m의 직경 보다 약간 큰)을 사용 하, 복합물을 플라스틱 하 고 적 운 세포를 완전히 분리를. 다음 단계를 위해 준비 하는 동안 인큐베이터에 복구 oocytes를 허용 합니다.
- 따뜻한 산 Tyrode의 솔루션, MEMα/BSA, 고 37 ° c (500 µ L/마우스) Waymouth의 미디어. 장소 300 µ L 작은 9 잘 유리 접시의 각 잘.
- Zona pellucida (ZP)를 제거 하려면 Tyrode의 솔루션으로 5-10 oocytes를 전송. 솔루션에만 30 ~ 45 s oocytes를 노출 합니다.
참고: 솔루션에 너무 작은 노출 제거 되지 않습니다는 ZP 완전히는 파열 및 확산에서 염색체는 oocytes를 방지할 것 이다. 너무 많이 노출 손상 하 고는 oocyte 죽 일 것입니다. 해 부 현미경 ZP 디졸브를 보고 노출 시간 최적화에 도움이 있습니다.
주의: 신선한 Tyrode의 솔루션을 사용 하는 중요 기능 나 이와 함께 감소입니다. Oocytes는 ZP의 균일 한 소화 되도록 치료의 각 그룹에 대 한 Tyrode의 솔루션의 신선한 잘을 사용 합니다. - ZP 제거 직후에 oocytes 따뜻하게 MEMα/BSA/FBS 매체에 전송 하 여 세척. 이 세 단계를 반복 합니다.
참고: 전송, oocytes 쉽게 뭉쳐 것과 유리 피 펫 또는 모 세관 다음 제거는 ZP의 다는 것을 조심 하십시오. 유리 피 펫 또는 모 세관 Waymouth의 중간에 미리 일로 함께 튀어나와 oocytes 최소화 됩니다. - 전송 및 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 Waymouth의 중간에 30 분 동안 복구 oocytes를 허용.
- 5 단계로 진행 합니다.
5. 미와 MII Oocyte Chromatin
- PAP 펜을 사용 하 여 그림 6A와 같이 유리 슬라이드에 11 x 44 m m2 사각형을 그립니다.
- 정착 액의 얇은 층으로 슬라이드 코트 (1 %paraformaldehyde, 0.2% H2O, pH 9.2 트리톤 X 100) 슬라이드에 정착 액의 100 µ L를 pipetting 앞뒤로 슬라이드 락을. 초과 정착 액의 제거를 누릅니다.
- 가능한 작은 미디어와 작은 입 피 펫 바늘 5-10 oocytes 사이 선택 하 고 끌어 바늘 줄에 고정 제-코팅 슬라이드 통 솔루션으로 슬라이드 위에 1 cm에서 oocytes를 입금 하는 동안. Oocytes는 입금 되었습니다 하 고 그들은 버스트 있다 해 부 현미경을 사용 하 여이 단계를 수행 합니다.
참고:는 oocytes 슬라이드에 즉시 폭발 한다. 높이 oocytes는 영향 chromatin 확산의 정도 입금. 자세한 내용은 그림 6 에 대표적인 결과 참조 하십시오. - 닫힌된 습도 챔버에 하룻밤 준수 chromatin 있도록 실 온에서 슬라이드를 품 어.
- 완전히 건조 린스 0.4% 일로 에이전트-H2O, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드를 슬라이드 수 있습니다.
- 6 단계로 진행 합니다.
6입니다. Immunolabelling
- 표 1에 설명 된 항 체 희석 버퍼 (ADB)를 준비 합니다.
- 워시 버퍼 (WB) 솔루션 (ADB PBS에 희석 10%)의 50 mL를 포함 하는 두 개의 Coplin 항아리와 50 mL WB와 0.05% 세제 솔루션을 포함 한 Coplin jar 준비 (예를 들어, 50 mL WB에 10% 세제의 250 µ L을 추가).
- 워시 슬라이드 섹션 1과 5 10 분 동안이 프로토콜의 WB의 50 mL를 포함 하는 하나의 Coplin jar에서에서 준비 했다.
주의: 슬라이드 immunolabelling 중 어느 시점에서 말리 게 하지 마십시오. - 워시 Coplin jar 포함 50 mL WB와 0.05% 세제 용액에서 10 분에 대 한 슬라이드. 그런 다음 나머지 Coplin jar 10 분에 대 한 WB 솔루션 50 mL를 포함 하는 슬라이드를 씻어.
- ADB에서 희석 하는 선택한 기본 항 체의 100 µ L 초과 액체와 커버 슬라이드 누릅니다. 닫힌된 습 챔버에 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
참고: 부 화 3 2 단축 될 수 있다 37 ° c.에 시간 취재는 coverslip 또는 parafilm으로 슬라이드 하 여 항 체 (예, 50 µ L)의 작은 볼륨을 사용 합니다. - 0.2% 일로 에이전트-PBS 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.
- 6.2에서 6.5 단계를 반복 합니다.
- ADB에 희석 된 이차 항 체의 100 µ L 초과 액체와 커버 슬라이드 누릅니다. 슬라이드 2 1 품 어 닫힌된 습 실에서 37 ° C에서 시간.
- 워시 Coplin 단지 0.2% 일로 에이전트-PBS 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 10 분에 대 한 2 번 슬라이드.
- 워시 Coplin 단지 0.2% 일로 에이전트-H2O 솔루션, pH 8.0의 50 mL를 포함 하는 5 분에 대 한 2 번 슬라이드.
7. 마운트 슬라이드
- 의향 chromatin 확산 단계 2에서에서 준비, 100 µ L 4', 6-diamidino-2-phenylindole를 포함 하는 설치 매체의 추가 (DAPI, 1.5µg / mL). 미와 MII chromatin에서 준비 단계 5 확산, 대 추가 DAPI를 포함 하는 설치 매체의 50 µ L (1.5µg / mL). 부드럽게 멀리 초과 액체를 되 리.
- 22 m m x 60 m m coverslip 위에 배치 하 고 명확한 매니큐어와 인감. 형광 현미경 검사 법을 통해 평가까지 4 ° C 또는-20 ° C에서 슬라이드 상자에 저장 합니다.
참고: 탭 커버 슬립에 가볍게 매니큐어와 씰링 전에 초과 설치 매체를 제거 합니다.
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Representative Results
우리는 시각화 및 oocytes meiotic 염색체를 평가 대 한 두 가지 기법을 설명 했습니다. 첫 번째 기술은 배아 및 신생아 난소에 의향 진행 평가 쪽으로 음식을 제공 했었죠. 의향 chromatin 확산 준비 중 감수 분열, 페어링, synapsis 염색체를 포함 하 여 수많은 동적 프로세스를 시각화에 대 한 매우 귀중 한 하 고 desynapsis, 동종 재결합 하 고 개장 하는 epigenetic 염색체. 여기, 우리는 증명 하고있다 강력한 시각화에 대 한이 메서드의 유틸리티 및 oocytes C57BL/6J 배아에서 수확에 크로스 오버의 정량 분석 (그림 3B 및 3c). 셀 pachytene substage에 풍부 하 게 마우스 배아 18.5 dpc (그림 1)에서 검색 했다. 두 가지 주요 특징 pachytene substage 의향의 나는 homologs, 그리고 체 쌍 당 하나 이상의 MLH1/3-긍정적인 크로스 오버의 대형 사이 synapsis 완료. Homologs 사이 완전 한 synapsis 20 SYCP3에 중복의 존재에 의해 각 성 그리고 SYCP1 뻗어. 야생-타입 oocytes에서 크로스 오버 형성 하 우리 immunolabeled 의향 chromatin 준비 SYCP3, SYCP1, MLH1, 검출 하는 항 체를 사용 하 여 확산 및 DNA DAPI를 사용 하 여 스테인드. 그림 3B 27 MLH1 foci 20 완벽 하 게 조립된 SC 구조에 따라 분산의 존재에 의해 입증 되는 pachytene 단계 oocyte의 대표 이미지를 묘사. 야생-타입 oocytes에서 감지 MLH1 긍정적인 크로스의 평균 수는 24 ± 3 (그림 3 C, N = 15 oocytes). 그림 3D SMC6 pericentromeric 섬으로 (PCH) 지역에서 및 염색체 팔 따라 풍부한 MLH1 foci pachytene 단계에서 사우스 캐롤라이나 따라 분산 보여줍니다. 그림 3E 묘사 pachytene 개최 oocyte 염색체 확산 준비 했다 최적의 장소와 개별 염색체는 구별할 수, SYCP3, SMC6, MLH1의 정확한 평가 방지. 최적의 염색체 스프레드 때 hypo-추출 버퍼에 난소의 인큐베이션 인지 너무 오래 오래 충분히 관찰할 수 있습니다.
두 번째 방법 설명 oocytes meiotic 재개 (그림 6B-D)를 다음에 염색 질 형태를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. Ploidy, 뿐만 아니라 단백질 지 방화, 수 있다 쉽게 부과, 염색체 분리 오류의 가능한 원인에 노출. 그림 6B 20 염색체를 보여주는 미 oocyte 묘사와 centromere 및 pericentromeric 섬으로 착 합니다. 그림 6 c 는 염색체 팔과 PCH를 따라 topoisomerase IIα (TOPOII)를 볼 수 있는 확대 된 이미지입니다. 그림 6D 묘사 MII oocyte 어디 짝된 자매 chromatids 염색체 및 centromere 형태학에 의해 구별 될 수 있다. 이 기법을 시도 하는 때 일반적인 오류 oocytes PFA 코팅 슬라이드에 때로 너무 멀리 떨어져 (그림 6E-F)을 확산 하는 염색체를 분출 하지 포함 됩니다. ZP 완전히 제거 되지 않은 경우 그림 6E같이 염색체는 스핀 들에 관련 된 유지 됩니다. Oocytes는 PFA 코팅 슬라이드에서 너무 높은 삭제 됩니다, 염색체 너무 멀리 떨어져 묘사 그림 6 층에 퍼질 수 있다.
그림 1: Meiotic 의향 타임 라인 여성 배아 및 신생아 개발 중. 블루 윤곽 특정 의향 하위 단계 생식 세포 (leptotene, zygotene, pachytene, 및 diplotene/dictyate 단계) 배아 및 신생아 개발 하는 동안 관찰의 인구를 나타냅니다. 어두운 파란색 증가는 특정 의향 하위 단계 된다 더 풍부한 타이밍을 나타냅니다. 이 그림 참조2에서 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 태아와 신생아 여성 새끼에서 난소 추출. (A, B) 첫 번째 컷 (1) 산 모 자 궁 경적에서 검색 되는 즉시 머리/목에 배아를 목을 벨을 앞 발 위에 이루어집니다. 두 번째 컷 (2) 앞 발 (3) 아래 앞쪽 절반을 따라 절 개를 이어서 태아의 후부 절반의 복 부 정중 선 따라 이루어집니다. 뒷 다리와 꼬리 (4) 제거를 위한 마지막 컷이 이루어집니다. (A) 여성 새끼에서 난소의 격리에 대 한 해 부 커트의 정면 보기 회로도 (B) 내부 장기의 상대적 위치와 난소의 격리에 대 한 해 부 컷의 측면 보기 회로도 붉은 빛에 표시 된 지역 포함 간, 창 자, 절 개 하는 동안 제거 됩니다. 지 벽 및 관련된 기관 표시 됩니다 라이트 블루. 이 지역에는 난소, 자 궁 경적의 상단에 신장의 열 등 한 기둥에 붙어 있는 포함 되어 있습니다. (C) 간 및 내장의 제거 다음 태아의 등 쪽 벽의 정면 구조 보기. (D) 약 15-18 dpc에 남성과 여성의 생식 기 사이 형태학 상 다름의 도식 적인 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 의향 chromatin 확산 준비. (A) 유리 슬라이드 회로도 의향 chromatin 확산 준비에 대 한. 검은 사각형 윤곽선을 액체 차단기 펜 외곽선을 나타냅니다. (B, C) 대표 이미지와 야생-타입 pachytene 단계 oocytes 의향 chromatin를 사용 하 여에서 크로스 오버 형성의 정량화 단계 1에서에서 설명 된 준비 방법을 확산. (B) Chromatin 스프레드 18.5 dpc에서 난소 fromC57BL/6J 마우스 배아 격리를 사용 하 여 수행 했다. Chromatin 스프레드 SC 측면 요소 단백질 SYCP3 (빨간색), 그리고 사우스 캐롤라이나 중앙 요소 단백질 SYCP1 (마젠타), MLH1에 대 한 항 체와 immunolabeled (녹색, 크로스 오버 이벤트 마커), DAPI (블루, DNA) 했다. 눈금 막대 = 10 µ m. (C) 점 플롯 MLH1 foci의 카운트 15 pachytene 단계 chromatin에서 얻은 확산 준비. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (D, E) 비교 최적의 (D)와 최적의 (E) 의향의 확산 준비, 각각. Chromatin 확산 했다 SMC6 (적색), MLH1 (녹색)에 대 한 항 체와 함께 immunolabeled 및 SYCP3 (블루). 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 성인 난소의 회로도. 이 다이어그램은 성인 마우스 난소, 수 란 관, ampulla 및 자 궁의 해부학을 묘사 한다. 마우스 난소의 신장의 열 등 기둥과 복 부의 후부 벽에 연결 하는 난소 인 대 주의 절 개 하 여 제거 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 입 운영 하는 유리 피 펫, 유리 모 세관 및 수동 마이크로미터 주사기 oocyte 조작을 위해 사용의 이미지. (A) 유리 피펫은 oocyte 조작자는 순서 대로 다음 구성 요소 구성: 입 조각, 라텍스 튜브 (3.2 m m 내경 (ID) x 6.4 m m 외부 직경 (OD)), 1 mL 피 펫 팁, 라텍스 튜브 (11.1 m m OD x 6.4 m m ID) 및 유리 피 펫 파스퇴르. 프레임 파스퇴르 피펫으로 열 하는 유리의 끝과 끝 뾰족한 끝 (그림 5A1) 만들려고 뽑아. (B) 유리 모 세관 oocyte 조작 순서에는 다음 구성 요소로 구성 되어: 입 조각, 0.45 μ m 필터 (옵션), 라텍스 튜브 (6.4 m m OD x 3.2 m m ID), 1 mL 피 펫 팁, 라텍스 튜브 (11.1 m m OD x 6.4 m m ID) 및 70 µ l 유리 모 세관. 유리 모 세관 튜브는 센터에서 화 염에가 열 하 고 잘 흘린 끝 (그림 5B1) 두 개의 모세 혈관을 만드는 반대 방향에서. (C) 수동 마이크로미터-주사기 시퀀스에서 다음 구성 요소 구성 되어: Mitutoyo 150-208 마이크로미터 헤드 (중간 크기, 0-1 "범위, 0.001" 졸업), 5ml 주사기, 라텍스 튜브 (6.4 m m OD x 3.2 m m ID), 1 mL 피 펫 팁, 라텍스 튜브 (11.1 m m OD x 6.4 m m ID), 1 mL 피 펫 팁과 83 x 0.5 m m2 젤 로드 팁. Mitutoyo 150-208 마이크로미터 헤드 5 mL 주사기 (그림 5C1)에 단단히 삽입 됩니다. 젤 로드 팁은 안전 하 게, 연결 1 mL 피 펫 고정 되도록 팁 (그림 5C2)를 잘라입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: I와 II oocyte chromatin 확산 준비 대표 분열. (A) I와 II oocyte chromatin 확산 준비 분열에 대 한 개략도 슬라이드. Oocytes (원) 운영 하는 입 유리 피 펫 또는 모 세관 직선 (다음 화살표)를 통해 발표. 검은 사각형 윤곽선을 액체 차단기 펜 개요를 나타냅니다. (B, C) 최적의 분열 나 chromatin 확산 준비. 분열 중 기 나 염색체 했다 스테인드 DAPI (블루, DNA), 그리고 immunolabeled CEN (녹색, kinetochore/centromere 표식)에 대 한. 스케일 바 = 10 µ m. (B) 히스톤 h 4에 대 한 항 체 (디 메 틸 K20, 트라이 메 틸 K20) pericentromeric 섬으로 (PCH)를 분류 하는 데 사용 했다. (C) 항 체 Topoisomerase IIα (TOPOII)에 대해 PCH와 염색체 축 레이블을 사용 되었다. (D) 최적 분열 II chromatin 확산 준비. 분열 II 염색체는 CEN (녹색), 및 H4 히스톤 DAPI (블루, DNA), 및 immunolabeled 스테인드 했다 (디 메 틸 K20, 트라이-메 틸 K20) PCH를. 눈금 막대: 10µm. (E, F) 가난한 분열 나 chromatin 확산 준비. 염색체는 DAPI (블루, DNA), 및 CEN (녹색)에 대 한 immunolabeled와 meiotic cohesin 구성 요소, REC8 얼룩이 있었다. 스케일 바 = 10 µ m (E)는 oocyte PFA 코팅 슬라이드에 출시에 따라 파열 하지 않았다. 너무 멀리 떨어져 확산 되었다 (F) 염색체 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 항목 | 금액 | 최종 농도 |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1.5 g | 3% (w/v) |
| 말 혈 청 | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% 세제 (참조 자료의 테이블) PBS에서 |
250 Μ | 0.05% (v/v) |
표 1: 항 체 희석 버퍼 (ADB) 제조 법. 4 ° C에서 ADB를 저장 또는-20 ° C에서 주식 대량 제작 하는 경우 동결. ADB 오염 될 수 있다, 그래서 좋은 무 균 기술을 사용 하 고 각 사용 하기 전에 오염에 대 한 솔루션을 평가 있는지 확인 하십시오. ADB의 더 작은 aliquots는 오염을 최소화 하기 위해 준비 또한 수 있습니다.
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Discussion
Chromatin 확산 준비 시간순으로 여성 포유류 감수 분열 및 관련된 단백질의 동적 지역화를 공부 하는 연구자를 수 있습니다. 배아 및 신생아 chromatin 스프레드 meiotic 의향에 걸쳐 이벤트의 가까운 분석 하실 수 있습니다. 분열 중 기 나 고 분열 II chromatin 스프레드 단일 자매를 구별 하는 데 사용 수에서 chromatids 쌍 자매 및 쌍된 동종 염색체 뿐만 아니라 ploidy 평가. 비교 함으로써, 여기서 설명 하는 프로토콜 수 유리한 자주 배경 신호 chromatin-바인딩 단백질의 해상도 감소 하는 높은 수준의 생성 전체 oocyte immunolabelling에 비해. 게다가, chromatin 확산 기법 라이브 셀 이미징, 시간 및 특수 장비의 큰 투자를 요구 하는 매력적인 대안을 나타냅니다.
배아 및 신생아 난소를 찾아서 추출 어려울 수 있습니다. 신중 하 게 다른 모든 장기와 난소에 대 한 검색 및 각 태아/강아지 (그림 2B)에 대 한 PBS의 신선한 요리를 사용 하기 전에 PBS를 포함 하는 별도 접시에 신장 외 자료를 추출 하는 것이 좋습니다. 태아/강아지 남성 인 경우는 고환 관 형성 (그림 2D) 생식 기의 위치에 의해 구별할 수 있을 것입니다. 남성 배아 개발, testes 점점 더 큰 타원형 모양의 음 경 쪽으로 하강 것입니다.
Oocyte chromatin 확산 기법 oocyte 컬렉션 및 입 식 유리 피 펫 또는 모 세관을 사용 하 여 조작의 숙달을 필요 합니다. 이 프로토콜을 수행 하기 전에 입 피 펫을 제어 연습 하는 것이 좋습니다. 적절 한 크기 유리 피 펫 또는 모 세관 컬렉션에 대 한 고 oocytes denuding oocytes 부 화기 뿐만 아니라 Tyrode의 솔루션에서 외부는 시간을 최소화 하 여 효율성 그리고 성공의 기회를 증가할 것 이다. ZP 제거에 대 한 올바른 타이밍이이 방법의 성공을 위해 매우 중요 하다. Oocytes는 시간의 부족 금액에 대 한 Tyrode의 솔루션에 알을 품는, 경우는 ZP 하지 완전히 제거 됩니다. 이 그림 6E에서 볼 수 있듯이 슬라이드에서 효율적으로 파열에서 oocytes를 방지할 수 있습니다. 그러나, 경우는 oocytes는 너무 오래를 위한 Tyrode의 솔루션에 알을 품는, oocyte 품질 및 다운스트림 면역 형광 염색 심하게 떨어집니다. Oocytes는 ZP Tyrode의 솔루션에 녹이 고 정확한 시간을 결정 하는 현미경을 보고 하는 것이 좋습니다. Tyrode의 솔루션을 한 번에만 5-10 oocytes를 추가 하는 것은 과도 한 노출을 최소화 합니다. oocytes는 PFA 코팅 슬라이드 위에 너무 높은 경우, 염색체는 너무 멀리 떨어져 (그림 6F) 확산 될 수 있습니다. 최적의 결과 oocytes 슬라이드 위에 1 ㎝ 출시 때 발견 된다. 결과 방해할 수 있는 다른 요인 oocyte 조작 단계 동안 주변 공기의 감소 CO2 레벨에 장기간된 노출 포함 됩니다. 이 pH 변동 oocyte 품질, 유해 미디어에 원인과 오렌지 레드에서 미디어의 진보적인 색깔 변화에 의해 명백한 분홍색. 미디어의 버퍼링 용량 또한; 시간이 지남에 감소 따라서, 1 주 이상 (4 ° C)에 저장 된 미디어를 사용 하 여 하지 않는 것이 좋습니다. 버퍼링에 CO2 를 필요 하지 않는, M2 매체 일반적으로 대신 사용 됩니다.
Chromatin 확산 준비에 제한 셀의 네이티브 컨텍스트에서 chromatin의 시각화의 부족 이다. 핵의 외부 세포 소재를 시각화 수 없습니다 하 고 스핀 들 형성 평가 될 수 없습니다. 따라서, 다른 방법은 oogenesis chromatin 스프레드, monastrol 처리, 모노-폴라 스핀 들22으로 양극 스핀 들을 축소 후 전체 oocyte immunolabelling 등 외를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이로써 여동생 셀의 컨텍스트에서 평가 될 chromatids. 여기 설명 하는 chromatin 확산 방법은 chromatin 형태학 그리고 염색체 ploidy oogenesis 소설 유전자 변형 및 돌연변이 마우스 모델에 걸쳐 평가를 쉽게 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 G.H. 하 세영 훈련 그랜트 화목에서 미국 국립 암 연구소 (NIH) (CA009110)와 NIGMS (R01GM11755) P.W.J에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
| 60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
| 35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
| Fine forceps | VWR | 300-050 | |
| Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
| Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
| Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| 50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
| Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
| Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
| Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| 16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
| Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
| Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
| PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
| Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
| Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
| Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
| Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
| Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
| Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
| Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
| 83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
| α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
| Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
| 500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
| Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
| VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear nail polish | Amazon | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
| Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
| Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
| Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
| Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |
References
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