Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Todimensjonal Gel geleelektroforese kombinert med massespektrometri metoder for en analyse av menneskelige hypofysen adenom vev proteom

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

Her presenterer vi en todimensjonal gel geleelektroforese (2DE) kombinert med massespektrometri (MS) til å skille og identifisere menneskelige hypofysen adenom vev proteom, som presenterer en god og reproduserbar 2DE mønster. Mange proteiner er observert i hver 2DE spot når analysere komplekse kreft proteom med bruk av høy følsomhet MS.

Abstract

Menneskelige hypofysen adenom (PA) er en vanlig svulst som oppstår i menneskelige hypofysen i hypothalamus-hypofyse-målrettet orgel aksen systemer, og kan klassifiseres som enten klinisk funksjonelle eller nonfunctional PA (FPA og NFPA). NFPA er vanskelig for tidlig stadium diagnose og terapi på grunn av knapt heve hormonene i blodet sammenlignet FPA. Vårt langsiktige mål er å bruke Proteomikk metoder for å oppdage pålitelig biomarkers for avklaring av PA molekylære mekanismer og anerkjennelse av effektiv diagnostiske, prognostiske markører og terapeutiske mål. Effektiv todimensjonal gel geleelektroforese (2DE) kombinert med massespektrometri (MS) metoder ble presentert her for å analysere menneskelig PA proteomes, inkludert forberedelse av prøver, 2D gel geleelektroforese, protein visualisering, bildeanalyser, i-gel Trypsin fordøyelsen, peptid masse fingeravtrykk (PMF) og tandem masse massespektrometri (MS-/ MS). 2-dimensjonal geleelektroforese matrise-assistert laser desorpsjon/ionisering massespektrometri PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-Væskekromatografi (Langbane) MS-/ MS prosedyrer er vellykket brukt i en analyse av NFPA proteom. Med bruk av en høy følsomhet masse spectrometer, ble mange proteiner identifisert med metoden 2DE-LC--MS-/ MS i hver 2D gel i en analyse av komplekse PA vev å maksimere dekningen av menneskelig PA proteom.

Introduction

PA er en vanlig svulst som oppstår i menneskelige hypofysen i hypothalamus-hypofyse-målrettet orgel aksen systemer som lek betydelig rollene inne det menneskelige endokrine systemet. PA inkluderer klinisk funksjonelle og nonfunctional PAs (FPA og NFPA)1,2. NFPA er vanskelig i tidlig stadium diagnose og terapi fordi bare litt forhøyede hormonnivåene (f.eksLH og FSH) i blodet sammenlignet FPA, som har betydelig økte nivåer av tilsvarende hormoner i blodet3,4 ,5. Klargjøring av molekylære mekanismer og oppdagelsen av effektiv biomarkers har viktig klinisk betydning i diagnose, behandling og prognosen for NFPA. Vårt langsiktige mål er å utvikle og bruke proteomic metoder for å studere NFPA for å pålitelig biomarkers å avklare sin molekylære mekanismer og gjenkjenne effektiv terapeutisk mål samt diagnostiske og prognostiske markører. 2-DE kombinert med MS metoder har vært mye brukt i våre langsiktige forskningsprogram om menneskelig PA proteom1,2,6,7, inkludert etablering av proteom referanse kart3,8, analyse av ulikt uttrykt protein profiler9,10,11,12,13, hormon varianter14 ,15, post-translasjonell endringer som fosforylering14 og tyrosin nitration16,17,18, proteomic varianten av invasiv forhold til Noninvasiv NFPAs19og proteomic heterogenitet NFPA subtyper13, som førte til oppdagelsen av flere viktige pathway nettverk (mitokondrie dysfunksjon, celle syklus feilregulering, oksidativt stress og MAPK signalisering systemet abnormitet) som er endret i NFPA13,19,20.

2DE skiller proteiner deres isoelectric punkt (pI) (isoelectric fokus, IEF) og molekylvekt (via natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese, SDS side)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dette er en vanlig og klassisk separasjon teknikk innen Proteomikk, siden introduksjonen av begrepene proteom og Proteomikk i 199524. MS er avgjørende teknikken for å finne ut identiteten til 2DE-separerte proteiner, inkludert PMF og MS-/ MS strategier. Svært rask utvikling av MS instrumenter, spesielt i aspekter av gjenkjenning følsomhet og oppløsning, i kombinasjon med forbedring av LC-systemet, forbedrer identiteten til lav eller svært lav overflod proteiner i en proteom å maksimere den dekning av en proteom. Det også utfordrer våre tradisjonelle begreper at bare én eller to proteiner i en 2D gel i en analyse av komplekse menneskelig vev proteom og gir en mulighet til å identifisere flere proteiner i en 2D gel i en analyse av komplekse menneskelig vev proteom og maksimere dekningen av NFPA proteom.

Her beskriver vi detaljerte protokoller av 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-LC-MS-/ MS som har blitt brukt i analysen av menneskelig NFPA proteom. Protokollene inkluderer forberedelse av prøver, første dimensjon (isoelectric fokus, IEF), andre dimensjonen (SDS-side), visualisering av proteiner (sølv flekker og Coomassie blå flekker), image analyse av 2D gel, i-gel trypsin fordøyelsen, rensing av tryptic peptider, PMF, MS-/ MS og database stekende3,8,25,26. Dessuten, denne protokollen lett oversettes for analyse av andre menneskelig vev proteomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nåværende protokollen følger retningslinjene Xiangya Hospital medisinsk etikk komiteen av Central Sør University, Kina. En hodet cap og hansker bør brukes hele eksperimentelle fremgangsmåten å unngå keratin forurensning fra hud og hår8.

1. forberedelse av prøver

  1. Samle PA vev (0.2 - 0,5 mg) fra neurosurgical avdeling. Umiddelbart fryse i flytende nitrogen, og deretter overføre til-80 ° C for lagring.
  2. Legge til 2 mL 0,9% NaCl i deionisert destillert vann (ddH2O). Bruk denne løsningen for å vaske lett blod fra vevet overflaten (3 x).
    Merk: ddH2O med en ledningsevne 18.2 MΩ/cm brukes i hele protokollen. Noen av tissuemight tapt når vasket av blod fra en vevet overflaten.
  3. Legg til et volum (10 mL, 4 ° C) av løsningen inneholder 2 M eddiksyre og 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol for hver 0,5 - 0,6 g av vev, homogenize (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, 10 x) med en vev homogenizer, sonicate homogenate for 20 s, lyophilize , og lagre på −80 ° C.
  4. Mål proteininnholdet i den lyofilisert, homogenisert prøver ved bicinchoninic syre (BCA) analysen kit.
    Merk: BCA kvantifisering er ikke en absolutt kvantifisering og målt resultatet vil endres med en annen tekniker og eksperimentelle agent. En fast konsentrasjon eksempel standard skal brukes for forskjellige eksperimenter. Derfor bestemmes siste lasting mengden proteiner for hver 2D gel med sølv-farget eller Coomassie-farget god oppløsning bildet i den forhåndsutformede eksperimenter.
    1. Legge til ca 300 µg på lyofilisert homogenisert utvalget ett volum (282 µL) for protein-utpakking buffer (8 M urea og 4% CHAPS), etterfulgt av står for 2t, sonicating i et vannbad i 5 min, roterende 1t, sonicating igjen i vannbad i 5 min , roterende igjen 1t og sentrifugering 15.000 x g for 20 min.
    2. Forberede BSA standard løsninger med konsentrasjoner som nevnt: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1500, 2000 µg/mL med kommersielle BSA standard (2 mg/mL).
    3. Mix BCA reagens A og B (A:B = 50:1) som BCA fungerende løsning før å bruke.
    4. Legge til 0,1 mL av prøven eller standard løsningen 2 mL BCA fungerende løsning i et microfuge rør, etterfulgt av miksing og deretter rugende på 37 ° C i 30 min. Endelig kule ved romtemperatur for 10 min og måle A562 nm OD verdi.
    5. Beregne standarden lineær linjen (A562 nm vs BSA konsentrasjon) å få en regresjonsligningen beregner prøve protein innhold med en562nm -verdi.
  5. Bruk 150 µg av protein tilsvarende lyofilisert utvalget for sølv flekker eller 500 µg protein for Coomassie flekker, for en 18 cm immobilisert pH gradient (IPG) stripe pH 3-10 lineære (NL).
    Merk: IPG tørr stripen er 0,5 mm tykk og 3 mm bred, med forskjellige lengder inkludert 7, 11, 13, 18 og 24 cm og ulike pH områder inkludert pH 4-5, 4-7, 6-9 og 3-10 i en lineær eller lineær pH gradering. IPG bufferen må passe de stripe27,28.
  6. 1.6.Add 250 µL av utdrager buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 100 mM DTT (Legg før bruk), 0,5% v/v pharmalyte (Legg til før bruk), og et spor av bromophenol blå).
  7. Holde løsningen under 30 ° C, etterfulgt av vortexing i 5 minutter, sonicating i 5 minutter, og roterende for 50 min.
  8. Legge til 110 µL rehydrering bufferen (7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 60 mM DTT (Legg før bruk), 0,5% v/v IPG buffer (Legg før bruk), og et spor av bromophenol blå). Sonicate i 5 minutter. Da rotere utvalget for 50 min, vortex i 5 min og sentrifuge for 20 min 15.000 x g.
  9. Samle nedbryting (350 µL) som protein prøve løsningen8.

2. todimensjonal Gel geleelektroforese

  1. IEF (første dimensjon): utføre IEF på isoelectric fokus systemet som beskrevet nedenfor.
    1. Legge til 350 µL av protein prøve løsningen i sporet 18 cm IPG stripe innehaveren.
    2. Sette en 18 cm IPG stripe gel-side-ned på protein prøve løsningen (unngå bobler).
    3. Legge til 3-4 mL av mineralolje å dekke IPG stripen.
    4. Sett sammen IPG stripe abonnenten til det isoelectric fokus systemwith den spisse enden på baksiden (+) plate og firkantet slutten på forsiden (−) plate.
    5. Rehydrate overnatting (~ 18 h ved romtemperatur).
    6. Angi IEF parametere: maksimum gjeldende 30 µA per stripen, 20 ° C; 250 V 1 h, 125 Vh, trinn og hold. 1000 V, 1 h, 500 Vh, gradienten; 8000 V, 1 h, 4000 Vh, gradienten; 8000 V, 4 h, 32 000 Vh, trinn og hold. og 500 V, 0,5 h, 250 Vh, trinn og hold. La det kjøre opp til en total tid 7,5 h og 36,875 Vh.
    7. Etter IEF, ta ut hver IPG stripe og fjerne den ekstra mineral oljen med en uløselig papirhåndkle. Nå Pakk stripen i et stykke plastfolie, og lagre på −80 ° C.
      Merk: IPGstrip innehaver må rengjøres med IPGstrip abonnenten rensemiddel og destillert vann.
  2. SDS-side (andre dimensjon): utføre SDS-siden i en loddrett celle geleelektroforese System
    Merk: Hver SDS gel-sidestørrelse skal 255 x 190 x 1 mm.
    1. Bruke en multi gel trinse for å kaste 12% siden løse gels. Støping 12% siden geleer, følger du denne fremgangsmåten.
      1. Legge til 270 mL ddH2O, 150 mL på 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL av 40% (w/v) akrylamid/bisacrylamide lagerløsning (29:1, 40% w/v akrylamid og 1,38% w/v-N N'-methylenebisacrylamide), 3 mL 10% ammonium persulfate og 150 µL av TEMED å gjøre gel løsning i et beaker. Bland forsiktig og unngå bobler.
      2. Hell gel løsningen forsiktig i multikasting kammeret opp til forventet gel høyde (19 cm).
      3. Straks legge ca 3 mL ddH2O på hver retting gel å dekke geléer. La gel danner i ca 1 time.
    2. Forberede 20 L geleelektroforese bufferen (25 mM Tris, 192 mM glyserin og 0,1% SDS). Fyll geleelektroforese separasjon enhet buffer tanken med denne bufferen.
    3. Ta ut fokusert IPG strimler fra fryseren, og equilibrate strimler i 10 min av rocking forsiktig i 4 mL redusere likevekt buffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glyserol, 2% w/v DTT (Legg før bruk) og spor av bromophenol blå).
    4. Equilibrate for 10 min av forsiktig rocking redusert IPG strimler 4 mL alkylation likevekt buffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urea, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glyserol, 2,5% w/v iodoacetamide (Legg til før bruk), og et spor av bromophenol blå).
    5. Under gel likevekt, demontere multikasting kammeret og ta ut forberedt løse gel kassetten. Skyll 3 x med ddH2O. Fjern overflødig ddH2O med en uløselig papirhåndkle og satt i en gel stander.
    6. Skyll equilibrated IPG strimler med geleelektroforese buffer, og fjerne overflødig væske på IPG stripe overflaten med uløselig tørkepapir.
    7. Sette en IPG stripe på løse SDS side gel, og la IPG stripens plast side lenger glassplaten og den spisse enden til venstre.
    8. Hell 3-4 mL av varm 1% agarose i SDS geleelektroforese bufferen (~ 80 ° C) raskt å forsegle IPG stripen på toppen av hver side SDS-gel, og sette topp-siden av IPG stripe ned til toppen av kortere glassplaten uten bobler, og deretter danner i 10 min.
    9. Sett samlet gel kassetten mellom plast pakninger i loddrett geleelektroforese systemet. Sett toppen av gel med IPG stripen ved katoden (−).
    10. Justere nivået på geleelektroforese buffer å fordype gel kassetten.
    11. Koble satt Power Supply/kontrollenheten i konstant spenning modus og kjøre 200 V i ca 370 min mens overvåking fargestoff.
    12. Ta ut gel kassetten fra geleelektroforese systemet etter kjøringen, og fjerner gel fra gel kassetten, unngå rive gel, etterfulgt av farging av 2DE-separerte proteiner.
  3. Farging av 2DE-separerte proteiner
    1. Sølv flekker
      1. Forsiktig overføre gel med to hender på et brett som inneholder 250 mL fiksering løsning (50% metanol (v/v) og 5% (v/v) eddiksyre) og forsiktig risting gel for 20 min.
      2. Forkaste løsningen og legge til 250 mL av 50% (v/v) metanol i skuffen og forsiktig risting i 10 min.
      3. Forkast metanol og legge til 250 mL av ddH2O i skuffen. Riste forsiktig i 10 min.
      4. Forsiktig riste gel i 1 min i 250 mL sensibilisering bufferen som inneholder 0.02% (w/v) natrium tiosulfat, og forkaste væsken.
      5. Forsiktig risting gel i 250 mL av ddH2O for 1 min (gjenta en gang). Kaste væsken etter hvert trinn.
      6. Forsiktig risting gel for 20 min i 250 mL sølv reaksjon løsning (0,1% (w/v) Sølvnitrat med 200 µL 37% (v/v) formaldehyd lagt før bruk).
      7. Forsiktig risting gel i 250 mL av ddH2O for 1 min (gjenta en gang). Kaste væsken etter hvert trinn.
      8. Riste gel forsiktig i 250 mL utviklingsløsning (3% (w/v) natriumkarbonat med 100 µL 37% (v/v) formaldehyd lagt før bruk) til ønsket intensitet av flekker er oppnådd (vanligvis 1-3 min), så kast væsken.
      9. Forsiktig riste gel for 10 min i 250 mL stoppe løsning (5% (v/v) eddiksyre) og kast væsken.
      10. Forsiktig riste i 5 min i 250 mL av ddH2O og kast væsken.
      11. Holde gel i 250 mL oppbevaring 8,8% glyserol på 4 ° C.
    2. Coomassie briljant blå flekker
      1. Forberede Coomassie flekk løsning ved å løse opp Coomassie briljant blå G250 0,3 g ammonium sulfate 25 g og fosforsyre 25 mL i ddH2O og et totalt volum på 200 mL. Før bruk må legge metanol 50 mL.
      2. Legge til 250 mL Coomassie flekk løsning gel og forsiktig risting ved romtemperatur før klart protein flekker (~ 2-4 h). Kast væsken.
      3. Legge til 250 mL av ddH2O og riste sakte for 5 minutter, deretter to ganger mer. Kast væsken.
      4. Legg til 250 mL destaining løsning (20% (v/v) etanol) og rist sakte til bakgrunnsfargen blitt nesten fargeløs, og forkaste væsken.
      5. Erstatte med fersk destaining løsningen når gamle en får mørke, og forkaste væsken.
      6. Legge til 250 mL av ddH2O og riste sakte for 5 min. Forkast væsken.
      7. Legge til 250 mL oppbevaring (8,8% glyserol) og holde på 4 ° C.
  4. Todimensjonal gel geleelektroforese bildeanalyser
    1. Digitalisere de farget gels med en planskanner.
    2. Bildet inn 2D gel bildet analyse systemet.
    3. Oppdage og kvantifisere hvert sted å bruke en 2D gel analyseprogramvare i henhold til produsentens protokollen.
    4. Matche flekker mellom forskjellige gels.

3. identifisering av 2DE-separerte proteiner med MS

  1. Utarbeidelse av tryptic peptid blanding
    Merk: Silikoniserte eller lav-oppbevaring rør og pipette-spisser skal brukes til å unngå tap av proteiner eller peptider.
    1. Sølv-gel destaining
      1. Avgiftsdirektoratet gel flekker i en 1,5 mL silikoniserte rør, og vaske i 500 µL ddH2O 6 ganger.
      2. Sette vasket gel i en ny 1,5 mL silikoniserte tube, og hakke det i mange små biter (0,5-1 mm3).
      3. Destain gel bitene i 20 µL destaining løsningen som blander en del av 30 mM kalium ferricyanide og en del av 100 mM natrium tiosulfat (1:1) før bruk la brun farge forsvinner (vanligvis 1-2 min). Kast væsken.
      4. Vask gel stykker med 20 µL av ddH2O 5 - 6 ganger å la den gule fargen forsvinner. Kaste væsken etter hvert trinn.
      5. Legge til 20 µL av 200 mM ammonium bikarbonat gel bitene, og holde 20 min. vaskes gel bitene med ddH2O (20 µL, 1 time). Kast væsken.
      6. Tørke av gel bitene med 30 µL acetonitrile minst to ganger for å la gel bitene slå en ugjennomsiktig hvit, og vakuum-sentrifuge tørr i 30 min.
    2. Coomassie briljant blå gel destaining
      1. Skjær gel flekker i en 1,5 mL silikoniserte rør og vask med 500 µL ddH2O 3 ganger.
      2. Sette vasket gel i en ny 1.5-mL silikoniserte tube, og hakke det i flere biter (0,5-1 mm3) med en pipette tips.
      3. Destain gel i 50-100 µL destaining løsning (1:1 v/v blanding 200 mM NH4HCO3 med acetonitrile) avhengig gel, ruge på 37 ° C i et vannbad. Gjenta og legge til frisk destaining løsning til fargen forsvinner (~ 1 h). Kaste væsken etter hvert trinn.
      4. Vask gel stykker en gang med 20 µL av ddH2O.
      5. Tørke gel bitene i 100 µL acetonitrile (minst to ganger) å la gel bitene slå en ugjennomsiktig hvit.
      6. Vakuum tørr i 30 min.
    3. I-gel trypsin fordøyelsen av proteiner i tørket gel stykker
      1. Oppløse 20 µg (833 pmol) av lyofilisert trypsin pulver i 100 µL av 50 mM eddiksyre.
      2. Fortynne 20 µL av trypsin løsning (200 ng/µL) til 16 ng/µL med 230 µL av 50 mM ammonium bikarbonat.
      3. Legge til 20-30 µL (0,32-0.48 µg) av fortynnet trypsin løsningen hver rør som inneholder tørket gel stykker. Inkuber 18-20 h i en 37 ° C i vannbad. La løsningen stå på 4 ° C for 30 min.
      4. Sentrifuge løsningen forsiktig for 10 s. Sonicate i et vannbad for 5-6 minutter til 30 ° C, og deretter virvel 12.000 x g i 2 minutter.
      5. Samle nedbryting som inneholder tryptic peptid blanding i en 0,5 mL silikoniserte tube.
    4. Rensing av tryptic peptid blanding med C18 microcolumn.
      1. Vask kolonnene C18 med acetonitrile (10 µL, 5 ganger), og deretter med 50% acetonitrile (10 µL, 5 ganger).
      2. Equilibrate med 0,1% trifluoro eddiksyre (TFA) (10 µL, 5 ganger).
      3. Pipetter prøven opp og ned gjennom forberedt C18 kolonnen for 15 ganger.
      4. Vask prøven 2 x 10 µL 0,1% TFA.
        Merk: Renset tryptic peptidene beholdes i kolonnen C18.
      5. Legge til et volum (6 µL) løsning (85% v/v acetonitrile/0.1% v/v maursyre) i et rent 0,5 mL silikoniserte rør, Pipetter denne løsningen forsiktig og sakte opp og ned gjennom peptid-C18 perler for 10 x å vaske bond peptider i løsningen, air-dry , og lager (−20 ° C) for MS analyse.
  2. MS analyse
    1. MALDI-MS PMF analyse
      1. Legge til 4 µL av 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA å oppløse renset tryptic peptid blandingen. Last 2 µL oppløst tryptic peptid blanding på en MALDI plate og umiddelbart legge 2 µL а oppsamling-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) løsning som inneholder 10 g/L i 500 mL/L acetonitrile 1 mL/L TFA, deretter air-dry.
      2. Legg MALDI platen med tryptic peptid blanding i en MALDI-MULTIPLE Sclerosis masse spectrometer.
        Merk: Parameterne instrument er angitt som reflektor modus med 20 kV akselererende spenning, positiv polaritet og 160 ns forsinkelsen utvinning tid. Hver MS spekteret er kjøpt med 200 laser skudd med en rekke m/z 1000 til 4000 etter eksterne kalibrering med standard peptid masse.
      3. Bruke en MS spekteret-prosessering programvare for å behandle hver MS spektrum, inkludert planlagte korreksjon, støy fjerning (5%) og topp deisotoping.
      4. Korrigere masse listen fra hver MS spektrum med fjerning av forurensende massene fra trypsin, matrise, keratins og andre ukjente forurensninger parallelt tom-gel eksperimenter.
      5. Input korrigert massen liste til en PMF-basert protein søker programvare å identifisere proteiner i Swiss-beskytte protein databasen med følgende søkeparametrene, inkludert PMF søketype, menneskelig, trypsin med 1 maksimal savnet cleavage, fast carbamidomethyl cystein, variabel metionin oksidasjon, monoisotopic, peptid masse toleranse 50 ppm, peptid kostnad staten (1 +), og signal til støy (S/N) 5.0.
      6. Identifisere proteiner med statistisk signifikant protein score, og der protein score =-10 × log(p), der p er sannsynligheten for at observert kampen er en tilfeldig hendelse.
    2. MALDI--MS-/ MS analyse
      1. Legge til 4 µL av 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA å oppløse renset tryptic peptid blandingen. Hver renset tryptic peptid blanding (0,5 µL) ble oppdaget på en 384-og MALDI-plate umiddelbart oppdaget 0,5 µL av mettet CHCA matrise i 50% acetonitrile/0.1% TFA på peptid prøven og tørkes i luften.
      2. La MALDI-TOF-TOF MS/MS behandles automatisk, bruker 100 laser skudd for å skaffe en MS1 spekteret, og samler 6 gjentatt MS1 spectra i en syntetisk MS1 spektrum.
      3. Angi 4 mest-intens forløper ioner fra hver syntetiske MS1 spekteret for MS-/ MS analyse. Bruk 100 laser skudd for hver forløper ion til å erverve en MS-/ MS spekteret, og samle 4 gjentatt MS-/ MS spectra i en syntetisk MS-/ MS spektrum.
      4. Bruke syntetisk MS-/ MS data søke etter proteiner gjennom en MS/MS-basert protein søker programvare med parametere inkludert MS-/ MS Ion søk, Swiss-beskytte menneskelige databasen, trypsin maksimalt 1 tapte cleavage, fast carbamidomethyl (C), variabler Oksidasjon (M), monoisotopic masse verdi, peptid masse toleranse ± 100 ppm, og fragment masse toleranse ± 0,7 Da.
      5. Identifisere et protein med en statistisk signifikant sannsynlighet basert på Mowse score og ioner poeng = -10 x Log(P), der p er sannsynligheten for at observert kampen er en tilfeldig hendelse.
    3. LC-ESI--MS-/ MS analyse
      1. Legge til 6 µL av 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v maursyre å oppløse renset tryptic peptid blandingen.
      2. Bruk en høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) system sammen online med en electrospray ionization (ESI)-MS-/ MS masse spectrometer med et MS-/ MS data ervervet programvare til å administrere hele operasjonen.
      3. Bruk C18 felle kolonne (300 µm ID × 5 mm lengde), og omvendt-fase C18 kolonnen (75 µm ID x 15 cm lengde) med en separasjon gradient på 98% løsemiddel en (0,1% maursyre) og 2% løsemiddel B (0,1% maursyre i 100% acetonitrile) i 2 minutter , 2% til 40% løsemiddel B for 45 min, 40% til 95% løsemiddel B i 5 min og 95% løsemiddel B i 10 min (totalt av 65 min på 300 nL/min).
      4. Angi positiv-ion og data-avhengige automatisk undersøkelsen modus å erverve MS og MS-/ MS spectra, og angi kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) for ion fragmentering.
      5. Angi hver MS skanning for masse m/z 350-1800 med en oppløsning på 100.000 på m/z 400. Utføre skanningen for de 7 mest-intense ionene i MS scan.
      6. Bruk MS/MS-basert protein søker programvare jeg søke databasen for identifikasjon av proteiner.
        1. Velg menneskelige protein databasen.
        2. Velg trypsin med en savnet cleavage nettstedet tillatt.
        3. Angi peptid toleranse (±10 ppm), fragmentere ion toleranse (±0.8 Da), peptid kostnad (2 + 3 + og 4 +), fast carbamidomethylation på cystein og variabel oksidasjon på metionin.
        4. Angi false oppdagelsen priser (FDR) < 1%, og bare peptider med rank 1 godtas.
        5. Identifisere protein med PSM≥1 (PSMs: Antall identifiserte peptid sekvenser (PSMs) for protein, inkludert de redundant identifisert) og minst to unike peptider per protein.
      7. Også bruke MS/MS-basert protein søker programvare II søke databasen for identifikasjon av proteiner.
        1. Konvertere raw MS-filen med filtypen .mgf.
        2. Valgt menneskelige protein databasen (uniprothuman_20161031.fasta hvilke behersker 70940 sekvenser og 23897047 rester).
        3. Velg trypsin fordøyelsen maksimalt 2 tapte cleavages.
        4. Sett fast carbamidomethyl (C), variabel deamidated (NQ) og oksidasjon (M), forløperen ion masse toleranse 10 ppm, datter ion masse toleranse 0,8 Da, og monoisotopic peak.
        5. Identifisere proteiner med en betydning terskelen til 0,05 og minst 2 unike peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. 2DE-MALDI MS PMF: med den eksperimentelle prosedyren beskrevet ovenfor, totalt 150 µg proteiner var utdraget fra FSH-uttrykt NFPA vev (kvinne, 50 år gammel, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+), og TSH (-)) og plassert med en 18 cm IPG strip (pH 3-10 NL) og en stort format SDS side gel, deretter visualisert med sølv flekker. Vi fikk et reproduserbare og god 2DE gel mønster av NFPA vev proteom (figur 1), med en gjennomsnittlig posisjonelle avvik på 1,98 ± 0,75 mm i IEF retning og 1,62 ± 0.68 mm i SDS side retning, og med en 1200 protein flekker oppdaget i 2DE gel kartet som ble distribuert hovedsakelig i pH 4-8 og masse 15-150 kDa3. Totalt var 337 gel flekker forbrukeravgift og utsatt for gel destaining, trypsin fordøyelsen, rensing av tryptic peptider og MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis PMF analyse. PMF data ble brukt for protein identitet med MASKOT søk mot menneskelig protein databasen. Totalt 192 redundante proteiner (representerer 107 nonredundant proteiner) ble identifisert fra 141 gel flekker av 337 analysert gel flekker (141/337 = 42%), og ingen protein ble identifisert i 196 flekker (196/337 = 58%) (Tabell 1). For de 141 flekkene, eneste protein per sted ble identifisert i 121 flekker, 2 proteiner per sted ble identifisert i 12 flekker (flekker 31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148 og 224), 5 proteiner per sted ble identifisert i 3 steder (flekker 19 22 og 23), 6 proteiner per sted ble identifisert i 3 steder (flekker 24, 91 og 93) og 7 proteiner per sted ble identifisert i 2 plasser (flekker 72 og 92).

2. 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-LC--MS-/ MS: bruker den eksperimentelle prosedyren beskrevet ovenfor, totalt 500 µg protein utvunnet fra en invasiv NFPA vev (mann, 22 år gammel, ACTH (-), hGH (-), PRL (++), LH (-) og FSH (-)) ble plassert med en 18 cm IPG strip ( pH 3-10 NL) og et stort format SDS side gel, deretter visualisert med Coomassie blå G250 flekker. Denne flekker gitt et reproduserbare og høy kvalitet 2DE gel mønster av invasiv NFPA vev proteom (figur 2), med en gjennomsnittlig posisjonelle avvik 1.95 + 0,85 mm i IEF retning og 1,85 ± 0,79 mm i SDS-sideretningen og ca 1100 protein spotsdetected 2DE gel kart hovedsakelig distribuerte innen pH 4-8 og masse 15-150 kDa29. De 10 stedene valgt tilfeldig og merket i figur 2 var forbrukeravgift og utsettes for gel destaining, trypsin fordøyelsen, rensing av tryptic peptider, etterfulgt av MALDI--MS-/ MS og LC-ESI--MS-/ MS analyser. Hver MS-/ MS dataset ble brukt for protein identitet med MASKOT søk mot menneskelig protein databasen. For alle flekker, gjennomsnittlig 1 protein per sted ble identifisert med MALDI-TOF-TOF MS-/ MS analyse, mens mange proteiner (gjennomsnitt 63 proteiner i en enkelt gel spot et gjennomsnitt på 71 proteiner i en pool av 2 matchet flekker og gjennomsnittlig 118 proteiner i en pool av 3 mell Hed gel flekker) i hver tilsvarende spot ble identifisert med LC-ESI--MS-/ MS analyse (tabell 2). Her må man nevne at LC-ESI--MS-/ MS systemet har en mye høyere følsomhet og oppløsning i forhold til MALDI--MS-/ MS analyse systemet. Disse dataene tydelig viser at hver 2D gel stedet inneholder mange proteiner, ikke bare én eller to proteiner i komplekse human kreft tissue proteom.

Figure 1
Figur 1 : Sølv farget 2-DE mønster av en FSH-uttrykt NFPA proteom analysert med IPGstrip pH 3 - 10 NL og 12% gel konsentrasjon av SDS-side. Rødbrun flekker er sølv-farget proteiner er oransje bakgrunn av sølv-farget gel. Merket flekker ble analysert med MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis PMF. Gjengitt fra Wang X, et al. (2015) 3, med tillatelse fra Wiley-VCH. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Coomassie blå farget 2-DE mønster av en NFPA proteom analysert med IPGstrip pH 3 - 10 NL og 12% gel konsentrasjon av SDS-side. Merket flekker ble analysert med MALDI-TOF-TOF MS-/ MS og LC-ESI--MS-/ MS. Flekker 1 *, 2 *, 3 *, 5 *, og 16 * var samsvarer med de tilsvarende stedene 1, 2, 3, 5 og 16, og samlet fra 2 matchet gels. Endret fra Zhan X, et al. (2018) 29, med tillatelse fra Wiley-VCH. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: Nummeret av proteiner som ble identifisert i hver 2DE gel spot med MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis PMF analyse.

Table 2
Tabell 2: Antall proteiner som ble identifisert i hver 2DE gel spot med MS-/ MS analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2DE, kombinert med MS metoder, inkludert 2DE-MS PMF og 2DE-MS/MS, har blitt brukt i vårt langsiktige program - bruk av Proteomikk menneskelige NFPA proteomic variasjoner og molekylære nettverk varianter for utviklingen av molekylære mekanismer og oppdagelsen av effektiv biomarkers for NFPAs. 2DE-baserte sammenlignende Proteomikk med god reproduserbarhet spiller en viktig rolle i identifikasjon av NFPA proteomic variasjoner9,10,11,12,13, 19og 2DE kombinert med metoden antistoff demonstrerer sine fordeler i oppdagelsen av en gitt post-translasjonell modifikasjon og varianter av en gitt protein, for eksempel gjenkjenning av tyrosin nitration16,17 , 18 og GH varianter14,15.

2DE sammen med MS metode anses imidlertid en arbeidskrevende teknikk med vanskeligheter i analyser av lav overflod proteiner, hydrofobe proteiner, svært grunnleggende eller sure proteiner og svært høy eller lav masse proteiner2. For eksempel, ekstremt lav masse (< 10 kDa) eller høy masse (> 150 kDa) proteiner, og svært grunnleggende (pI > 7.5 eller 8) eller sure (pI < 3.5 eller 4) proteiner er ikke lett oppdaget av 2DE med en 18 cm IPG stripe pH 3-10 NL3. Med den raske utviklingen av gel-fri separasjon metoder, inkludert todimensjonale flytende kromatografi (2D-lb) kombinert med stabil isotop merking som iTRAQ og TMT i de siste ti årene23, virker det som 2-DE er gradvis trukket fra sin sentrale status i Proteomikk forskning i analysen av komplekse vev proteom fordi 2D-LC kombinert med stabil isotop merking og MS-/ MS metoder effektivt overvinne ulempene ved 2DE-baserte metoder.

Nyere studier funnet at, med bruk av høy følsomhet massespektrometri, for eksempel en LC-ESI-MS-/ MS (sin følsomhet er i 1-10 amol område) i identifisering av 2DE-separerte proteiner, de nye egenskapene av metoden 2-DE ble oppdaget som viser at en 2D gel stedet inneholder mange proteiner (tabell 2). Dette løp mot til den tradisjonelle konseptet av bare én eller to proteiner per sted, som er dokumentert av verden 2DPAGE databasen (World-2DPAGE portal: http://world-2dpage.expasy.org/portal). Dette tydelig viser at gjennomstrømningen av 2-DE i identiteten til proteiner i en kompleks menneskelige proteom er mye høyere enn tidligere antatt, nemlig at det var bare en til to proteiner i et 2D gel sted. Denne techinique gir løfte om bruk for 2DE innen Proteomikk. En 2DE kan skille tusen til ti tusen flekker3,8,22 i analysen av den komplekse menneskelige proteom, dermed 2DE er en mer detaljert separasjon teknikk maksimalt forenkle kompleksiteten i proteom prøver før LC--MS-/ MS analyse i forhold til 2D-LC systemet at første-dimensjonale LC vanligvis genererer 18 til 30 fraksjoner før LC--MS-/ MS analyse. 2DE i kombinasjon med høy følsomhet massespektrometri kan derfor brukes til å etablere enorme informasjonen referanse kartet for den komplekse menneskelige proteom, spesielt for de lav eller svært lav overflod proteiner. I tillegg 2-DE sammen med stabil isotop merking (som iTRAQ, TMT og SILAC) og høy følsomhet massespektrometri kan brukes å kvantifisere storstilt proteomic variasjoner blant ulike forhold. Videre 2DE kombinert med stabil isotop merking og høy følsomhet massespektrometri har absolutt fordeler i omfattende gjenkjenning og måling av protein PTMs, protein varianter, protein artsdannelse og protein arter. Disse fordelene vil ha 2DE revitalisert innen Proteomikk.

Videre er finnes protokollene for analyse av menneskelig PA vev proteom beskrevet her lett oversatt for å studere andre menneskelig sykdom proteomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det er ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation av Kina (Grant nr. 81572278 og 81272798 til XZ), tilskudd fra Kina "863" planlegger Project (Grant No. 2014AA020610-1 til XZ) og Xiangya Hospital midlene Talent introduksjon (til XZ) i Hunan Provinsielle Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 14JJ7008 til XZ). Forfatterne også erkjenner vitenskapelige bidrag av Dr. Dominic M. Desiderio i Universitetet i Tennessee Health Science Center. X.Z. kontinuerlig utviklet og brukt 2DE-MS metoder til å analysere hypofysen adenom proteom fra 2001, unnfanget konseptet for nåværende manuskriptet, skrev reviderte manuskriptet, koordinert relevant arbeidet og var ansvarlig for den økonomisk støtte og tilsvarende arbeid. Y.L. deltok i revisjon av manuskriptet. Y.H deltok i innhenting av referanser og revisjon av manuskriptet. Alle forfattere godkjent siste manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
  28. Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Tags

Kreftforskning problemet 134 todimensjonal Gel geleelektroforese Isoelectric fokusere akrylamid Gel geleelektroforese sølv flekker Coomassie flekker Image Analysis peptid masse fingeravtrykk (PMF) Tandem massespektrometri (MS-/ MS) hypofysen Adenoma proteom
Todimensjonal Gel geleelektroforese kombinert med massespektrometri metoder for en analyse av menneskelige hypofysen adenom vev proteom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y.… More

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome. J. Vis. Exp. (134), e56739, doi:10.3791/56739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter