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Immunology and Infection

Candida albicans में फिल्म निर्माण के दृश्य एक स्वचालित Microfluidic डिवाइस का उपयोग

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

Summary

इस प्रोटोकॉल एक अनुकूलन स्वचालित microfluidic डिवाइस के उपयोग के लिए Candida albicans में मेजबान शारीरिक स्थितियों के तहत फिल्म निर्माण कल्पना का वर्णन ।

Abstract

Candida albicans मनुष्य के सबसे आम कवक रोगज़नक़ है, अस्पताल के बारे में 15%-पूति मामलों का अधिग्रहण किया । सी. albicans की एक प्रमुख डाह विशेषता है, जो कि बायोटिक और अजैव सतहों से जुड़ी हुई कोशिकाओं के संरचित समुदायों को, के रूप में बनाने की क्षमता है । C. albicans जैव फिल्म होस्ट ऊतकों, जैसे श्लैष्मिक परतों, और चिकित्सा उपकरणों पर, जैसे कैथेटर, पेसमेकर, डेंचर, और संयुक्त कृत्रिम पर प्रपत्र कर सकते हैं । वे अत्यधिक शारीरिक और रासायनिक perturbations के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, क्योंकि जैव फिल्म महत्वपूर्ण नैदानिक चुनौतियों मुद्रा, और प्रसार संक्रमण बीज के लिए जलाशयों के रूप में कार्य कर सकते हैं. इन विट्रो परख में विभिंन ऐसे microtiter प्लेट परख, शुष्क वजन माप, सेल व्यवहार्यता परख के रूप में सी. albicans फिल्म गठन, अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है, और फोकल स्कैनिंग लेजर माइक्रोस्कोपी । इन सभी की परख एकल अंत बिंदु परख रहे हैं, जहां फिल्म निर्माण एक विशिष्ट समय बिंदु पर मूल्यांकन किया है । यहां, हम लामिना प्रवाह की स्थिति के तहत एक स्वचालित microfluidic डिवाइस का उपयोग कर वास्तविक समय में फिल्म निर्माण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस विधि की अनुमति देता है के रूप में फिल्म के गठन के अवलोकन के लिए इस तरह के समय के साथ विकसित, अनुकूलनीय शर्तों का उपयोग कर रहे है कि उन लोगों के रूप में मेजबान की नकल, संवहनी कैथेटर में सामना करना पड़ा । इस प्रोटोकॉल को जेनेटिक म्यूटेंट के साथ-साथ रीयल-टाइम में फिल्मी विकास पर रोगाणुरोधी एजेंटों के निरोधात्मक इफेक्ट का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

Candida albicans मानव microbiota के एक खानेवाला सदस्य है, लेकिन यह भी एक अवसरवादी रोगज़नक़, सतही और गंभीर कवक संक्रमण के कारण1,2में सक्षम है । सी albicans की एक प्रमुख डाह विशेषता है अपने को लचीला और दवा प्रतिरोधी फिल्म फार्म, कोशिकाओं के समुदायों के एक सतह का पालन करने की क्षमता है और एक extracellular मैट्रिक्स सामग्री में संलग्न1,3। C. albicans फिल्म के उच्च संरचित कर रहे हैं, कई कोशिका प्रकार (दौर नवोदित खमीर-प्रपत्र कोशिकाओं, अंडाकार pseudohyphal कोशिकाओं, और ट्यूबलर hyphal कोशिकाओं)4की अनेक परतों से युक्त । C. albicans फिल्म विकास दौर खमीर के पालन के साथ शुरू होता है एक सतह के लिए फार्म का कोशिकाओं (बोने की संरचना), सतह पर इन कोशिकाओं के प्रसार के बाद, और फिर अपरिपक्व फिल्म संरचना की परिपक्वता में एक पूरी तरह से गठन किया है कि extracellular मैट्रिक्स सामग्री से घिरा हुआ है फिल्म4। परिपक्व फिल्म मुख्यतः लंबी hyphal कोशिकाओं से बना है कि घने और परस्पर नेटवर्क के रूप में, के लिए वास्तुकला स्थिरता प्रदान कर रहा है फिल्म4। इस फिल्म के जीवन चक्र के दौरान, गोल नवोदित खमीर कोशिकाओं परिपक्व फिल्म से फैलाने, और शरीर के अंय क्षेत्रों के लिए यात्रा कर सकते है प्रसार संक्रमण या बीज अंय साइटों4,5में नई फिल्मों का कारण । C. albicans बायोटिक सतहों पर, जैसे श्लैष्मिक सतहों और पूरे मेजबान ऊतक पर, और अजैव सतहों पर, जैसे कैथेटर, पेसमेकर, डेंचर, और कृत्रिम जोड़ों के रूप में कर सकते हैं । इस वजह से, वे बेहद कठिन है, और कई मामलों में, केवल प्रभावी उपचार रणनीति संक्रमित डिवाइस को हटाने के लिए है4में । यह इस प्रकार नैदानिक सेटिंग्स में मनाया उन के लिए इसी तरह की शर्तों के तहत फिल्म निर्माण की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

सी. albicans 6,7,8के अध्ययन के लिए प्रयुक्त vivo पशु मॉडलों में कई महत्वपूर्ण हैं; हालांकि, इन अध्ययनों महंगा हो सकता है, समय लगता है, और उपभेदों और रोगाणुरोधी एजेंटों की संख्या है कि एक निश्चित समय पर परीक्षण किया जा सकता द्वारा सीमित कर रहे हैं । इन विट्रो में दूसरी ओर फिल्म परख, तेजी से, उच्च रोधी यौगिकों और उत्परिवर्ती उपभेदों के प्रवाह का आकलन करने के लिए अनुमति देते हैं, और कर रहे है और अधिक लागत प्रभावी और नैतिक फिल्म की तुलना में एथिकल पशु मॉडल9में किए गए परख, 10,11,12,13,14. यहां हम इन विट्रो परख का वर्णन है कि हम विकसित और लामिना प्रवाह के तहत एक अनुकूलन microfluidic डिवाइस14,15का उपयोग करते हुए अस्थाई फिल्म गठन का पालन अनुकूलित । परख, प्रारंभिक पालन कदम, सेल प्रसार, फिल्मी परिपक्वता, और सेल फैलाव सहित, फिल्म निर्माण के प्रत्येक चरण के दृश्य के लिए अनुमति देता है । परख भी एक फिल्म के विकास में सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन कल्पना उपयोगी है ।

Microtiter प्लेटें, जो आम तौर पर इन विट्रो में के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि उच्च प्रवाह, नियंत्रित प्रवाह की स्थिति के लिए अनुमति नहीं है । पारंपरिक लामिना फ्लो सेल सिस्टम नियंत्रित प्रवाह की स्थिति में लगातार फिल्म गठन के आकलन के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन इन अक्सर समय के लिए स्थापित करने के लिए और सीमित गतिशील रेंज नियंत्रण और प्रवाह है करते हैं । microfluidic डिवाइस यहां का उपयोग उच्च प्रवाह प्लेटों के संयोजन से इन सीमाओं पर काबू (४८ कुओं युक्त) एक निर्मित लामिना प्रवाह कक्ष के साथ और उच्च प्रतिलिपि, बहुमुखी है, और अनुकूलन ।

यहां, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित microfluidic डिवाइस के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक जंगली-type C. albicans तनाव, एक के विकास पर एक ज्ञात रोधी एजेंट के प्रभाव के निर्माण का आकलन करने के लिए, और फिल्म दो उत्परिवर्ती उपभेदों में गठन (bcr1Δ/Δ और efg1 Δ/Δ) है कि पहले से इन विट्रो में और vivo16,17,18में फिल्मी दोष है की सूचना दी गई । वर्णित प्रोटोकॉल एक फिल्म के विकास के दौरान में बाधा फिल्म गठन को बाधित में रोगाणुरोधी एजेंटों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और उत्परिवर्ती पुस्तकालयों स्क्रीनिंग द्वारा सामान्य फिल्म विकास के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए.

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Protocol

1. फंगल सेल कल्चर की तैयारी

नोट: आचरण सेल संस्कृति काम (अर्थात् खोलने क्रायोजेनिक स्टॉक ट्यूबों, सेल संस्कृति ट्यूबों, और कुप्पी) एक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर । कैबिनेट की पराबैंगनी (यूवी) प्रभावाधीन लैंप पर बारी से कम 1 ज काम करने से पहले, और बंद यूवी चिराग बारी है, जबकि सक्रिय रूप से कैबिनेट में काम कर रहे । दस्ताने, सुरक्षा चश्मा पहनते हैं, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण, और पीठ की सतह को दूषित और प्रयोग के शुरू करने से पहले ७०% इथेनॉल के साथ पिपेट । बुनियादी रोकनेवाला सूक्ष्मजीवविज्ञानी तकनीकों के साथ बाँझ फिल्टर सुझावों और अपनेपन का उपयोग की सिफारिश कर रहे हैं.

  1. लकीर सी. albicans उपभेदों (जंगली-प्रकार, bcr1 Δ/Δ, और efg1 Δ/Δ) खमीर निकालने पर peptone डेक्सट्रोज (YPD) मध्यम (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% ग्लूकोज; pH ६.८) आगर प्लेट्स । ४८ घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन, मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रथाओं के बाद19।
  2. YPD तरल मध्यम के 4 मिलीलीटर (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% ग्लूकोज, पीएच ६.८) और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक मिलाते हुए मशीन में २२५ rpm पर मिलाते के साथ लगाना के लिए एक एकल पृथक कॉलोनी का चयन करें 12-15 एच, निंनलिखित मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी prac के लिए tices१९.
  3. एक cuvette (1 मिलीलीटर, 1 सेमी पथ की लंबाई) में ६०० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) को मापने के द्वारा संस्कृति के सेल घनत्व का निर्धारण, मानक सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रथाओं के बाद19।
  4. सेल संस्कृति को कमजोर करने के लिए एक अंतिम आयुध डिपो६०० ०.५, 2 x 107 कोशिकाओं के समकक्ष/एमएल, रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (RPMI) में-१६४० मध्यम (१६५ मिमी 3 युक्त-morpholinopropane-1-sulfonic एसिड (MOPS), एल Glutamine, और सोडियम के बिना बिकारबोनिट, पीएच ७.०) या मकड़ी मध्यम (1% पोषक तत्व शोरबा, 1% mannitol, ०.४% कश्मीर2HPO4, पीएच ७.२) ।
    नोट: वैकल्पिक मीडिया के लिए ब्याज की उपभेदों के विशिष्ट विकास का समर्थन किया जा सकता है ।
    नोट: सेल के कमजोर पड़ने को पहले से ज्यादा न बनाएं । यह कदम ३.३ के बाद कमजोर पड़ने शुरू की सिफारिश की है (नीचे वर्णित) क्रम में hyphae गठन की दीक्षा को रोकने के लिए कोशिकाओं से पहले की जा रही देखने के चैनल में वरीयता प्राप्त है ।

2. Microfluidic प्लेट के Microfluidic चैनलों की तैयारी

नोट: microfluidic प्रणाली के उपयोगकर्ता पुस्तिका का संदर्भ लें (सामग्री की तालिका देखें) प्लेटों और साधन सेटअप के बारे में जानकारी के लिए ।

  1. microfluidic प्रयोग चलाने से पहले, गर्म RPMI के 20 मिलीलीटर-१६४० मीडिया या मकड़ी मीडिया एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर । चरण २.८ में परिकलनों के आधार पर अतिरिक्त मीडिया खंड की आवश्यकता हो सकती है । पूर्व वार्मिंग मीडिया प्रयोग के दौरान हवा के बुलबुले के गठन को रोकता है ।
  2. microfluidics प्रणाली है जो नियंत्रक, दो बिजली की आपूर्ति इकाइयों, माइक्रोस्कोप, कैमरा, और कंप्यूटर प्रणाली से जुड़ी शामिल चालू करें । कंप्यूटर पर प्रोग्राम मेनू से सिस्टम (सामग्री तालिका देखें) को नियंत्रित करता है जो सॉफ़्टवेयर खोलें । प्रोग्राम खोले जाने के बाद दो विंडो दिखाई देंगी ।
  3. उपयोग में प्लेट की पट्टी कोड संख्या की स्थिति जानें और जब सॉफ़्टवेयर द्वारा संकेत संख्या इनपुट । दो खिड़कियों पर सॉफ्टवेयर देखने के लिए दो अलग कंप्यूटर स्क्रीन का उपयोग करें । एक खिड़की (नियंत्रण मॉड्यूल) प्लेट के लिए नियंत्रण और दूसरी खिड़की (असेंबल, इमेजिंग मॉड्यूल) शामिल माइक्रोस्कोप और कैमरा के लिए नियंत्रण शामिल हैं ।
  4. नियंत्रक पर हीटर बिजली बटन पर स्विच और ३७ डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रक पर तीर बटन का उपयोग करने के लिए microfluidics प्रणाली तापमान सेट ।
  5. इस प्रकार के रूप में बाँझ पानी का उपयोग इंटरफेस प्लेट (चित्रा 1) साफ. बाँझ पानी के साथ थाली के नीचे स्प्रे और लेंस कागज का उपयोग करने के लिए गंदगी को हटाने/ आराम अंतरफलक प्लेट स्वच्छ लेंस कागज पर नीचे चेहरा हवा सूखी । ७०% isopropanol और लेंस कागज का उपयोग अंतरफलक प्लेट के ऊपर साफ ।
    नोट: इंटरफ़ेस प्लेट microfluidic सिस्टम को उस प्लेट से जोड़ता है जिसमें सेल और मीडिया शामिल होंगे । सुनिश्चित करें कि कोई तरल नहीं रहता है और है कि सभी तंतुओं और गंदगी हटा रहे हैं । अनुचित सफाई कम गुणवत्ता छवियों और वीडियो में परिणाम हो सकता है ।
  6. अंतरफलक प्लेट पर ट्यूबों से संघनित्र निकालें ।
    1. प्लेट चेहरा नीचे लेंस कागज पर आराम कर छोड़ दें । प्लेट के लिए मैनुअल मोड पर नियंत्रण मॉड्यूल विंडो में क्लिक करें । कतरनी नियंत्रण मेनू अनुभाग में, स्तंभों के लिए द्रव चयन पर क्लिक करें 1-4 और 5-8, और ड्रॉप-डाउन मेनू से ३७ ° c का चयन करें । कतरनी नियंत्रण अनुभाग में, स्थिर करने के लिए प्रवाह मोड सेट और 2 डाइन/cm2 (०.२ Pa) (चित्रा 2a) के लिए अधिकतम कतरनी सेट ।
    2. प्रवेश कुओं पर क्लिक करें अंतरफलक प्लेट ट्यूबों के माध्यम से बाँझ हवा का प्रवाह शुरू करने के लिए संघनित्र को हटा दें । 5 मिनट के बाद, अच्छी तरह से प्लेट नियंत्रण खंड (चित्र 2a) में रोकें बटन पर क्लिक करें. इंटरफेस प्लेट में ट्यूबों का निरीक्षण करने के लिए पुष्टि करें कि सभी संघनित्र हटा दिया गया है । अगर बूंदें अभी भी दिखाई दे रहे हैं, बाँझ हवा के प्रवाह को दोहराने, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, एक और 5 मिनट के लिए ।
      नोट: प्रवेश ट्यूबों ०.२२ माइक्रोन फिल्टर से जुड़े रहे है सुनिश्चित करने के लिए केवल बाँझ हवा microfluidics प्रणाली के लिए शुरू की है । प्रवाह नियंत्रण मॉड्यूल विंडो में स्क्रीन पर ईवेंट लॉग द्वारा मॉनिटर किया जा सकता है ।
  7. माइक्रोस्कोप स्टेज पर ४८-well 0-20 डाइन microfluidic प्लेट लगाएं ।

3. Candida albicans Microfluidic प्रणाली में फिल्म गठन

  1. फिल्म गठन रिकॉर्ड करने के लिए, पूर्व गर्म RPMI के ६०० µ एल जोड़ने-१६४० मध्यम या प्रवेश कुओं को मकड़ी माध्यम (प्लेट लेआउट के लिए चित्रा 1 देखें) । प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए दो प्रतिकृति है ।
    1. परीक्षण के लिए सी albicans वंय-प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों की फिल्म के गठन के लिए, जोड़ें ६०० µ एल स्पाइडर मध्यम प्रयोग प्लेट के कुओं के प्रवेश के लिए ।
    2. रोधी दवाओं (या ब्याज की अंय यौगिकों) की उपस्थिति में फिल्म के गठन के परीक्षण के लिए, जोड़ें ६०० µ एल के RPMI-१६४० मध्यम से दो कुओं (नकारात्मक नियंत्रण) और ६०० µ एल के RPMI-१६४० मध्यम amphotericin बी के साथ पूरक (16 µ g/एमएल) (या पसंद की दवा पर वांछित एकाग्रता) दो अंय प्रवेश कुओं के लिए ।
      नोट: एक 12 एच के लिए फिल्म निर्माण प्रयोग, पूर्व के ६०० µ एल जोड़-प्रवेश कुओं को मीडिया गर्म । लंबे समय तक प्रयोगों के लिए प्रवेश कुओं के लिए अतिरिक्त मीडिया (५० µ एल/ अच्छी तरह से (१,५०० µ एल) की अधिकतम मात्रा से अधिक नहीं है ।
  2. धीरे ४८ अच्छी तरह से microfluidic प्लेट के शीर्ष पर साफ इंटरफ़ेस प्लेट कम । स्लाइड अंतरफलक प्लेट थोड़ा छोड़ दिया जब तक दौर थाली पर ट्यूब प्रवेश और आउटलेट कुओं के शीर्ष पर तैनात हैं ।
बाएं से इंटरफेस प्लेट पर लीवर की स्थिति में इंटरफेस प्लेट ताला करने के लिए सही करने के लिए, प्रयोग सुनिश्चित करने के वाटरप्रूफ है बारी ।
नोट: अंतरफलक की थाली में ट्यूबों से बाँझ हवा का प्रवाह प्रवेश या आउटलेट कुओं में तरल धक्का होगा (कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चयनित दिशा पर निर्भर करता है), इतना है कि तरल प्रवेश और आउटलेट के बीच देखने के चैनल के माध्यम से बहती है अनुकूलित दिशा और उपयोगकर्ता द्वारा तय की गति में वेल्स ।
  • कतरनी नियंत्रण अनुभाग में, स्थिर करने के लिए प्रवाह मोड सेट और 1 डाइन/cm2 (०.१ Pa) के लिए अधिकतम कतरनी सेट । मीडिया के साथ प्रवेश कुओं पर क्लिक करें आउटलेट कुओं के लिए प्रवेश से मीडिया के प्रवाह शुरू (चित्रा 2a) के लिए प्रधानमंत्री चैनल । 5 मिनट के बाद अच्छी तरह से प्लेट नियंत्रण अनुभाग में stop बटन पर क्लिक करें । इंटरफ़ेस प्लेट निकालें और microfluidic प्लेट कुओं का निरीक्षण । चैनलों को भड़काने के बाद, केवल मीडिया की एक छोटी सी बूंद आउटलेट कुओं में दिखाई जानी चाहिए । यदि ड्रॉप दिखाई नहीं देता है, प्रधानमंत्री 2 मिनट वेतन वृद्धि में चैनलों जब तक आउटलेट कुओं में मीडिया की छोटी बूंद दिखाई है ।
    नोट: भड़काने के लिए देखने के चैनलों से हवा निकालने और सुनिश्चित करना है कि चैनलों वांछित मीडिया से भर रहे है की आवश्यकता है ।
  • microfluidic प्लेट से अंतरफलक की थाली निकालें और यह एक बाँझ सतह पर अलग सेट । सेल संस्कृति के ५० µ एल जोड़ें (१.५ कदम में वर्णित) प्रत्येक आउटलेट अच्छी तरह से ।
    1. परीक्षण के लिए C. albicans वंय-प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों, जोड़ें ५० µ जंगली के प्रकार (SC5314) स्पाइडर मीडिया में सेल संस्कृति के दो आउटलेट कुओं को, स्पाइडर मीडिया में bcr1 Δ/Δ दो आउटलेट कुओं को, और मकड़ी मीडिया में efg1 Δ/दो आउटलेट कुओं को । अंतरफलक थाली microfluidic प्लेट पर वापस प्लेस और ढक्कन ताला (प्लेट लेआउट के लिए चित्रा 1 देखें) ।
      नोट: चरण 3.1.1 में वर्णित के रूप में, सभी संबंधित इनपुट वेल्स स्पाइडर मीडिया होते हैं ।
    2. परीक्षण के लिए सी albicans amphotericin बी या ब्याज के अंय यौगिक की उपस्थिति में फिल्म गठन, RPMI में जंगली प्रकार (SC5314) सेल संस्कृति के ५० µ एल जोड़ें-१६४० मध्यम चार आउटलेट कुओं के लिए । अंतरफलक थाली microfluidic प्लेट पर वापस प्लेस और ढक्कन ताला (प्लेट लेआउट के लिए चित्रा 1 देखें) ।
      नोट: 3.1.2 चरण में वर्णित के रूप में, सभी इसी इनपुट वेल्स के साथ और amphotericin B या ब्याज के अंय यौगिक के बिना RPMI-१६४० मीडिया होते हैं ।
  • कतरनी नियंत्रण अनुभाग में, स्थिर करने के लिए प्रवाह मोड सेट और 2 डाइन/cm2 (०.२ Pa) के लिए अधिकतम कतरनी सेट । आउटलेट कुओं पर क्लिक करें कोशिकाओं के साथ आउटलेट कुओं के लिए प्रवेश से मीडिया के प्रवाह शुरू (चित्रा 2a) के लिए सी. albicansके बोने शुरू करते हैं । के बाद 3 एस अच्छी तरह से प्लेट नियंत्रण खंड में stop बटन पर क्लिक करने के लिए इनपुट कुओं में प्रवेश करने से कोशिकाओं को रोकने के ।
    नोट: कोशिकाएं आउटलेट कुओं से प्रवेश कुओं की ओर ले जाया जाता है; यह आवश्यक है कि प्रवाह कोशिकाओं प्रवेश कुओं तक पहुंचने से पहले बंद कर दिया है । यह सुनिश्चित करता है कि प्रवेश कुओं सेल संस्कृति के साथ प्रदूषित नहीं है और है कि प्रवेश कुओं में मीडिया प्रयोग की अवधि के लिए बाँझ रहता है । कतरनी बल और समय की जरूरत इस्तेमाल किया मीडिया की चिपचिपाहट और कोशिकाओं के आकार पर आधारित है ।
  • प्रारंभिक कक्ष पालन के लिए देखने चैनल में 10-20 मिनट के लिए कोई प्रवाह (0 डाइन/cm2) के साथ स्थिर रहने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें । इस 10-20 मिनट पालन कदम के दौरान, कैमरा स्तर की स्थिति पर कब्जा करने के लिए कंप्यूटर की स्थापना की और पूर्व फ्लश छवियों (4-6 वर्गों में विस्तार से वर्णित) प्राप्त करना शुरू करते हैं ।

    • 4. Microfluidic प्रयोग के लिए मंच पदों की स्थापना

    नोट: स्टेज पदों और प्लेट अंशांकन बस प्रयोग शुरू करने से पहले सेट किया जाना चाहिए । इस सेटअप कंप्यूटर प्रयोग के दौरान छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रत्येक को देखने चैनल के पदों को स्टोर करने की अनुमति देता है । microfluidic प्लेट को स्टेज पोजिशन पर सेट करने के बाद परेशान नहीं होना चाहिए । यदि प्लेट ले जाई जाती है तो प्रयोग के शुरू होने से पहले स्टेज पोजिशन रिसेट करनी पड़ेगी ।

    1. चरण स्थितियां सेट करने के लिए विज़ुअलाइज़ेशन विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (सामग्री तालिका देखें) का उपयोग करें; प्रत्येक देखने चैनल एक मंच (1-24)(चित्र1 d) है और प्रत्येक चरण में देखने चैनल(चित्रा 1C) के साथ विभिन्न पदों पर छवि पर कब्जा करने के लिए तीन उप चरणों (1-3) है. इमेजिंग मॉड्यूल विंडो में, एमडीए टैब पर क्लिक करके ' बहु-आयामी अधिग्रहण ' (एमडीए) मॉड्यूल खोलें (चित्रा बी b).
    2. एमडीए मॉड्यूल में बाएं हाथ की ओर मेनू में ' स्टेज ' टैब पर क्लिक करें (चित्रा बी b). चरण अनुभाग में, ४८ well 0-20 डाइन microfluidic प्लेट के लिए मास्टर स्टेज सूची लोड । प्रत्येक दृश्य चैनल में छवि प्राप्ति के लिए तीन चरण होने चाहिए.
    3. ' नमूना पुनः लोड समायोजन ' (SRA) और ' चरण निरपेक्ष स्थिति के लिए ले जाएँ ' (मानचित्र) मॉड्यूल SRA टैब और मानचित्र टैब (चित्र b) पर क्लिक करके खोलें । SRA मॉड्यूल में, क्रॉसहेयर के साथ एक छवि पूर्वावलोकन देखने के लिए ' लाइव ' बटन दबाएँ.
    4. जॉयस्टिक का उपयोग करना, अच्छी तरह से थाली की स्थिति है कि इस तरह के तीर की नोक (शारीरिक रूप से प्लेट पर स्थित) चैनल को देखने के निकट 4 सॉफ्टवेयर पर क्रॉसहेयर के साथ संरेखित करता है । मानचित्र मेनू में, ' सेट Origin' बटन (चित्र b) दबाएं । वर्तमान स्थिति अब X, Y, और Z में 0 पढ़ा जाना चाहिए ।
    5. SRA मॉड्यूल में, बाएँ हाथ के मेनू में ' आरंभिक संदर्भ बिंदुओं ' अनुभाग पर क्लिक करें (चित्र b) । पर क्लिक करें ' लोड सेटिंग्स ' और ४८ अच्छी तरह से 0-20 डाइन microfluidic प्लेट के लिए फ़ाइल लोड ।
    6. एमडीए मॉड्यूल के मंच खंड पर, डबल पर क्लिक करें ' मंच स्थिति 22, 2 ' । इस स्थिति को देखने चैनल संख्या 22 के मध्य (उप चरण 2) इंगित करता है । यह माइक्रोस्कोप देखने के चरण और चैनल 22 को देखने के द्वारा तीर मार्कर के करीब निकटता में कैमरा ध्यान केंद्रित लाएगा । जॉयस्टिक का उपयोग करना, अच्छी तरह से थाली की स्थिति ऐसी है कि तीर की नोक (शारीरिक प्लेट पर स्थित) चैनल 22 को देखने के सन्निकट क्रॉसहेयर के साथ संरेखित करता है.
    7. SRA मॉड्यूल का ' अद्यतन संदर्भ अंक ' टैब में एमडीए मॉड्यूल में y की स्थिति में बिंदु 2 के y निर्देशांक की प्रतिलिपि बनाएँ (चित्र b) ।
    8. SRA के ' अपडेट स्टेज पोजिशन्स ' टैब में, ' एमडीएस स्टेज लिस्ट पर लागू करें ' (चित्रा बीसी) पर क्लिक कीजिये.
      नोट: इस प्लेट में सभी को देखने के चरण पदों (1-24) को माइक्रोस्कोप मंच पर विशिष्ट microfluidic प्लेट स्थिति पर तुले होने के लिए अद्यतन करेगा ।
    प्लेट अब छवि अधिग्रहण के लिए तैयार है और सभी 24 देखने चैनलों में तीन पदों से छवियों को कैप्चर करते समय स्थानांतरित करने के लिए नपे मंच पदों का उपयोग करेगा ।

    5. Microfluidic प्रयोग के दौरान छवि कैप्चर के लिए अधिग्रहण की स्थापना

    1. इमेजिंग मॉड्यूल विंडो में, एमडीए मॉड्यूल का उपयोग करें और बाएँ हाथ के मेनू में ' सहेजें ' टैब पर क्लिक करें (चित्र बी#). कंप्यूटर पर अधिग्रहीत छवियों को संग्रहीत करने के लिए प्रयोग और फ़ोल्डर के लिए फ़ाइल नाम का चयन करें ।
    2. एमडीए मॉड्यूल में, बाईं ओर मेनू में ' डीकॉक ' टैब पर क्लिक करें और यह १४५ कुल छवियों को प्राप्त करने के लिए सेट; 5 मिनट के लिए छवियों के बीच डीकॉक सेट करें । यह 1 छवि में एक 12 एच के लिए हर 5 मिनट के विकास के प्रयोग के लिए एक फिल्म का परिणाम होगा ।
      नोट: छवियों और छवियों की कुल संख्या के बीच समय अंतराल प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । यदि इमेजिंग से अधिक के लिए 12 ज, कदम ३.१ में प्रवेश कुओं के लिए अतिरिक्त मीडिया जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि कुओं सूखी नहीं चला है । अब प्रयोगों के लिए अतिरिक्त मीडिया को जोड़ने के लिए, के रूप में जरूरत (५० µ एल/
    3. एमडीए मॉड्यूल में, बाएँ हाथ के मेनू में ' तरंग दैर्ध्य ' टैब पर क्लिक करें (चित्रा 2 बी) और 1 के रूप में प्रयोग के लिए तरंग दैर्ध्य की संख्या निर्धारित किया है । तरंग दैर्ध्य 12-20 ms, ०.६ लाभ और 20 मेगाहर्ट्ज डिजिटलर के एक जोखिम समय के साथ ५०% Brightfield और ५०% कैमरा पर कब्जा करने के लिए सेट करें ।
      नोट: अतिरिक्त तरंग दैर्ध्य प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए तरंग दैर्ध्य सहित इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, हम सफलतापूर्वक mCherry और GFP इस microfluidic डिवाइस का उपयोग कर टैग C. albicans visualized है) । अधिग्रहण के मापदंडों को प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर भी बदला जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक दूसरे तरंग दैर्ध्य की स्थापना और ' प्रत्येक Timepoint पर ' का चयन ' और एक तिहाई तरंग दैर्ध्य और चयन ' प्रत्येक Timepoint में ' जोखिम को अधिकतम करने के लिए beginners के लिए सिफारिश की है छवि अधिग्रहण के अवसर है कि ध्यान में हैं ।
    4. एमडीए मॉड्यूल में, बाईं ओर मेनू में मंच सूची टैब का चयन करें । चरणों 1, 1-24, 3 प्रदर्शित किया जाएगा । एक के बाद एक, प्रत्येक चरण पर क्लिक करें, और ठीक ध्यान सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए मैंयुअल रूप से प्रत्येक चरण के लिए देखने के चैनल में कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित । प्रत्येक चरण के लिए सेटिंग्स को अद्यतन करने और सहेजने के लिए चरण सूची के आगे काला तीर क्लिक करें । कंप्यूटर इन मैन्युअल रूप से परिभाषित स्थिति सेटिंग्स और फोकल सेटिंग्स हर समय बिंदु पर छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग करेगा । ' निकालें ' तीर का उपयोग कर सूची से किसी भी अप्रयुक्त चरणों को निकालें ।
      नोट: एमडीए मॉड्यूल और कार्यक्रम interchangeably चरणों के रूप में देखने के चैनलों को देखें, और एक ही शब्दावली सॉफ्टवेयर द्वारा प्रयोग किया जाता है ।

    6. Microfluidic प्रयोग रनिंग

    1. इमेजिंग मॉड्यूल विंडो में, एमडीए मॉड्यूल का उपयोग कर, सभी उप चरणों के लिए पालन कोशिकाओं के पूर्व फ्लश छवियों पर कब्जा शुरू करने के लिए ' मोल ' का चयन करें (चित्रा बी#).
      नोट: इमेजिंग मॉड्यूल विंडो और कैमरा नियंत्रण अब छवियों पर कब्जा किया जा रहा है कि दिखाएगा और नक्शा, SRA, और एमडीए मॉड्यूल अब दिखाई नहीं होगा. कब्जा कर लिया छवियों को भी पक्ष पर एक टाइमर दिखाएगा, छवि संख्या को इंगित करने के लिए कब्जा कर लिया जा रहा है और अगली छवि पर कब्जा चक्र शुरू होने से पहले समय चूक जाएगा । अगले चरण के साथ आगे बढ़ने से पहले कैप्चर किए जाने वाले चित्रों के एक दौर के लिए प्रतीक्षा करें ।
      नोट: इमेजिंग मॉड्यूल विंडो स्क्रीन पर ' रोकें ' या ' ईवेंट चिह्नित करें ' बटन का उपयोग न करें । प्रयोग के दौरान इस बिंदु से, माउस को केवल दूसरे कंप्यूटर स्क्रीन (चित्र 2a) पर नियंत्रण माड्यूल विंडो पर रखें । इस इमेजिंग मॉड्यूल खिड़की परेशान से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. नियंत्रण मॉड्यूल विंडो में प्लेट के लिए मैनुअल मोड पर रहते हैं । कतरनी नियंत्रण अनुभाग में, स्थिर करने के लिए प्रवाह मोड सेट और 1 डाइन/cm2 (०.१ Pa) के लिए अधिकतम कतरनी सेट । आउटलेट वेल्स O1, O7, O13 और O19 पर क्लिक करें आउटलेट कुओं (चित्रा 2a) के लिए प्रवेश से मीडिया के प्रवाह शुरू करने के लिए गैर-पालन कोशिकाओं को हटा दें । 5 मिनट के बाद अच्छी तरह से प्लेट नियंत्रण अनुभाग में stop बटन पर क्लिक करें । छवियों के एक दूसरे दौर के लिए अनुमति प्राप्त हो । छवियां visualized किया जा सकता है और समय चूक इमेजिंग मॉड्यूल विंडो में दूसरी स्क्रीन पर नजर रखी जा सकती है ।
    3. कतरनी नियंत्रण खंड में, अधिकतम कतरनी स्तंभ में संख्या पर क्लिक करके और ०.५ दर्ज करने के लिए कुंजीपटल का उपयोग करके ०.५ डाइन/cm2 (०.५ Pa) के लिए मैक्स कतरनी प्रवाह को समायोजित करें । कुंजीपटल पर enter कुंजी दबाएँ और नियंत्रण मॉड्यूल विंडो (चित्र 2a) में ईवेंट लॉग में प्रवाह दर में परिवर्तन की पुष्टि करें । प्रयोग के लिए अंधेरे में परेशान छोड़ 12 ज ।
      नोट: प्रकाश और आंदोलन/कंपन के लिए जोखिम पूरी तरह से प्रयोग में अधिग्रहीत छवियों की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं । microfluidic प्रयोग के अंत में, इमेजिंग मॉड्यूल विंडो किसी भी चित्र नहीं दिखाएगा और SRA, नक्शे, और एमडीए मॉड्यूल दिखाने के लिए वापस लौट जाएगा । इमेजिंग मॉड्यूल सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जा सकता है छवियों को देखने के लिए, वीडियो इकट्ठा, और (नीचे वर्णित) का गठन किया है ।

    7. परिणामों का विश्लेषण करना

    1. इमेजिंग मॉड्यूल विंडो में, ' विश्लेषण उपकरण ' टैब का चयन करें और ड्रॉप डाउन मेनू से ' बहु-आयामी डेटा की समीक्षा ' (RMD) पर क्लिक करे । RMD मॉड्यूल में, ' आधार फ़ाइल चुनें ' पर क्लिक करें । इसमें ' मल्टी-आयामी डाटा सेट परफॉर्मेंस ' विंडो खुल जाएगी ।
    2. ' चुनें निर्देशिका ' बटन पर क्लिक करें और फ़ोल्डर है जो चरण ५.१ में प्रयोग को बचाने के लिए इस्तेमाल किया गया था चुनें । ' डेटा सेट ' सूची में, प्रयोग फ़ाइल लॉग (. nd एक्सटेंशन) का चयन करें । लॉग लोड होने के बाद, ' view ' बटन पर क्लिक करें ।
    3. बाएँ हाथ के ' तरंग दैर्ध्य ' मेनू में विकल्पों पर क्लिक करके तरंग दैर्ध्य का चयन करें और एक ड्रॉप-डाउन मेनू से देखने के लिए चरण स्थिति का चयन. छवि संख्या राइट-क्लिक करके मॉड्यूल के शीर्ष पर संख्याओं से लोड करने के लिए छवि चुनें । एक बार चयनित, छवियों लोड करने के लिए ' लोड छवि (ओं) ' बटन पर क्लिक करें । आप एक छवि या सभी छवियों को एक ही बार में देख सकते हैं ।
    4. एक समय चूक वीडियो बनाने के लिए सभी छवियों का चयन करें । चयनित छवियां एक नई विंडो में एक वीडियो के रूप में खुलेगी । इमेजिंग मॉड्यूल विंडो में ' फ़ाइल ' टैब पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से ' इस रूप में सहेजें ' चुनें । परिणामी वीडियो को डिफ़ॉल्ट फ़ाइल के रूप में सहेजें (TIFF/MetaSeries) ।
    5. ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सहेजी गई वीडियो फ़ाइल खोलें और लोड करें. ImageJ में, ' फ़ाइल ' टैब पर क्लिक करें और ' के रूप में सहेजें ' पर क्लिक करें । ड्रॉप-डाउन मेनू से '. avi ' चुनें और फ़ाइल को एक. avi फ़ाइल में कनवर्ट करें जिसका उपयोग करके JPEG कनवर्ज़न सेट 10 फ़्रेंस/
      नोट: वीडियो की गति फ्रेम में फेरबदल करके समायोजित किया जा सकता है/
    6. के लिए, दोहराव चरण ७.२, ७.३, और ७.४ ।
    छवि लोड करने के लिए ' लोड छवि (ओं) ' बटन पर क्लिक करें और पिछले छवि (संख्या १४४) चुनें । छवि एक नई विंडो में खुलेगी । ' थ्रेशोल्ड छवि ' बटन पर क्लिक करें और ' समावेशी ' थ्रेशोल्ड चुनें. कर्सर ले जाएं जब तक कि फिल्मी कोशिकाओं के लाल रंग के होते हैं, और कोई कोशिकाओं के साथ क्षेत्रों रंग नहीं कर रहे हैं ।
  • माप लॉग इन करने के लिए ' ओपन लॉग ' बटन पर क्लिक करें (बटन ' ओपन लॉग ' केवल शुरू में प्रदर्शित करेगा, एक बार एक लॉग सक्रिय है बटन ' F9: लॉग इन डेटा ' का नाम होगा) । ' ओपन डाटा लॉग ' विंडो पर ' डायनेमिक डेटा एक्सचेंज ' का चयन करें और ' ओके ' पर क्लिक करे ।
  • इमेजिंग मॉड्यूल विंडो में, ' विश्लेषण उपकरण ' टैब का चयन करें और ' क्षेत्र आँकड़े दिखाएँ ' पर क्लिक करते हैं. यह एक नई छवि से माप प्रदर्शित खिड़की खुल जाएगा । ' माप ' विकल्पों में उपलब्ध ' संपूर्ण छवि ' का चयन करें और ' F9: लॉग डेटा ' पर क्लिक करें । सभी माप के साथ एक एक्सेल फ़ाइल प्रदर्शित किया जाएगा । ' क्षेत्र ' और ' थ्रेसहोल्ड क्षेत्र ' के लिए मूल्यों का पता लगाने और पूर्व के बाद विभाजित करने के लिए इस क्षेत्र के लिए एक संख्यात्मक मूल्य प्राप्त करने के लिए फिल्म के कब्जे में ।
    नोट: प्रत्येक छवि के लिए ' क्षेत्र ' प्रयोग के दौरान प्राप्त समान है और इस प्रकार ' थ्रेसहोल्ड क्षेत्र ' माप के लिए जंगली प्रकार उपभेदों और उत्परिवर्ती उपभेदों या के प्रभाव का मूल्यांकन के बीच फिल्म निर्माण में मतभेदों का मूल्यांकन किया जा सकता है फिल्म गठन पर दवा का परीक्षण किया ।

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    Representative Results

    हम microfluidic फिल्म परख प्रदर्शन यहां वर्णित दो मीडिया शर्तों के तहत एक जंगली प्रकार सी. albicans तनाव का उपयोग (RPMI-१६४० और स्पाइडर मीडिया), जंगली ज्ञात रोधी दवा amphotericin बी की उपस्थिति में प्रकार तनाव (16 µ जी/RPMI में एमएल), और दो उत्परिवर्ती उपभेदों पहले मकड़ी मीडिया में (bcr1Δ/Δ और efg1 Δ/Δ) फिल्म के गठन में दोष है की सूचना दी ।

    वीडियो 1 RPMI-१६४० मध्यम में एक जंगली प्रकार की फिल्म के विकास का पता चलता है और रोधी दवा के प्रभाव, amphotericin बी, पर फिल्म गठन । जंगली प्रकार की स्थितियों के तहत, कई कोशिकाओं को दृढ़ता से चैनल का पालन करें, कोशिकाओं के रूप में समय की प्रगति hyphae, और एक मोटी फिल्म intercalating hyphae और खमीर कोशिकाओं के साथ मनाया जा सकता है । microfluidic प्रयोग के अंत की ओर, जंगली प्रकार की फिल्म पूरी तरह से देखने चैनल भरता है । amphotericin बी की उपस्थिति, हालांकि, इस फिल्म को कम करने पर एक स्पष्ट प्रभाव है । विशेष रूप से, कोशिकाओं के पालन कम है, और, अनुपचारित शर्तों के विपरीत, amphotericin बी की उपस्थिति में, कई कोशिकाओं को मीडिया की कतरनी प्रवाह के साथ दूर बह देखा जा सकता है । समय की प्रगति के रूप में, कोशिकाओं hyphae फार्म करने में विफल और एक फिल्म का गठन नहीं है । इन मतभेदों को भी चित्रा 3में दिखाया गया है, जो 0 एच, 2 एच, 6 एच, और 12 एच में परख से 4 समय अंक दर्शाया गया है ।

    2 वीडियो एक जंगली प्रकार की फिल्म के विकास से पता चलता है और दो पहले मकड़ी मीडिया में फिल्म दोषपूर्ण म्यूटेंट (bcr1 Δ/Δ और efg1 Δ/Δ) की सूचना दी । दोनों bcr1 Δ/Δ और efg1 Δ/Δ उपभेदों isogenic जंगली प्रकार तनाव की तुलना में गंभीर रूप से कम फिल्म गठन दिखा । efg1 Δ/Δ तनाव के लिए, हमने देखा है कि पालन कोशिकाओं hyphae फार्म नहीं है और जिसके परिणामस्वरूप फिल्म बुरी तरह दोषपूर्ण है । के लिए bcr1 Δ/Δ तनाव, हमने देखा है कि न केवल bcr1 Δ/Δ तनाव फिल्म गठन में दोषपूर्ण है, लेकिन यह भी एक स्पष्ट पालन दोष है, जहां कोशिकाओं कतरनी प्रवाह की दिशा में बहती देखा जा सकता है के रूप में वे का पालन करने में विफल प्रदर्शित करता है चैनल देखना. इन मतभेदों को भी चित्रा 4में दिखाया गया है, जो 0 एच, 2 एच, 6 एच, और 12 एच में परख से 4 समय अंक दर्शाया गया है ।

    Figure 1
    चित्रा 1: इस प्रयोग में प्रयुक्त Microfluidic साधन. पैनल एक microfluidic उपकरण का इस्तेमाल किया दिखाता है, पैनल बी इंटरफेस प्लेट से पता चलता है, पैनल सी एक देखने के चैनल (चरण) और तीन उप चरणों के प्रयोग के दौरान कैमरे द्वारा कब्जा कर लिया की एक योजनाबद्ध रूपरेखा से पता चलता है, और पैनल डी ४८ की एक योजनाबद्ध रूपरेखा-अच्छी तरह से microfluidic थाली आउटलेट और प्रवेश कुओं और देखने की खिड़की के एक योजनाबद्ध के साथ इस्तेमाल किया दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्रा 2: इमेजिंग modulesoftware और microfluidic प्लेट नियंत्रण प्रणाली के स्क्रीनशॉट का चयन करें. पैनल एक नियंत्रण मॉड्यूल से पता चलता है, कि microfluidic प्लेट के लिए नियंत्रण होता है, और पैनल बी इमेजिंग मॉड्यूल विंडो से पता चलता है, ' चाल चरण निरपेक्ष स्थिति ' (नक्शा) मॉड्यूल, ' बहु-आयामी अधिग्रहण ' (एमडीए) मॉड्यूल, और ' नमूना पुनः लोड समायोजन ' (SRA) मॉड्यूल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्रा 3: amphotericin के लिए जोखिम बी फिल्म गठन दोषों में परिणाम । समय निर्भर RPMI में फिल्म के गठन के दृश्य-१६४० मीडिया (कॉलम 1), और RPMI-१६४० मीडिया के साथ पूरक 16 µ g/एमएल amphotericin बी (कॉलम 2) के तहत गतिशील प्रवाह (०.५ डाइन/cm2) में ३७ ° c के लिए 12 h पद-पालन में microfluidic प्रणाली । प्रतिनिधि 0 एच (बाद पालन और प्रारंभिक धो), 2 एच, 6 एच, और 12 एच छवियों (ऊपर से नीचे) isogenic वंय प्रकार तनाव SN250 (कॉलम 1 और 2) के लिए दिखाए जाते हैं । स्केल बार्स प्रत्येक पैनल में 20 µm हैं । इसी समय चूक फिल्म निर्माण के वीडियो वीडियो 1में प्रदान की जाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्रा 4: BCR1 या EFG1 का विलोपन में फिल्म गठन के दोषों का परिणाम है । स्पाइडर मीडिया में फिल्म निर्माण के समय निर्भर दृश्य (कॉलम 1-3) गतिशील प्रवाह के तहत (०.५ डाइन/cm2) में ३७ ° c के लिए 12 h पद-पालन microfluidic प्रणाली में । प्रतिनिधि 0 एच (पद पालन और प्रारंभिक धो), 2 ज, 6 ज, और 12 ज छवियों (ऊपर से नीचे) के लिए दिखाए जाते है isogenic वंय-प्रकार तनाव SN250 (कॉलम 1), bcr1Δ/Δ तनाव (कॉलम 2), और efg1 Δ/Δ तनाव (कॉलम 3) । स्केल बार्स प्रत्येक पैनल में 20 µm हैं । इसी समय चूक फिल्म निर्माण के वीडियो वीडियो 2में प्रदान की जाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    वीडियो 1: इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    वीडियो 2: इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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    Discussion

    अनुकूलन योग्य microfluidic फिल्म परख यहां वर्णित एक ही सेल स्तर पर वास्तविक समय में फिल्म निर्माण के दृश्य के लिए अनुमति देता है जब एक निश्चित दर लामिना प्रवाह और लगातार तापमान के संपर्क में । यह जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों में फिल्म के विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है, और नैदानिक सेटिंग्स में मनाया शारीरिक स्थितियों की नकल है कि शर्तों के तहत फिल्म पर रोगाणुरोधी एजेंट उपचार के प्रभाव । इन विट्रो में अधिकांश के विपरीत फिल्म परख, इस विधि के रूप में यह रूपों वास्तविक समय में एक विकासशील फिल्म की परीक्षा के लिए अनुमति देता है ।

    इस विधि में एक उच्च प्रवाह तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां 24 नमूनों को एक साथ चलाया जा सकता है के लिए एक साथ फिल्म के गठन का आकलन । विधि भी उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के आनुवंशिक स्क्रीन सामान्य रूप से फिल्म विकास के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए आयोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यौगिक पुस्तकालय स्क्रीन में रुचि के रोगाणुरोधी यौगिकों के खिलाफ effectivity का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमें आशा है कि इस microfluidic डिवाइस के भविष्य के अनुप्रयोगों ऐसी स्क्रीन शामिल होंगे । हम ध्यान दें, तथापि, कि कुछ दवा उपचार परीक्षण इस microfluidic डिवाइस का उपयोग कर के रूप में बनाई गई फिल्म की मोटाई द्वारा सीमित हो जाएगा & #62 के लिए उगाया जाता है; 16 एच को देखने चैनल रोकना करते हैं । इस प्रकार, औषध परीक्षण प्रयोगों के लिए प्रदर्शन की आवश्यकता होगी & #60; १६ एच.

    कुल मिलाकर, इस डिवाइस को उच्च अनुकूलन और बहुमुखी है, और राज्यों भर में विभिन्न माइक्रोबियल प्रजातियों का आकलन करने के लिए समायोजित किया जा सकता, प्रवाह दर, तापमान, गर्मी के समय, और मीडिया. विधि वर्णित है कि प्रारंभिक सेल पालन, फिल्म परिपक्वता, और सेल dispersing सहित, फिल्म निर्माण के विभिंन पहलुओं के एक नंबर के बारे में जानकारी प्रदान करता है । हालांकि हम केवल एकल प्रजाति के लिए परिणाम रिपोर्ट यहां फिल्म निर्माण, इस प्रोटोकॉल भी दोहरे और मिश्रित प्रजातियों के अध्ययन के गठन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

    इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए दो चरण महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, प्रणाली में हवा के बुलबुले प्रयोगात्मक तापमान पर मीडिया overheating से बचा जाना चाहिए । एक आम कदम मीडिया है कि पहले से गरम नहीं किया गया में कोशिकाओं के कमजोर पड़ने है । कोशिकाओं को एक ही मीडिया है कि प्रवेश कुओं के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है में पतला किया जाना चाहिए । दूसरा, आउटलेट से प्रवेश कुओं के लिए कोशिकाओं के प्रवाह ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए; यदि कोशिकाओं को बहुत दूर प्रवाह, प्रवेश मीडिया दूषित हो जाएगा और प्रयोग व्याख्यात्मक परिणाम नहीं निकलेगा । दूसरी ओर, यदि कक्षों को देखने वाले चैनल में सभी तरह से स्थानांतरित करने की अनुमति नहीं है, तो प्रयोग के दौरान कोई भी कक्ष चैनल में दिखाई नहीं देगा, जो कि रिक्त छवियों के लिए अग्रणी है. अतिरिक्त प्रमुख बिंदुओं को ध्यान में रखने के लिए कर रहे है कि मात्रा और microfluidic प्लेट में कुओं के बीच आंदोलन प्रत्येक कॉलम के लिए एक साथ जुड़े हुए हैं, और यह संभव के रूप में ज्यादा मीडिया स्थिरता (समान चिपचिपापन, कोशिका घनत्व के साथ, और बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है संरचना) और इसी प्रकार कोशिकाओं के आकार (यदि संभव हो तो), अलग मीडिया और विभिंन सेल आकार के रूप में कॉलम में विभिंन प्रवाह दरों होगा । प्रयोग के दौरान, कोशिकाओं के backflow एक खुर्दबीन का उपयोग करते हुए नजर रखी है; हालांकि, केवल दो चैनल (एक 10x उद्देश्य का उपयोग करते हुए) एक समय में देखा जा सकता है । इस प्रकार, यह अत्यधिक करने के लिए एक नकली प्रयोग करने की सिफारिश की है करने के लिए आउटलेट से प्रवेश कुओं के लिए आवश्यक समय मापने के लिए कोशिकाओं और मीडिया का उपयोग करने की योजना बनाई वास्तविक प्रयोग में इस्तेमाल किया जाएगा ।

    आम तौर पर, हम अत्यधिक एक इन विट्रो परख के रूप में इस microfluidic के उपयोग की सिफारिश के लिए vivo पशु परीक्षण में पहले का उपयोग किया जाएगा । परख, तथापि, अभी भी एक इन विट्रो परख है, और परिणाम के लिए प्रासंगिक पशु मॉडल में मांय की आवश्यकता होगी । हमारे अनुभवों में, इस microfluidic फिल्म परख के परिणामों के लिए सबसे अच्छा पूर्वानुमान मूल्य पड़ा है vivo में फिल्म की परख के साथ तुलना में अंय इन विट्रो परख हम14का आकलन किया है ।

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    Disclosures

    Clarissa जे Nobile BioSynesis, Inc, एक कंपनी के अवरोधकों और सी. albicans फिल्म के निदान के विकास के एक संस्थापक है ।

    Acknowledgments

    हम Nobile लैब के सभी सदस्यों को फिल्म की परख पर उपयोगी चर्चा के लिए धंयवाद । इस अध्ययन में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) अनुदान R21 AI125801 (to C.J.N.) का समर्थन किया गया था. D.L.R. मेक्सिको और संयुक्त राज्य अमेरिका (UC-MEXUS) और Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT) के लिए कैलिफोर्निया संस्थान के विश्वविद्यालय से डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
    Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
    ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast Extract Criterion C7341
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677
    Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
    Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
    MOPS Sigma-Aldrich M3183
    Nutrient Broth Criterion C6471
    Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
    Agar Criterion C5001
    Amphotericin B Corning 30-003-CF
    Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
    Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
    Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
    Lens Paper VWR 52846-001
    Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
    Shaking Incubator Eppendorf M12820004

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

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