Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

To-dimensionelle gelelektroforese kombineret med massespektrometri metoder til analyse af menneskelige hypofyseadenom væv proteom

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

Her præsenterer vi en to-dimensionel gelelektroforese (2DE) kombineret med massespektrometri (MS) til at adskille og identificere menneskelige hypofyseadenom væv proteomet, som præsenterer en god og reproducerbare 2DE mønster. Mange proteiner er observeret i hver 2DE plet når analysere komplekse kræft proteomet med brug af høj-følsomhed MS.

Abstract

Menneskelige hypofyseadenom (PA) er en fælles tumor, der opstår i den menneskelige hypofyse hypothalamus-hypofyse-målrettet orgel akse systemer, og kan klassificeres som enten klinisk funktionelle eller nonfunctional PA (FPA og NFPA). NFPA er vanskeligt for tidlig fase diagnose og terapi på grund af knap opløftende hormoner i blodet i forhold til FPA. Vores langsigtede mål er at bruge proteomics metoder til at opdage pålidelige biomarkører for afklaring af PA molekylære mekanismer og anerkendelse af effektiv diagnostiske, prognostiske markører og terapeutiske mål. Effektive to-dimensionelle gelelektroforese (2DE) kombineret med massespektrometri (MS) metoder blev præsenteret her for at analysere menneskelige PA proteomes, herunder forberedelse af prøver, 2D gelelektroforese, protein visualisering, billedanalyse, i-gel Trypsin fordøjelse, peptid masse fingeraftryk (PMF) og tandem masse massespektrometri (MS/MS). 2-dimensionelle gel elektroforese matrix assisted laser desorption/Ionisation massespektrometri PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-væskekromatografi (LC) MS/MS procedurer har været anvendt med succes i en analyse af NFPA proteomet. Med brug af et high-sensitivity massespektrometer, blev mange proteiner identificeret med 2DE-LC-MS/MS metoden i hver 2D gel spot i en analyse af komplekse PA væv til at maksimere dækningen af menneskelige PA proteomet.

Introduction

PA er en fælles tumor, der opstår i den menneskelige hypofyse hypothalamus-hypofyse-målrettet orgel akse systemer, som spiller en vigtig rolle i den menneskelige endokrine system. PA omfatter klinisk funktionelle og ikke-fungerende PAs (FPA og NFPA)1,2. NFPA er vanskeligt i tidlig fase diagnose og terapi på grund af kun lidt forhøjet hormonniveauer (f.eks., LH og FSH) i blodet i forhold til FPA, som har betydeligt øget niveauer af tilsvarende hormoner i blodet3,4 ,5. Afklaring af de molekylære mekanismer og opdagelsen af effektiv biomarkører har vigtige kliniske betydning i diagnose, behandling og prognose af NFPA. Vores langsigtede mål er at udvikle og bruge proteom metoder til at studere NFPA for opdagelsen af pålidelige biomarkører at præcisere sin molekylære mekanismer og genkende effektive terapeutiske mål samt diagnostiske og prognostiske markører. 2-DE kombineret med MS metoder har været flittigt brugt i vores langsigtet forskningsprogram vedrørende menneskelige PA proteomet1,2,6,7, herunder etablering af proteomet reference kort3,8, analyse af varierende udtrykt protein profiler9,10,11,12,13, hormon varianter14 ,15, posttranslationelle modifikationer såsom fosforylering14 og tyrosin nitrering16,17,18, proteom variation af invasive forhold til noninvasiv NFPAs19og proteom heterogenitet NFPA undertyper13, som førte til opdagelsen af flere vigtige pathway netværk (mitokondriel dysfunktion, celle cyklus dysregulering, oxidativ stress og MAPK signalering system abnormitet) der er ændret i NFPA13,19,20.

2DE adskiller proteiner ifølge deres isoelektriske punkt (pI) (isoelektrisk fokusering, IEF) og molekylvægt (via sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dette er en fælles og klassisk adskillelse teknik inden for proteomics, siden indførelsen af begreberne proteomet og proteomics i 199524. MS er den afgørende teknik for at finde ud af 2DE-adskilt proteiner, herunder PMF og MS/MS strategier identitet. Den meget hurtige udvikling af MS instrumenter, især i aspekter af påvisning følsomhed og opløsning, i kombination med forbedring af LC system, i høj grad forbedrer identiteten af lavt eller meget lavt overflod proteiner i en proteomet at maksimere den dækning af en proteomet. Det også udfordrer vores traditionelle begreber at kun én eller to proteiner er til stede i en 2D gel spot i en analyse af komplekse menneskelige væv proteomet og giver mulighed for at identificere flere proteiner i en 2D gel spot i en analyse af komplekse menneskelige væv proteom og maksimere dækningen af NFPA proteomet.

Her beskriver vi detaljerede protokoller af 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-LC-MS/MS, hvor held har været anvendt i analysen af menneskelige NFPA proteomet. Protokollerne, der omfatter forberedelse af prøver, først dimension (isoelektrisk fokusering, IEF), anden dimension (SDS-PAGE), visualisering af proteiner (sølv farvning og Coomassie blå farvning), image analyse af 2D gel, i-gel trypsin fordøjelse, rensning af tryptic peptider, PMF, MS/MS og database sviende3,8,25,26. Desuden, denne protokol nemt oversætter til analyse af andre humane væv proteomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne i den Xiangya Hospital medicinsk etik Udvalget af Central South University, Kina. Et hoved hætte og handsker skal bæres for at undgå keratin kontaminering fra huden og hår8hele eksperimentel procedure.

1. forberedelse af prøver

  1. Indsamle PA væv (0,2 - 0,5 mg) fra den neurokirurgiske afdeling. Straks fryse i flydende kvælstof, og derefter overføre til-80 ° C til opbevaring.
  2. Der tilsættes 2 mL 0,9% NaCl i ionbyttet destilleret vand (ddH2O). Brug denne løsning til let vask blod fra væv overflade (3 x).
    Bemærk: ddH2O med en ledningsevne på 18.2 MΩ/cm bruges overalt i protokollen. Nogle af tissuemight gå tabt, når du vasker væk blod fra en serviet overflade.
  3. Tilføj en diskenhed (10 mL; 4 ° C) af den løsning, der indeholder 2 M eddikesyre og 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol for hver 0,5 - 0,6 g væv, homogeniseres (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, 10 x) med en væv homogeniseringsapparat, der sonikeres et homogenatet for 20 s, lyophilize , og opbevares ved −80 ° C.
  4. Måle proteinindholdet i den frysetørrede, homogeniserede prøver ved hjælp af bicinchoninic syre (BCA) assay kit.
    Bemærk: BCA kvantificering er ikke en absolut kvantificering, og det målte resultatet vil blive ændret med en forskellige tekniker og den eksperimentelle agent. Bør anvendes en fast koncentration prøve standard for forskellige eksperimenter. Derfor, den endelige lastning proteiner for hver 2D gel vil fastsættes med sølv-farvet eller Coomassie farvede god opløsning billedet i de præ-designede eksperimenter.
    1. Tilføje omkring 300 µg af frysetørrede homogeniseret prøven til én diskenhed (282 µL) af udvinding af protein buffer (8 M urinstof og 4% CHAPS), efterfulgt af stående til 2 h, sonicating i et vandbad i 5 min, roterende for 1 h, sonicating igen i vandbad i 5 min , roterende igen for 1 h, og centrifugering ved 15.000 x g i 20 min.
    2. Forberede BSA standardopløsninger med koncentrationer som nævnt: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1.500, 2.000 µg/mL med den kommercielle BSA standard (2 mg/mL).
    3. Mix BCA reagens A og B (A:B = 50: 1) som BCA brugsopløsning før anvendelsen.
    4. Tilsættes 0,1 mL af prøven eller standardopløsningen 2 mL af BCA brugsopløsning i et mikrofuge rør, efterfulgt af blanding og derefter inkubation ved 37 ° C i 30 min. Endelig afkøles ved stuetemperatur i 10 min og foranstaltning A562 nm O.D. værdi.
    5. Beregner den lineære standardlinje (A562 nm vs. BSA koncentration) at opnå en regressionsligningen for beregning af stikprøve protein indhold med en562nm værdi.
  5. Bruge 150 µg af protein svarende frysetørrede prøven for sølvfarvning eller 500 µg protein til Coomassie farvning, for en 18-cm immobiliseret pH gradient (IPG) strip pH 3-10 ikke-lineære (NL).
    Bemærk: IPG tør strip er 0,5 mm tyk og 3 mm bred, med forskellige længder herunder 7, 11, 13, 18, 24 cm og forskellige pH spænder herunder pH 4-5, 4-7, 6-9 og 3-10 i enten en lineære eller ulineære pH gradient. IPG buffer anvendes skal passe strip27,28.
  6. 1.6.add 250 µL af udvinding buffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% (w/v) CHAPS, 100 mM DTT (tilføje inden brug), 0,5% v/v pharmalyte (tilføje inden brug), og et spor af bromophenol blå).
  7. Holde løsning under 30 ° C, efterfulgt af vortexing i 5 min, sonicating i 5 min, og roterende i 50 min.
  8. Tilføje 110 µL af rehydrering buffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% (w/v) CHAPS, 60 mM DTT (tilføje inden brug), 0,5% v/v IPG buffer (tilføje inden brug), og et spor af bromophenol blå). Læg instrumenterne i ultralydsbad i 5 min. Derefter rotere prøve for 50 min, vortex i 5 min, og der centrifugeres i 20 min. på 15.000 x g.
  9. Indsamle supernatanten (350 µL) som protein prøve løsning8.

2. to-dimensionelle gelelektroforese

  1. IEF (første dimension): udføre IEF på isoelektrisk fokusering systemet som beskrevet nedenfor.
    1. Tilføje 350 µL af prøveopløsningen protein i slot af en 18-cm IPG strip indehaveren.
    2. Sætte en IPG-strip 18 cm gel-side-down på protein prøveopløsningen (undgå bobler).
    3. Der tilsættes 3-4 mL af mineralsk olie til at dække IPG strip.
    4. Saml IPG strip indehaveren i den isoelektrisk fokusering systemwith den spidse ende på bagsiden (+) plade og firkantede ende på forsiden (−) plade.
    5. Rehydrere natten over (~ 18 h ved stuetemperatur).
    6. Angive parametrene IEF: maksimalt nuværende 30 µA pr strip, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, trin og hold; 1.000 V, 1 h, 500 Vh, gradient; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh, gradient; 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, trin og hold; og 500 V, 0,5 h, 250 Vh, trin og hold. Lad det køre op til en samlet tid på 7,5 h og 36,875 Vh.
    7. Efter IEF, tage ud hver IPG strimmel og fjerne den ekstra mineralsk olie med en uopløselig køkkenrulle. Nu wrap strimlen i et stykke plastic wrap, og opbevares ved −80 ° C.
      Bemærk: Indehaveren af IPGstrip skal rengøres med IPGstrip holder rengøring løsning og destilleret vand.
  2. SDS-PAGE (anden dimension): udføre SDS-PAGE i en lodret celle elektroforese System
    Bemærk: Hver SDS-PAGE gel størrelse bør være 255 x 190 x 1 mm.
    1. Bruge en multi gel caster til støbt 12% siden løse geler. Støbning 12% siden geler, skal du udføre følgende trin.
      1. Tilføje 270 mL af Hedeselskabet2O, 150 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL 40% (w/v) acrylamid/bisacrylamide stamopløsning (29: 1, 40% w/v acrylamid og 1.38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL 10% ammonium persulfat, og 150 µL af TEMED at gøre gel løsning i et bægerglas. Bland forsigtigt og undgå boblerne.
      2. Hæld gelopløsning forsigtigt ind i multicasting kammeret op til den forventede gel højde (19 cm).
      3. Straks tilføje omkring 3 mL ddH2O på hver løsning gel til at dække geler. Lad gel polymerisere for omkring 1 h.
    2. Forberede 20 L af elektroforese buffer (25 mM Tris, 192 mM glycerin og 0,1% SDS). Fyld elektroforese adskillelse enhed buffer tanken med denne buffer.
    3. Tegne de fokuserede IPG strimler fra fryseren, og Blandingen henstår strimler i 10 min ved rocking forsigtigt i 4 mL af at reducere ligevægt buffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urinstof, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol, 2% w/v DTT (tilføje inden brug) og et spor af bromophenol blå).
    4. Blandingen henstår i 10 min af blidt vuggende reduceret IPG strimler i 4 mL alkylering ligevægt buffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M urinstof, 2% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol, 2,5% w/v iodoacetamide (tilføje inden brug), og et spor af bromophenol blå).
    5. Under gel ligevægt, demontere multicasting kammeret og tegne den forberedte løsning gel kassette. Skyl 3 x med ddH2O. Fjern overskydende ddH2O med en uopløselig køkkenrulle, og læg i en gel stander.
    6. Skyl de afbalancerede IPG strimler med elektroforese buffer, og fjerne overskydende væske på IPG strip overflade med uopløselige papir håndklæde.
    7. Sætte en IPG strip på den løse SDS-PAGE gel, og lad IPG-striben plastik side kontakt længere glasplade og den spidse ende til venstre.
    8. Hæld 3-4 mL af hot 1% Agarosen i SDS elektroforese buffer (~ 80 ° C) hurtigt at forsegle IPG stribe på toppen af hver SDS-PAGE gel, og sætte top-siden af IPG striben ned til toppen af den kortere glasplade uden bobler, og derefter polymerisere i 10 min.
    9. Indsæt den forsamlede gel kassette lodret mellem plastik pakninger i lodret elektroforese system. Læg toppen af gel med IPG strimlen ud for katode (−).
    10. Justere niveauet af elektroforese buffer at fordybe gel kassette.
    11. Tilslut og Indstil magt levering/kontrol enhed i konstant spænding mode, og køre på 200 V for ca 370 min mens overvågningen farvestoffet.
    12. Efter at have kørt, tegne gel kassette fra elektroforese system, og fjern forsigtigt gel fra gel kassette, undgå rive gel, efterfulgt af farvning af 2DE-adskilt proteiner.
  3. Farvning af 2DE-adskilt proteiner
    1. Sølv farvning
      1. Forsigtigt overføre gel med to hænder i en bakke, der indeholder 250 mL af fiksering løsning (50% methanol (v/v) og 5% (v/v) eddikesyre), og Ryst forsigtigt gel i 20 min.
      2. Kassér løsningen og tilsættes 250 mL 50% (v/v) metanol i skuffen og Ryst forsigtigt i 10 min.
      3. Kassér methanol og tilsættes 250 mL af Hedeselskabet2O i skuffen. Ryst forsigtigt i 10 min.
      4. Forsigtigt ryste gel for 1 min i 250 mL af overfølsomhed buffer indeholdende 0,02% (w/v) natrium thiosulfate, og skille sig af med væsken.
      5. Ryst forsigtigt gel i 250 mL af Hedeselskabet2O for 1 min (gentage endnu en gang). Kassér flydende efter hvert trin.
      6. Ryst forsigtigt gel i 20 min. i 250 mL sølv reaktion løsning (0,1% (w/v) sølvnitrat med 200 µL 37% (v/v) formaldehyd tilføjet før brug).
      7. Ryst forsigtigt gel i 250 mL af Hedeselskabet2O for 1 min (gentage endnu en gang). Kassér flydende efter hvert trin.
      8. Ryste gel forsigtigt i 250 mL udvikling løsning (3% (w/v) natriumcarbonat med 100 µL 37% (v/v) formaldehyd tilføjet før brug) indtil den ønskede intensitet af farvning opnås (almindeligvis 1-3 min), derefter slette væsken.
      9. Forsigtigt ryste gel til 10 min i 250 mL stoppe løsning (5% (v/v) eddikesyre) og kassér væsken.
      10. Forsigtigt ryste i 5 min i 250 mL af Hedeselskabet2O og kassér væsken.
      11. Holde gel i 250 mL opbevaring opklaring 8,8% glycerol ved 4 ° C.
    2. Coomassie strålende blå farvning
      1. Forberede Coomassie farvning løsning ved at opløse Coomassie strålende blå G250 0,3 g, ammonium sulfat 25 g og fosforsyre 25 mL i ddH2O og op til et volumen på 200 mL. Før brug, tilføje methanol 50 mL.
      2. Der tilsættes 250 mL Coomassie farvning løsning gel og Ryst forsigtigt ved stuetemperatur indtil clear protein pletter (~ 2-4 h). Kassér flydende.
      3. Der tilsættes 250 mL af Hedeselskabet2O og ryste langsomt i 5 min., derefter to gange mere. Kassér flydende.
      4. Der tilsættes 250 mL affarvning løsning (20% (v/v) ethanol) og ryste langsomt indtil baggrundsfarven bliver næsten farveløs, og skille sig af med væsken.
      5. Erstatte med den friske destaining løsning, når gamle en bliver mørkt, og kassér væsken.
      6. Der tilsættes 250 mL af Hedeselskabet2O og ryste langsomt i 5 min. Fjern væsken.
      7. Der tilsættes 250 mL opbevaring opklaring (8,8% glycerol) og holde ved 4 ° C.
  4. To-dimensionelle gel elektroforese billedanalyse
    1. Digitalisere de farvede geler med en flatbed-scanner.
    2. Input billedet i 2D gel billede analysesystem.
    3. Påvise og bestemme hvert sted ved hjælp af en 2D gel billede analyse software efter producentens protokol.
    4. Matche steder mellem forskellige geler.

3. identifikation af 2DE-adskilt proteiner med MS

  1. Forberedelse af tryptic peptid blanding
    Bemærk: Silikoniseret eller lav-opbevaring rør og pipette tips skal bruges til at undgå tab af proteiner eller peptider.
    1. Sølv-gel affarvning
      1. Punktafgifter gel steder til en 1,5 mL Silikoniseret tube, og vask i 500 µL ddH2O 6 gange.
      2. Sætte den vasket gel ind i en ny 1,5 mL Silikoniseret rør, og hakke det i mange små stykker (0,5-1 mm3).
      3. Destain gel stykker i 20 µL af den destaining løsning, der blander en del af 30 mM kalium Ferricyanid og en del af 100 mM natrium thiosulfate (1:1) før brug for at lade den brunlige farve forsvinder (almindeligvis 1-2 min). Kassér flydende.
      4. Vaske gel stykker med 20 µL af Hedeselskabet2O 5 - 6 gange at lade den gule farve forsvinder. Kassér flydende efter hvert trin.
      5. Tilføj 20 µL af 200 mM ammoniumbicarbonat gel stykker, og bo for 20 min. Wash gel stykker med ddH2O (20 µL, 1 gang). Kassér flydende.
      6. Dehydrere gel stykkerne med 30 µL acetonitril mindst to gange for at lade gel stykker slå en uigennemsigtig hvid, og vakuum-centrifuge tør i 30 min.
    2. Coomassie strålende blå gel affarvning
      1. Skær gel steder i en 1,5 mL Silikoniseret tube og vask med 500 µL ddH2O mindst 3 gange.
      2. Sætte den vasket gel ind i en ny 1,5 mL Silikoniseret rør, og hakke det i flere stykker (0,5-1 mm3) med en pipette spids.
      3. Destain gel i 50-100 µL affarvning løsning (1:1 v/v mix 200 mM NH4HCO3 med acetonitril) afhængigt af gel volumen, inkuberes ved 37 ° C i et vandbad. Gentag og tilføje frisk affarvning løsning, indtil farven forsvinder (~ 1 h). Kassér flydende efter hvert trin.
      4. Vaske gel stykker en gang med 20 µL af Hedeselskabet2O.
      5. Dehydrere gel stykkerne i 100 µL acetonitril (mindst to gange) at lade gel stykker slå en uigennemsigtig hvid.
      6. Støvsuger tør i 30 min.
    3. I-gel trypsin fordøjelsen af proteiner i tørrede gel stykker
      1. Opløse 20 µg (833 pmol) af frysetørrede trypsin pulver i 100 µL af 50 mM eddikesyre.
      2. Fortyndes 20 µL af trypsin løsning (200 ng/µL) til 16 ng/µL med 230 µL af 50 mM ammoniumbicarbonat.
      3. Tilføje 20-30 µL (0,32 0,48 µg) af den fortyndede trypsin løsning til hvert rør, der indeholder tørret gel stykker. Der inkuberes i 18-20 h i et 37 ° C i vandbad. Lad opløsningen stå ved 4 ° C i 30 min.
      4. Centrifugeres løsningen blidt i 10 s. Sonicate i et vandbad i 5-6 min. ved 30 ° C og derefter centrifugeres ved 12.000 x g i 2 min.
      5. Indsamle supernatanten indeholdende tryptic peptid blandingen ind i en 0,5 mL Silikoniseret rør.
    4. Rensning af tryptic peptid blanding med C18 microcolumn.
      1. Vask hver C18 kolonne med acetonitril (10 µL, 5 gange), og derefter med 50% acetonitril (10 µL, 5 gange).
      2. Reagensglasset med 0,1% trifluor eddikesyre (TFA) (10 µL, 5 gange).
      3. Afpipetteres prøven op og ned gennem den forberedte C18 kolonne for 15 gange.
      4. Vaske prøve 2 x 10 µL 0,1% TFA.
        Bemærk: De renset tryptic peptider er bevaret i C18 kolonne.
      5. Tilføj en diskenhed (6 µL) opløsning (85% v/v acetonitrile/0.1% v/v myresyre) i en ren 0,5 mL Silikoniseret tube, afpipetteres denne løsning forsigtigt og langsomt op og ned gennem peptid-C18 perler til 10 x at vaske bond peptider oploesningen, lufttørre , og butikken (−20 ° C) for MS analyse.
  2. MS analyse
    1. MALDI-MS PMF analyse
      1. Tilføj 4 µL af 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA at opløse renset tryptic peptid blanding. Belastning 2 µL opløst tryptic peptid blandingen på en MALDI tallerken og straks tilføje 2 µL af а-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) løsning, der indeholder 10 g/L i 500 mL/L acetonitril 1 mL/L TFA, derefter lufttørre.
      2. Indlæse MALDI plade med tryptic peptid blandingen i en MALDI-MS massespektrometer.
        Bemærk: Parametrene instrument er angivet som reflektor mode med 20 kV accelererende spænding, positiv polaritet og 160 ns udvinding forsinkelsestiden. Hver MS spektrum er erhvervet med 200 laser skud med et udvalg af m/z 1.000 til 4.000 efter eksterne kalibrering med den standard peptid masse.
      3. Bruge en MS spektrum-forarbejdning software til at behandle hver MS spektrum, herunder baseline korrektion, støj fjernelse (5%) og peak deisotoping.
      4. Rette masse listen fra hver MS spektrum med fjernelse af kontaminerende masserne fra trypsin, matrix, keratiner og andre ukendte forureninger parallelt af Tom-gel eksperimenter.
      5. Inddata den korrigerede masse liste i en PMF-baseret protein søgning software til at identificere proteiner Swiss-Prot protein database med følgende søgeparametrene, herunder PMF søgetype, menneskelige, trypsin med 1 maksimale savnet kavalergang, fast carbamidomethyl cystein, variabel methionin oxidation, monoisotopic, peptid masse tolerance 50 ppm, peptid afgift tilstand (1 +), og et signal til støj (S/N) 5.0.
      6. Identificere proteiner med statistisk signifikant protein scoringer, og hvor protein score =-10 × log(p), hvor p er sandsynligheden for, at den observerede match er en tilfældig begivenhed.
    2. MALDI-MS/MS analyse
      1. Tilføj 4 µL af 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA at opløse renset tryptic peptid blanding. Hver renset tryptic peptid blanding (0,5 µL) blev spottet på en 384-godt MALDI-plade, straks spottet 0,5 µL af mættede CHCA matrix i 50% acetonitrile/0.1% TFA på toppen af peptid prøven og derefter tørret i fri luft.
      2. Lad MALDI-TOF-TOF MS/MS styres automatisk, ved hjælp af 100 laser skud til at erhverve en MS1 spektrum, og akkumulere 6 gentages MS1 spektre i et syntetisk MS1 spektrum.
      3. Sæt 4 mest intense forløber ioner fra hvert syntetiske MS1 spektrum for MS/MS analyse. Brug 100 laser skud for hver forløber ion at erhverve et MS/MS spektrum, og akkumuleres 4 gentages MS/MS-spektre i et syntetisk MS/MS spektrum.
      4. Bruge den syntetiske MS/MS data til at søge efter proteiner gennem en MS/MS-baseret protein søgning software med parametre, herunder MS/MS Ion søgning, Swiss-Prot menneskelige database, trypsin med maksimalt 1 ubesvarede kavalergang, faste carbamidomethyl (C), variable Oxidation (M), monoisotopic masse værdi, peptid masse tolerance ± 100 ppm og fragment masse tolerance ± 0,7 Da.
      5. Identificere et protein med en statistisk signifikant sandsynlighed baseret på Mowse score, og ioner score = -10 x Log(P), hvor p er sandsynligheden for, at den observerede match er en tilfældig begivenhed.
    3. LC-ESI-MS/MS analyse
      1. Tilføj 6 µL af 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v myresyre at opløse renset tryptic peptid blanding.
      2. Brug en high-performance væskekromatografi (HPLC) system kombineret online med en electrospray Ionisation (ESI)-MS/MS mass spectrometer med en MS/MS data-erhvervet management software til at styre hele operationen.
      3. Bruge C18 fælde kolonne (300 µm i.d. × 5 mm længde), og omvendt-fase C18 kolonne (75 µm i.d. x 15 cm længde) med en adskillelse gradient på 98% opløsningsmiddel (0,1% myresyre) og 2% opløsningsmiddel B (0,1% myresyre i 100% acetonitril) for 2 min , 2-40% væske B for 45 min, 40% til 95% væske B i 5 min, og 95% væske B i 10 min (65 min 300 nL/min. i alt).
      4. Angiv positive-ion mode og data-afhængige automatisk undersøgelse mode at erhverve MS og MS/MS-spektre, og sæt kollision-induceret dissociation (CID) for ion fragmentering.
      5. Angiv hver MS scanning til en massiv række m/z 350-1.800 med en opløsning på 100.000 på m/z 400. Udføre scanningen for de 7 mest intense ioner i MS-scanning.
      6. Brug MS/MS-baseret protein søgning software jeg at søge i databasen for identifikation af proteiner.
        1. Vælg den menneskelige protein database.
        2. Vælg trypsin med en forpasset kavalergang websted tilladt.
        3. Sæt peptid tolerance (±10 ppm), fragment ion tolerance (±0.8 Da), peptid afgift (2 + 3 + og 4 +), fast carbamidomethylation på cystein og variable oxidation på methionin.
        4. Tariffastsættelse falsk opdagelse (FDR) < 1%, og kun peptider med rank 1 accepteres.
        5. Identificere protein med PSM≥1 (PSMs: det samlede antal identificerede peptid sekvenser (PSMs) for protein, herunder redundant identificeret) og mindst to unikke peptider pr. protein.
      7. Også, bruge MS/MS-baseret protein søgning software II til at søge i databasen for identifikation af proteiner.
        1. Konvertere raw MS-fil til en .mgf fil.
        2. Valgt den menneskelige protein database (uniprothuman_20161031.fasta, som indeholder 70940 sekvenser og 23897047 restprodukter).
        3. Vælg trypsin fordøjelse med et maksimum på 2 ubesvarede splittelser.
        4. Sæt fast carbamidomethyl (C), variabel deamidated (NQ) og oxidation (M), forløber ion masse tolerance 10 ppm, datter ion masse tolerance 0,8 Da og monoisotopic peak.
        5. Identificere proteiner med en betydning tærskel på 0,05 og mindst 2 unikke peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. 2DE-MALDI MS PMF: med den eksperimentelle fremgangsmåden ovenfor, ialt 150 µg proteiner blev udvundet fra FSH-udtrykt NFPA væv (kvinde, 50 år gammel, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+), og TSH (-)) og klædt med en 18 cm IPG strip (pH 3-10 NL) og et stort format SDS-PAGE gel, derefter visualiseres med sølv farvning. Vi opnåede en reproducerbar og god 2DE gel mønster NFPA væv proteomet (figur 1), med en gennemsnitlig positionelle afvigelse på 1,98 ± 0,75 mm i retningen IEF og 1,62 ± 0,68 mm i retningen SDS-PAGE og med en cirka 1.200 protein steder opdaget i 2DE gel kortet, der blev primært fordelt inden for pH 4-8 og masse 15-150 kDa3. I alt, var 337 gel steder skåret ud og underkastes gel affarvning, trypsin fordøjelse, rensning af tryptic peptider og MALDI-TOF-MS PMF analyse. PMF data blev brugt til protein identitet med MASCOT søgning mod det menneskelige protein database. I alt 192 redundante proteiner (der repræsenterer 107 nonredundant proteiner) blev identificeret fra 141 gel steder ud af 337 analyseret gel steder (141/337 = 42%), og ingen protein blev identificeret i 196 steder (196/337 = 58%) (Tabel 1). For de 141 steder, kun én protein pr. spot blev identificeret i 121 steder, 2 proteiner pr. spot blev identificeret i 12 steder (steder 31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148 og 224), 5 proteiner pr. spot blev identificeret i 3 steder (steder 19 22 og 23), 6 proteiner pr. spot blev identificeret i 3 steder (steder 24, 91 og 93), og 7 proteiner pr. spot blev identificeret i 2 steder (steder 72 og 92).

2. 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-LC-MS/MS: bruger den eksperimenterende fremgangsmåden ovenfor, ialt 500 µg protein udvundet fra en invasiv NFPA væv (mand, 22 år gammel, ACTH (-), hGH (-), PRL (++), LH (-) og FSH (-)) var klædt med en 18 cm IPG strip ( pH 3-10 NL) og et stort format SDS-PAGE gel, derefter visualiseres med Coomassie blå G250 farvning. Denne farvning givet en reproducerbar og høj kvalitet 2DE gel mønster af invasive NFPA væv proteomet (figur 2), med en gennemsnitlig positionelle afvigelse på 1,95 ± 0.85 mm i retningen IEF og 1,85 ± 0,79 mm i retningen SDS-PAGE og med cirka 1.100 protein spotsdetected i 2DE gel kortet, der blev primært fordelt inden for rækkevidde af pH 4-8 og en masse 15-150 kDa29. De 10 steder udvalgt tilfældigt og mærket i figur 2 blev skåret og underkastes gel affarvning, trypsin fordøjelse, rensning af tryptic peptider, efterfulgt af MALDI-MS/MS og LC-ESI-MS/MS analyser. Hver MS/MS datasæt blev brugt til protein identitet med MASCOT søgning mod det menneskelige protein database. For alle steder, et gennemsnit på 1 protein pr. spot blev identificeret med MALDI-TOF-TOF MS/MS analyse, mens mange proteiner (et gennemsnit på 63 proteiner i en enkelt gel spot, et gennemsnit på 71 proteiner i en pulje af 2 matchede steder, og et gennemsnit på 118 proteiner i en pulje af 3 m hed gel steder) i hver tilsvarende stedet blev identificeret med LC-ESI-MS/MS analyse (tabel 2). Her skal man nævne, at LC-ESI-MS/MS systemet har en meget højere følsomhed og opløsning i forhold til MALDI-MS/MS analysesystem. Disse data viser klart, at hver 2D gel spot indeholder mange proteiner, ikke bare en eller to proteiner i komplekse menneskelige kræft væv proteomet.

Figure 1
Figur 1 : Sølv farvet 2-DE mønster af en FSH-udtrykt NFPA proteomet analyseres med IPGstrip pH 3 - 10 NL og 12% gel koncentration af SDS-PAGE. Den rød-brun pletter er sølv-farvet proteiner, orange er på baggrund af sølv-farvet gel. Mærket steder blev analyseret med MALDI-TOF-MS PMF. Gengivet fra Wang X, et al. (2015) 3, med tilladelse fra Wiley-VCH. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Coomassie blå farves 2-DE mønster af en NFPA proteomet analyseres med IPGstrip pH 3 - 10 NL og 12% gel koncentration af SDS-PAGE. Mærket steder blev analyseret med MALDI-TOF-TOF MS/MS og LC-ESI-MS/MS. Steder 1 *, 2 *, 3 *, 5 *, og 16 * blev matchet til de tilsvarende steder 1, 2, 3, 5 og 16, og sammenlægges fra 2 matchede geler. Ændret fra Zhan X, et al. (2018) 29, med tilladelse fra Wiley-VCH. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: Antallet af proteiner, der blev identificeret i hver 2DE gel spot med MALDI-TOF-MS PMF analyse.

Table 2
Tabel 2: Antal af proteiner, der blev identificeret i hver 2DE gel spot med MS/MS analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2DE, kombineret med MS metoder herunder 2DE-MS PMF og 2DE-MS/MS, held har været anvendt i vores langsigtede program - brug af proteomics at studere menneskelige NFPA proteom variationer og molekylære netværk variationer for udredning af molekylære mekanismer og opdagelsen af effektiv biomarkører for NFPAs. 2DE-baserede sammenlignende proteomics med god reproducerbarhed spiller en vigtig rolle i identifikationen af NFPA proteom variationer9,10,11,12,13, 19og 2DE kombineret med metoden antistof viser dens fordele i påvisning af en given posttranslationel modifikation og varianter af et bestemt protein, som påvisning af tyrosin nitrering16,17 , 18 og GH varianter14,15.

2DE kombineret med en MS metoden anses dog en arbejdskrævende teknik med vanskeligheder i analyser af lav overflod proteiner, hydrofobe proteiner, særdeles grundlæggende eller sure proteiner og ekstremt lav eller høj masse proteiner2. For eksempel, ekstremt lav masse (< 10 kDa) eller high-mass (> 150 kDa) proteiner, og meget grundlæggende (pI > 7,5 eller 8) eller sure (pI < 3.5 eller 4) proteiner nemt registreres ikke af 2DE med en 18-cm IPG strimler af pH 3-10 NL3. Med den hurtige udvikling af gel-fri adskillelse metoder, herunder todimensionale væskekromatografi (2D-LC) kombineret med stabil isotop mærkning som iTRAQ og TMT i de sidste ti år23, synes det, at 2-DE har gradvist fjernes fra sin centrale status i proteomics forskning i analyse af komplekse væv proteomet fordi 2D-LC kombineret med stabil isotop mærkning og MS/MS-analysemetoder effektivt overvinde ulemperne ved 2DE-baserede metoder.

Nylige undersøgelser fandt, at med brug af høj-følsomhed massespektrometri, såsom en LC-ESI-MS/MS (dens følsomhed er inden for 1-10 Jørgen rækkevidde) i identifikation af 2DE-adskilt proteiner, de nye egenskaber af metoden 2-DE blev opdaget som Vis at en 2D gel spot indeholder mange proteiner (tabel 2). Dette var i modstrid til den traditionelle opfattelse af kun en eller to proteiner pr. spot, som fremgår af verden 2DPAGE database (World-2DPAGE portal: http://world-2dpage.expasy.org/portal). Dette viser klart, at overførselshastighed på 2-DE i identiteten af proteiner i en kompleks menneskelige proteomet er meget højere end hidtil antaget, nemlig at der var kun én til to proteiner i en 2D gel spot. Denne techinique giver et løfte om brug for 2DE inden for proteomics. Én 2DE kan adskille 1.000 til 10.000 steder3,8,22 i analysen af det komplekse menneskelige proteomet, således 2DE er en mere detaljeret adskillelse teknik til at inddæmme forenkle kompleksiteten af proteomet prøver før LC-MS/MS analyse i forhold til 2D-LC systemet, den første-dimensionelle LC almindeligt genererer 18 til 30 fraktioner inden LC-MS/MS analyse. 2DE i kombination med høj følsomhed massespektrometri kan derfor bruges til at etablere enorme oplysninger reference kort for det komplekse menneskelige proteomet, især for lave eller meget lav overflod proteiner. 2-DE i kombination med stabil isotop mærkning (f.eks. iTRAQ, TMT og SILAC) og høj følsomhed massespektrometri kan desuden bruges til at kvantificere større proteom variationer mellem forskellige betingelser. Derudover 2DE kombineret med stabil isotop mærkning og høj følsomhed massespektrometri har absolut fordele i storstilet påvisningen og kvantificeringen af protein PTMs, protein varianter, protein artsdannelse og protein arter. Disse fordele vil have 2DE revitaliseret inden for proteomics.

Desuden, de nuværende protokoller til analyse af menneskelige PA væv proteomet beskrevet her let kan oversættes til at studere andre menneskers sygdom proteomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr. 81572278 og 81272798 til XZ), tilskud fra Kina "863" planlægge projektet (Grant No. 2014AA020610-1 til XZ), Xiangya Hospital midler til Talent Introduktion (til XZ) og Hunan Provincial Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 14JJ7008 til XZ). Forfatterne også anerkende den videnskabelige bidrag af Dr. Dominic M. Desiderio i University af Tennessee Health Science Center. X.Z. løbende udviklet og brugt 2DE-MS metoder til at analysere hypofyseadenom proteom fra 2001, udtænkt koncept for det foreliggende manuskript, skrev og revideret håndskriftet, koordineret de relevante arbejde og var ansvarlig for den økonomisk støtte og tilsvarende arbejde. Y.L. deltog i revisionen af håndskriftet. Y.H deltog i indsamling af referencer og revision af håndskriftet. Alle forfattere godkendt det endelige manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
  28. Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Tags

Kræftforskning spørgsmål 134 to-dimensionelle gelelektroforese isoelektrisk fokusering acrylamid gelelektroforese sølv farvning Coomassie farvning billedanalyse peptid masse fingeraftryk (PMF) Tandem massespektrometri (MS/MS) hypofyse Adenom proteom
To-dimensionelle gelelektroforese kombineret med massespektrometri metoder til analyse af menneskelige hypofyseadenom væv proteom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y.… More

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome. J. Vis. Exp. (134), e56739, doi:10.3791/56739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter