Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

هلام ثنائي الأبعاد التفريد مقترنة بأساليب الطيف الكتلي لتحليل البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

نقدم هنا، هلام ثنائي الأبعاد التفريد (2DE) مقترنة بالطيف الكتلي (مللي ثانية) لفصل وتحديد البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية، الذي يعرض نمط 2DE جيدة واستنساخه. ولوحظت العديد من البروتينات في كل بقعة 2DE عند تحليل البروتين السرطان معقدة باستخدام MS حساسية عالية.

Abstract

الورم الحميد الغدة النخامية البشرية (السلطة الفلسطينية) هو ورم شائعة التي تحدث في الغدة النخامية البشرية في النظم محور تحت المهاد-النخامية-استهداف الجهاز، ويمكن أن تصنف السلطة الفلسطينية أما سريرياً وظيفي أو غير وظيفي (FPA و NFPA). ومن الصعب NFPA لمرحلة التشخيص المبكر والعلاج بسبب بالكاد رفع مستوى الهرمونات في الدم بالمقارنة مع FPA. هدفنا طويل الأجل لاستخدام أساليب البروتيوميات لاكتشاف المؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتوضيح الآليات الجزيئية السلطة الفلسطينية والاعتراف بعلامات التشخيص، تشخيصية فعالة والأهداف العلاجية. هلام ثنائي الأبعاد فعالة التفريد (2DE) مقترنة بأساليب الطيف الكتلي (مللي ثانية) وعرضت هنا لتحليل البشرية بروتيوميس السلطة الفلسطينية، بما في ذلك إعداد العينات، التفريد جل 2D، التصور البروتين، وتحليل الصور، في جل الهضم التربسين وهضميد بصمة الشامل (تحلان) جنبا إلى جنب كتلة قياس الطيف الكتلي (MS/MS). هلام ثنائي الأبعاد التفريد الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين الكتلي تحلان (2DE--استخدام MS تحلان)، 2DE--استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد أو مرض التصلب العصبي المتعدد، والفصل اللوني السائل 2DE (LC) MS/MS الإجراءات التي طبقت بنجاح في تحليل البروتين NFPA. مع استخدام مطياف كتلة حساسية عالية، حددت العديد من البروتينات باستخدام أسلوب 2DE-LC-MS/MS في جل 2D كل بقعة في تحليل الأنسجة السلطة الفلسطينية معقدة تحقيق أقصى قدر من التغطية للبروتين البشري في السلطة الفلسطينية.

Introduction

السلطة الفلسطينية هو ورم شائعة التي تحدث في الغدة النخامية البشرية في النظم محور الجهاز تحت المهاد-النخامية-المستهدفة، التي تلعب أدواراً هامة في نظام الغدد الصماء الإنسان. وتشمل السلطة الفلسطينية سريرياً وظيفية ولا يعمل نظام تقييم الأداء (FPA و NFPA)1،2. NFPA أمر صعب في مرحلة التشخيص المبكر والعلاج بسبب مستويات الهرمون مرتفعة قليلاً فقط (مثلاً، LH و FSH) في الدم بالمقارنة مع FPA، الذي شهد زيادة كبيرة في مستويات الهرمونات المقابلة في الدم3،4 ،5. توضيح الآليات الجزيئية واكتشاف المؤشرات الحيوية فعالة له أهمية سريرية هامة في التشخيص والعلاج، والتكهن من NFPA. هو هدفنا طويل الأجل تطوير واستخدام أساليب البروتين لدراسة NFPA لاكتشاف المؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتوضيح آلياته الجزيئية، والاعتراف بالأهداف العلاجية الفعالة، فضلا عن علامات التشخيص وتنبؤاتها. 2-دي مقترنة بمرض التصلب العصبي المتعدد الأساليب قد استخدمت على نطاق واسع في برنامجنا البحوث طويلة الأجل فيما يتعلق بالإنسان السلطة الفلسطينية البروتين1،2،،من67، بما في ذلك إنشاء مرجع البروتين خرائط3،8، تحليل البروتين الأثران عن ملامح9،10،11،12،13، المتغيرات هرمون14 ،15، التعديلات بوستترانسلاشونال مثل الفسفرة14 وتيروزين نترته16،،من1718، واختلاف البروتين الغازية نسبة إلى موسع نفباس19، وإلى عدم تجانس البروتين NFPA الأنواع الفرعية13، مما أدى إلى اكتشاف عدة شبكات المسار الهام (خلل mitochondrial والتقلبات دورة الخلية، والأكسدة، وإشارات MAPK شذوذ النظام) التي يتم تغييرها في NFPA13،،من1920.

2DE يفصل البروتينات وفقا isoelectric نقطة (pI) (تركز isoelectric، الضمنية) والوزن الجزيئي (عن طريق الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23-هذا أسلوب فصل الكلاسيكي ومشتركة في ميدان البروتيوميات، منذ الأخذ بمفاهيم البروتين والبروتينات في 199524. مرض التصلب العصبي المتعدد هو الأسلوب حاسمة لمعرفة الهوية البروتينات المفصولة 2DE، بما في ذلك استراتيجيات تحلان و MS/MS. التطور السريع جداً لمرض التصلب العصبي المتعدد الصكوك، لا سيما في الجوانب للكشف عن حساسية والقرار، في تركيبة مع تحسين نظام LC، يحسن إلى حد كبير هوية البروتينات وفرة منخفضة أو منخفضة للغاية في البروتين إلى أقصى حد ممكن تغطية البروتين. كما أنه يتحدى مفاهيمنا التقليدية واحدة فقط أو اثنين من البروتينات موجودة في 2D هلام موضعي في تحليل البروتين الأنسجة البشرية المعقدة، ويوفر فرصة للتعرف على البروتينات متعددة في 2D هلام موضعي في تحليل الأنسجة البشرية المعقدة البروتين، وتحقيق أقصى قدر من التغطية للبروتين NFPA.

هنا يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة من 2DE--استخدام MS تحلان، 2DE--استخدام MS/MS، و 2DE-LC-MS/MS التي استخدمت بنجاح في تحليل البروتين NFPA البشرية. البروتوكولات وتشمل إعداد العينات، البعد الأول (isoelectric التركيز، الضمنية)، البعد الثاني (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، تصور بروتينات (تلطيخ الفضة وتلطيخ أخذ الأزرق)، صورة التحليل في 2D هلام، التربسين في جل الهضم، تنقية الببتيدات تريبتيك وتحلان، MS/MS، وقاعدة بيانات الحارقة3،8،،من2526. وعلاوة على ذلك، يترجم هذا البروتوكول بسهولة لتحليل بروتيوميس الأنسجة البشرية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية إكسيانجيا المستشفى الطبية الأخلاقيات اللجنة الجامعة الجنوبية المركزية، الصين. يجب أن تلبس قبعة رأس وقفازات للإجراءات التجريبية بأكملها لتفادي التلوث الكيراتين من الجلد والشعر8.

1-إعداد العينات

  1. جمع السلطة الفلسطينية الأنسجة (0.2-0.5 ملغ) من قسم الجراحة العصبية. تجميد فورا في النتروجين السائل، ومن ثم نقل إلى-80 درجة مئوية لتخزين.
  2. إضافة 2 مل من 0.9% كلوريد الصوديوم في المياه المقطرة (ddH2س). استخدام هذا الحل لخفة غسل الدم من سطح النسيج (3 x).
    ملاحظة: ddH2س مع موصلية 18.2 MΩ/سم تستخدم في جميع أنحاء البروتوكول. يتم فقدان بعض تيسويمايت عند غسل قبالة الدم من الأنسجة سطح الأرض.
  3. إضافة وحدة تخزين (10 مل؛ 4 درجة مئوية) من الحل الذي يحتوي على حمض الخليك م 2 و 0.1% (v/v) β-ميركابتوثانول لكل 0.5-0.6 غرام أنسجة، ومجانسة (1 دقيقة، 13,000 في الدقيقة، 4 درجة مئوية، 10 x) مع الخالطون أنسجة، sonicate هوموجيناتي ل 20 ق، ليوفيليزي ، وتخزينها في −80 درجة مئوية.
  4. قياس محتوى البروتين المجففة بالتبريد، والاعتداء مجموعة من عينات المتجانس باستخدام حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي).
    ملاحظة: اتفاق التعاون الأساسي الكمي ليس القياس الكمي مطلق، وسوف تتغير النتيجة المقاسة مع فني مختلف وعامل تجريبي. وينبغي استخدام معيار نموذج تركيز ثابت لتجارب مختلفة. ولذلك، سيتم تحديد المبلغ النهائي تحميل من البروتينات لكل جل 2D مع صورة قرار حسن الملطخة بالفضة أو أخذ الملون في التجارب المصممة مسبقاً.
    1. إضافة حوالي 300 ميكروغرام من العينة المتجانس المجففة بالتبريد إلى مجلد واحد (282 ميليلتر) لاستخراج البروتين المخزن المؤقت (م 8 اليوريا والفصول 4 في المائة)، تليها الدائمة ح 2، سونيكاتينج في حمام مائي لمدة 5 دقائق، بالتناوب ح 1، سونيكاتينج مرة أخرى في حمام الماء لمدة 5 دقائق ، مرة أخرى بالتناوب ح 1، وسينتريفوجينج في 15,000 س ز لمدة 20 دقيقة.
    2. إعداد الحلول القياسية جيش صرب البوسنة مع تركيزات كما ذكر: 0، 25، 125، 250، 500، 750، 1,500، 2,000 ميكروغرام/مل مع معيار قانون سرية المصارف التجارية (2 مغ/مل).
    3. كاشف "مزيج اتفاق التعاون الأساسي" A و B (A:B = 50: 1) كاتفاق التعاون الأساسي العامل الحل قبل استخدامها.
    4. إضافة 0.1 مل من العينة أو الحل القياسية لمل 2 من اتفاق التعاون الأساسي العامل الحل في [ميكروفوج] أنابيب، متبوعاً بالاختلاط وتفرخ ثم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أخيرا تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وقياس A562 نانومتر قيمة نقلت.
    5. حساب خط الخطي القياسية (A562 نانومتر مقابل تركيز جيش صرب البوسنة) الحصول معادلة انحدار لحساب البروتين عينة المحتوى مع قيمة562nm .
  5. استخدام 150 ميكروغرام من البروتين يعادل العينة المجففة بالتبريد للفضة تلطيخ أو 500 ميكروغرام من البروتين لأخذ تلطيخ، لدرجة حموضة pH المعطل تداولها 18 سم قطاع (IPG) تدرج 3-10 غير الخطية (NL).
    ملاحظة: قطاع IPG الجافة 0.5 مم سميكة و 3 ملم على نطاق، مع أطوال مختلفة بما في ذلك 7، 11، 13، 18، و 24 سم ونطاقات pH المختلفة بما في ذلك درجة الحموضة 4-5، 4-7 و 6-9 و 3-10 أما تدرج درجة حموضة الخطية أو غير الخطية. يجب احتواء المخزن المؤقت المستخدم IPG27،قطاع28.
  6. 1.6.Add 250 ميليلتر لاستخراج المخزن المؤقت (م 7 اليوريا، وال م 2، 4% (w/v) الفصول، 100 مم DTT (إضافة قبل الاستخدام)، 0.5% v/v فارماليتي (إضافة قبل الاستخدام)، وتعقب بروموفينول الأزرق).
  7. يبقى الحل أقل من 30 درجة مئوية، تليها فورتيكسينج لمدة 5 دقائق، سونيكاتينج لمدة 5 دقائق، والتناوب لمدة 50 دقيقة.
  8. إضافة 110 ميليلتر الإماهة المخزن المؤقت (م 7 اليوريا، وال م 2، 4% (w/v) الفصول، 60 ملم DTT (إضافة قبل الاستخدام)، 0.5% v/v IPG المخزن المؤقت (إضافة قبل الاستخدام)، وتعقب بروموفينول الأزرق). Sonicate لمدة 5 دقائق. ثم قم بتدوير العينة لمدة 50 دقيقة، ودوامه لمدة 5 دقائق، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 15,000 س ز.
  9. جمع المادة طافية (350 ميليلتر) ك حل عينة البروتين8.

2-ثنائي الأبعاد جل التفريد

  1. الضمنية (البعد الأول): تنفيذ الضمنية على نظام التركيز isoelectric كما هو موضح أدناه.
    1. إضافة 350 ميليلتر من الحل عينة البروتين في فتحه صاحب قطاع IPG 18 سم.
    2. وضعت 18 سم IPG قطاع جل جانب-لأسفل على الحل عينة البروتين (تجنب فقاعات).
    3. إضافة 3-4 مل الزيوت المعدنية لتغطية قطاع IPG.
    4. تجميع حامل قطاع IPG في سيستيمويث التركيز isoelectric نهاية مدببة على اللوحة الخلفية (+) ونهاية مربعة على اللوح الأمامي (−).
    5. ترطيب بين عشية وضحاها (ح ~ 18 في درجة حرارة الغرفة).
    6. تعيين معلمات الضمنية: الحد الأقصى الحالي 30 µA كل قطاع، 20 درجة مئوية؛ 250 الخامس، ح 1، 125 Vh، وخطوة والاحتجاز؛ 1,000 الخامس، ح 1، 500 Vh، التدرج؛ 8,000 V, 1 ح، 4,000 Vh، التدرج؛ 8,000 الخامس، ح 4، 32,000 Vh، وخطوة والاحتجاز؛ و 500 الخامس، ح 0.5، 250 Vh، والخطوة وعقد. فلتشغيل إلى إجمالي وقت ح 7.5 و 36,875 Vh.
    7. بعد الانبعاث، تأخذ بها كل قطاع IPG وإزالة الزيوت المعدنية الإضافية مع منشفة ورقية غير قابلة للذوبان. الآن التفاف القطاع في ورقة من البلاستيك، وتخزينها في −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تنظيف مع صاحب إيبجستريب تنظيف الحل حامل إيبجستريب وماء مقطر.
  2. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (البعد الثاني): أداء الحزب الديمقراطي الصربي صفحة في "نظام التفريد الخلية عمودياً"
    ملاحظة: يجب أن يكون كل حجم جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 255 × 190 × 1 مم.
    1. استخدام الناعم جل متعددة لتحويل 12% الصفحة حل المواد الهلامية. لصب 12% والهلام الصفحة، قم بالخطوات التالية.
      1. إضافة مل 270 من ddH2س، 150 مل 1.5 مل 180 من 40% (w/v) الاكريلاميد/بيساكريلاميدي الأسهم الحل م تريس-HCl (pH 8.8)، (فيها، 40% w/v الاكريلاميد و 1.38% w/v N، N '-ميثيلينيبيساكريلاميدي)، 3 مل من فوق كبريتات الأمونيوم 10%، و 150 ميليلتر من تيميد جعل الهلام الحل في كوب. المزيج بلطف وتجنب الفقاعات.
      2. صب جل الحل برفق في قاعة الإرسال المتعدد حتى ارتفاع جل المتوقعة (19 سم).
      3. فور إضافة حوالي 3 مل ddH2س على كل جل حل لتغطية المواد الهلامية. السماح للهلام بلمرة لحوالي 1 ساعة.
    2. إعداد ل 20 من المخزن المؤقت التفريد (25 مم تريس، الغليسيرين 192 مم، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1%). ملء الخزان المخزن المؤقت وحدة الفصل الكهربي مع هذا المخزن المؤقت.
    3. إخراج شرائط IPG مركزة من الثلاجة، وحجته الشرائط لمدة 10 دقائق من الهز برفق في 4 مل من تقليل المخزن المؤقت للتوازن (375 مم تريس-HCl (pH 8.8)، اليوريا م 6، 2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، الجلسرين 20% (v/v)، 2% w/v DTT (إضافة قبل الاستخدام) ، وتعقب بروموفينول الأزرق).
    4. حجته لمدة 10 دقائق بلطف هزاز شرائط IPG انخفاض في المخزن المؤقت للتوازن الألكلة مل 4 (375 مم تريس-HCl (pH 8.8)، اليوريا م 6، 2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، الجلسرين 20% (v/v)، إيودواسيتاميدي 2.5% w/v (إضافة قبل الاستخدام)، وتعقب بروموفينول الأزرق).
    5. خلال التوازن هلام، تفكيك قاعة الإرسال المتعدد، وتأخذ بها كاسيت جل حل استعداد. شطف x 3 مع ddH2إزالة O. ddH الزائدة2س مع منشفة ورقية غير قابلة للذوبان، ووضع ستاندير هلام.
    6. شطف شرائط IPG متوازن مع المخزن المؤقت للتفريد، وإزالة السائل الزائد على سطح قطاع IPG بمنشفة ورقية غير قابلة للذوبان.
    7. وضع قطاع IPG على حل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام، وترك الجانب البلاستيك في قطاع IPG الاتصال بلوحة الزجاج أطول ونهاية أشار إلى اليسار.
    8. صب 3-4 مل من الساخنة 1% [اغروس] في الحزب الديمقراطي الصربي التفريد المخزن المؤقت (~ 80 درجة مئوية) بسرعة لختم قطاع IPG على رأس كل جل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ووضعت على الجانب العلوي من قطاع IPG وصولاً إلى الجزء العلوي من لوحة زجاج أقصر دون فقاعات ثم بلمرة لمدة 10 دقائق.
    9. إدراج كاسيت جل تجميعها رأسياً بين الحشايا البلاستيكية في النظام الكهربائي العمودي. وضع الجزء العلوي من الجل مع قطاع IPG بجوار الكاثود (−).
    10. ضبط مستوى المخزن المؤقت التفريد أن تزج في الكاسيت هلام.
    11. الاتصال وتعيين "وحدة" الإمداد/مراقبة السلطة في وضع الجهد المستمر، وتشغيل 200 الخامس لحوالي 370 دقيقة بينما رصد الصبغة.
    12. بعد تشغيل، تأخذ بها كاسيت جل من نظام التفريد، وإزالة الجل بلطف من الكاسيت هلام، تجنب تمزق الهلام، متبوعاً تلطيخ 2DE فصل البروتينات.
  3. تلوين فصل 2DE البروتينات
    1. تلوين الفضة
      1. نقل بلطف الهلام مع اثنين من الأيدي في علبة تحتوي على 250 مل من محلول التثبيت (الميثانول 50% (v/v) وحامض الخليك 5% (v/v))، وتهز برفق للهلام لمدة 20 دقيقة.
      2. تجاهل الحل وإضافة 250 مل ميثانول 50% (v/v) في العلبة وهزه برفق لمدة 10 دقائق.
      3. تجاهل الميثانول وإضافة 250 مل من ddH2س في الدرج. تهز بلطف لمدة 10 دقائق.
      4. بلطف يهز هلام لمدة 1 دقيقة في 250 مل من المخزن المؤقت للتوعية تتضمن ثيوكبريتات الصوديوم 0.02% (w/v)، وتجاهل السائل.
      5. بلطف يهز الهلام في 250 مل من ddH2س لمدة 1 دقيقة (كرر مرة أخرى). تجاهل السائل بعد كل خطوة.
      6. بلطف يهز هلام لمدة 20 دقيقة في حل رد فعل الفضي 250 مل (نترات الفضة 0.1% (w/v) مع 200 ميليلتر 37% (v/v) فورمالدهايد أضيف قبل الاستخدام).
      7. بلطف يهز الهلام في 250 مل من ddH2س لمدة 1 دقيقة (كرر مرة أخرى). تجاهل السائل بعد كل خطوة.
      8. اهتزاز هلام برفق في حل تطوير 250 مل (يضاف كربونات الصوديوم 3% (w/v) مع 100 ميليلتر 37% (v/v) فورمالدهايد قبل الاستخدام) حتى يتم الحصول على كثافة المرجوة لتلطيخ (عادة من 1-3 دقيقة)، ثم تجاهل السائل.
      9. بلطف يهز هلام لمدة 10 دقائق في 250 مل وقف الحل (حامض الخليك 5% (v/v)) وتجاهل السائل.
      10. بلطف يهز لمدة 5 دقائق في 250 مل من ddH2س وتجاهل السائل.
      11. ضع الجل في 250 مل تخزين حل والغليسيرول 8.8 في المائة عند 4 درجة مئوية.
    2. أخذ صبغة زرقاء رائعة
      1. إعداد أخذ تلطيخ الحل بتذويب أخذ الرائعة الأزرق G250 ز 0.3 وسلفات الأمونيوم ز 25، وحامض الفوسفوريك 25 مل في ddH2س ويصل إلى إجمالي حجم 200 مل. قبل الشروع في الاستخدام، إضافة الميثانول 50 مل.
      2. إضافة 250 مل أخذ تلطيخ حل للجل وهزه برفق في درجة حرارة الغرفة حتى واضحة تظهر بقع البروتين (~ 2-4 ح). تجاهل السائل.
      3. إضافة 250 مل من ddH2س ويهز ببطء لمدة 5 دقائق، ثم مرتين أكثر. تجاهل السائل.
      4. إضافة 250 مل من محلول ديستينينج (20% (v/v) الإيثانول) واهتز ببطء حتى يصبح عديم اللون تقريبا لون الخلفية، وتجاهل السائل.
      5. استبدال مع الحل ديستينينج جديدة عند القديم واحد هو الحصول على الظلام، وتجاهل السائل.
      6. إضافة 250 مل من ddH2س ويهز ببطء للحد الأدنى 5 تجاهل السائل.
      7. إضافة 250 مل من تخزين الحل (والغليسيرول 8.8 في المائة)، والحفاظ على 4 درجة مئوية.
  4. تحليل الصور التفريد هلام ثنائي الأبعاد
    1. رقمنة الهلام الملون مع الماسح ضوئي مسطح.
    2. إدخال الصورة في نظام تحليل الصور جل 2D.
    3. كشف وتحديد كل بقعة استخدام برمجيات تحليل صورة 2D جل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    4. تتطابق مع البقع بين مختلف المواد الهلامية.

3-تحديد البروتينات المفصولة 2DE مع مرض التصلب العصبي المتعدد

  1. إعداد مزيج الببتيد تريبتيك
    ملاحظة: ينبغي استخدام أنابيب سيليكونيزيد أو الاحتفاظ بها منخفضة وماصة نصائح لتجنب أي خسارة في البروتينات أو الببتيدات.
    1. فضة-هلام ديستينينج
      1. المكوس هلام البقع إلى 1.5 مل siliconized الأنبوبة، وتغسل في 500 ميليلتر ddH2س 6 مرات.
      2. وضع هلام غسلها في أنبوب 1.5 مل سيليكونيزيد جديدة، وتخطر عليه إلى العديد من القطع الصغيرة (0.5-1 ملم3).
      3. ديستين قطعة جل في 20 ميليلتر من الحل ديستينينج الذي يمزج جزء من سيانيد البوتاسيوم 30 ملم وجزء من ثيوكبريتات الصوديوم 100 ملم (1:1) قبل استخدامها للسماح للون البنى تختفي (عادة 1-2 دقيقة). تجاهل السائل.
      4. تغسل القطع هلام مع 20 ميليلتر من ddH2س 5-6 مرات للسماح اللون الأصفر تختفي. تجاهل السائل بعد كل خطوة.
      5. إضافة 20 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 200 ملم إلى القطع هلام، والبقاء ليغسل 20 دقيقة جل القطع مع ddH2س (20 ميليلتر، 1 مرة). تجاهل السائل.
      6. يذوي القطع هلام مع 30 ميليلتر الاسيتو الانيتريل مرتين على الأقل للسماح للقطع جل تتحول أبيض معتم، والفراغ-أجهزة الطرد المركزي الجافة لمدة 30 دقيقة.
    2. أخذ جل الأزرق الرائعة ديستينينج
      1. قص البقع جل في أنبوب 1.5 مل سيليكونيزيد وتغسل مع 500 ميليلتر ddH2س 3 مرات على الأقل.
      2. وضع هلام غسلها في أنبوب siliconized 1.5 مل جديدة، وتخطر عليه إلى عدة قطع (0.5-1 ملم3) مع تلميح ماصة.
      3. ديستين الهلام في 50-100 ميليلتر ديستينينج الحل (1:1 v/v ميكس 200 ملم NH4HCO3 مع الاسيتو الانيتريل) تبعاً لحجم هلام، واحتضان في 37 درجة مئوية في حمام مائي. كرر وإضافة حل ديستاينينج جديدة حتى يختفي اللون (~ 1 ح). تجاهل السائل بعد كل خطوة.
      4. تغسل القطع جل مرة واحدة مع 20 ميليلتر ddH2o.
      5. يذوي القطع جل في 100 ميليلتر الاسيتو الانيتريل (مرتين على الأقل) للسماح للقطع جل تحويل معتم الأبيض.
      6. الفراغ الجافة لمدة 30 دقيقة.
    3. في جل التربسين هضم البروتينات في القطع هلام المجففة
      1. حل 20 ميكروغرام (833 pmol) من مسحوق التربسين المجففة بالتبريد في 100 ميليلتر من حمض الخليك 50 مم.
      2. تمييع 20 ميليلتر لحل التربسين (200 نانوغرام/ميليلتر) إلى 16 نانوغرام/ميليلتر مع ميليلتر 230 من بيكربونات الأمونيوم 50 مم.
      3. إضافة 20-30 ميليلتر (0.32 0.48 ميكروغرام) من الحل التربسين المخفف لكل أنبوبة تحتوي على قطع هلام المجففة. احتضانها ح 18-20 في 37 درجة مئوية في حمام الماء. واسمحوا أن الحل الوقوف عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      4. الطرد المركزي في الحل برفق سنكيت س. 10 في حمام مائي لمدة 5-6 دقائق عند 30 درجة مئوية وثم الطرد المركزي في 12,000 س ز 2 دقيقة.
      5. جمع المادة طافية يحتوي على خليط الببتيد تريبتيك إلى أنبوب siliconized 0.5 مل.
    4. تنقية خليط الببتيد تريبتيك مع C18 microcolumn.
      1. تغسل كل عمود C18 مع الاسيتو الانيتريل (10 ميليلتر، 5 مرات)، ومن ثم مع 50% الاسيتو الانيتريل (10 ميليلتر، 5 مرات).
      2. حجته مع حمض الخليك تريفلورو 0.1% (تفا) (10 ميليلتر، 5 مرات).
      3. "الماصة؛" العينة صعودا ونزولاً عن طريق عمود C18 مستعدة ل 15 مرة.
      4. تغسل العينة 2 x 10 ميليلتر 0.1% تفا.
        ملاحظة: يتم الاحتفاظ الببتيدات تريبتيك المنقاة في عمود C18.
      5. إضافة وحدة تخزين (6 ميليلتر) الحل (85% v/v acetonitrile/0.1% حمض الفورميك v/v) في أنبوب نظيف 0.5 مل سيليكونيزيد، "الماصة؛" هذا الحل بلطف وبطء صعودا وهبوطاً من خلال الخرز الببتيد-C18 ل x 10 ليغسل الببتيدات السندات إلى الحل، أيردري ، ومخزن (−20 درجة مئوية) لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد.
  2. تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد
    1. تحليل استخدام--مايكروسوفت "تحلان"
      1. إضافة 4 ميليلتر من 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v تفا لإذابة الخليط الببتيد تريبتيك المنقي. تحميل 2 ميليلتر حله الببتيد تريبتيك الخليط على صفيحة استخدام وعلى الفور إضافة 2 ميليلتر من حل حمض а-سينو-4-هيدروكسيسيناميك (شكا) يحتوي على 10 جرام/لتر في الاسيتو الانيتريل 500 مل/لتر 1 مل/لتر تفا، ثم أيردري.
      2. تحميل لوحة استخدام خليط الببتيد تريبتيك مع مطياف شامل استخدام MS.
        ملاحظة: يتم تعيين المعلمات الصك كوضع عاكس مع 20 كيلوفولت التعجيل بالجهد والأقطاب الإيجابية وتأخير ns 160 استخراج الوقت. وتكتسب كل طيف مرض التصلب العصبي المتعدد مع 200 طلقات الليزر مع طائفة من m/z 1,000 إلى 4,000 بعد المعايرة الخارجية مع الببتيد القياسية الجماهيري.
      3. استخدام برمجيات طيف-معالجة مرض التصلب العصبي المتعدد لمعالجة كل طيف مرض التصلب العصبي المتعدد، بما في ذلك تصحيح خط الأساس، وإزالة الضوضاء (5%)، وذروة ديسوتوبينج.
      4. تصحيح قائمة أسلحة من كل طيف مرض التصلب العصبي المتعدد مع إزالة تلويث الجماهير من التربسين ومصفوفة وكراتين والملوثات الأخرى غير معروف بالتوازي مع التجارب جل فارغة.
      5. إدخال قائمة الشامل المصوبة إلى بروتين على أساس تحلان البحث عن برنامج لتحديد البروتينات في قاعدة البروتين بروت السويسرية مع معلمات البحث التالية، بما في ذلك نوع البحث تحلان، البشرية، التربسين مع 1 كحد أقصى وغاب الانقسام، وثابت سيستين كارباميدوميثيل، الميثيونين متغير الأكسدة، مونويسوتوبيك، الببتيد التسامح الشامل 50 جزء من المليون، تهمة الببتيد الدولة (1 +)، وإشارة إلى الضوضاء (S/N) 5.0.
      6. تحديد البروتينات مع عشرات البروتين يعتد به إحصائيا، وفيها نقاط البروتين =-10 × log(p), حيث p هو احتمال أن المباراة الملاحظ حدث عشوائي.
    2. تحليل استخدام-MS/MS
      1. إضافة 4 ميليلتر من 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v تفا لإذابة الخليط الببتيد تريبتيك المنقي. رصدت على استخدام 384-جيدا-طبق كل خليط الببتيد تريبتيك المنقي (0.5 ميليلتر)، رصدت فورا 0.5 ميليلتر من مصفوفة شكا المشبعة بنسبة 50% acetonitrile/0.1% تفا على رأس العينة الببتيد، وثم تجفف في الهواء.
      2. اسمحوا MS/MS استخدام-TOF-TOF يمكن إدارتها تلقائياً، استخدام طلقات الليزر 100 للحصول على واحد MS1 الطيف، و 6 تراكم تكرار MS1 الأطياف إلى واحد من الطيف MS1 الاصطناعية.
      3. تعيين 4 السلائف أكثر كثافة الأيونات من كل الطيف MS1 الاصطناعية لتحليل MS/MS. تكرار استخدام الليزر 100 طلقة لكل أيون السلائف اكتساب أحد MS/MS الطيف، وتتراكم 4 MS/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف إلى واحد من الطيف MS/MS الاصطناعية.
      4. استخدام البيانات MS/MS الاصطناعية للبحث عن البروتينات عن طريق بروتين MS/MS-تعتمد البحث عن البرامج مع المعلمات بما في ذلك "البحث عن أيون" MS/MS، قاعدة بشرية بروت السويسرية، التربسين بحد أقصى 1 الانقسام وغاب، كارباميدوميثيل الثابتة (ج)، ومتغير أكسدة (M)، وقيمة جماعية مونويسوتوبيك، الببتيد التسامح الشامل ± 100 جزء من المليون، وبلغة التسامح ± 0.7 الشامل دا.
      5. تحديد بروتين مع احتمال معتدا به إحصائيا استناداً إلى نقاط موس، ونقاط الأيونات =-10 × Log(P), حيث p هو احتمال أن المباراة الملاحظ حدث عشوائي.
    3. تحليل LC-ESI-MS/MS
      1. إضافة ميليلتر 6 من 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v حمض الفورميك لإذابة الخليط الببتيد تريبتيك المنقي.
      2. استخدام نظام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) مقرونا تاين اليكتروسبراي (ESI) على الإنترنت--كتلة MS/MS مطياف مع برنامج إدارة الحصول على بيانات MS/MS لإدارة العملية برمتها.
      3. استخدام عمود C18 فخ (300 ميكرون الهوية × 5 مم الطول)، وعكس المرحلة C18 عمود (معرف x 15 سم طول 75 ميكرون) مع تدرج انفصال في المذيبات 98 ٪ (0.1% حمض الفورميك) والمذيبات 2% ب (0.1% حمض الفورميك في الاسيتو الانيتريل 100 ٪) لمدة 2 دقيقة ، 2 إلى 40 ٪ مذيب ب 45 دقيقة، والمذيبات ب من 40% إلى 95% لمدة 5 دقائق ومذيب 95% ب 10 دقيقة (ما مجموعة 65 دقيقة في 300 nL/دقيقة).
      4. تعيين وضع أيون إيجابية ووضع البيانات تعتمد على المسح التلقائي لاكتساب مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف، وتعيين التفكك الناجمة عن تصادم (CID) لتجزئة أيون.
      5. تعيين كل عملية مسح مرض التصلب العصبي المتعدد إلى مجموعة كتلة من m/z 350-1,800 مع قرار 100000 في m/z 400. إجراء الفحص للايونات معظم مكثفة 7 في مسح مرض التصلب العصبي المتعدد.
      6. البروتين استخدام MS/MS-على أساس البحث عن البرنامج الأول للبحث في قاعدة البيانات للتعرف على البروتينات.
        1. حدد قاعدة بيانات البروتين البشري.
        2. حدد التربسين مع واحد يسمح للانقسام وغاب عن الموقع.
        3. مجموعة الببتيد التسامح (± 10 جزء في المليون)، تفتيت أيون التسامح (±0.8 Da)، الببتيد كارباميدوميثيليشن المسؤول (2 + و 3 + و 4 +)، ثابتة في سيستين، والأكسدة متغير في الميثيونين.
        4. تعيين معدلات اكتشاف كاذبة (FDR) < 1%، وفقط من الببتيدات مع رتبة 1 مقبولة.
        5. تحديد البروتين مع PSM≥1 (النظام: العدد الإجمالي لتسلسل الببتيد التي تم تحديدها (النظام) للبروتين، بما في ذلك تلك المحددة redundantly) واثنين على الأقل من الببتيدات فريدة من نوعها للبروتين.
      7. أيضا، استخدام MS/MS-أساس البروتين برمجيات البحث الثاني للبحث في قاعدة البيانات للتعرف على البروتينات.
        1. تحويل ملف MS الخام إلى ملف.mgf.
        2. تحديد قاعدة بيانات البروتين البشري (uniprothuman_20161031.fasta التي تحتوي على تسلسلات 70940 وبقايا 23897047).
        3. حدد الهضم التربسين بحد أقصى 2 الانشقاقات الضائعة.
        4. تعيين ثابت كارباميدوميثيل (ج)، ديميداتيد متغير (NQ) وأكسدة (M)، السلائف أيون التسامح الشامل 10 أجزاء من المليون، ابنه أيون التسامح الشامل 0.8 دا، وذروة مونويسوتوبيك.
        5. تحديد البروتينات مع عتبة أهمية 0.05 و 2 على الأقل من الببتيدات فريدة من نوعها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. 2DE--استخدام MS تحلان: مع الإجراء التجريبي المبين أعلاه، تم استخراج ما مجموعة 150 ميكروغرام البروتينات من الأنسجة NFPA FSH-أعرب عن (أنثى، 50 عاماً، ACTH (-)، وهرمون النمو (-)، PRL (-)، وناحية اليسار (-)، FSH (+)، والهرمون (-)) وصفت مع 18 سم قطاع IPG (NL الأس الهيدروجيني 3-10) وهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تنسيق كبير، ثم تصور مع تلطيخ الفضة. حصلنا على نمط هلام 2DE الجيدة واستنساخه من NFPA أنسجة البروتين (الشكل 1)، مع متوسط انحراف موضعية من 1.98 ± 0.75 ملم باتجاه الانبعاث و ± 1.62 مم 0.68 في اتجاه صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ومع بقع بروتين حوالي 1,200 الكشف عن خريطة هلام 2DE التي وزعت أساسا داخل المنطقة للأس الهيدروجيني 4-8 و 15-150 الشامل كاتشين3. في المجموع، اقتطعت 337 جل البقع وتعرض لجل ديستينينج، الهضم التربسين، وتنقية الببتيدات تريبتيك، وتحليل "تحلان" استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد. تم استخدام بيانات تحلان لهوية البروتين مع البحث عن التميمة ضد قاعدة بيانات البروتين البشري. تم تحديد ما مجموعة 192 البروتينات زائدة (تمثل البروتينات نونريدوندانت 107) من البقع جل 141 من أصل 337 جل تحليل البقع (141/337 = 42%)، وتم تحديد لا البروتين في البقع 196 (196/337 = 58%) (الجدول 1). تم تحديد تلك البقع 141، البروتين واحد فقط لكل بقعة في البقع 121، تم تحديد البروتينات 2 كل بقعة في البقع 12 (البقع 31 و 32، 33، 41، 42، 43، 44، 68، 75، 137، 148، و 224)، تم تحديد البروتينات 5 كل بقعة في البقع 3 (19 البقع ، 22 و 23)، وحددت 6 البروتينات كل بقعة في البقع 3 (البقع 24 و 91 و 93)، وتم تحديد البروتينات 7 كل بقعة في البقع 2 (البقع 72 و 92).

2. 2DE--استخدام MS/MS و 2DE--LC-MS/MS: باستخدام الإجراء التجريبي المبين أعلاه، قد صفت ما مجموعة 500 ميكروغرام من البروتين المستخرج من أنسجة NFPA الغازية (أنثى، عمره 22 عاماً، ACTH (-)، هرمون النمو (-)، PRL (++) و LH (-) و FSH (-)) مع (قطاع IPG 18 سم NL pH 3-10) وهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تنسيق كبير، ثم تصور مع أخذ الأزرق G250 تلطيخ. هذا تلطيخ أسفرت عن نمط جل 2DE استنساخه وعالية جودة من البروتين الأنسجة NFPA الغازية (الشكل 2)، مع متوسط انحراف موضعية ± 1.95 0.85 ملم باتجاه الانبعاث و 1.85 ± 0.79 ملم باتجاه صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ومع حوالي بروتين 1,100 سبوتسديتيكتيد في 2DE هلام الخريطة التي وزعت أساسا داخل نطاق pH 4-8 وكتلة 15-150 كاتشين29. 10 مواقع تم اختيارها عشوائياً والمسمى في الشكل 2 تم ديستينينج هلام قصت ويتعرضون ل، التربسين الهضم وتنقية الببتيدات تريبتيك، متبوعاً باستخدام--MS/MS وتحليلات LC-ESI-MS/MS. استخدم dataset MS/MS كل هوية البروتين مع البحث عن التميمة ضد قاعدة بيانات البروتين البشري. لجميع المواقع، قد حددت في متوسط 1 من البروتين لكل بقعة مع تحليل استخدام-TOF-TOF MS/MS، بينما العديد من البروتينات (متوسط بروتينات 63 في بقعة واحدة هلام متوسط 71 البروتينات في بركة بقع المتطابقة 2 ومتوسطة من البروتينات 118 في بركة بطاريتك 3 البقع جل هد) حددت في كل بقعة المقابلة مع تحليل LC-ESI-MS/MS (الجدول 2). وهنا أحد يجب أن أذكر أن نظام LC-ESI-MS/MS لديه حساسية أعلى بكثير، والقرار بالنسبة لنظام تحليل استخدام-MS/MS. هذه البيانات تبين بوضوح أن كل 2D هلام موضعي يحتوي على الكثير من البروتينات، وليس فقط واحد أو اثنين من البروتينات في البروتين أنسجة السرطان البشرية المعقدة.

Figure 1
الشكل 1 : فضة الملون النمط 2-دي من البروتين NFPA FSH-وأعرب تحليلها مع الأس الهيدروجيني إيبجستريب 3 - 10 تركيز جل NL و 12% من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البقع الحمراء-براون هي البروتينات الملطخة بالفضة، أورانج خلفية جل الملطخة بالفضة. تم تحليل البقع المسمى مع "تحلان" استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد. مستنسخة من وانغ X, et al. (2015) 3، بإذن من يقمن إيلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : أخذ الأزرق الملون النمط 2-دي من البروتين NFPA تحليلها مع الأس الهيدروجيني إيبجستريب 3- 10 تركيز جل NL و 12% من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. وجرى تحليل البقع المسمى مع استخدام-TOF-TOF MS/MS و LC-ESI-MS/MS. البقع 1 *، 2 *, 3 *، 5 *، و 16 * كانت مطابقة للبقع المقابلة 1، 2، 3، 5، و 16، وتجمع من المواد الهلامية المتطابقة 2. تعديل من زان X, et al. (2018) 29، بإذن من يقمن إيلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Table 1
الجدول 1: عدد من البروتينات التي تم تحديدها في كل 2DE هلام بقعة مع تحليل "تحلان" استخدام-TOF-MS.

Table 2
الجدول 2: العدد البروتينات التي تم تحديدها في كل بقعة هلام 2DE مع تحليل MS/MS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2DE، إلى جانب أساليب مرض التصلب العصبي المتعدد بما في ذلك تحلان 2DE MS و 2DE--MS/MS، وقد استخدمت بنجاح في برنامجنا الطويل الأجل--استخدام البروتينات لدراسة البشرية NFPA البروتين الاختلافات والتباينات الشبكة الجزيئية للكشف عن الآليات الجزيئية و اكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة نفباس. 2DE المستندة البروتيوميات مقارنة مع إمكانية تكرار نتائج جيدة تلعب دوراً هاما في تحديد هوية NFPA البروتين الاختلافات9،،من1011،،من1213، 19، و 2DE مقترنة بأسلوب جسم يوضح مميزاتها في الكشف عن تعديل بوستترانسلاشونال معين والمتغيرات بروتين معين، مثل الكشف عن تيروزين نترته16،17 , 18 وهرمون النمو المتغيرات14،15.

ومع ذلك، يعتبر 2DE مقترنة بأسلوب مرض التصلب العصبي المتعدد أسلوب العمالة الكثيفة مع صعوبات في التحليلات المتعلقة بوفرة منخفضة البروتينات والبروتينات مسعور والبروتينات الحمضية أو الأساسية للغاية والبروتينات جماعية عالية أو منخفضة للغاية2. على سبيل المثال، كتلة منخفضة جداً (< كاتشين 10) أو كتلة عالية (> كاتشين 150) البروتينات، والغاية الأساسية (pI > 7.5 أو 8) أو الحمضية (pI < 3.5 أو 4) البروتينات لا يتم بسهولة الكشف عن طريق 2DE مع 18 سم IPG الشريط من الأس الهيدروجيني 3-10 NL3. مع التطور السريع لأساليب خالية من جل الانفصال، بما فيها اللوني السائل ثنائي الأبعاد (2D-LC) مقترنة بوسم النظائر المستقرة مثل إيتراق والحديد في السنوات العشر الأخيرة23، يبدو أن دي 2 انسحبت تدريجيا من به مركز وسط في البروتيوميات البحوث في تحليل البروتين الأنسجة المعقدة لأنه 2D-LC مقترنة بوسم النظائر المستقرة وأساليب MS/MS فعالية التغلب على عيوب الأساليب المستندة إلى 2DE.

ووجدت الدراسات الأخيرة، مع استخدام الكتلي عالية الحساسية، مثل LC-ESI-MS/ماجستير (الحساسية في نطاق أمول 1-10) في تحديد البروتينات مفصولة 2DE، تم اكتشاف خصائص جديدة للأسلوب 2-دي التي تظهر أن 2D هلام موضعي يحتوي على العديد من البروتينات (الجدول 2). وهذا يتعارض مع المفهوم التقليدي للبروتينات واحد أو اثنين فقط من كل بقعة، كما يتضح من قاعدة 2DPAGE في العالم (بوابة العالم-2DPAGE: http://world-2dpage.expasy.org/portal). وهذا يبين بوضوح أن الإنتاجية من 2-دي في الهوية البروتينات في البروتين البشري معقدة أعلى بكثير من واحد يفترض مسبقاً، إلا وهي أن هناك فقط واحد إلى اثنين البروتينات في بقعة هلام 2D. ويوفر هذا تشينكو الوعد باستخدام 2DE في ميدان البروتيوميات. يمكن فصل واحد 2DE على مدى آلاف إلى عشرة آلاف البقع3،،من822 في تحليل البروتين البشري المعقدة، ومن ثم 2DE أسلوب انفصال أكثر تفصيلاً لتبسيط شكل أقصى الطابع المعقد للبروتين عينات قبل تحليل LC-MS/MS بالنسبة إلى النظام في 2D-ش أن ش أول ثلاثي الأبعاد يولد عادة كسور 18 إلى 30 قبل تحليل LC-MS/MS. ولذلك، يمكن استخدام 2DE في تركيبة مع حساسية عالية الطيف الكتلي لإنشاء الخريطة المرجعية معلومات هائلة للبروتين البشري المعقدة، خاصة بالنسبة لتلك المنخفضة أو منخفضة جداً وفرة البروتينات. وبالإضافة إلى ذلك، 2-دي في تركيبة مع النظائر المستقرة العلامات (مثل إيتراق، والحديد، وسيلك) وحساسية عالية الطيف الكتلي يمكن استخدامها لقياس الاختلافات البروتين على نطاق واسع بين مختلف الظروف. وعلاوة على ذلك، 2DE إلى جانب وسم النظائر المستقرة وحساسية عالية الطيف الكتلي ومزايا مطلقة في الكشف على نطاق واسع، والتقدير الكمي للمتغيرات البروتين والبروتين انتواع، بتمس البروتين وأنواع البروتين. وسيكون هذه المزايا 2DE أحياء في ميدان البروتيوميات.

وعلاوة على ذلك، والبروتوكولات الحالية لتحليل السلطة الفلسطينية البشرية أنسجة البروتين الموصوفة هنا تترجم بسهولة دراسة أخرى بروتيوميس الأمراض البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أنه لا يوجد أي تعارض في المصالح.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81572278 و 81272798 إلى XZ)، والمنح من الصين "863" خطة المشروع (رقم المنحة 2014AA020610-1 إلى XZ) وأموال مستشفى إكسيانجيا "المواهب مقدمة" (XZ)، وفي هونان مؤسسة العلوم الطبيعية المقاطعات في الصين (رقم المنحة 14JJ7008 إلى XZ). الكتاب أيضا تعترف بالمساهمة العلمية للدكتور دومينيك م. ديسيديريو في مركز العلوم الصحية في جامعة تينيسي. X.Z. باستمرار نمواً وتستخدم أساليب 2DE--مرض التصلب العصبي المتعدد لتحليل البروتين الورم الحميد في الغدة النخامية بدءاً من عام 2001 وتصور المفهوم للمخطوطة الحالية وكتب وتنقيح المخطوط، تنسيق العمل ذات الصلة وكان مسؤولاً عن الدعم المالي والعمل المناظرة. وشارك Y.L. في مراجعة المخطوطة. وأي إتش شاركت في مجموعة من المراجع، ومراجعة المخطوطة. ووافق جميع المؤلفين المخطوط النهائي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
  28. Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Tags

تركز أبحاث السرطان، العدد 134، التفريد هلام ثنائي الأبعاد، إيسويليكتريك، التفريد هلام الاكريلاميد، تلطيخ الفضة، أخذ تلطيخ، وتحليل الصور، هضميد بصمة الشامل (تحلان)، جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (MS/MS)، الغدة النخامية الورم الحميد، البروتين
هلام ثنائي الأبعاد التفريد مقترنة بأساليب الطيف الكتلي لتحليل البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y.… More

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome. J. Vis. Exp. (134), e56739, doi:10.3791/56739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter