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Immunology and Infection

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56743

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Geräts anpassbare automatisierte mikrofluidischen Biofilmbildung in Candida Albicans unter physiologischen Bedingungen Host zu visualisieren.

Abstract

Candida Albicans ist der häufigste pilzliche Erreger des Menschen, was etwa 15 % der Fälle von nosokomialen Sepsis. Eine größere Virulenz-Attribut von C. Albicans ist seine Fähigkeit, Form Biofilme, strukturierten Gemeinschaften von Zellen zu biotischen und abiotischen Oberflächen befestigt. C. Albicans Biofilme bilden können auf Host Gewebe, wie z. B. Schleimhaut Schichten und medizinischen Geräten wie Herzschrittmachern, Katheter, Zahnersatz und Gelenkprothesen. Biofilme stellen signifikante klinische Herausforderungen, weil sie sehr widerstandsfähig gegen physikalische und chemische Störungen sind und können als Stauseen Samen Infektionen verbreitet wirken. Verschiedene in-vitro- Assays wurden genutzt, um C. Albicans Biofilmbildung wie Mikrotiter-Platte-Assays, Trockengewicht Messungen, Zelle Lebensfähigkeit Assays und konfokale Lasermikroskopie Scan zu studieren. Alle diese Tests sind einzelne Endpunkt Assays, wo Biofilmbildung zu einem bestimmten Zeitpunkt bewertet. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Biofilmbildung in Echtzeit mit einem automatisierten mikrofluidischen Gerät unter Laminar-Flow-Bedingungen zu studieren. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Biofilmbildung wie der Biofilm entwickelt sich im Laufe der Zeit mit anpassbaren Bedingungen, die denen der Host, wie denen in Gefäßkathetern nachahmen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, die Biofilm-Defekte genetische Mutanten und die hemmenden Auswirkungen von antimikrobiellen Wirkstoffen auf Biofilm Entwicklung in Echtzeit einzuschätzen.

Introduction

Candida Albicans gehört Kommensalen der menschlichen Mikrobiota, aber es ist auch eine opportunistische Erreger, verursachen oberflächliche und schweren Pilzinfektionen1,2. Eine größere Virulenz-Eigenschaft von C. Albicans ist seine Fähigkeit, Form elastisch und resistente Biofilme Gemeinschaften von Zellen eine Oberfläche eingehalten und eingeschlossen in eine extrazelluläre Matrix-Werkstoff-1,-3. C. Albicans Biofilme sind hochgradig strukturiert, mit mehreren Schichten von mehreren Zelltypen (angehende Hefe-Form Runde Zellen, ovale pseudohyphal Zellen und röhrenförmigen Bodenaggregaten Zellen)4. C. Albicans Biofilm Entwicklung beginnt mit der Einhaltung runden Hefe-Form Zellen eine Oberfläche (Aussaat des Biofilms), gefolgt von der Verbreitung dieser Zellen an der Oberfläche, und dann die Reifung des unreifen Biofilms Struktur in eine voll ausgebildet Biofilm, die extrazelluläre Matrix Material4umgeben ist. Der Reife Biofilm besteht überwiegend aus länglichen Bodenaggregaten Zellen, die Dichte und miteinander verbundenen Netzwerken, die architektonischen Stabilität, der Biofilm-4bilden. Über den gesamten Lebenszyklus der Biofilm Runde Knospen Hefe Zellen zerstreuen von der Reife Biofilm und können Reisen in andere Regionen des Körpers zu disseminierte Infektionen verursachen oder Samen neue Biofilme an anderen Standorten4,5. C. Albicans können auf biotische Oberflächen, z. B. Schleimhaut-Oberflächen und in der gesamten Wirtsgewebe, und abiotischen Oberflächen, wie z.B. Kathetern, Herzschrittmacher, Zahnersatz und Gelenkprothesen Biofilme bilden. Aufgrund der widerspenstigen Eigenschaften von Biofilmen sie sind extrem schwer zu beseitigen, und in vielen Fällen ist die einzige wirksame Behandlungsstrategie Entfernung des infizierten Gerät4. Es ist so entscheidend für Biofilmbildung unter Bedingungen ähnlich denen beobachtet im klinischen Umfeld zu untersuchen.

Es gibt mehrere kritische in Vivo Tiermodellen zur Untersuchung von C. Albicans Biofilm Bildung6,7,8; aber können diese Studien kostspielig, zeitaufwändig, und sind begrenzt durch die Anzahl der Stämme und antimikrobielle Wirkstoffe, die zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden können. In-vitro- Biofilm-Assays, auf der anderen Seite ermöglichen die schnelle, Hochdurchsatz-Bewertung von Antimykotika Verbindungen und mutierte Stämme und sind kostengünstiger und ethische als Biofilm Assays durchgeführt Out in Tier9, Modelle 10,11,12,13,14. Hier beschreiben wir eine in-vitro- Tests, die wir entwickelt und optimiert, um die Biofilmbildung zeitlich unter Laminar-Flow mit einem anpassbaren mikrofluidischen Gerät14,15beobachten. Der Test ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Phasen der Biofilmbildung, einschließlich der Einhaltung der erste Schritt, Zellproliferation, Biofilm Reifung und Zelle Dispersion. Der Test eignet sich auch Zelle Morphologie Änderungen während der Entwicklung eines Biofilms zu visualisieren.

Mikrotiter-Platten, die in der Regel verwendet werden, für in-vitro- Biofilm-Assays, bei hohem Durchsatz nicht kontrollierten Strömungsverhältnisse zulassen. Traditionelle Laminar-Flow-Zelle-Systeme ermöglichen die kontinuierliche Bewertung der Biofilmbildung in kontrollierten Strömungsverhältnisse, aber diese sind oft zeitaufwändige Einrichten und sind in der Regel nur über begrenzte Dynamikumfang Kontrolle und Durchsatz. Die mikrofluidischen Gerät hier verwendete überwindet diese Einschränkungen durch die Kombination von Hochdurchsatz-Platten (mit 48 Brunnen) mit einer integrierten Laminar-Flow-Kammer und hoch reproduzierbare und vielseitig anpassbar.

Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Verwendung eines handelsüblichen automatisierte mikrofluidischen Geräts Biofilmbildung ein Wildtyp C. Albicans bewerten belasten, die Auswirkungen der bekannten Antimykotikum auf die Entwicklung eines Biofilms und Biofilm Bildung in zwei mutierte Stämme (bcr1Δ/Δ und efg1 Δ/Δ), die zuvor gemeldet wurden, um Biofilm haben Mängel in Vitro und in Vivo16,17,18. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Wirksamkeit antimikrobieller Mittel in der Hemmung der Biofilmbildung während der Entwicklung eines Biofilms zu testen und zu identifizieren, die für normale Biofilm Entwicklung durch screening mutierte Bibliotheken erforderlich.

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Protocol

(1) Pilzzelle Kultur Vorbereitung

Hinweis: Zellkultur Verhalten innerhalb eines Biosafety Kabinett arbeiten (d. h. Eröffnung kryogenen Lager Röhren, Zelle Kultur Röhren und Flaschen). Schalten Sie das Kabinett Ultraviolett (UV) keimtötende Lampe mindestens 1 h vor der Arbeit, und schalten Sie die UV-Lampe und arbeitet aktiv in das Gehäuse. Handschuhe, Schutzbrille und geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen, und die Oberfläche der Sitzbank und Pipetten mit 70 % Ethanol vor Beginn des Experiments zu dekontaminieren. Verwendung von sterilen Filterspitzen und Vertrautheit mit aseptischen mikrobiologische Grundtechniken werden empfohlen.

  1. Streak C. Albicans -Stämme (Wildtyp bcr1 Δ/Δ und efg1 Δ/Δ) auf Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Medium (Hefeextrakt 1 %, 2 % Pepton, 2 % Glukose; pH 6.8) Agarplatten. Inkubation bei 30 ° C für 48 h, folgende mikrobiologische Standardpraktiken19.
  2. Wählen Sie eine einzelne isolierte Kolonie von der Platte zu impfen in 4 mL YPD Flüssigmedium (Hefeextrakt 1 %, 2 % Pepton, 2 % Glukose; pH 6.8) und inkubieren Sie bei 30 ° C mit Schütteln bei 225 u/min in einem Standard-Inkubator für 12-15 h, folgende standard mikrobiologische Prac schütteln baren19.
  3. Bestimmen Sie die Zelldichte der Kultur durch die Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm in eine Küvette (1 mL, 1 cm Länge), folgende Standard mikrobiologische Verfahren19.
  4. Verdünnen Sie die Zellkultur auf eine endgültige OD600 von 0,5, äquivalent zu 2 x 107 Zellen/mL, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 Medium (165 mM 3-Morpholinopropane-1-Sulfo Säure (MOPS), L-Glutamin, mit und ohne Natrium Bikarbonat, pH 7.0) oder Spider-Medium (Nährbouillon 1 %, 1 % Mannit, 0,4 % K2HPO4, pH 7,2).
    Hinweis: Alternative Medien können verwendet werden, um die spezifischen Wachstumsraten der Stämme von Interesse zu unterstützen.
    Hinweis: Stellen Sie Zelle Verdünnungen nicht zu weit im Voraus. Es wird empfohlen, Verdünnungen nach Schritt 3.3 (wie unten beschrieben), um zu verhindern, dass die Einleitung der Hyphen Bildung vor Zellen ausgesät in der Anzeigekanal beginnen.

2. Vorbereitung des mikrofluidische Kanäle der mikrofluidischen Platte

Hinweis: Beachten Sie bitte die Bedienungsanleitung des mikrofluidischen Systems (siehe Tabelle der Materialien) für Informationen über Platten und Inbetriebnahme.

  1. Vor dem Ausführen der mikrofluidischen Experiment, warme 20 mL RPMI-1640 Medien oder Spider in einem Inkubator bei 37 ° C. Zusätzliche Datenträger kann erforderlich sein, nach den Berechnungen im Schritt 2,8. Vor Erwärmung Medien verhindert die Bildung von Luftblasen während des Experiments.
  2. Schalten Sie das Mikrofluidik-System umfasst den Controller, zwei Netzteile, Mikroskop, Kamera und Computer an das System angeschlossen. Öffnen Sie die Software, die das System steuert (siehe Tabelle der Materialien) im Menü Programm auf dem Computer. Zwei Fenster erscheint, sobald das Programm geöffnet wird.
  3. Suchen Sie die Barcode-Nummer der Platte im Einsatz und geben Sie die Nummer, wenn Sie von der Software aufgefordert werden. Verwenden Sie zwei separate Computer-Bildschirmen die Software an den zwei Fenstern anzeigen. Ein Fenster (Steuermodul) enthält die Steuerelemente für die Platte und das zweite Fenster (Montage, imaging Modul) enthält die Steuerelemente für das Mikroskop und Kamera.
  4. Schalten Sie die Heizung-Power-Taste auf dem Controller und stellen Sie der Mikrofluidik Systemtemperatur auf 37 ° C mit den Pfeiltasten auf der Temperaturregler ein.
  5. Reinigen Sie die Oberfläche Teller (Abbildung 1) mit sterilem Wasser wie folgt. Besprühen Sie die Unterseite der Platte mit sterilem Wasser und mit Linsenpapier um Schmutz/Staub zu entfernen. Ruhen der Schnittstelle Platte verdeckt auf saubere Linsenpapier an der Luft trocknen. Reinigen Sie die Oberseite der Schnittstelle Platte mit 70 % Isopropanol und Objektiv Papier.
    Hinweis: Die Schnittstelle Platte verbindet mikrofluidischen System auf die Platte, die die Zellen und die Medien enthalten wird. Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit bleibt und dass alle Fasern und Schmutz entfernt werden. Unsachgemäße Reinigung führen niedrige Bildqualität und Videos.
  6. Entfernen Sie Kondenswasser aus den Rohren auf der Schnittstelle Platte.
    1. Lassen Sie die Platte ruht auf dem Objektiv Papier verdeckt. In der Steuerung Modul-Fenster klicken Sie auf den manuellen Modus für die Platte. Klicken Sie in der Scherung Menü Abschnitt auf die Flüssigkeit Auswahl für Spalten 1-4 und 5-8, und wählen Sie 37 ° C aus der Drop-Down-Menü aus. Im Bereich Schere, Flow-Modus auf konstante und maximale Querkraft auf eingestellt 2 dyn/cm2 (0,2 Pa) (Abbildung 2A).
    2. Klicken Sie auf die Einlass-Brunnen zu den sterilen Luftstrom durch die Schnittstelle Platte Röhren Kondenswasser entfernen. Klicken Sie nach 5 min auf die Stopp-Taste im Bereich well-Platte (Abbildung 2A). Beobachten Sie die Rohre in der Schnittstelle Platte zu bestätigen, dass alle Kondensation entfernt wurde. Wenn Tröpfchen noch sichtbar sind, wiederholen Sie den sterilen Luftstrom, wie oben erwähnt, für weitere 5 Minuten.
      Hinweis: Die Einlass-Rohre sind 0,22 Mikron Filter, um sicherzustellen, dass nur steriler Luft der Mikrofluidik-System eingeführt ist beigefügt. Die Strömung kann durch das Ereignisprotokoll auf dem Bildschirm im Kontrollfenster Modul überwacht werden.
  7. Platzieren Sie die 48-gut 0-20 Testtinten mikrofluidischen Platte auf den Mikroskoptisch.

3. Candida Albicans Biofilmbildung in mikrofluidischen System

  1. Zum Aufzeichnen von Biofilmbildung fügen Sie 600 µL vorgewärmten RPMI-1640 Medium oder Spinne Medium die Einlass-Brunnen (siehe Abbildung 1 Platte Layout hinzu). Haben Sie zwei Wiederholungen für jede experimentelle Bedingung.
    1. Zu Testzwecken Biofilmbildung von C. Albicans hinzufügen Wildtyp und Mutanten Stämme 600 µL Spider Medium Einlass Brunnen der Experiment-Platte.
    2. Zu Testzwecken Biofilmbildung im Beisein von Antimykotika (oder andere Verbindungen des Interesses), fügen Sie 600 µL von RPMI-1640 Mittel-und zwei Brunnen (Negativkontrolle) und 600 µL RPMI-1640 Medium ergänzt mit Amphotericin B (16 µg/mL) (oder die gewünschte Medikament der Wahl bei Konzentration) zu zwei anderen Einlauf-Brunnen.
      Hinweis: Für ein 12 h-Biofilm-Bildung-Experiment, fügen Sie hinzu, 600 µL vorgewärmten Medien die Einlass-Brunnen. Fügen Sie für längere Experimente zusätzliche Medien (50 µL/h hinzu) die Einlass-Brunnen. Überschreiten Sie die maximale Lautstärke des Brunnens (1.500 µL) nicht.
  2. Die gereinigte Oberfläche Platte auf die 48 gut mikrofluidischen Platte langsam absenken. Schieben Sie die Schnittstelle Platte leicht nach links, bis die Rohre auf der Interphase-Platte auf den Einlass und Auslass Brunnen positioniert sind.
Durch Drehen des Hebels auf der Schnittstelle Platte von links nach rechts, um die Schnittstelle Platte in Position zu verriegeln, das Experiment zu gewährleisten ist luftdicht.
Hinweis: Sterile Luftstrom aus den Rohren in der Schnittstelle Platte schiebt die Flüssigkeit in den ein- oder Auslass Vertiefungen (abhängig von der Richtung ausgewählt, mit der Software auf dem Computer), so dass die Flüssigkeit durch die Anzeigekanal zwischen Einlass und Auslass fließt Brunnen in die individuelle Richtung und Geschwindigkeit vom Benutzer vorgegeben.
  • Im Bereich Schere, Flow-Modus auf konstante und maximale Querkraft auf eingestellt 1 dyn/cm2 (0,1 Pa). Klicken Sie auf Einlass Brunnen mit Medien um den Fluss der Medien vom Einlass, Auslass Wells (Abbildung 2A) den Kanal Prime zu beginnen. Nach 5 min klicken Sie auf die Stopp-Taste im Bereich well-Platte. Entfernen Sie die Schnittstelle und beobachten Sie mikrofluidischen Platte Brunnen zu. Nach dem Grundieren die Kanäle, sollte nur ein kleiner Tropfen der Medien in den Outlet-Vertiefungen sichtbar sein. Wenn der Tropfen nicht sichtbar ist, die Kanäle in Schritten von 2 min prime bis die kleine Tropfen der Medien in den Outlet-Vertiefungen sichtbar ist.
    Hinweis: Eine Grundierung ist erforderlich, um Luft aus dem Sichtkanäle entfernen und sicherstellen, dass die Kanäle mit den gewünschten Medien gefüllt sind.
  • Entfernen Sie die Schnittstelle aus der Mikrofluidik-Platte und legen Sie es beiseite auf eine sterile Oberfläche. Fügen Sie 50 µL der Zellkultur (beschrieben in Schritt 1.5) an jeder Steckdose gut.
    1. Zum Testen von C. Albicans Wildtyp und Mutanten Stämme, hinzu kommen 50 µL der Wildtyp (SC5314) Zellkultur in Spider Media zwei Outlet-Brunnen, bcr1 Δ/Δ in Spider Media, zwei Outlet Brunnen und efg1 Δ/Δ in Spider Media, zwei Outlet-Brunnen. Die Schnittstelle Platte wieder auf den Teller mikrofluidischen und sperren Sie den Deckel (siehe Abbildung 1 Platte Layout).
      Hinweis: Wie unter Punkt 3.1.1 beschrieben, enthalten alle entsprechenden Eingabe Wells Spider Media.
    2. C. Albicans Biofilmbildung im Beisein von Amphotericin B oder andere Verbindung von Interesse zu Testzwecken, fügen Sie hinzu, 50 µL der Wildtyp (SC5314) Zellkultur in RPMI-1640 Medium vier Outlet-Brunnen. Die Schnittstelle Platte wieder auf den Teller mikrofluidischen und sperren Sie den Deckel (siehe Abbildung 1 Platte Layout).
      Hinweis: Wie in Schritt 3.1.2 beschrieben, enthalten alle entsprechenden Eingabe Wells RPMI-1640 Medien mit und ohne Amphotericin B oder andere Verbindung von Interesse.
  • Im Bereich Schere, Flow-Modus auf konstante und maximale Querkraft auf eingestellt 2 dyn/cm2 (0,2 Pa). Klicken Sie auf Outlet-Brunnen mit Zellen Fluss der Medien vom Einlass, Auslass Wells (Abbildung 2A) zu beginnen, Aussaat von C. Albicansbeginnen. Nach 3 s Klicken Sie auf die Stopp-Taste in der well-Platte Kontrolle Abschnitt um zu verhindern, dass Zellen in der Eingabe Brunnen.
    Hinweis: Die Zellen werden von den Outlet-Brunnen in Richtung Einlass Brunnen verschoben; Es ist wichtig, dass der Fluss beendet wird, bevor die Zellen die Einlass-Brunnen zu erreichen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Einlass-Brunnen mit Zellkulturen nicht verunreinigt bekommen und die Medien in den Einlass Vertiefungen für die Dauer des Experiments steril bleibt. Die Querkraft und Zeitaufwand basiert auf die Viskosität des verwendeten Mediums und die Größe der Zellen.
  • Lassen Sie die Zellen mit Stromstille (0 dyn/cm2) für 10-20 min in der Anzeigekanal für die Einhaltung der ursprünglichen Zelle stationär bleiben. Während dieser 10-20 min Einhaltung Schritt richten Sie den Computer zu erfassen die Bühne Kamerapositionen und beginnen bereits bündig Bilder (ausführlich in Kapitel 4-6) zu erwerben.
  • (4) einrichten die Bühne Positionen für das Experiment mikrofluidischen

    Hinweis: Die Bühne Positionen und Platte Kalibrierung sollte nur vor Beginn des Experiments festgelegt werden. Dieses Setup ermöglicht dem Computer, die Positionen der einzelnen Anzeigen Kanäle für die Aufnahmen während des Experiments zu speichern. Die mikrofluidischen Platte sollte nicht gestört werden, nach dem Einrichten der Bühne Positionen. Wenn die Platte verschoben wird, werden die Bühne Positionen haben vor Beginn des Experiments zurückgesetzt werden.

    1. Die Visualisierungs-Analyse-Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), das Bühnenbild Positionen; Jede Anzeigekanal ist eine Bühne (1-24) (Abbildung 1) und jede Stufe hat drei Sub-Phasen (1-3) für die Bildaufnahme an verschiedenen Positionen entlang der Anzeigekanal (Abbildung 1). Öffnen Sie im imaging Modulfenster das "Multi-Dimensional Erwerb" (MDA) Modul durch Klicken auf die Registerkarte "MDA" (Abb. 2 b).
    2. Der MDA Modul klicken Sie auf die Registerkarte "Stage" im Menü auf der linken Seite (Abb. 2 b). Abschnitt "Bühne" Laden der master Stufe-Liste für die 48 gut 0 - 20 Testtinten mikrofluidischen Platte. Jedes Anzeigekanal muss drei Stufen für die Bildaufnahme.
    3. Öffnen Sie die "Sample Reload Anpassung" (SRA) und "Stage zur Absolutposition bewegen" (MAP) Module durch Klicken auf die Registerkarte "SRA" und die Registerkarte Karte (Abb. 2 b). Drücken Sie im SRA-Modul auf "Live" zu sehen, eine Bildvorschau mit Fadenkreuz.
    4. Mit dem Joystick, positionieren Sie die well-Platte so, dass die Spitze des Pfeils (physisch auf der Platte) angrenzend an Kanal 4 Anzeigen deckt sich mit dem Fadenkreuz auf die Software. Im Menü Karte die Taste "Set Herkunft" (Abb. 2 b). Die aktuelle Position sollte jetzt lauten 0 in X, Y und Z.
    5. Klicken Sie im SRA-Modul im Abschnitt "Initial Reference Points" im Menü links (Abb. 2 b). Klicken Sie auf "Einstellungen laden" und laden Sie die Datei für die 48 gut 0 - 20 Testtinten mikrofluidischen Platte.
    6. Doppelklicken Sie auf die Bühne Abschnitt des Moduls MDA auf "Tischposition 22,2'. Diese Position zeigt die Mitte (Sub-Stufe 2) des Sehens Kanalnummer 22. Dieses holt das Mikroskop anzeigen Bühne und der Kamerafokus in unmittelbarer Nähe auf die Pfeil-Markierung durch Kanal 22 anzeigen. Mit dem Joystick, positionieren Sie die well-Platte so, dass die Spitze des Pfeils (physisch auf der Platte) neben dem Kanal 22 Anzeigen deckt sich mit dem Fadenkreuz.
    7. Kopieren Sie die Y-Koordinate im MDA-Modul in die Y-Position von Punkt 2 im Reiter "Update Referenzpunkte" des Moduls SRA (Abb. 2 b).
    8. Im Reiter "Update Bühne Positionen" die SRA, klicken Sie auf "Übernehmen MDA-Bühne-Liste" (Abb. 2 b).
      Hinweis: Dadurch wird aktualisiert alle anzeigen Bühne Positionen in der Platte (1-24) an die spezifischen mikrofluidischen Platte Position auf den Mikroskoptisch kalibriert werden.
    Die Platte ist nun bereit für die Bildaufnahme und nutzt die kalibrierten Bühne Positionen um zu bewegen, während Aufnahmen aus drei Positionen in allen 24 Kanäle anzeigen.

    5. Einrichten von Akquisitionen für Bild zu erfassen, während der Mikrofluidik-Experiment

    1. Verwenden Sie im Modulfenster imaging die MDA-Modul und klicken Sie auf "Speichern" im Menü links (Abb. 2 b). Wählen Sie den Dateinamen für das Experiment und den Ordner, um die aufgenommenen Bilder auf dem Computer zu speichern.
    2. Klicken Sie im MDA-Modul auf die Registerkarte "Zeitraffer" "im Menü links und setzen Sie ihn auf 145 Gesamtbilder erwerben; der Zeitraffer zwischen Bildern, 5 min eingestellt. Dies führt zu 1 Bild alle 5 min für ein 12 h Biofilm Entwicklung Experiment.
      Hinweis: Der zeitliche Abstand zwischen den Bildern und die Gesamtzahl der Bilder kann basierend auf experimentellen Anforderungen angepasst werden. Wenn länger als 12 h imaging, fügen Sie zusätzliche Medien hinzu, die Einlass-Brunnen am Schritt 3.1 um sicherzustellen, dass der Brunnen nicht trocken laufen. Fügen Sie für längere Experimente zusätzliche Medien Bedarf (50 µL/h hinzu) die Einlass-Brunnen.
    3. Klicken Sie im MDA-Modul auf die Registerkarte "Wellenlängen" "im Menü links (Abb. 2 b) und die Anzahl der Wellenlänge für das Experiment als 1 festgelegt. Legen Sie die Wellenlänge, bei 50 % Hellfeld und 50 % erfassen Kamera mit einer Belichtungszeit von 12-20 ms, 0,6 Gain und 20 MHz Digitizer.
      Hinweis: Zusätzliche Wellenlängen können verwendet werden, einschließlich Wellenlängen für die Fluoreszenz-Bildgebung (zum Beispiel, wir haben erfolgreich visualisiert mCherry und GFP gekennzeichnet C. Albicans -Stämme, die mit diesem Gerät mikrofluidischen). Die Parameter der Erwerb können auch basierend auf experimentellen Anforderungen geändert werden. Beispielsweise die Einrichtung einer zweiten Wellenlänge und Auswahl "Autofokus bei jeder Timepoint" und eine dritte Wellenlänge und wählen Sie "Belichtungsautomatik bei jeder Timepoint" empfiehlt sich für Anfänger und Bild Akquisitionsmöglichkeiten zu maximieren, im Fokus stehen.
    4. Wählen Sie im MDA-Modul die Stufe Liste Registerkarten im linken Menü. Phasen 1,1 – wird 24,3 angezeigt. Eins nach dem anderen, klicken Sie auf jeder Stufe, und verwenden Sie die Feinfokussierung Einstellungen manuell fokussieren auf die Zellen in der Anzeigekanal für jede Stufe. Sobald das Sichtfeld im Fokus ist, klicken Sie auf den schwarzen Pfeil neben der Bühne-Liste zu aktualisieren und speichern die Einstellungen für die einzelnen Phasen. Der Computer wird diese manuell definierten Einstellungen und fokale Einstellungen verwenden, um Bilder zu jedem Zeitpunkt zu erwerben. Entfernen Sie alle unbenutzten Phasen aus der Liste mit dem "Entfernen"-Pfeil.
      Hinweis: Das MDA-Modul und das Programm finden Sie Anzeigen von Channels als Stufen austauschbar, und die gleiche Terminologie wird von der Software verwendet.

    6. Durchführung des mikrofluidischen Experiments

    1. Die imaging mit dem MDA-Modul wählen Sie im Modulfenster "Acquire" beginnen bereits bündig Aufnahmen eingehalten Zellen für alle Sub-Phasen (Abb. 2 b).
      Hinweis: Das imaging Modulfenster und die Kamerasteuerung zeigt nun Bilder, die aufgenommen werden, sind und die Karte, SRA und MDA-Modul wird nicht mehr sichtbar sein. Aufgenommenen Bilder zeigen auch einen Timer auf der Seite, an der Bildnummer gefangen und die Zeitspanne, bevor der nächste Zyklus der Bild-Erfassung startet. Warten Sie, bis eine Runde Bilder, bevor Sie mit dem nächsten Schritt erfasst werden.
      Hinweis: Verwenden Sie die Schaltflächen 'Pause' oder "Mark Event" nicht auf dem imaging Modul-Fenster-Bildschirm. Halten Sie ab diesem Zeitpunkt während des Experiments die Maus nur auf die Kontrolle-Modul-Fenster auf dem zweiten Bildschirm (Abbildung 2A). Dies ist wichtig, nicht zu stören das imaging Modulfenster.
    2. In der Steuerung Modul Fenster Aufenthalt auf den manuellen Modus für die Platte. Im Bereich Schere, Flow-Modus auf konstante und maximale Querkraft auf eingestellt 1 dyn/cm2 (0,1 Pa). Klicken Sie auf Anschluss Brunnen O1, O7, O13 und O19, um den Fluss der Medien vom Einlass, Auslass Wells (Abbildung 2A) zu beginnen, nicht eingehalten Zellen zu entfernen. Nach 5 min klicken Sie auf die Stopp-Taste im Bereich well-Platte. Lassen Sie für eine zweite Runde der Bilder erworben werden. Bilder visualisiert werden und die Zeitspanne auf dem zweiten Bildschirm im Modulfenster imaging überwacht werden kann.
    3. Im Bereich Schere, anpassen der max Schubfluss 0,5 dyn/cm2 (0,5 Pa) durch Klicken auf die Nummer im Feld Max Scherkraft, Spalte und verwenden der Tastatur zum Eingeben von 0,5. Drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, und bestätigen Sie die Änderung im Durchfluss in das Ereignisprotokoll in der Steuerelement-Modul-Fenster (Abbildung 2A). Lassen Sie das Experiment ungestört in der Dunkelheit für 12 h.
      Hinweis: Einwirkung von Licht und Bewegung/Vibrationen können die Qualität der Bilder, die das Experiment erworbenen stark reduzieren. Am Ende des Experiments mikrofluidischen bildgebenden Modulfenster zeigt keine Bilder und kehrt zurück zu zeigen die SRA, Karte und MDA-Module. Die Software zur Abbilderstellung Modul kann verwendet werden, um die Bilder ansehen, montieren Sie die Videos und quantifizieren die Biofilme gebildet (unten beschrieben).

    7. Analyse der Ergebnisse

    1. Wählen Sie im imaging Modulfenster die Registerkarte Analyse-Tools und klicken Sie auf "Multi-Dimensional Bewertungsdaten" (RMD) aus dem Drop-down-Menü. Klicken Sie im RMD-Modul auf "Select Base File". Dadurch wird das "Multi-Dimensional Datensatz Utilities" Fenster geöffnet.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Verzeichnis auswählen" und wählen Sie den Ordner, die verwendet wurde, um das Experiment im Schritt 5.1 zu retten. Wählen Sie in der Liste "Datensätze" Experiment Dateiprotokoll (Endekennug-Erweiterung). Sobald das Protokoll geladen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche "anzeigen".
    3. Wählen Sie die Wellenlänge durch Klicken auf Optionen im Menü links "Wellenlänge" und die Tischposition um ein Dropdown Menü anzuzeigen. Wählen Sie das Bild von den Zahlen auf der Oberseite des Moduls zu laden, mit der rechten Maustaste die Bildnummer. Einmal ausgewählt, klicken Sie auf die Taste "Bilder laden", um die Bilder zu laden. Sie können ein Bild oder alle Bilder auf einmal anzeigen.
    4. Wählen Sie alle Bilder ein Zeitraffer-video zu machen. Die ausgewählten Bilder werden als Video in einem neuen Fenster öffnen. Klicken Sie auf der Registerkarte "Datei" im Fenster "imaging Modul" und wählen Sie "Speichern unter" aus dem Dropdown-Menü. Speichern Sie das resultierende Video als die Standard-Datei (TIFF/MetaSeries).
    5. Öffnen Sie und laden Sie die gespeicherte Videodatei mit ImageJ-Software. ImageJ klicken Sie auf die Registerkarte "Datei" und klicken Sie auf "Speichern unter". Wählen Sie ".avi" aus der Drop-Down-Menü und Konvertieren der das in eine AVI-Datei unter Verwendung der JPEG-Konvertierung, 10 Bilder/s eingestellt.
      Hinweis: Die Geschwindigkeit des Videos kann durch Veränderung der Bilder/s eingestellt werden.
    6. Quantifizierung des Biofilms, wiederholen Sie die Schritte 7.2, 7.3 und 7.4.
    Wählen Sie das letzte Bild (Nr. 144), und klicken Sie auf "Bilder laden"-Taste, um das Bild zu laden. Das Bild wird in einem neuen Fenster geöffnet. Klicken Sie auf "Schwelle Bild" und wählen Sie "Inclusive" Schwelle. Bewegen Sie den Mauszeiger, bis die Biofilm-Zellen rot gefärbt sind, und Regionen mit keine Zellen sind nicht gefärbt.
  • Klicken Sie auf "Open Log" Messungen anmelden (die Schaltfläche erscheint nur anfangs 'Open Log'; Sobald ein Protokoll aktiv ist die Schaltfläche "wird umbenannt zu ' F9: Log-Daten"). Wählen Sie im Fenster 'Open Data Log' "Dynamic Data Exchange" und klicken Sie auf "ok."
  • Wählen Sie im imaging Modulfenster die Registerkarte Analyse-Tools, und klicken Sie auf "Zeigen Statistiken zu einer Region". Dies öffnet ein neues Fenster mit Messungen aus dem Bild. Wählen Sie "Ganzes Bild" in die "Maßnahme" verfügbaren Optionen und klicken Sie auf "F9: Log-Daten." Eine Excel-Datei mit allen Messungen wird angezeigt. Suchen Sie die Werte für "Bereich" und "Thresholded" und teilen Sie der letzteren durch Ersteres einen numerischen Wert für die Fläche der Biofilm zu erhalten.
    Hinweis: Der "Raum" für jedes Bild, erhalten während des Experiments ist identisch und somit kann die Thresholded Flächenmessung verwendet werden, um Unterschiede in der Biofilmbildung zwischen Wildtyp Stämme und mutierte Stämme zu bewerten oder die Wirksamkeit von der getestete Medikament auf Biofilmbildung.
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    Representative Results

    Wir führten mikrofluidischen Biofilm Assays beschrieben hier mit einem Wildtyp C. Albicans Belastung Bedingungen zwei Medien (RPMI-1640 und Spider Media), der Wildtyp Stamm in der Gegenwart bekannte antimykotische Wirkstoff Amphotericin B (16 µg/mL) in RPMI, und zwei mutierte Stämme zuvor berichtet, dass Mängel in Biofilmbildung (bcr1Δ/Δ und efg1 Δ/Δ) in Spider Media.

    Video 1 zeigt die Entwicklung der Wildtyp Biofilm in RPMI-1640 Medium und die Auswirkungen der pilzbefallverhütende Droge, Amphotericin B, auf Biofilmbildung. Wildtyp Bedingungen mehrere Zellen stark zu halten, um den Kanal, die Zellen bilden Pilzfäden mit fortschreitender Zeit und ein dicken Biofilm mit verschuppen Hyphen beobachtet werden und Hefezellen. Gegen Ende des Experiments mikrofluidischen füllt der Wildtyp Biofilm vollständig aus der Anzeigekanal. Das Vorhandensein von Amphotericin B, hat jedoch eine ausgeprägte Wirkung auf die Verringerung des Biofilms. Insbesondere die Einhaltung der Zellen wird vermindert, und im Gegensatz zu unbehandelten Bedingungen in Gegenwart von Amphotericin B, können mehrere Zellen wegfließen mit dem Schubfluss der Medien gesehen werden. Als die Zeit fortschreitet, werden die Zellen nicht Form Hyphen und ein Biofilm bildet sich nicht. Diese Unterschiede sind auch in Abbildung 3gezeigt, die 4 Zeitpunkten aus der Assay bei 0 h, 2 h, 6 h und 12 h zeigt.

    Video 2 zeigt die Entwicklung der Wildtyp Biofilm und zwei zuvor Biofilm-defekt-Mutanten (bcr1 Δ/Δ und efg1 Δ/Δ) in Spider-Medien berichtet. Beide bcr1 -Δ/Δ und efg1 -Δ/Δ-Stämme zeigen stark reduzierten Biofilmbildung im Vergleich zu den isogenen Wildtyp Stamm. Für die efg1 Δ/Δ Sorte beobachteten wir, dass die haften Zellen keine Hyphen bilden und der daraus resultierenden Biofilm stark defekt ist. Für den bcr1 -Δ/Δ-Sorte, wir beobachteten, dass die bcr1 Δ/Δ Belastung Defekt in Biofilmbildung, aber es ist nicht nur zeigt eine klare Einhaltung defekt, wo Zellen gesehen werden kann in Richtung des Schubflusses driften, da sie nicht zur Einhaltung der Anzeigekanal. Diese Unterschiede sind auch in Abbildung 4dargestellt, die 4 Mal Punkte aus dem Assay bei 0 h, 2 h, 6 h und 12 h zeigt.

    Figure 1
    Abbildung 1: mikrofluidischen Instrument in diesem Experiment verwendet. Zentrale A zeigt die mikrofluidischen Instrument verwendet, Panel -B zeigt der Schnittstelle Platte Panel C zeigt einen schematischen Überblick über ein einzelnes Anzeigekanal (Bühne) und drei Sub-Phasen während des Experiments von der Kamera eingefangen und Panel D zeigt einen schematischen Überblick über die 48-Well mikrofluidischen Platte mit einer schematischen Ablauf und Zulauf Brunnen und Sichtfenster verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 2
    Abbildung 2: Wählen Sie Screenshots von imaging-Modulesoftware und mikrofluidischen Platte Kontrollsystem. Zentrale A zeigt das Steuermodul, das die Steuerelemente für die Mikrofluidik Platte enthält, und zentrale B imaging Modul-Fenster, die "bewegen Stage zur Absolutposition" (MAP)-Modul, das Modul "Multi-Dimensional Erwerb" (MDA) und das Modul "Probe Reload Anpassung" (SRA). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 3
    Abbildung 3: Exposition gegenüber Amphotericin B ergibt sich Biofilm Formation Mängel. Zeit abhängige Visualisierung der Biofilmbildung in RPMI-1640 (Spalte1), und RPMI-1640 Medien mit 16 µg/mL Amphotericin B (Spalte 2) unter dynamischen Fluss (0,5 dyn/cm2) bei 37 ° C für 12 h nach Einhaltung in mikrofluidischen System ergänzt. Repräsentative 0 h (nach dem Beitritt und seine ersten Waschen), 2 h, 6 h und 12 h Bilder (von oben nach unten) sind für die isogene Wildtyp Stamm SN250 gezeigt (Spalten 1 und 2). Maßstabsleisten sind 20 µm in jeder Gruppe. Entsprechende Zeit-Zeitraffer-Videos der Biofilmbildung sind in Video 1zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 4
    Abbildung 4: Löschen von BCR1 oder EFG1 führt Biofilm-Bildung-Mängel. Zeit abhängige Visualisierung der Biofilmbildung in Spider Media (Spalten 1-3) unter dynamischen Fluss (0,5 dyn/cm2) bei 37 ° C für 12 h nach Einhaltung in mikrofluidischen System. Repräsentative 0 h (nach dem Beitritt und seine ersten Waschen), 2 h, 6 h und 12 h Bilder (von oben nach unten) sind für die isogene Wildtyp Stamm SN250 gezeigt (Spalte 1), bcr1Δ/Δ Belastung (Spalte 2) und efg1 Δ/Δ Belastung (Spalte 3). Maßstabsleisten sind 20 µm in jeder Gruppe. Video 2verfügen über entsprechende Zeit-Zeitraffer-Videos der Biofilmbildung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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    Discussion

    Anpassbare mikrofluidischen Biofilm Assays hier beschriebenen ermöglicht die Visualisierung der Biofilmbildung in Echtzeit auf eine Einzelzelle Niveau, wenn eine Pauschale Laminar-Flow und konstante Temperatur ausgesetzt. Freuen Sie sich auf ein mächtiges Mittel, um die Entwicklung von Biofilmen in Wildtyp und Mutanten Stämme zu studieren, und die Auswirkungen der antimikrobielle Wirkstoff Behandlungen auf Biofilme unter Bedingungen, die physiologische Bedingungen nachahmen im klinischen Umfeld beobachtet. Im Gegensatz zu den meisten in-vitro- Biofilm-Assays, diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung Biofilm in Echtzeit wie es bildet.

    Diese Methode kann in gewissem Hochdurchsatz-verwendet werden, wo können bis zu 24 Proben werden gleichzeitig ausführen, um die Biofilmbildung zu beurteilen. Die Methode kann auch zur Durchführung von genetischen Bildschirme von mutierten Bibliotheken, für normale Biofilm Entwicklung notwendigen Gene zu identifizieren und kann verwendet werden, um die Effektivität gegen Biofilme antimikrobielle Verbindungen des Interesses an Substanzbibliothek Bildschirme zu beurteilen. Wir gehen davon aus, dass zukünftige Anwendungen des Gerätebetriebs mikrofluidischen solche Bildschirme enthalten werden. Wir beachten Sie jedoch, dass bestimmte Drogentests Behandlung durch die Dicke des Biofilms gebildet mit diesem mikrofluidischen Gerät als Biofilme für gewachsen begrenzt werden > 16 h sind in der Regel die Anzeigekanal verstopfen. So müssen Drogentests Experimente durchgeführt werden, für < 16 h.

    Insgesamt ist dieses Gerät ist hochgradig anpassbar und vielseitig, und kann angepasst werden, um verschiedene Mikrobenarten über Königreiche, Durchflussraten, Temperaturen, Inkubationszeiten und Medien zu bewerten. Die beschriebene Methode informiert über eine Reihe von verschiedenen Aspekten der Biofilmbildung, einschließlich der Einhaltung der ursprünglichen Zelle, Biofilm Reifung und Zelle Zerstreuung. Obwohl wir nur Ergebnisse für einzelne Arten Biofilmbildung hier berichten, könnte dieses Protokoll auch Doppel - und mixed-Arten Biofilmbildung studieren angepasst.

    Zwei Schritte sind entscheidend für dieses Protokoll erfolgreich durchführen. Erstens müssen Luftblasen im System vermieden werden, durch die Medien bei der experimentellen Temperatur vorheizen. Eine gemeinsame Fehltritt ist die Verdünnung der Zellen in den Medien, die nicht vorgewärmt wurde. Zellen sollten in demselben Medium verdünnt werden, die für die Einlass-Brunnen verwendet wird. Zweitens, den Fluss der Zellen vom Auslass Einlass, die Brunnen müssen sorgfältig überwacht werden; Wenn die Zellen weit fließen, die Einlass-Medien kontaminiert werden und das Experiment wird nicht interpretierbaren Ergebnissen. Auf der anderen Seite, wenn die Zellen nicht erlaubt sind, ganz in der Anzeigekanal zu bewegen dann keine Zellen während des Experiments im Kanal angezeigt werden, führen zu leere Bilder. Weitere wichtige Punkte im Auge behalten werden, dass das Volumen und die Bewegung zwischen den Brunnen in der Mikrofluidik-Platte miteinander, für jede Spalte verknüpft sind, und es wichtig ist, so viel Medien-Konsistenz wie möglich zu halten (mit ähnlicher Viskosität, Dichte, Handy und Zusammensetzung) und ähnlich große Zellen (wenn möglich), wie verschiedene Medien und verschiedene Zellgrößen verschiedene Durchflussmengen in der Spalte haben. Während des Versuchs der Rückfluss der Zellen unter dem Mikroskop überwacht; jedoch können nur zwei Kanäle gleichzeitig (mit einem 10 X-Objektiv) angezeigt werden. So, es wird dringend empfohlen, ein mock Experiment zur Messung der Zeit benötigt, um vom Auslass Einlass Brunnen mit den Zellen fließen durchführen und Medien in das eigentliche Experiment verwendet werden sollen.

    Im Allgemeinen empfehlen wir die Verwendung des mikrofluidischen Biofilm Assays als ein in-vitro- Test, bevor Sie in Vivo Tierversuche genutzt werden. Der Test ist jedoch immer noch ein in-vitro- Test und Ergebnisse werden in relevanten Tiermodellen überprüft werden müssen. In unsere Erfahrungen, die Ergebnisse des mikrofluidischen Biofilm Assays hatten den besten Vorhersagewert für in Vivo Biofilm Assays im Vergleich zu anderen in-vitro- Tests haben wir14bewertet.

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    Disclosures

    Clarissa J. Nobile ist einer der Gründer von BioSynesis, Inc., ein Unternehmen für die Entwicklung von Inhibitoren und Diagnostik von C. Albicans Biofilmen.

    Acknowledgments

    Wir danken allen Mitgliedern des Nobile Lab für hilfreiche Diskussionen an Biofilm-Assays. Diese Studie wurde von der National Institutes of Health (NIH) Stipendium R21 AI125801 (C.J.N.) unterstützt. D.L.R. wurde durch ein Promotionsstipendium von der University of California Institute für Mexiko und den Vereinigten Staaten (UC-MEXUS) und Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT) unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
    Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
    ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast Extract Criterion C7341
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677
    Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
    Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
    MOPS Sigma-Aldrich M3183
    Nutrient Broth Criterion C6471
    Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
    Agar Criterion C5001
    Amphotericin B Corning 30-003-CF
    Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
    Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
    Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
    Lens Paper VWR 52846-001
    Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
    Shaking Incubator Eppendorf M12820004

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
    2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
    3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
    4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
    5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
    6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
    7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
    8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
    9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
    10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
    11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
    12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
    13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
    14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
    15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
    16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
    17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
    18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
    19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

    Tags

    Infektionskrankheiten Ausgabe 130 Biofilm Candida Albicans Visualisierung mikrofluidischen Gerät in-vitro- Biofilm-Assays Biofilm Methoden Biofilm Protokolle Biofilm Bildschirme Laminar-flow
    Visualisierung der Biofilmbildung in <em>Candida Albicans</em> ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät
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    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, More

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

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