Summary
이 프로토콜에서는 호스트 생리 적 조건 하에서 Candida albicans 에 biofilm 형성을 시각화 하는 사용자 지정 가능한 자동화 된 미세 장치를 사용 하 여를 설명 합니다.
Abstract
Candida albicans 인간의 병원 획득 패 혈 증 경우의 약 15%를 일으키는 가장 일반적인 곰 팡이 병원 체 이다. C. albicans 의 주요 독성 특성은 그것의 양식 biofilms 능력, biotic 및 abiotic 표면에 연결 된 세포의 구조적된 커뮤니티. C. albicans biofilms 호스트 조직, 점 막 층, 같은 카 테 터, 심장, 의치, 공동 prostheses 등 의료 기기에 형성할 수 있다. 그들은 물리적, 화학적 물결에 높게 저항 하기 때문에 씨앗에 저수지 전파 감염으로 작동할 수 있다 Biofilms 중요 한 임상 도전 포즈. 분석 실험 체 외에 다양 한 C. albicans biofilm 형성, 결정 플레이트 분석 실험, 건조 중량 측정, 세포 생존 능력 분석 실험, confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 등 공부를 이용 되어 있다. 이 분석 실험의 모두 단일 끝점 분석 실험, biofilm 형성 특정 시간에 평가 됩니다. 여기, 우리 층 흐름 조건 하에서 자동된 미세 장치를 사용 하 여 실시간에 biofilm 형성 연구 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 biofilm 혈관 카 테 터에서 발생 하는 등 호스트의 모방 하는 사용자 지정 조건을 사용 하 여 시간이 지남에 개발로 biofilm 형성의 관찰에 대 한 수 있습니다. 유전 돌연변이의 biofilm 결함 뿐만 아니라 실시간으로 biofilm 개발에 항균 성 대리인의 억제 효과 평가 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
Introduction
그러나 그것은 또한는 기회 주의 병원 체, 표면 하 고 심한 곰 팡이 감염1,2를 일으키는 능력이 candida albicans 인간의 microbiota의 공생 회원입니다. C. albicans 의 주요 독성 특성 양식 복구 하는 기능 이며, 약물 내성 biofilms, 세포의 표면에 준수 고 기질 소재1,3에. C. albicans biofilms는 고도로 구조화, 포함 하는 여러 종류의 세포 여러 레이어 (신진 효 모-양식 라운드 셀, 타원형 pseudohyphal 셀 및 관 hyphal 셀)4. C. albicans biofilm 개발 표면에,이 세포의 확산에 의해 따라 (에서 biofilm 시드), 표면에 둥근 효 모 형태의 세포의 부착으로 시작 하 고 다음 미 숙 biofilm의 성숙으로 구조를 완벽 하 게 형성 된 biofilm 기질 소재4에 의해 둘러싸여. 성숙한 biofilm biofilm4건축 안정성을 제공 밀도 연결 네트워크를 형성 하는 길쭉한 hyphal 세포 주로 구성 됩니다. Biofilm 라이프 사이클에 걸쳐 신진 효 모 라운드 세포 성숙 biofilm에서 분산 하 고 전파 감염 시키거나 다른 사이트4,5에서 새로운 biofilms 씨앗 몸의 다른 지역에 여행 수 있습니다. C. albicans 는 biotic 표면, 점 막 표면에와 같은 및 호스트 조직, 전체에 카 테 터, 심장, 틀니, 인공 관절 등의 비 생물 적인 표면에 biofilms를 형성할 수 있다. Biofilms의 고집 불통 속성으로 인해 그들은 매우 어려운 근절, 그리고 많은 경우에서 유일 하 게 효과적인 치료 전략은 감염 된 장치4의 제거. 따라서 조사 임상 설정에서 관찰 된 것과 유사한 조건 하에서 biofilm 형성에 결정적 이다.
몇 가지 중요 한 vivo에서 동물 모델이 C. albicans biofilm 형성6,,78; 공부 하는 데 사용 그러나, 이러한 연구 비용, 시간이 소요 될 수 있으며 긴장 및 한 번에 테스트할 수 있는 항균 성 대리인의 수에 의해 제한 됩니다. 생체 외에서 biofilm 분석 실험, 다른 한편으로, 항진균 성 화합물 및 돌연변이 체 긴장의 급속 한, 높은 처리량 평가 대 한 허용 하 고 훨씬 더 비용 효율적이 고 윤리적인 biofilm 분석 실시 보다는 동물에서 모델9, 10,,1112,,1314. 여기는 생체 외에서 분석 결과 우리가 개발 하 고 사용자 지정 가능한 미세 장치14,15를 사용 하 여 층 류에서 일시적으로 biofilm 형성을 관찰 하도록 최적화에 대해 설명 합니다. 분석 결과 시각화 biofilm 형성, 초기 부착 단계, 세포 증식, biofilm 성숙, 세포 분산 등의 각 단계에 대 한 수 있습니다. 분석 결과 시각화는 biofilm의 개발을 통해 세포 형태학 변화에도 유용 합니다.
일반적으로 체 외에서 biofilm 분석 실험, 높은 처리량을 동안에 대 한 활용 결정 접시 제어 흐름 조건에 대 한 허용 하지 않습니다. 전통적인 층 흐름 전지 시스템 제어 흐름 조건에서 biofilm 형성의 지속적인 평가 대 한 허용 하지만 이러한 시간이 소요를 설정 하 고 동적 범위 컨트롤 및 처리량 제한 하는 경향이 많습니다. 여기 활용 미세 장치 내장 층 류 챔버와 높은 처리량 판 (48 웰 스 포함)를 결합 하 여 이러한 한계를 극복 하 고 매우 재현 하 고 다재 다능 한, 사용자 정의.
우리가 야생-타입 C. albicans 의 biofilm 형성 평가를 상업적으로 사용할 수 있는 자동화 미세 장치 사용에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기, 스트레인, biofilm, biofilm의 개발에 알려진 항진균 제의 효과 두 돌연변이 체 긴장 (bcr1Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ) 이전 biofilm를 보고 된에서 대형 생체 외에서 그리고 vivo에서16,,1718결함. Biofilm의 개발을 통해 biofilm 형성 억제에 항균 성 대리인의 효능을 테스트 하 고 돌연변이 라이브러리를 검사 하 여 정상적인 biofilm 개발에 필요한 유전자를 식별 하는 설명된 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 곰 팡이 세포 문화 준비
참고: 행위 세포 배양 작업 (즉, 극저온 주식, 셀 문화 관, 관과 플라스 크 여) biosafety 내각 내에서. 캐비닛의 자외선 (UV) 살 균 램프 적어도 1 h 작업, 캐비닛에 적극적으로 노력 하는 동안 UV 램프 해제 이전 설정. 장갑, 안전 안경, 그리고 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 벤치와 실험의 시작 이전에 70% 에탄올과 펫의 표면 오염을 제거 하 다하고. 살 균 필터 팁과 기본 무 균 미생물 기술 가진 친밀의 사용이 권장 됩니다.
- 효 모에 연속 C. albicans 긴장 (야생-타입, bcr1 Δ/Δ, 및 efg1 Δ/Δ) 추출 펩 포도 당 (YPD) 매체 (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, pH 6.8) 한 천 배지. 48 h 30 ° C에서 품 어, 표준 미생물 사례19.
- 하나의 고립 된 식민지 YPD 액체 매체 (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, pH 6.8)의 4 mL에 접종 하 고 12-15 h, 다음 표준 미생물 윤리적 인큐베이터 떨고 표준에 225 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 품 어 접시에서 선택 tices19.
- 문화의 셀 밀도 600에서 광학 밀도 (OD)를 측정 하 여 결정 한 베트 (1 mL, 1 cm 경로 길이), 표준 미생물에 nm 사례19.
- 0.5, 2 x 107 셀/mL, 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI)-1640 매체에 동일의 최종 세600 세포 배양 희석 (165 m m 3-morpholinopropane-1-sulfonic 산 (MOPS), L-글루타민를 포함 하 고 나트륨 없이 중 탄산염, pH 7.0) 또는 거미 매체 (1% 영양 국물, 마 니 톨 1%, 0.4% K2HPO4, pH 7.2).
참고: 대체 미디어 관심의 긴장의 특정 성장을 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다.
참고: 사전에 너무 멀리 셀 희석을 하지 않습니다. 희석 단계 3.3 (아래 설명 참조) 셀 보기 채널에 시드 되 고 이전 균 형성의 개시를 방지 하기 위해 후 시작 하는 것이 좋습니다.
2. 미세 판의 미세 채널의 준비
참고: 미세 시스템의 사용자 설명서를 참조 하십시오 (재료의 표 참조) 접시 및 장비 설정에 대 한 정보.
- 37 ° c.에 인큐베이터에 미세 실험, 따뜻한 RPMI 1640 미디어 나 거미 미디어 20 mL를 실행 하기 전에 추가 미디어 볼륨 단계 2.8에서에서 계산에 따라 필요할 수 있습니다. 전 지구 온난화 미디어 실험 기간 동안 기포의 형성을 방지합니다.
- 컨트롤러, 2 개의 전원 공급 장치, 현미경, 카메라, 그리고 컴퓨터 시스템에 연결을 포함 하는 마이크로 시스템을 켭니다. 오픈 시스템을 제어 하는 소프트웨어 (재료의 표 참조) 컴퓨터에서 프로그램 메뉴에서. 프로그램이 열리면 두 개의 창이 표시 됩니다.
- 사용에서 접시의 바코드 번호를 찾아서는 소프트웨어에 의해 메시지가 표시 되 면 번호를 입력 합니다. 두 개의 창에 소프트웨어를 두 개의 별도 컴퓨터 화면을 사용 합니다. 한 창 (제어 모듈) 접시에 대 한 컨트롤을 포함 하 고 두 번째 창 (몽타주, 이미징 모듈) 현미경과 카메라에 대 한 컨트롤이 포함 되어 있습니다.
- 컨트롤러에서 히터 전원 버튼에 전환 하 고는 마이크로 시스템 온도 37 ° C 온도 컨트롤러에서 화살표 단추를 사용 하 여를 설정 합니다.
- 청소 살 균 수를 사용 하 여 다음과 같이 인터페이스 플레이트 (그림 1). 살 균 물으로 접시의 바닥을 살포 하 고 흙/먼지 제거 렌즈 종이 사용 합니다. 건조 한 공기를 깨끗 한 렌즈 종이에 인터페이스 플레이트 뒤집어를 놓습니다. 70% 소 프로 파 놀과 렌즈 종이 사용 하 여 인터페이스 플레이트의 상단을 청소 하십시오.
참고: 인터페이스 플레이트 셀 및 미디어를 포함 하는 접시를 미세 시스템을 연결 합니다. 아무 액체 유지 모든 섬유 및 먼지 제거 됩니다 확인 하십시오. 낮은 품질의 이미지 및 비디오에 발생할 수 있습니다 부적 절 한 청소. - 인터페이스에 튜브에서 응축을 제거 합니다.
- 렌즈 종이 뒤집어 접시를 남겨 주세요. 컨트롤에서 모듈 창 접시 수동 모드에서 클릭 합니다. 기울이기 컨트롤 메뉴 섹션에서 1-4 및 5-8, 열 유체 선택을 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 37 ° C를 선택 합니다. 기울이기 컨트롤 섹션에서 상수를 흐름 모드를 설정 하 고 최대 전단 2 다 인/c m2 로 설정 (0.2 Pa) (그림 2A).
- 입구 우물 인터페이스 플레이트 튜브 응축 제거를 통해 살 균 공기의 흐름을 시작을 클릭 합니다. 5 분 후 잘 플레이트 제어 섹션 (그림 2A)에서 정지 버튼을 클릭 합니다. 모든 응축 제거 되었습니다 확인 하려면 인터페이스 플레이트에서 튜브를 관찰 합니다. 방울 여전히 표시 되는 경우 위에서 언급 한, 또 다른 5 분에 대 한 살 균 공기의 흐름을 반복.
참고: 유입 튜브만 살 균 공기 마이크로 시스템에 도입 되도록 0.22 미크론 필터에 연결 됩니다. 흐름 제어 모듈 창에서 화면에 이벤트 로그에서 모니터링할 수 있습니다.
- 현미경 단계에 48-잘 0-20 다 인 미세 접시를 놓습니다.
3. 미세 시스템에서 candida albicans Biofilm 형성
- Biofilm 형성을 기록, 입구 웰 스 (플레이트 레이아웃 그림 1 참조)를 미리 데워 RPMI 1640 매체 또는 거미 매체의 600 µ L를 추가 합니다. 각 실험 조건에 대 한 두 개의 복제 있다.
- C. albicans 의 biofilm 형성 테스트용 야생 형 및 돌연변이 체 긴장 실험 접시의 웰 스 입구에 600 µ L 거미 매체를 추가 합니다.
- Biofilm 형성 항진균 약물 (또는 관심의 다른 화합물)의 테스트를 위해 추가 RPMI 1640 매체 2 개의 우물 (부정적인 제어)의 600 µ L와 RPMI 1640 매체 암포 B (16 µ g/mL)와 보완의 600 µ L (또는 약물의 선택에서 원하는 농도) 두 개의 다른 입구 우물을.
참고: 12 h biofilm 형성 실험에 대 한 입구 우물을 미리 데워 진된 미디어의 600 µ L를 추가 합니다. 더 이상 실험에 대 한 입구 우물을 추가 미디어 (50 µ L/h)를 추가 합니다. 잘 (1, 500 µ L)의 최대 볼륨을 초과 하지 마십시오.
- 천천히 낮은 48 잘 미세 접시 위에 청소 인터페이스 플레이트. 인터페이스 판 약간 왼쪽 때까지 밀어 interphase 접시에 튜브 입구 및 출구 우물 위에 배치 됩니다.
참고: 인터페이스 플레이트에 튜브에서 살 균 공기의 흐름 (방향에 따라 컴퓨터에서 소프트웨어를 사용 하 여 선택), 입구 또는 출구 우물에 액체를 밀어 것입니다 입구와 출구 사이 보기 채널을 통해 흐르는 액체를 사용자 지정된 방향 및 속도 사용자에 의해 규정의 우물
참고: 못쓰게는 보기 채널에서 공기를 제거 하 고 채널 원하는 미디어와 함께 가득 차 있습니다 확인 합니다.
- C. albicans 테스트용 야생 형 및 돌연변이 체 긴장, 두 개의 콘센트 우물, bcr1 Δ/Δ 2 개의 콘센트 우물, 거미 미디어에서 및 efg1 Δ/Δ 2 개의 콘센트 우물 거미 미디어에서 거미 미디어에서 야생-타입 (SC5314) 세포 배양의 50 µ L을 추가 합니다. 미세 접시에 다시 인터페이스 접시를 놓고 뚜껑을 고정 (플레이트 레이아웃 그림 1 참조).
참고: 단계 3.1.1에서에서 설명한 대로 모든 해당 입력된 우물 거미 미디어를 포함. - C. albicans biofilm 형성 암포 B 또는 관심의 다른 화합물의 존재를 테스트 하기 위해 4 개의 콘센트 우물을 사용 RPMI 1640 매체에 야생-타입 (SC5314) 세포 배양의 50 µ L을 추가 합니다. 미세 접시에 다시 인터페이스 접시를 놓고 뚜껑을 고정 (플레이트 레이아웃 그림 1 참조).
참고: 단계 3.1.2에에서 설명 된 대로 모든 해당 입력된 우물 RPMI 1640 미디어와 암포 B 또는 관심의 다른 화합물 없이 포함.
참고: 셀 입구 우물;으로 콘센트 우물에서 이동 흐름 세포 입구 우물을 도달 하기 전에 중지 됩니다 필수적 이다. 이렇게 하면 입구 우물 세포 배양으로 오염 얻이 되지 않습니다 입구 우물에서 미디어 실험의 기간에 대 한 살 균 남아 있습니다. 필요한 시간과 전단 힘 사용 된 미디어의 점도 및 셀의 크기에 근거한 다.
4. 미세 실험 단계 위치 설정
참고: 단계 위치와 플레이트 보정 그냥 실험을 시작 하기 전에 설정 되어야 합니다. 이 설치는 실험 기간 동안 이미지를 캡처에 대 한 각 보기 채널의 위치를 저장 하는 컴퓨터를 허용 한다. 미세 판 무대 위치를 설정한 후 방해 안 한다. 접시 이동 무대 위치 실험의 시작 하기 전에 다시 설정 해야 합니다.
- 시각화 분석 소프트웨어를 사용 하 여 (재료의 표 참조) 무대를 설정 하려면 위치; 각 보기 채널 단계 (1-24) (그림 1D) 이며, 각 단계는 이미지 캡처 보기 채널 (그림 1C)에 따라 다른 위치에 대 한 3 개의 하위 단계 (1-3). 이미징 모듈 창에서 MDA 탭 (그림 2B)를 클릭 하 여 ' 다차원 수집 ' (MDA) 모듈을 엽니다.
- MDA에서 모듈 (그림 2B) 왼쪽에 있는 메뉴에서 '무대' 탭을 클릭 하십시오. 무대 섹션에서 48 잘 0-20 다 인 미세 판에 대 한 마스터 단계 목록을 로드 합니다. 각 보기 채널 3 단계 이미지 수집에 대 한 있어야 합니다.
- ' 샘플 로드 조정 ' (SRA)를 열고 ' 절대 위치로 이동 무대 ' (지도) 모듈 SRA 탭과 지도 탭 (그림 2B)를 클릭 하 여. SRA 모듈에서 십자선으로 이미지 미리 보기 '라이브' 단추를 누릅니다.
- 잘 플레이트 위치는 조이스틱을 사용 하 여 같은 (접시에 있는) 화살표의 팁 보기 채널 4에 인접 한 소프트웨어에 십자선 정렬. 지도 메뉴에서 (그림 2B) ' 원점 설정 ' 버튼을 누릅니다. 현재 위치 0 X, Y, 및 Z 이제 읽어야 합니다.
- SRA 모듈에서 왼쪽 메뉴 (그림 2B)에 ' 초기 참조 점을 ' 섹션을 클릭 합니다. ' 로드 설정 ' 클릭 하 고 48 잘 0-20 다 인 미세 판에 대 한 파일을 로드 합니다.
- MDA 모듈의 무대 섹션, 두 번 클릭에 ' 무대 위치 22,2'. 이 위치는 볼의 중간 (하위 단계 2) 나타냅니다 채널 번호 22. 이 무대를 보는 현미경 고 카메라 초점에 가까운 화살표 표식 채널 22 보고 있습니다. 잘 플레이트 위치는 조이스틱을 사용 하 여 그런 (접시에 있는) 화살표의 팁 보기 채널 22에 인접 한 십자선에 맞춥니다.
- SRA 모듈 (그림 2B)의 ' 업데이트 참조 포인트 ' 탭에 지점 2의 Y 위치에 MDA 모듈에서 Y 좌표를 복사 합니다.
- SRA의 ' 업데이트 단계 위치 ' 탭에서 'MDA 단계 목록에 적용'을 클릭 합니다 (그림 2B).
참고:이 업데이 트 됩니다 모든 현미경 스테이지의 특정 미세 플레이트 위치 보정을 판 (1-24)에 단계 위치 보기.
5. 이미지에 대 한 인수를 설정 캡처 미세 실험 중
- 이미징 모듈 창에서 MDA 모듈을 사용 하 고 왼쪽 메뉴 (그림 2B)에 '저장' 탭을 클릭 합니다. 실험 및 컴퓨터에서 수집 된 이미지를 저장 하는 폴더에 대 한 파일 이름을 선택 합니다.
- MDA 모듈에서 왼쪽 메뉴에 'Timelapse' 탭을 클릭 하 고 설정 145 총 이미지; 이미지-5 분 사이 timelapse를 설정 합니다. 이 1 개의 심상 12 h biofilm 개발 실험에 대 일 분 마다 발생 합니다.
참고: 이미지와 이미지의 총 수 사이 시간 간격 조정할 수 있습니다 실험 요구 사항에 따라. 12 h 이상 이미징 하는 경우 추가할 추가 미디어 단계 3.1에서 입구 우물 우물 건조 실행 할 수 있도록. 더 이상 실험에 대 한 추가 추가 미디어 (50 µ L/h)을 필요에 따라 입구 우물에. - MDA 모듈 왼쪽 메뉴 (그림 2B)에 '파장' 탭을 클릭 하 고 1로 실험에 대 한 파장의 수를 설정 합니다. 50%와 50% 명시 잡으려고 파장 설정 카메라 12 20 ms, 0.6 이득 및 20 MHz 디지타이저의 노출 시간.
참고: 추가 파장 사용할 수 있습니다, 형광 이미징에 대 한 파장을 포함 하 여 (예를 들어 우리는 성공적으로 시각 mCherry 및이 미세 소자를 사용 하 여 태그 GFP C. albicans 긴장). 인수의 매개 변수 또한 변경할 수 있습니다 실험 요구 사항에 따라. 예를 들어, 두 번째 파장을 설정 하 고 '각 Timepoint에 자동'을 선택 하 고 제 3 파장 '각 Timepoint에 Autoexposure' 선택 하면 것이 좋습니다 초점에 있는 이미지 획득 기회를 극대화 하기 위해 초보자를 위한. - MDA 모듈에서 왼쪽 메뉴의 단계 목록 탭을 선택 합니다. 단계 1, 1-24,3 표시 됩니다. 한 명씩, 각 단계에서 클릭 하 고 정밀한 초점 설정을 사용 하 여 수동으로 초점을 보기 채널의 셀에 각 단계에 대 한. 보기의 필드에 초점입니다, 일단 업데이트 하 고 각 단계에 대 한 설정을 저장 단계 목록 옆에 있는 검은색 화살표를 클릭 합니다. 컴퓨터는 모든 시간 지점에서 이미지를 이러한 수동으로 정의 위치 설정 및 초점 설정을 사용 합니다. '제거' 화살표를 사용 하 여 목록에서 모든 사용 하지 않는 단계를 제거 합니다.
참고: MDA 모듈과 프로그램 단계 교환, 채널 보기를 참조 하 고 동일한 용어는 소프트웨어에 의해 사용 됩니다.
6. 미세 실험 실행
- 이미징 모듈 창에서 MDA 모듈을 사용 하 여 모든 하위 단계 (그림 2B)에 대 한 준수 셀의 사전 플러시 이미지 캡처를 시작 하려면 ' 취득을'을 선택 합니다.
참고: 이미징 모듈 창과 카메라 컨트롤 표시 됩니다 이미지 표현 되는 고 지도, SRA, 및 MDA 모듈을 더 이상 표시 됩니다. 촬영 된 이미지도 표시 됩니다 타이머 측면에서, 체포 되 고 이미지 수를 나타내는 및 시간 경과에 다음 이미지 캡처 주기 시작 하기 전에. 다음 단계로 진행 하기 전에 캡처 이미지의 한 라운드를 기다립니다.
참고: 이미징 모듈 창 화면에 '일시 중지' 또는 ' 마크 이벤트 ' 버튼을 사용 하지 마십시오. 실험 기간 동안에이 시점에서 두 번째 컴퓨터 화면 (그림 2A)에서 제어 모듈 창 에서만 마우스를 유지. 이 이미징 모듈 창을 방해 하지 않도록 해야 합니다. - 에 제어 모듈 창 체재 접시 수동 모드에. 기울이기 컨트롤 섹션에서 상수를 흐름 모드를 설정 하 고 최대 전단 1 다 인/c m2 로 설정 (0.1 Pa). 콘센트 웰 스 o 1 O7, O13, O19 콘센트 웰 스 (그림 2A)에 입구에서 미디어의 흐름을 시작 비 준수 셀을 제거 하려면 클릭 합니다. 5 분 잘 플레이트 컨트롤 섹션에서 중지 버튼을 클릭 후. 수 이미지의 두 번째 라운드에 대 한 허용. 이미지를 구상 될 수 있다 고 이미징 모듈 창에서 두 번째 화면에서 시간 경과 모니터링할 수 있습니다.
- 기울이기 컨트롤 섹션에서 조정 0.5 다 인/cm2 최대 전단 흐름 (0.5 Pa) 최대에 있는 번호를 클릭 하 여 전단 열 하 고 0.5를 입력 하는 키보드를 사용 하 여. 키보드에서 enter 키를 눌러 고 유량 제어 모듈 창 (그림 2A)에서 이벤트 로그에 있는 변화를 확인 합니다. 실험 12 h에 대 한 어둠 속에 그대로 둡니다.
참고: 빛에 노출 및 운동/진동 심각 하 게 실험을 통해 획득 하는 이미지의 품질을 줄일 수 있습니다. 미세 실험의 끝에, 이미징 모듈 창이 어떤 이미지를 표시 되지 않습니다 하 고 SRA, 지도, 및 MDA 모듈을 보여주는 다시 되돌아갑니다. 이미지 보기, 동영상, 모이고는 biofilms 계량을 이미징 모듈 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 (아래 설명) 형성.
7. 분석 결과
- 이미징 모듈 창에서 ' 분석 도구 ' 탭을 선택 하 고 ' 검토 다차원 데이터 클릭 ' (RMD)에서 드롭 다운 메뉴. RMD 모듈에서 ' 기본 파일 선택 '를 클릭 합니다. 이 ' 다차원 데이터 집합 유틸리티 ' 창이 열립니다.
- ' 디렉터리 선택 ' 버튼 클릭 하 고 단계 5.1에서에서 실험을 저장 하는 데 사용 된 폴더를 선택 합니다. ' 데이터 집합 ' 목록에서 실험 파일 로그 (.nd 확장)을 선택 합니다. 로그 로드 되 면 '보기' 버튼을 클릭 합니다.
- 왼쪽 '파장' 메뉴에서 옵션을 클릭 하 여 파장을 선택 하 고 무대 위치 드롭 다운 메뉴에서 보기를 선택 합니다. 이미지 번호를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 모듈 상단 숫자에서 로드할 이미지를 선택 합니다. 일단 선택, 이미지 로드 '이미지 로드' 버튼을 클릭 합니다. 하나의 이미지 또는 모든 이미지를 한 번에 볼 수 있습니다.
- 시간 경과 비디오 있도록 모든 이미지를 선택 합니다. 선택 된 이미지는 새 창에서 비디오로 열 것 이다. 이미징 모듈 창에서 '파일' 탭을 클릭 하 고 선택 '다른 이름으로 저장' 드롭 다운 메뉴에서. 기본 파일 (TIFF/MetaSeries)로 동영상 결과 저장 합니다.
- 열고 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 저장 된 비디오 파일을 로드 합니다. ImageJ, '파일' 탭을 클릭 하 고 '다른 이름으로 저장'을 클릭 합니다. 드롭 다운 메뉴에서 '.avi'를 선택 하 고 10 프레임/s로 설정 하는 JPEG 변환을 사용 하 여.avi 파일을 파일을 변환.
참고: 비디오의 속도 초당 프레임을 변경 하 여 조정할 수 있다. - Biofilms 계량, 7.2, 7.3 및 7.4 단계를 반복 합니다.
참고: 실험 기간 동안 얻은 각 이미지에 대 한 '지역'은 동일 하 고 따라서 ' Thresholded 지역 ' 측정 야생-타입 긴장과 돌연변이 체 긴장 biofilm 형성에 차이 평가 또는 평가의 효과를 사용할 수는 biofilm 형성에 마약 테스트입니다.
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Representative Results
우리 수행 미세 biofilm 분석 결과 설명 여기 야생-타입을 사용 하 여 두 미디어 조건 (RPMI 1640 그리고 거미 미디어) C. albicans 스트레인, 알려진된 항진균 약물 RPMI, 암포 B (16 µ g/mL)의 야생-타입 스트레인 그리고 2 개의 돌연변이 체 긴장 이전 거미 미디어에 biofilm 형성 (bcr1Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ)에서 결함을 보고.
비디오 1 RPMI 1640 매체에 biofilm 형성에 항진균 약물, 암포 B의 효과 야생-타입 biofilm의 개발을 보여 줍니다. 야생-타입 조건 하에서 여러 셀으로 강하게 준수, 셀 형성 시간 진행 되는 동안, 균 고 두꺼운 biofilm 균 intercalating으로 관찰 될 수 있다 효 모 세포. 미세 실험의 끝, 야생-타입 biofilm 완전히 보기 채널을 채웁니다. 그러나 암포 B의 존재는, 감소는 biofilm에 뚜렷한 효과가 있다. 특히, 세포의 부착을 점감 하 고, 치료 조건, 암포 B, 존재와 달리 여러 셀 볼 수 있는 미디어의 전단 흐름 멀리 흐르는. 시간 진행, 양식 균을 세포 실패와는 biofilm 형성 하지 됩니다. 이러한 차이 그림 3, 4 시간-포인트 0 h, 2 시간, 6 h, 12 h에서 분석 결과에서 묘사에 표시 됩니다.
비디오 2 보여줍니다 야생-타입 biofilm의 개발 그리고 2 이전 거미 미디어에 biofilm 결함 돌연변이 (bcr1 Δ/Δ와 Δ/Δ efg1 )을 보고. 두 bcr1 Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ 긴장 심각 하 게 감소 biofilm 형성 isogenic 야생-타입 스트레인에 비해 표시. Efg1 Δ/Δ 스트레인에 대 한 준수 세포 균을 형성 하지 않는다 고 결과 biofilm 심각 결함이 관찰 합니다. Bcr1 Δ/Δ 스트레인에 대 한 우리는 것이 관찰 뿐만 아니라 bcr1 Δ/Δ 스트레인 biofilm 형성, 하지만 그것에 결함이 또한 명확한 준수 결함, 세포를 볼 수 있는 표시에 실패 그들이 전단 흐름의 방향으로 표류는 채널 보기. 이러한 차이 그림 4, 0 h, 2 시간, 6 h, 12 h에서 분석 결과에서 4 시간 포인트 묘사에 표시 됩니다.
그림 1:이 실험에서 사용 된 미세 기계. 패널 A 미세 악기 사용, B 보여줍니다 인터페이스 플레이트 패널 C 보여줍니다 단일 보기 채널 (단계)와 3 개의 하위 단계, 실험 기간 동안 카메라에 의해 촬영의 도식 개요 패널 표시 및 패널 D 48-잘 미세 판 출구와 입구 우물과 보기 창의 회로도 함께 사용의 도식 개요를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: modulesoftware 및 미세 판 이미징의 선택 스크린샷 제어 시스템. A 패널 제어 모듈 미세 플레이트에 대 한 컨트롤을 포함 하 고 패널 B 이미징 모듈 창, ' 이동 무대 절대 위치 ' (지도) 모듈, ' 다차원 수집 ' (MDA) 모듈 그리고 ' 샘플 로드 조정 ' (SRA) 모듈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 노출 암포 b biofilm 형성 결함 발생. RPMI-1640 미디어 (열 1), 및 미세 시스템에 12 h 후 준수에 대 한 37 ° C에서 16 µ g/mL에서 동적 흐름 (0.5 다 인/cm2) 암포 B (열 2) 보충 RPMI 1640 미디어 biofilm 형성의 시간 종속 시각화. 대표 오 (후 준수 및 초기 세척), 2 시간, 6 h와 12 h 이미지 (위에서 아래로) 표시 되어 있습니다. isogenic 야생-타입 스트레인 SN250 (열 1 및 2). 스케일 바 각 패널에서 20 µ m입니다. Biofilm 형성의 해당 시간 경과 비디오 비디오 1에 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: BCR1 또는 EFG1 의 삭제 biofilm 형성 결함 발생합니다. 미세 시스템에 12 h 후 준수에 대 한 종속 시각화 거미 미디어 (열 1-3) 37 ° C에서 동적 흐름 (0.5 다 인/cm2) 아래에 biofilm 형성의 시간. 대표 오 (후 준수 및 초기 세척), 2 시간, 6 h와 12 h 이미지 (위에서 아래로) 표시 되어 있습니다. isogenic 야생-타입 스트레인 SN250 (열 1), bcr1Δ/Δ 스트레인 (열 2), 및 efg1 Δ/Δ 스트레인 (열 3). 스케일 바 각 패널에서 20 µ m입니다. Biofilm 형성의 해당 시간 경과 비디오 비디오 2에 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 사용자 지정 가능한 미세 biofilm 분석 결과 수에 biofilm 형성의 시각화에 대 한 고정된 속도 층 흐름과 일정 한 온도에 노출 되 면 단일 셀 수준에 실시간으로. 그것은 야생 형 및 돌연변이 체 긴장에 biofilms의 개발 연구에 강력한 수단을 제공 하 고 생리 조건 모방 조건 하에서 biofilms에 항균 성 에이전트 처리의 효과 임상 설정에서 관찰. 대부분 체 외에서 biofilm 분석 실험와 달리이 메서드는 실시간으로 개발 biofilm의 시험에 대 한 수 있습니다 그것은 형성 하는으로.
24 샘플까지 될 수 있는 동시에 biofilm 형성 평가 실행 높은 처리 방식으로이 메서드를 사용할 수 있습니다. 메서드는 정상적인 biofilm 개발에 필요한 유전자를 식별 하기 위해 돌연변이 라이브러리의 유전 스크린을 사용할 수 있습니다 하 고 화합물 라이브러리 화면에 대 한 관심의 항균 성 화합물의 biofilms에 대 한 유효성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는이 미세 소자의 미래 응용 프로그램 같은 화면 포함 됩니다 예상. 그러나 우리는 주의, 그 특정 약물 치료 테스트 제한 됩니다 biofilms에 대 한 성장으로이 미세 소자를 사용 하 여 형성 된 biofilm의 두께 의해 > 16 h 보기 채널을 췄 다 경향이 있다. 따라서, 약물 테스트 실험 수행 될 필요가 있을 것 이다 < 16 h.
전반적으로,이 장치는 매우 사용자 정의 하 고 다양 한, 그리고 왕국, 유량, 온도, 보육 시간, 및 미디어에 걸쳐 종 미생물을 평가 하기 위해 조정 될 수 있다. 설명 하는 방법을 biofilm 형성, 초기 세포 부착, biofilm 성숙, 세포 분산 등의 다양 한 측면의 숫자에 대 한 정보를 제공 합니다. 비록 우리가 단일 종 biofilm 형성 여기에 대 한 결과 보고,이 프로토콜 또한 듀얼 및 혼합 종 biofilm 형성 연구에 적용할 수 있습니다.
두 단계는이 프로토콜을 성공적으로 수행 하려면 중요 합니다. 첫째, 시스템에서 공기 방울 실험 온도에서 미디어를 예 열 하 여 피해 야 한다. 한 일반적인 실수는 하지 preheated은 미디어에서 셀의 희석. 셀 입구 우물에 사용 되는 동일한 미디어에 희석 한다. 둘째, 웰 스는 신중 하 게 모니터링 해야 합니다; 입구에 콘센트에서 셀의 흐름 셀 흐름 너무 멀리, 입구 미디어 오염 되 고 실험 해석할 결과 생성 하지 것입니다. 다른 한편으로, 셀 셀 실험 기간 동안 채널에 표시 됩니다 모든 방법 보기 채널으로 이동 하려면 허용 되지 않는, 경우 빈 이미지를 선도. 마음에 계속 추가 키 포인트는 볼륨 및 미세 플레이트에 웰 스 사이의 움직임 연결 함께 각 열에 대 한 가능한 많은 미디어 일관성을 유지 하는 것이 중요 하다 (유사한 점도와 밀도, 셀 및 구성)와 비슷한 크기의 셀 (가능한 경우), 다른 미디어와 다른 셀 크기 열에서 다른 흐름 율을가지고 것입니다. 실험, 동안 셀의 혈 류 현미경;를 사용 하 여 모니터링은 그러나, 두 개의 채널 (10 X 목표를 사용 하 여) 한 번에 볼 수 있습니다. 따라서, 좋습니다 입구 웰 스 셀을 사용 하 여 콘센트에서 흐름 하는 데 필요한 시간을 측정 하는 모의 실험을 수행 하 고 미디어 실제 실험에 사용 될 계획.
일반적으로 좋습니다이 미세 biofilm 분석 결과의 분석 결과 생체 외에서 vivo에서 동물을 테스트 하기 전에 활용으로 사용을. 그러나 분석 결과,, 아직도 시험관에서 분석 결과, 고 결과 관련 동물 모델에서 유효성을 검사할 필요가 있을 것 이다. 우리의 경험에서이 미세 biofilm 분석 결과의 결과 최고의 예측 값 했다 vivo에서 biofilm 분석 실험 분석 실험 체 외에 다른과 비교에 대 한14를 평가 했습니다.
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Disclosures
고모 J. Nobile BioSynesis, Inc., 저 해제 및 C. albicans biofilms의 진단 개발 회사의 설립자 이다.
Acknowledgments
우리 biofilm 분석에 유용한 토론 Nobile 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 이 연구는 건강 (NIH) 부여 R21 AI125801 (C.J.N.)의 국가 학회에 의해 지원 되었다. D.L.R.는 멕시코와 미국 (UC-MEXUS)와 Consejo 나시오날 드 많은 y Technologia (CONACYT) 캘리포니아 연구소의 대학에서 박사 과정 장학금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
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