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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

여기, 우리는 2 차원 젤 전기 이동 법 (2DE) 질량 분석 (MS) 분리 하 고 좋고 재현할 2DE 패턴 선물 인간의 뇌 adenoma 조직 프로테옴 식별과 함께 제시. 많은 단백질은 고감도 석사의 사용과 복잡 한 암 프로테옴을 분석할 때 각 2DE 자리에 관찰 됩니다.

Abstract

인간의 뇌 adenoma (PA)는 시상 하 부-뇌 하 수 체-대상 기관 축 시스템에 인간의 뇌에서 발생 하 고 임상 기능 또는 작동 하지 않는 PA (FPA 및 NFPA)으로 분류 될 수 있습니다 일반적인 종양 이다. NFPA 초기 단계 진단 및 치료 때문에 간신히 FPA에 비해 혈액에 호르몬을 높이기 어렵습니다. 우리의 장기 목표 PA 분자 메커니즘의 명확 하 고 효과적인 진단, 예 후 마커 및 치료 대상의 인식에 대 한 신뢰할 수 있는 biomarkers를 proteomics 메서드를 사용 하는 것입니다. 여기에 제시 된 효과적인 2 차원 젤 전기 이동 법 (2DE) 질량 분석 (MS) 방법으로 결합 했다에서 젤 이미지 분석, 단백질 시각화, 2 차원 젤 전기 이동 법, 샘플의 준비를 포함 하 여 인간의 PA proteomes를 분석 하 트립 신 소화, 펩 티 드 대량 지문 (PMF), 및 탠덤 질량 분석 (MS/MS). 2 차원 젤 전기 이동 법 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS, 그리고 2DE-액체 크로마토그래피 (LC) MS/MS 절차 성공적으로 적용 된 NFPA 프로테옴의 분석에서. 높은 감도 질량 분석기를 사용 하 여, 많은 단백질 각 2D 젤 인간의 PA 프로테옴의 범위를 최대화 하기 위해 복잡 한 PA 조직 분석에 자리에서 2DE-LC-MS/MS 방법으로 확인 했다.

Introduction

PA 인간의 내 분 비 시스템에 중요 한 역할을 하는 시상 하 부-뇌 하 수 체-대상 기관 축 시스템에 인간의 뇌에서 발생 하는 일반적인 종양 이다. PA 임상 기능 및 작동 하지 않는 파 (FPA 및 NFPA)1,2포함 되어 있습니다. NFPA 어렵습니다 초기 단계 진단 및 치료에 크게 혈액3,4 해당 호르몬의 수준을 증가 FPA에 비해 혈액에만 약간 상승된 호르몬 수준 (예를 들어, LH 및 FSH) 때문에 ,5. 분자 메커니즘의 명확 하 고 효과적인 바이오 마커의 발견 진단, 치료, 및 NFPA의 예 후에 중요 한 임상적 의미가 있다. 우리의 장기 목표는 개발 하 고 proteomic 메서드를 사용 하 여 그것의 분자 메커니즘을 명확 하 게 믿을 수 있는 바이오 마커의 발견을 위한 NFPA를 공부 하 고 효과적인 치료 대상 진단 및 예 후 마커 인식입니다. 2-데 MS 방법으로 결합 된 인간 PA 프로테옴1,2,6,7, 프로테옴 참조의 설립을 포함 하 여에 대 한 장기 연구 프로그램에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 3,8, 차동 표현한 단백질 프로필9,10,11,,1213, 호르몬 변종14의 분석 지도 ,15, 인 산화14 티로신 nitration16,,1718같은 포스트 번역 상 수정, 상대적으로 침략의 proteomic 변형 비 침범 성 NFPAs19, 그리고 NFPA 하위13, 여러 중요 한 통로 네트워크 (미토 콘 드 리아 기능 장애, 세포 주기 dysregulation, 산화 스트레스와 MAPK 신호의 발견에 지도 proteomic이 시스템 이상)는 NFPA13,,1920에 변경 될 수 있습니다.

2DE 분리 단백질 그들의 전자 점 (pI) (전자 포커스, IEF) 및 분자량 (나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법, SDS 페이지)를 통해1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. 이것은 프로테옴 199524proteomics의 개념의 도입 이후, proteomics의 분야에서 일반적이 고 고전적인 분리 기술 이다. MS는 2DE 분리 단백질, PMF 및 MS/MS 전략 등의 정체성을 찾기 위한 중요 한 기술입니다. 검출 감도 및 해상도, 함께 LC 시스템의 개선의 측면에서 특히 MS 계기의 아주 급속 한 발전은 크게 향상 극대화 프로테옴에서 낮은 또는 매우 낮은 풍부한 단백질의 id는 프로테옴의 적용 범위입니다. 그것은 또한 유일한 한 우리의 전통적인 개념을 도전 또는 두 2D 젤 복잡 한 인간의 조직 프로테옴의 분석에서 자리에 단백질과 2D 젤 복잡 한 인간의 조직 분석에 자리에 있는 여러 단백질을 확인할 수 있는 기회를 제공 한다 프로테옴 NFPA 프로테옴의 범위를 극대화.

여기 우리 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS의 상세한 프로토콜 설명/MS, 그리고 2DE-LC-MS/MS 인간의 NFPA 프로테옴의 분석에서 성공적으로 사용 되었습니다. 프로토콜 포함 준비 샘플, 먼저 치수 (전자 포커스, IEF), 두 번째 차원 (SDS 페이지), 단백질 (실버 얼룩 및 Coomassie 파란 얼룩)의 시각화, 분석에서 젤 트립 신 소화, 2D 젤의 이미지 tryptic 펩 티 드, PMF, MS/MS, 및3,8,,2526타는 듯한 데이터베이스의 정화. 또한,이 프로토콜은 쉽게 다른 인체 조직 proteomes의 분석에 대 한 변환합니다.

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Protocol

현재 프로토콜 Xiangya 병원 의료 윤리 위원회의 중앙 남쪽 대학, 중국의 지침을 따릅니다. 머리 모자와 장갑은 피부와 머리카락8각 질 오염을 피하기 위하여 전체 실험 절차에 대 한 착용 되어야 한다.

1입니다. 샘플의 준비

  1. 신경외과 학과에서 PA 조직 (0.2-0.5 mg)를 수집 합니다. 액체 질소에 즉시 고정 하 고 스토리지-80 ° C에 전송.
  2. 추가 2 mL의 0.9 %NaCl 이온을 제거 된 증류수 (ddH2O). 이 솔루션을 사용 하 여 가볍게 씻어 조직 표면 (3 배)에서 혈액.
    참고: ddH2O 18.2 m ω/cm의 전도도와 프로토콜 전체에서 사용 됩니다. 직물의 표면에서 혈액에서 세척 할 경우는 tissuemight의 일부 손실 될.
  3. 2m 초 산 및 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol 모든 0.5-0.6 g의 조직에 대 한 포함 된 솔루션의 볼륨 (10ml, 4 ° C)를 추가, (1 분, 13000 rpm, 4 ° C, 10 x) 조직 균질 화기와 균질, sonicate 20 homogenate s, lyophilize −80 ° C에 저장
  4. 동결 건조 된 단백질 함량 측정, bicinchoninic 산 (BCA)를 사용 하 여 무 균된 샘플 시험 키트.
    참고: BCA 정량화 하지는 절대 정량화 이며 측정된 결과 다른 기술자와 실험 에이전트 변경 될 것입니다. 고정된 농도 샘플 표준 다른 실험을 위해 사용 되어야 한다. 따라서, 각 제 2 젤에 대 한 단백질의 최종 선적 금액에서 미리 디자인 된 실험은 스테인드 또는 Coomassie 스테인드 좋은 해상도 이미지와 결정 됩니다.
    1. 무 균된 동결 건조 된 샘플의 약 300 µ g 단백질을 추출의 한 볼륨 (282 µ L)으로 추가 버퍼 (8 M 요소와 챕 스 4%), 뒤에 서 2 시간, 5 분, 1 시간, 다시 5 분 동안 물 목욕에서 sonicating 회전 물 목욕에서 sonicating 1 시간, 다시 회전 하 고 20 분 동안 15000 x g에서 centrifuging.
    2. 듯이 BSA 농도로 표준 솔루션을 준비: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1500, 2000 µ g/mL 상업 BSA 표준 (2 mg/mL)와 함께.
    3. 믹스 BCA 시 약 A와 B (A:B = 50: 1) BCA 작업 솔루션을 사용 하기 전에.
    4. BCA 작업 솔루션 혼합 후 30 분 동안 37 ° C에서 배양 하 여 다음 microfuge 관에서의 2 ml 샘플 또는 표준 솔루션의 0.1 mL를 추가 합니다. 마지막으로 10 분 동안 실내 온도에 냉각 하 고 측정 하는 A562 nm O.D. 값.
    5. 표준 선형 선 계산 (A562 nm BSA 농도 대) 회귀 방정식 계산 샘플 단백질562nm 값으로 콘텐츠를.
  5. 사용 하 여 얼룩, 실버 단백질 동등한 동결 건조 된 샘플의 150 µ g 또는 500 µ g Coomassie 얼룩 (IPG) 스트립 pH 그라데이션 18 cm 고정된 전화에 대 한 3-10 비선형 (NL)에 대 한 단백질의.
    참고: IPG 건조 지구 7, 11, 13, 18, 및 24 cm, 및 선형 또는 비선형 pH 그라데이션에 pH 4-5, 4-7, 6-9, 및 3-10을 포함 한 다른 pH 범위를 포함 하 여 다른 길이 0.5 m m 두께 3 mm 폭, 이다. 사용 하는 IPG 버퍼 스트립27,28맞아야 합니다.
  6. 추출 버퍼의 1.6.Add 250 µ L (7 M 요소, 2 M thiourea, 4% (w/v) 균열, 100 mM DTT (사용 전에 추가), 0.5 %v / v pharmalyte (사용 전에 추가), 그리고 bromophenol 블루의 추적).
  7. 30 ° c, 5 분, 5 분, sonicating 및 50 분에 대 한 회전에 대 한 vortexing 다음 솔루션을 유지.
  8. 리하이드레이션 버퍼의 110 µ L을 추가 (7 M 요소, 2 M thiourea, 챕 스 4% (w/v), 60mm DTT (사용 전에 추가), 0.5 %v / v IPG 버퍼 (사용 전에 추가), 그리고 bromophenol 블루의 추적). 5 분 동안 sonicate. 다음 샘플 50 분, 5 분, 소용돌이 및 15000 x g에서 20 분 동안 원심 분리기 회전.
  9. 단백질 샘플 솔루션8로 상쾌한 (350 µ L)를 수집 합니다.

2. 2 차원 젤 전기 이동 법

  1. IEF (처음 차원): 아래 설명 된 대로 전자 초점 시스템에 IEF를 수행.
    1. 18 cm IPG 스트립 소유자의 슬롯에 단백질 샘플 솔루션의 350 µ L를 추가 합니다.
    2. 단백질 샘플 솔루션에는 18 cm IPG 스트립 젤-사이드-다운을 넣어 (거품을 피하기 위해).
    3. IPG 스트립을 충당 하기 위해 미네랄 오일의 3-4 mL를 추가 합니다.
    4. 다시 (+) 판과 앞 (−) 접시에 광장 끝에 전자 초점 systemwith 뾰족한 끝으로 IPG 스트립 홀더를 조립.
    5. 하룻밤 실 온에서 (~ 18 h) rehydrate
    6. IEF 매개 변수 설정: 스트립, 20 ° C; 당 최대 전류 30 µ A 250 V, 1 시간, 125 Vh, 단계 및 보류; 1000 V, 1 시간, 500 Vh 그라데이션; 8000 V, 1 시간, 4000 Vh 그라데이션; 8000 V, 4 h, 32000 Vh, 단계 및 보류; 그리고 500 V, 0.5 h, 250 Vh, 단계 및 보류. 7.5 h와 36875 Vh의 총 시간을 실행 하자.
    7. IEF, 후 각 IPG 스트립 밖으로 하 고 불용 성 종이 타월로 여분의 미네랄 오일 제거. 이제, 플라스틱 포장의 시트에 스트립을 포장 하 고 −80 ° C에 저장
      참고: IPGstrip 홀더 청소 솔루션 IPGstrip 보유자와 청소 해야 하 고 증류수.
  2. SDS 페이지 (2 차원): 수행 수직 셀 전기 시스템에 SDS 페이지
    참고: 각 SDS 페이지 젤 크기는 255 x 190 x 1 m m 이어야 한다.
    1. 멀티 젤 캐스터를 사용 하 여 12% 캐스팅 페이지 젤 해결. 페이지 젤 주조 12%, 다음 단계를 수행 합니다.
      1. DdH2O, 1.5의 150 mL 270 mL을 추가 M Tris-HCl (pH 8.8), 40% (w/v) 아크릴/bisacrylamide 재고 솔루션의 180 mL (29: 1, 40 %w / v 아크릴 및 1.38 %w / v N, N'-methylenebisacrylamide), 10% 염화 persulfate의 3 mL 젤 있도록 TEMED의 150 µ L 비 커에 솔루션입니다. 부드럽게 혼합 하 고 거품을 피하기 위해.
      2. 부드럽게 예상된 젤 높이 (19 cm)까지 멀티 캐스팅 챔버에 젤 솔루션을 붓으십시오.
      3. 즉시 각 해결 젤은 젤 커버에 약 3 mL ddH2O를 추가 합니다. 약 1 시간에 대 한 유해 젤을 하자.
    2. 전기 이동 법 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글 리세 린, 그리고 0.1 %SDS)의 20 리터를 준비 합니다. 전기 이동 법 별거 단위 버퍼 탱크를이 버퍼에 채워 넣어 라.
    3. 집중된 IPG 스트립, 냉동 실에서 꺼내와 평형 버퍼 (375 mM Tris HCl (pH 8.8), 6 M 요소, 2% (w/v) SDS, 글리세롤 20% (v/v), 2 %w / v DTT (사용 전에 추가)를 줄이는 4 mL 락을 부드럽게 하 여 10 분 동안 스트립을 equilibrate 그리고 bromophenol 블루의 추적).
    4. 감소 된 IPG 스트립 4 mL 알 평형 버퍼에 락을 부드럽게 하 여 10 분 동안 equilibrate (375 mM Tris HCl (pH 8.8), 6 M 요소, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) 글리세롤, 2.5 %w / v iodoacetamide (사용 전에 추가), 그리고 bromophenol 블루의 추적).
    5. 젤 평형 중 멀티 캐스팅 챔버를 분해 하 고 준비 해결 젤 카세트를 꺼내. DdH2O. 제거 초과 ddH2O 불 용해성 종이 타월로 3 x 린스 하 고 젤 stander에 넣어.
    6. 전기 이동 법 버퍼, equilibrated IPG 스트립 린스 하 고 불용 성 종이 타월로 IPG 스트립 표면에 과잉 액체를 제거 합니다.
    7. IPG 스트립을 해결 SDS 페이지 젤에 넣고 IPG 스트립의 플라스틱 측면 더 이상 유리 접시와 왼쪽에 뾰족한 끝에 문의 합시다.
    8. 거품 없이 짧은 유리 접시의 상단 아래로 IPG 스트립의 상단 측면 각 SDS 페이지 젤 위에 뜨거운 1% agarose IPG 스트립을 밀봉 하기 위하여 신속 하 게 SDS 전기 영동 버퍼 (~ 80 ° C)에서 3-4 mL를 부 어 넣은 다음 10 분 동안 유해 합니다.
    9. 수직 전기 시스템의 플라스틱 가스 켓 사이 수직으로 조립된 젤 카세트를 삽입 합니다. 음극 (−) 옆 IPG 스트립 젤 상단에 넣어.
    10. 전기 이동 법 버퍼 몰입할 젤 카세트의 수준을 조정 합니다.
    11. 연결 일정 전압 모드에서 전원 공급 장치/제어 장치를 설정 하 고 염료를 모니터링 하는 동안 약 370 분 200 V에서 실행.
    12. 실행 후 전기 영동 시스템에서 젤 카세트에 밖으로 하 고 부드럽게 2DE 분리 단백질의 얼룩 뒤 젤을 찢 어 피 젤 카세트에서 젤을 제거 합니다.
  3. 2DE 분리 단백질의 얼룩
    1. 실버 얼룩
      1. 부드럽게 고정 솔루션 (50% 메탄올 (v/v) 및 5% (v/v) 초 산)의 250 mL를 포함 하는 쟁반에 두 손으로 젤을 전송 하 고 부드럽게 흔들어 20 분 젤.
      2. 솔루션을 삭제 하 고 트레이에 50% (v/v) 메탄올의 250 mL를 추가 하 고 10 분 동안 부드럽게 흔들어.
      3. 메탄올을 무시 하 고 트레이에 ddH2O의 250 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 부드럽게 흔들어.
      4. 부드럽게 0.02% (w/v) 나트륨 thiosulfate를 포함 하는 민감성 버퍼의 250 mL에 1 분 동안 젤을 흔들어 하 고 액체를 삭제.
      5. 부드럽게 ddH2O 1 분 (한 번 더 반복)의 250 ml 젤을 흔들어. 각 단계 후에 액체를 폐기.
      6. 부드럽게 250 mL은 반응 솔루션 (사용 전에 추가 200 µ L 37% (v/v) 포름알데히드와 0.1% (w/v) 실버 질산염)에서 20 분 젤을 흔들어.
      7. 부드럽게 ddH2O 1 분 (한 번 더 반복)의 250 ml 젤을 흔들어. 각 단계 후에 액체를 폐기.
      8. 흔들어 250 mL 개발 솔루션에 부드럽게 젤 (3% (w/v) 100 µ L 37% (v/v) 포름알데히드와 탄산 나트륨 사용 전에 추가) 얼룩의 원하는 강도 (일반적으로 1-3 분) 때까지 다음 폐기 액체.
      9. 부드럽게 10 분 젤 솔루션 (5% (v/v) 초 산)를 중지 하는 250 mL에 흔들어 고 액체를 삭제.
      10. 부드럽게 ddH2O의 250 mL에 5 분 동안 흔들어 하 고 액체를 삭제.
      11. 젤 250 mL 4 ° c.에 8.8% 글리세롤의 솔루션을 저장 하십시오
    2. Coomassie 화려한 블루 얼룩
      1. 화려한 Coomassie를 용 해 하 여 솔루션 얼룩 Coomassie 준비 G250 0.3 g, 황산 암모늄 25 g 및 인산 25 mL ddH2O와 200 mL의 총 볼륨까지 블루. 사용 전에 추가 메탄올 50 mL.
      2. Coomassie 솔루션 젤을 얼룩이 지기의 250 mL을 추가 하 고 지우기까지 실 온에서 부드럽게 흔들어 단백질 반점이 나타나는 (2 ~ 4 h). 액체를 삭제 합니다.
      3. DdH2O의 250 mL을 추가 하 고 흔들어 천천히 5 분에 대 한 다음 두 번 더. 액체를 삭제 합니다.
      4. Destaining 솔루션 (20% (v/v) 에탄올)의 250 mL을 추가 하 고 배경 색상 거의 무색이 될 때까지 액체를 버리고 천천히 흔들.
      5. 때 이전 하나 점점 어두운, 신선한 destaining 솔루션으로 대체 하 고 액체를 삭제.
      6. DdH2O의 250 mL을 추가 하 고 천천히 5 분 삭제 액체에 대 한 동요.
      7. 추가 솔루션 (8.8% 글리세롤) 저장의 250 mL와 4 ° c.에 계속
  4. 2 차원 젤 전기 이동 법 이미지 분석
    1. 평판 스캐너로 얼룩진된 젤을 디지털화 합니다.
    2. 제 2 젤 이미지 분석 시스템에 이미지를 입력 합니다.
    3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 2D 젤 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 자리를 계량 및 검색 합니다.
    4. 다른 젤 사이 반점과 일치.

3. 신분증 2DE 구분 된 MS와 단백질의

  1. Tryptic 펩 티 드 혼합물의 준비
    참고: 시 또는 낮은 고정 튜브와 피 펫 팁은 단백질 또는 펩 티 드의 손실을 방지 하기 위해 사용 되어야 한다.
    1. 실버 젤 destaining
      1. 관광 명소 시 1.5 mL로 튜브, 500 µ L ddH2O 6 번에 세척 젤 삭제하시오
      2. 새로운 시 1.5 mL 튜브에 넣어 세척된 젤 그리고 많은 작은 조각으로 그것을 말하다 (0.5-1 m m3).
      3. 갈색 색상 (일반적으로 1-2 분) 사라질 수 있도록 30 mM 칼륨 ferricyanide 부분과 100mm 나트륨 thiosulfate (1:1) 사용 전에 일부를 믹스 destaining 솔루션의 20 µ L에서 젤 조각 destain 액체를 삭제 합니다.
      4. 씻어 ddH2O의 20 µ L로 젤 조각 5-6 번 노란색 사라질 수 있도록. 각 단계 후에 액체를 폐기.
      5. 젤 조각에 200 m m 염화 중 탄산염의 20 µ L을 추가 하 고 (20 µ L, 1 시간) ddH2O 젤 조각 20 분 세척에 대 한 유지. 액체를 삭제 합니다.
      6. 불투명 화이트, 그리고 진공 원심 분리기 건조 30 분 설정 젤 조각 수 있도록 30 µ L 이기와 젤 조각을 두 번 이상 탈수.
    2. Coomassie 화려한 블루 젤 destaining
      1. 시 1.5 mL 튜브에 젤 명소를 잘라내어 500 µ L ddH2O 3 회 이상 세척.
      2. 새로운 1.5 mL 시 관으로 세척된 젤을 넣고 여러 조각으로 그것을 말하다 (0.5-1 m m3) 피 펫 팁.
      3. 50-100 µ L destaining 솔루션 (1:1 v/v 믹스 200 mM NH4HCO3 이기)에 따라 젤 볼륨 젤 destain, 물 목욕에서 37 ° C에서 품 어. 반복 하 고 색상 (h ~ 1) 사라질 때까지 신선한 destaining 솔루션을 추가 합니다. 각 단계 후에 액체를 폐기.
      4. 워시 젤 조각을 한 번 20 µ L ddH2o.
      5. 100 µ L 이기 (두 번 이상)는 불투명 흰색 설정 젤 조각 수 있도록에서 젤 조각 탈수.
      6. 진공 건조 30 분입니다.
    3. 말린된 젤 조각에서 단백질의에서 젤 트립 신 소화
      1. 50 mM 아세트산의 100 µ L에 동결 건조 된 트립 신 가루 20 µ g (833 pmol)를 분해.
      2. 20 µ L의 트립 신 솔루션 (200 ng / µ L) 50 m m 염화 중 탄산염의 230 µ L로 16 ng / µ L를 희석.
      3. 20-30 µ L 추가 (0.32-0.48 µ g) 말린된 젤 조각에 포함 된 각 튜브를 희석된 trypsin 솔루션의. 물 목욕에서 37 ° C에 18-20 h에 대 한 품 어. 솔루션 4 ° C에서 30 분 동안 서 보자.
      4. 10 미 Sonicate 30 ° C에서 5-6 분 동안 물 욕조에 대 한 솔루션을 부드럽게 원심 하 고 2 분 동안 12000 x g에서 원심.
      5. 0.5 mL 시 관으로 tryptic 펩 티 드 혼합물을 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
    4. C18 microcolumn와 tryptic 펩 티 드 혼합물의 정화입니다.
      1. 각 C18 열을 이기 (10 µ L, 5 번), 그리고 50% 이기 (10 µ L, 5 번)와 함께 씻으십시오.
      2. 0.1 %trifluoro 초 산 (TFA) (10 µ L, 5 회) equilibrate.
      3. 플라스틱 샘플 아래로 준비 C18 열을 통해 15 시간.
      4. 워시 샘플 2 x 10 µ L 0.1 %TFA.
        참고: 정화 tryptic 펩 티 드 C18 열에 유지 됩니다.
      5. 깨끗 한 0.5 mL 시 튜브에서 솔루션 (85 %v / v acetonitrile/0.1% v/v 포 름 산)의 볼륨 (6 µ L)를 추가,이 솔루션을 부드럽게 플라스틱 및 천천히 위아래로 솔루션으로 본드 펩 티 드를 씻어 10 x에 대 한 펩 티 드-C18 구슬을 통해 건조 그리고 MS 분석에 대 한 저장소 (−20 ° C).
  2. MS 분석
    1. MALDI MS PMF 분석
      1. 85 %v / v acetonitrile/0.1% v/v 순화 tryptic 펩 티 드 혼합물을 해산 TFA의 4 µ L를 추가 합니다. 부하 2 µ L 해산 tryptic 펩 티 드 혼합물 MALDI 격판덮개에 그리고 즉시 추가 10 g/L 500 mL/L 이기에 포함 된 а-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 솔루션의 2 µ L 1 mL/L TFA, 다음 건조.
      2. Tryptic 펩 티 드 혼합물과 MALDI 격판덮개 MALDI MS 질량 분석기에 로드 합니다.
        참고: 악기 매개 변수 반사 모드 20으로 설정 됩니다 kV 가속 전압, 긍정적인 극성 및 160 ns 지연 추출 시간. 각 MS 스펙트럼은 표준 펩 티 드와 외부 교정 후 다양 한 m/z 1000 4000 200 레이저 샷으로 인수 질량.
      3. MS 스펙트럼 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 기준선 보정, 노이즈 제거 (5%), 및 최대 deisotoping를 포함 하 여 각 MS 스펙트럼 처리를.
      4. 오염 대 중 트립 신, 매트릭스, keratins, 및 빈 젤 실험의 병렬에서 다른 알 수 없는 오염 물질의 제거와 각 MS 스펙트럼에서 대량 목록 수정.
      5. 수정된 질량 PMF 검색 유형, 인간을 포함 하 여 다음 검색 매개 변수 스위스-보호 단백질 데이터베이스에 단백질을 식별 하기 위해 소프트웨어를 검색 하는 PMF-기반 단백질으로 놓친 1 최대 trypsin 분열, 고정 목록 입력 carbamidomethyl 시스테인, 가변 메티오닌 산화, monoisotopic, 펩 티 드 대량 공차 50 ppm, 펩 티 드 충전 상태 (1 +)와 신호 노이즈 (S/N) 5.0.
      6. 통계적으로 중요 한 단백질 점수를 가진 단백질 식별 단백질 점수 =-10 × log(p), 여기서 p는 확률 관찰 된 일치 하는 임의의 이벤트.
    2. MALDI MS/MS 분석
      1. 50 %v / v acetonitrile/0.1% v/v 순화 tryptic 펩 티 드 혼합물을 해산 TFA의 4 µ L를 추가 합니다. 각 정제 tryptic 펩 티 드 혼합물 (0.5 µ L) 384-잘 MALDI-접시에 발견, 즉시 50% acetonitrile/0.1% TFA 펩 티 드 샘플 상단에 포화 CHCA 매트릭스의 0.5 µ L을 발견 되었고 공기에 건조.
      2. MALDI TOF TOF MS/MS를 자동으로 관리 100 레이저 탄을 사용 하 여 하나의 MS1 스펙트럼을 취득 하 고 축적 6 한 합성 MS1 스펙트럼으로 MS1 스펙트럼을 반복.
      3. MS/MS 분석에 대 한 각 합성 MS1 스펙트럼에서 4 가장 강렬한 선구자 이온을 설정 합니다. 취득 한 MS/MS 스펙트럼 4 축적 각 선구자 이온에 대 한 사용 100 레이저 촬영 한 합성 MS/MS 스펙트럼으로 MS/MS 스펙트럼을 반복.
      4. 합성 MS/MS 데이터를 사용 하 여 MS/MS 이온 검색, 스위스-보호 인간의 데이터베이스 1 놓친된 절단 고정된 carbamidomethyl (C), 변수 최대 트립 신을 포함 한 매개 변수를 사용 하 여 소프트웨어를 검색 하는 MS/MS 기반 단백질을 통해 단백질에 대 한 검색 산화 (M), monoisotopic 질량 값, 펩 티 드 대량 허용 오차 ± 100ppm, 그리고 조각 대량 허용 오차 ± 0.7 다.
      5. Mowse 점수 및 이온 점수에 따라 통계적 확률 단백질 식별-10 = Log(P), p가 관찰 된 일치 하는 임의의 이벤트 확률 x.
    3. LC-ESI-MS/MS 분석
      1. 5 %v / v acetonitrile/0.1% v/v 포 름 산 분해 정화 tryptic 펩 티 드 혼합물을의 6 µ L를 추가 합니다.
      2. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템으로 분무 이온화 (ESI) 온라인 결합 사용-MS/MS 질량 분석기 전체 작업을 관리 하는 MS/MS 데이터 획득 관리 소프트웨어와 함께.
      3. C18 트랩 (300 µ m 아이디 × 5 mm 길이), 및 98% 용 매 (0.1% 포 름 산)에서 분리 그라데이션으로 역 위상 C18 열 (75 µ m 아이디 x 15 cm 길이) 및 2% 용 매 B 사용 하 여 (100% 이기에 0.1% 포 름 산) 2 분 45 분, 40% ~ 95% 용 매 B 5 분 및 10 분 (총 300 nL/분에서 65 분)에 대 한 95% 용 매 B에 대 한 2% ~ 40% 용 매 B.
      4. 긍정적인 이온 모드와 MS 및 MS/MS 스펙트럼을 취득 하 여 이온 조각화에 대 한 충돌 유도 된 분리 (CID)를 설정 데이터 의존성 자동 조사 모드를 설정 합니다.
      5. M/z 400에서 100, 000의 해상도 가진 350-1800 m/z의 대량 범위를 각 MS 검색을 설정 합니다. MS 검색에서 7 가장 강렬한 이온에 대 한 검사를 수행 합니다.
      6. 검색 소프트웨어를 사용 하 여 MS/MS 기반 단백질 단백질의 식별에 대 한 데이터베이스를 검색할 내가.
        1. 인간의 단백질 데이터베이스를 선택 합니다.
        2. 트립 신 놓친된 분열 사이트 허용 하나를 선택 합니다.
        3. 펩 티 드 허용 오차 (± 10 ppm), 이온 공차 (±0.8 Da), 시스테인에 펩 티 드 고정 되는 충전 (2 + 3 +, 4 +), carbamidomethylation 및 메티오닌에서 가변 산화 조각.
        4. 설정 틀린 발견 비율 (FDR) < 1%, 그리고 순위 1만 펩 티 드 허용 됩니다.
        5. PSM≥1 단백질 식별 (Psm: 중복 확인 된 그들을 포함 하 여 단백질에 대 한 확인 된 펩 티 드 순서 (Psm)의 총 수) 및 적어도 두 개의 독특한 펩 티 드 단백질 당.
      7. 또한, MS/MS 기반 단백질 검색 소프트웨어 II를 사용 하 여 단백질의 식별에 대 한 데이터베이스를 검색할.
        1. .Mgf 파일을 원시 MS 파일을 변환 합니다.
        2. 인간의 단백질 데이터베이스 (70940 시퀀스 및 23897047 잔류물을 포함 하는 uniprothuman_20161031.fasta)을 선택 합니다.
        3. 트립 신 소화 2 놓친된 분열의 최대를 선택 합니다.
        4. Carbamidomethyl (C), 변수 deamidated (NQ)과 산화 (M), 선구자 이온 질량 허용 오차 10 ppm, 딸 이온 질량 허용 오차 0.8 고정 세트 다, 및 monoisotopic 피크.
        5. 0.05 및 2 독특한 펩 티 드의 중요성 임계값을 갖는 단백질을 식별 합니다.

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Representative Results

1. 2DE MALDI MS PMF: 위에서 설명한 실험 절차, 150 µ g 단백질의 총 FSH 표현 NFPA 조직에서 추출 되었다 (여성, 50 세, ACTH (-), GH (-), PRL (-), (-) LH, FSH (+), 및 TSH (-))는 18 cm에 배열 하는 고 IPG 스트립 (pH 3-10 NL) 그리고 대형 SDS 페이지 젤, 다음은 얼룩과 시각. 우리가 얻은 1.98 ± IEF 방향으로 0.75 m m의 평균 위치 편차와 NFPA 조직 프로테옴 (그림 1), 및 1.62 ± 0.68 m m SDS 페이지 방향에 약 1200 단백질 반점의 재현성 및 좋은 2DE 젤 패턴 pH 4-8 및 대량 15-150 kDa3의 영역 내에 주로 배 부 되었다 2DE 젤 지도에서 발견. 총 337 젤 명소 excised 되었고 젤 destaining, 트립 신 소화, tryptic 펩 티 드, MALDI TOF MS PMF 분석의 정화. PMF 데이터 인간의 단백질 데이터베이스에 대해 마스코트 검색 단백질 id에 사용 되었다. (107 비중복 단백질 대표) 192 중복 단백질의 총 337 분석 된 젤 반점에서 141 젤 명소에서 확인 되었다 (141/337 = 42%), 그리고 아무 단백질 196 명소에서 확인 된 (196/337 = 58%) (표 1)입니다. 141 반점, 자리 당 하나의 단백질 121 명소에 발견 되었다에 대 한 자리 당 2 단백질 발견 했다 12 명소 (31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148, 그리고 224 반점), 자리 당 5 단백질 3 반점 (반점 19에서에서 확인 되었다 22, 및 23), 자리 당 6 단백질 3 반점 (반점 24, 91, 93), 발견 했다 고 자리 당 7 단백질 2 명소 (관광 명소 72, 및 92)에서 확인 되었다.

2. 2DE MALDI MS/MS와 2DE-LC-MS/MS: 위에서 설명한 실험 절차를 사용 하 여, 침입 NFPA 조직 (남성, 22 세, ACTH (-), hGH (-), PRL (+ +), (-), LH 및 FSH (-))에서 추출 하는 단백질의 500 µ g의 총 18 cm IPG 스트립 (배열 했다 pH 3-10 NL)와 대형 SDS 페이지 젤, 다음 Coomassie 파란 G250 얼룩과 시각. 이 염색 약 1.95 ± IEF 방향에서 0.85 m m의 평균 위치 편차와 침략 NFPA 조직 프로테옴 (그림 2), 및 1.85 ± 0.79 m m와 SDS 페이지 방향에서의 재현성 및 높은 품질 2DE 젤 패턴을 나왔고 pH 4-8 및 질량 15-150 kDa29의 범위 내에서 주로 배포 했다 2DE 젤 지도에서 1100 단백질 spotsdetected. 10 지 무작위로 선택 삭제 하 고 복종 젤 destaining은 그림 2 에 표시, 트립 신 소화, 정화 tryptic 펩 티 드의 선행 고 MALDI MS/MS와 LC-ESI-MS/MS 분석. 각 MS/MS 데이터 집합 인간의 단백질 데이터베이스에 대해 마스코트 검색 단백질 id에 사용 되었다. 모든 관광 명소에 대 한 자리 당 1 단백질의 평균 확인 되었다 MALDI TOF TOF MS/MS 분석, 반면 많은 단백질 (단일 젤 자리에서 63 단백질의 평균, 2 일치 장소, 수영장에 71 단백질의 평균 및 3 일치의 수영장에서 118 단백질의 평균 hed 젤 명소) 각 해당 자리에 LC-ESI-MS/MS 분석 (표 2)와 함께 발견 했다. 여기, 하나는 LC-ESI-MS/MS 시스템은 훨씬 더 높은 감도 및 해상도 MALDI MS/MS 분석 시스템 기준으로 언급 해야 합니다. 이 데이터는 각 2D 젤 자리 많은 단백질, 복잡 한 인간 암 조직 proteome의 단지 하나 또는 두 개의 단백질 포함 명확 하 게 보여 줍니다.

Figure 1
그림 1 : 실버는 FSH 표현 NFPA 프로테옴 분석 IPGstrip ph 3의 2-드 패턴 스테인드 - SDS 페이지의 10 NL와 12% 젤 농도. 붉은 갈색 반점은 스테인드 단백질, 오렌지 실버 스테인드 젤의 배경 이다. 레이블이 지정 된 관광 명소 MALDI TOF MS PMF로 분석 되었다. 왕, 외. X에서 재현 (2015) 3와 일리-VCH 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Coomassie 파란 얼룩이 NFPA 프로테옴 분석 IPGstrip ph 3-2-드 패턴 SDS 페이지의 10 NL와 12% 젤 농도. 레이블이 지정 된 관광 명소 MALDI TOF TOF MS/MS와 LC-ESI-MS/MS분석 되었다. 관광 명소 1 * 2, * 3, *, 5 *, 16 * 1, 2, 3, 5, 및 16, 해당 장소에 일치 되었고 2 일치 젤에서 풀링된. Zhan X, 외 에서 수정 (2018) 29와 일리-VCH 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Table 1
표 1: 숫자 각 2DE에서 파악 된 단백질의 젤 MALDI TOF MS PMF 분석 자리.

Table 2
표 2: MS/MS 분석 각 2DE 젤 자리에서 파악 된 단백질의 수입니다.

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Discussion

우리의 장기 프로그램-인간의 NFPA proteomic 변화와 분자 메커니즘의 해명에 대 한 분자 네트워크 변화를 연구 하는 proteomics의 사용에에서 2DE, 2DE MS PMF 등 2DE-MS/MS, MS 방법을 함께 성공적으로 사용 하 고 NFPAs에 대 한 효과적인 바이오 마커의 발견입니다. 좋은 재현성 2DE 기반 비교 proteomics NFPA proteomic 유사9,10,,1112,13, 의 식별에 중요 한 역 19, 그리고 2DE 항 체 메서드 함께 보여줍니다 주어진된 포스트 번역 상 수정 검출 및 티로신 nitration16,17 의 감지와 같은 주어진된 단백질의 변형에의 장점 , 18 그리고 GH 변종14,15.

그러나, MS 메서드 함께 2DE 낮은 풍부한 단백질, 소수 성 단백질, 매우 기본적인 또는 산 성 단백질, 그리고 매우 낮은 또는 높은 대량 단백질2의 분석에 어려움을 가진 노동 집약 기술 이라고 여겨진다. 예를 들어, 매우 낮은 질량 (< 10 kDa) 또는 높은 질량 (> 150 kDa) 단백질, 그리고 매우 기본적인 (pI > 7.5 또는 8) 또는 산 성 (pI < 3.5 또는 4) 단백질 검색 되지 않습니다 쉽게 18 cm 2DE IPG 스트립의 pH 3-10 NL3. 그 2-드에서 점차적으로 철회 했다 보인다 안정 동위 원소는 지난 10 년 동안23, iTRAQ TMT 등 라벨과 함께 2 차원 액체 크로마토그래피 (2D-LC)를 포함 하 여 젤 무료 분리 방법의 급속 한 발전의 proteomics에 중앙 상태 MS/MS 방법 효과적으로 2DE 기반 방법의 단점을 극복 하 고 2D-LC 안정 동위 원소 라벨와 결합 하기 때문에 복잡 한 조직 프로테옴 분석에서 연구.

최근의 연구 발견,는 LC-ESI-MS/MS (1-10 박 범위에 그것의 감도) 2DE 분리 단백질의 식별에서 등 높은 감도 질량 분석의 사용 방법 2-드의 새로운 특성 발견 되었다 쇼 2 차원 젤 자리 많은 단백질을 (표 2)에 포함 되어 있습니다. 세계 2DPAGE 데이터베이스에 의해 입증이 카운터 자리, 당 단 하나 또는 두 개의 단백질의 전통적인 개념을 달렸다 (세계 2DPAGE 포털: http://world-2dpage.expasy.org/portal). 이 명확 하 게 설명 2-데 복잡 한 인간 프로테옴에 단백질의 정체성에의 처리량은 훨씬 이전 가정, 즉 하나 이상의 2D 젤 자리에 1 ~ 2 단백질만 했다. 이 techinique 2DE proteomics의 분야에 대 한 사용의 약속을 제공합니다. 한 2DE 통해 분리할 수 있다 한 천 10 천 명소3,8,22 의 복잡 한 인간 프로테옴, 따라서 2DE 분석에는 극대 프로테옴의 복잡성을 단순화 하는 더 자세한 분리 기술 LC-MS/MS 분석 2D-LC 시스템 기준으로 첫 번째 차원 LC 일반적으로 LC-MS/MS 분석 전에 18 ~ 30 분수를 생성 하기 전에 샘플. 따라서, 높은 감도 질량 분석 함께에서 2DE 특히 그 낮은 대 한 복잡 한 인간 프로테옴의 엄청난 정보 참조 맵을 설정 또는 매우 낮은 풍부한 단백질을 사용할 수 있습니다. 또한, 안정 동위 원소와 함께에서 2-드 (iTRAQ, TMT, 단기 등) 라벨 및 높은 감도 질량 분석 사용할 수 있습니다 다른 조건 중 대규모 proteomic 유사 척도. 또한, 2DE 안정 동위 원소 라벨 결합 그리고 높은 감도 질량 분석 대규모 검색 및 단백질 PTMs, 단백질 이체, 단백질 speciation 및 단백질 종의 정량화에 절대 이점이 있다. 이러한 장점을 2DE proteomics의 분야에서 활성화 해야 합니다.

또한, 여기에 설명 된 인간 PA 조직 프로테옴의 분석에 대 한 현재 프로토콜 다른 인간의 질병 proteomes 공부를 쉽게 변환 됩니다.

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Disclosures

저자는 관심사의 충돌은 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작품은 중국 (보조금 번호 81572278 및 81272798 XZ), 중국 "863" 계획 프로젝트 (XZ 부여 제 2014AA020610-1), 재능에 대 소개 (XZ) Xiangya 병원 기금과는 호남에서 보조금의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원 되었다 중국의 지방 자연 과학 재단 (XZ에 보조금 번호 14JJ7008). 저자는 또한 테네시 대학 건강 과학 센터에서 박사 도미 닉 M. Desiderio의 과학적 기여를 인정합니다. X.Z. 지속적으로 개발 2001 년부터 시작 하는 뇌 하 수 체 adenoma 프로테옴 분석 2DE MS 방법을 사용, 현재 원고에 대 한 개념을 잉태, 쓴 원고를 수정, 조정 관련 업무, 그리고에 대 한 책임은 금융 지원 및 해당 작업입니다. Y.L. 원고 개정에 참가 했다. Y.H 참조, 컬렉션 및 원고 개정에 참가 했다. 모든 저자는 최종 원고를 승인 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

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References

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