Summary
Questo protocollo descrive l'uso di un dispositivo microfluidico automatico personalizzabile per visualizzare la formazione di biofilm in Candida albicans in condizioni fisiologiche host.
Abstract
Candida albicans è il più comune agente patogeno fungoso degli esseri umani, causando circa il 15% dei casi di sepsi nosocomiali. Un attributo di maggiore virulenza dei albicans del c. è la sua capacità di forma biofilm comunità strutturata delle cellule allegate alle superfici biotiche e abiotiche. C. albicans biofilm può formare su tessuti dell'ospite, come ad esempio strati mucosi e sui dispositivi medici, quali cateteri, pacemaker, protesi dentarie e protesi articolari. Biofilm pongono sfide cliniche significative perché sono altamente resistenti alle perturbazioni fisiche e chimiche e può agire come serbatoi per seme diffuse infezioni. Vari saggi in vitro sono state utilizzate per studiare la formazione di biofilm di albicans del c. , come saggi di piastra di microtitolo, misurazioni di peso secco, saggi di vitalità cellulare e confocale microscopia a scansione laser. Tutte queste analisi sono saggi single end-point, dove la formazione di biofilm è valutata a un momento specifico. Qui, descriviamo un protocollo per studiare la formazione di biofilm in tempo reale utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzati in condizioni di flusso laminare. Questo metodo permette l'osservazione della formazione di biofilm come biofilm si sviluppa nel tempo, con condizioni personalizzabili che imitano quelli di host, ad esempio quelle incontrate in cateteri vascolari. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare i difetti di biofilm di mutanti genetici nonché gli effetti inibitori degli agenti antimicrobici per lo sviluppo di biofilm in tempo reale.
Introduction
Candida albicans è un commensali membri del microbiota umano, tuttavia è anche un agente patogeno opportunistico, in grado di causare infezioni fungine superficiali e severa1,2. Un tratto di maggiore virulenza dei albicans del c. è la sua capacità di modulo resiliente e biofilm resistente alla droga, comunità di cellule aderito ad una superficie e racchiuso in una matrice extracellulare del materiale1,3. C. albicans biofilm sono altamente strutturato, contenente diversi strati di più tipi di cellule (lievito germogliante-forma tondeggiante cellule, cellule ovali pseudoifale e cellule tubulari ifale)4. Albicans del c. sviluppo di biofilm inizia con l'aderenza delle cellule di lievito-forma rotonda ad una superficie (semina il biofilm), seguita dalla proliferazione di queste cellule sulla superficie, e quindi la maturazione del biofilm acerbo strutturare in un biofilm ben formato che è circondato da matrice extracellulare materiale4. Il biofilm maturo è composto principalmente di cellule hyphal allungate che formano reti dense e comunicanti, fornendo la stabilità architettonica al biofilm4. Tutto il ciclo di vita del biofilm, tondo lievito gemmante cellule disperdono dal biofilm maturo e possono viaggiare ad altre regioni del corpo per causare le infezioni diffuse o seme nuovo biofilm presso altri siti4,5. C. albicans può formare biofilm su superfici biotiche, ad esempio superfici mucose e nel tessuto ospite e su superfici abiotiche, quali cateteri, pacemaker, protesi dentarie e protesi articolari. A causa delle proprietà ricalcitrante del biofilm, sono estremamente difficili da sradicare, e in molti casi la strategia unico trattamento efficace è la rimozione del dispositivo infetto4. È dunque fondamentale per studiare la formazione di biofilm in condizioni simili a quelle osservate nelle regolazioni cliniche.
Ci sono parecchi critici in vivo modelli di animali utilizzati per lo studio di c. albicans biofilm formazione6,7,8; Tuttavia, questi studi possono essere costosa, richiede tempo e sono limitati dal numero di ceppi e agenti antimicrobici che possono essere testati in un dato momento. In vitro biofilm saggi, d'altra parte, consentire la valutazione rapida, ad alta produttività di composti Antifungini e ceppi mutanti e sono molto più redditizi ed etici di biofilm saggi trasportati fuori in animale modelli9, 10,11,12,13,14. Qui descriviamo un test in vitro che abbiamo sviluppato e ottimizzato per osservare la formazione di biofilm temporaneamente sotto flusso laminare usando un personalizzabile microfluidici dispositivo14,15. Il test consente la visualizzazione di ogni fase della formazione del biofilm, compreso il passaggio di adesione iniziale, proliferazione, maturazione del biofilm e dispersione delle cellule. Il dosaggio è anche utile per visualizzare i cambiamenti di morfologia delle cellule durante lo sviluppo di un biofilm.
Piastre di microtitolazione, che vengono in genere utilizzati per in vitro biofilm saggi, mentre a resa elevata, non consentono per condizioni di flusso controllato. Sistemi cellulari tradizionali a flusso laminare consentono la valutazione continua di formazione di biofilm in condizioni di flusso controllato, ma questi sono spesso molto tempo per impostare e tendono ad avere un limitato controllo gamma dinamica e velocità effettiva. Il dispositivo di microfluidica utilizzato qui supera queste limitazioni mediante la combinazione di piastre di throughput elevato (contenente 48 pozzetti) con una camera di flusso laminare incorporato ed è altamente riproducibile, versatile e personalizzabile.
Qui, descriviamo un protocollo per l'uso di un dispositivo microfluidico automatizzati disponibili in commercio per valutare la formazione di biofilm di un selvaggio-tipo albicans del c. ceppo, gli effetti di un noto agente antifungino sullo sviluppo di un biofilm e biofilm formazione in due ceppi mutanti (bcr1Δ/Δ ed efg1 Δ/Δ) che precedentemente sono stati segnalati per avere biofilm difetti in vitro e in vivo16,17,18. Il protocollo descritto può essere utilizzato per testare l'efficacia degli agenti antimicrobici nell'inibire la formazione di biofilm in tutto lo sviluppo di un biofilm e per identificare geni richiesti per la sviluppo di biofilm normale mediante screening di librerie mutante.
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Protocol
1. preparazione fungosa delle cellule di cultura
Nota: Coltura cellulare condotta funziona (cioè apertura criogenici stock tubi, provette di coltura delle cellule e boccette) all'interno di una cappa di biosicurezza. Accendere h di lampada germicida almeno 1 di raggi ultravioletti (UV) del cabinet prima del lavoro e spegnere la lampada UV mentre lavorando attivamente nell'armadietto. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e dispositivi di protezione individuale appropriati e decontaminare la superficie del banco e pipette con etanolo al 70% prima dell'inizio dell'esperimento. Consigliato l'uso di puntali sterili con filtro e familiarità con le tecniche microbiologiche di base asettiche.
- Ceppi di c. albicans di striscia (wild-type, bcr1 Δ/Δ ed efg1 Δ/Δ) il lievito estrarre medio di peptone destrosio (YPD) (Estratto di lievito 1%, 2% di peptone, 2% glucosio; pH 6.8) piastre di agar. Incubare a 30 ° C per 48 h, seguente le pratiche microbiologiche standard19.
- Selezionare una singola colonia isolata dalla piastra di inoculare in 4 mL di terreno liquido YPD (1% di Estratto di lievito, 2% di peptone, 2% glucosio; pH 6.8) e incubare a 30 ° C con agitazione a 225 giri/min in standard agitazione incubatore per 12-15 h, seguenti standard microbiologici prac neria19.
- Determinare la densità delle cellule della cultura misurando la densità ottica (OD) a 600 nm in una cuvetta (1 mL, 1 cm di lunghezza di percorso), seguente standard microbiologici pratiche19.
- Diluire la coltura cellulare a un finale OD600 pari a 0,5, equivalente a 2 x 107 cellule/mL, nel mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640ft-(165 mM di acido 3-morpholinopropane-1-solfonico (MOPS), L-Glutammina e senza sodio bicarbonato, pH 7.0) o mezzo ragno (brodo nutriente 1%, 1% mannitolo, 0,4% K2HPO4, pH 7,2).
Nota: Supporto alternativo può essere utilizzato per sostenere la crescita di specifica ceppi di interesse.
Nota: Non fare diluizioni cella troppo in anticipo. Si consiglia di iniziare diluizioni dopo passo 3.3 (descritto di seguito) al fine di prevenire l'inizio della formazione di ife prima le cellule essendo testa di serie del canale di visualizzazione.
2. preparazione di canali microfluidici della piastra microfluidica
Nota: Fare riferimento al manuale utente del sistema microfluidico (Vedi tabella materiali) per informazioni su piastre e messa in funzione.
- Prima di eseguire l'esperimento di microfluidica, caldo 20 mL di RPMI-1640 media o media di ragno in un incubatore a 37 ° C. Volume multimediale aggiuntivo può essere richiesto sulla base di calcoli al punto 2.8. Pre-riscaldamento media previene la formazione di bolle d'aria durante l'esperimento.
- Attivare il sistema di microfluidica che comprende il controller, i due alimentatori, il microscopio, la fotocamera e computer collegato al sistema. Aprire il software che controlla il sistema (Vedi tabella materiali) dal menu del programma sul computer. Una volta aperto il programma, verranno visualizzate due finestre.
- Individuare il numero di codice a barre della piastra in uso e il numero quando richiesto dal software di input. Per visualizzare il software su due finestre, utilizzare due schermi di computer separati. Una finestra (modulo di controllo) contiene i controlli per la piastra e la seconda finestra (Montage, modulo imaging) contiene i controlli per il microscopio e la fotocamera.
- Accendere il pulsante di accensione del riscaldatore sul controller e impostare la microfluidica sistema temperatura a 37 ° C, utilizzando i pulsanti freccia sul controller di temperatura.
- Pulire la piastra di interfaccia (Figura 1) usando acqua sterile come segue. Spruzzare il fondo del piatto con acqua sterile e utilizzare carta per lenti per rimuovere lo sporco/polvere. Riposare l'interfaccia piastra a faccia in giù su carta obiettivo pulito per asciugare all'aria. Pulire la parte superiore della piastra di interfaccia utilizzando il 70% di isopropanolo e lente di carta.
Nota: La piastra di interfaccia collega il sistema microfluidico alla piastra che conterrà le cellule e i media. Assicurarsi che nessun liquido rimanga e che tutte le fibre e lo sporco vengono rimossi. Pulizia impropria può provocare video e immagini di bassa qualità. - Rimuovere la condensa dai tubi sulla piastra di interfaccia.
- Lasciare il piatto capovolto che riposa sul libro della lente. Nel controllo finestra modulo fare clic su modalità manuale per la piastra. Nella sezione menu controllo di taglio, fare clic su selezione fluido per colonne 1-4 e 5-8 e selezionare 37 ° C dal menu a discesa. Nella sezione controllo di taglio, impostare la modalità di flusso costante e impostare il taglio max 2 dyne/cm2 (0,2 Pa) (Figura 2A).
- Fare clic sui pozzi di aspirazione per avviare il flusso di aria sterile attraverso i tubi di piastra di interfaccia per rimuovere la condensa. Dopo 5 min, fare clic sul pulsante stop nella sezione di controllo ben piastra (Figura 2A). Osservare i tubi nella piastra di interfaccia per confermare che è stato rimosso completamente acqua di condensa. Se le goccioline sono ancora visibili, ripetere il flusso di aria sterile, come accennato in precedenza, per un altro 5 min.
Nota: I tubi di aspirazione sono collegati a filtri di 0,22 micron per garantire solo aria sterile viene introdotto il sistema di microfluidica. Il flusso può essere monitorato da registro eventi sullo schermo nella finestra del modulo di controllo.
- Posizionare la piastra di microfluidica 48 pozzetti 0-20 dyne sul tavolino del microscopio.
3. formazione di Biofilm di candida albicans nel sistema microfluidico
- Per registrare la formazione di biofilm, aggiungere 600 µ l di pre-riscaldato RPMI-1640 medio o medio di ragno per i pozzi di aspirazione (vedere la Figura 1 per il layout di piastra). Hanno due repliche per ogni condizione sperimentale.
- Per il test di biofilm di albicans del c. ceppi wild-type e mutanti, aggiungere 600 µ l ragno terreno pozzetti di entrata della piastra di esperimento.
- Per l'analisi di biofilm in presenza di farmaci antimicotici (o altri composti di interesse), aggiungere 600 µ l di terreno di RPMI-1640 a due pozzi (controllo negativo) e 600 µ l di RPMI-1640 supplementato con anfotericina B (16 µ g/mL) (o la droga della scelta presso desiderata concentrazione) a due altri pozzi di aspirazione.
Nota: Per un esperimento di formazione del biofilm 12h, aggiungere 600 µ l di supporti pre-riscaldati per i pozzi di aspirazione. Per gli esperimenti più aggiungere ulteriori supporti (50 µ l/h) per i pozzi di aspirazione. Non superare il volume massimo del pozzo (1.500 µ l).
- Abbassare lentamente la piastra di interfaccia pulita sopra la piastra microfluidica ben 48. Scorrere la piastra di interfaccia leggermente verso sinistra fino a quando i tubi sulla piastra interfase sono posizionati sopra i pozzetti di entrata e di uscita.
Nota: Flusso di aria sterile dai tubi nella piastra di interfaccia spingerà il liquido nei pozzetti ingresso o l'uscita (a seconda della direzione selezionata utilizzando il software sul computer), affinché il liquido fluisce attraverso il canale di visualizzazione tra l'ingresso e l'uscita pozzetti in direzione su misura e velocità dettata dall'utente.
Nota: Adescamento è necessario per eliminare l'aria dai canali di visualizzazione e garantire che i canali sono pieni di supporto desiderato.
- Per l'analisi di albicans del c. ceppi wild-type e mutanti, aggiungere 50 µ l della coltura delle cellule di tipo selvatico (SC5314) in media Spider due pozzetti di scarico, bcr1 Δ/Δ in media Spider a due pozzi di presa e efg1 Δ/Δ in media Spider a due pozzi di presa. Posizionare la piastra di interfaccia indietro sulla piastra microfluidica e bloccare il coperchio (Vedi Figura 1 per il layout di piastra).
Nota: Come descritto al punto 3.1.1, tutti i pozzetti di input corrispondenti contengono contenuti multimediali Spider. - Formazione di biofilm di albicans del c. in presenza di anfotericina B o altri composti di interesse di test, aggiungere 50 µ l della coltura delle cellule di tipo selvatico (SC5314) nel medium RPMI-1640 a quattro pozzi di presa. Posizionare la piastra di interfaccia indietro sulla piastra microfluidica e bloccare il coperchio (Vedi Figura 1 per il layout di piastra).
Nota: Come descritto al punto 3.1.2, tutti i pozzetti di input corrispondenti contengono supporti RPMI-1640 con e senza anfotericina B o altri composti di interesse.
Nota: Le celle vengono spostate dai pozzi presa verso i pozzi di aspirazione; è fondamentale che il flusso sia spento prima di raggiungono le cellule i pozzi di aspirazione. Questo assicura che i pozzi di aspirazione non avere contaminati con coltura delle cellule e che i media nei pozzetti ingresso rimane sterili per tutta la durata dell'esperimento. La forza di taglio e il tempo necessario dipende la viscosità del supporto utilizzato e la dimensione delle celle.
4. impostare le posizioni di Stage per l'esperimento di microfluidica
Nota: Le posizioni di fase e piastra calibrazione dovrebbe essere impostate solo prima di iniziare l'esperimento. Questa configurazione consente al computer di memorizzare le posizioni di ogni canale di visualizzazione per catturare le immagini durante l'esperimento. La piastra microfluidica dovrebbe non essere disturbata dopo aver impostato le posizioni di fase. Se la piastra è spostata, le posizioni di fase dovrà essere reimpostato prima dell'inizio dell'esperimento.
- Utilizzare il software di analisi di visualizzazione (Vedi tabella materiali) per impostare la fase posizioni; ogni canale di visualizzazione è una fase (1-24) (Figura 1) e ogni fase ha tre sotto-fasi (1-3) per l'acquisizione di immagine alle diverse posizioni lungo il canale di visualizzazione (Figura 1). Nella finestra del modulo imaging, aprire il modulo di 'Multi-dimensional acquisizione' (MDA) facendo clic sulla scheda MDA (Figura 2B).
- Nel MDA modulo fare clic sulla scheda 'Stage' nel menu sul lato sinistro (Figura 2B). Nella sezione fase, caricare l'elenco master fase per la piastra di microfluidica dyne 20 ben 0 - 48. Ogni canale di visualizzazione dovrebbe avere tre fasi per acquisizione di immagini.
- Aprire il 'Campione Reload Adjustment' (SRA) e 'Spostare Stage a posizione assoluta' moduli (mappa) cliccando sulla scheda SRA e scheda mappa (Figura 2B). Nel modulo SRA, premere il pulsante 'Live' per vedere un'anteprima dell'immagine con il puntatore a croce.
- Utilizzando il joystick, posizionare la piastra ben tale che la punta della freccia (fisicamente si trova sulla piastra) adiacente alla visualizzazione canale 4 sia allineato con il puntatore a croce sul software. Nel menu mappa, premere il pulsante 'Imposta origine' (Figura 2B). La posizione corrente del punto dovrebbe essere 0 in X, Y e Z.
- Nel modulo SRA, clicca sulla sezione 'Punti di riferimento iniziale' nel menu a sinistra (Figura 2B). Fare clic su 'Impostazioni' di carico e caricare il file per la piastra di microfluidica dyne 20 ben 0 - 48.
- La sezione di fase del modulo MDA, fare doppio clic su ' posizione stadio 22,2'. Questa posizione indica la metà (sub-fase 2) della visualizzazione canale numero 22. Questo porterà il microscopio in fase di visualizzazione e la messa a fuoco in stretta vicinanza al marcatore freccia visualizzando il canale 22. Utilizzando il joystick, posizionare la piastra ben tale che la punta della freccia (fisicamente si trova sulla piastra) adiacente alla visualizzazione canale 22 si allinea con il puntatore a croce.
- Copiare la coordinata Y nel modulo MDA in posizione Y del punto 2 nella scheda 'Aggiornamento punti di riferimento' del modulo di SRA (Figura 2B).
- Nella scheda 'Posizioni di Stage di aggiornamento' della SRA, fare clic su 'Applica a MDA fase elenco' (Figura 2B).
Nota: Questo consente di aggiornare tutte le visualizzazione posizioni di fase della piastra (1-24) essere calibrato per la posizione della piastra microfluidica specifici sul tavolino del microscopio.
5. configurazione di acquisizioni per immagine cattura durante l'esperimento di microfluidica
- Nella finestra del modulo di formazione immagine, utilizzare il modulo MDA e fare clic sulla scheda 'Salva' nel menu a sinistra (Figura 2B). Selezionare il nome del file per l'esperimento e la cartella in cui memorizzare le immagini acquisite sul computer.
- Nel modulo MDA, fare clic sulla scheda 'Timelapse' nel menu a sinistra e impostarlo per acquisire 145 immagini totale; impostare il timelapse tra immagini a 5 min. Questo si tradurrà in 1 immagine ogni 5 min per un esperimento di sviluppo di biofilm 12h.
Nota: L'intervallo di tempo tra le immagini e il numero totale di immagini può essere regolata sulla base sperimentali requisiti. Se imaging per più di 12 h, è possibile aggiungere ulteriori file multimediali per i pozzi di aspirazione al punto 3.1 al fine di garantire che i pozzi non funzionare a secchi. Per gli esperimenti più aggiungere ulteriori supporti, come necessario (50 µ l/h) per i pozzi di aspirazione. - Nel modulo MDA, fare clic sulla scheda 'lunghezze d'onda' nel menu a sinistra (Figura 2B) e impostare il numero di lunghezza d'onda per l'esperimento come 1. Impostare la lunghezza d'onda di catturare al 50% chiaro e 50% fotocamera con un tempo di esposizione di 12-20 ms, aumento di 0,6 e digitalizzatore di 20 MHz.
Nota: Altre lunghezze d'onda può essere utilizzato, tra cui lunghezze d'onda per l'imaging di fluorescenza (ad esempio, noi abbiamo correttamente visualizzato mCherry e ceppi GFP etichettate c. albicans utilizzando questo dispositivo microfluidico). I parametri di acquisizione possono anche essere alterati basato sui requisiti sperimentali. Ad esempio, impostare una seconda lunghezza d'onda e selezionando 'Autofocus presso ogni Timepoint' e una terza lunghezza d'onda e selezionando 'Esposizione automatica a ogni Timepoint' è raccomandato per i principianti massimizzare le opportunità di acquisizione di immagine che sono a fuoco. - Nel modulo MDA, selezionare le schede di elenco di fase nel menu a sinistra. Fasi 1,1 – 24,3 verrà visualizzato. Uno per uno, fare clic su ogni fase e utilizzare le impostazioni di messa a fuoco per mettere a fuoco manualmente sulle cellule del canale di visualizzazione per ogni fase. Una volta che il campo di vista è a fuoco, cliccate sulla freccia nera accanto all'elenco di fase per aggiornare e salvare le impostazioni per ogni fase. Il computer utilizzerà queste impostazioni posizione definita manualmente e focale per acquisire immagini in ogni momento. Rimuovere eventuali fasi inutilizzati dall'elenco utilizzando i tasti freccia 'Rimuovi'.
Nota: Il modulo MDA e il programma fare riferimento a visualizzazione canali come fasi in modo intercambiabile, e la stessa terminologia viene utilizzata dal software.
6. esecuzione dell'esperimento di microfluidica
- Nella finestra del modulo imaging, utilizzando il modulo MDA, selezionare "Acquire" per iniziare a catturare le immagini pre-risciacquo delle cellule aderite per tutte le sub-fasi (Figura 2B).
Nota: La finestra di modulo imaging e i controlli della fotocamera ora mostrerà immagini che sono stati catturati e il modulo mappa, SRA e MDA non sarà più visibile. Le immagini catturate mostrerà anche un timer sul lato, per indicare il numero dell'immagine catturato e il lasso di tempo prima di avviare il successivo ciclo di acquisizione immagine. Aspettare un turno delle immagini da acquisire prima di procedere con il passaggio successivo.
Nota: Non utilizzare i pulsanti 'Pause' o 'Mark evento' sulla schermata di finestra modulo imaging. Da questo punto in poi durante l'esperimento, tenere il mouse solo nella finestra del modulo di controllo sullo schermo del computer secondo (Figura 2A). Questo è importante per evitare di disturbare la finestra di modulo imaging. - Nel modulo controllo finestra soggiorno sulla modalità manuale per la piastra. Nella sezione controllo di taglio, impostare la modalità di flusso costante e impostare il taglio max 1 dyne/cm2 (0,1 Pa). Fare clic su pozzi uscita O1, O7, O13 e O19 per iniziare il flusso di file multimediali da ingresso ai pozzetti di scarico (Figura 2A) per rimuovere le cellule non hanno aderito. Dopo 5 min fare clic sul pulsante stop nella sezione di controllo ben piatto. Consentono una seconda serie di immagini da acquisire. Immagini possono essere visualizzati e il lasso di tempo possa essere monitorato sul secondo schermo nella finestra del modulo di formazione immagine.
- Nella sezione controllo di taglio, regolare il flusso di shear max a 0,5 dyne/cm2 (0,5 Pa) cliccando sul numero in max taglio colonna e utilizzando la tastiera per digitare 0.5. Premere il tasto INVIO sulla tastiera e confermare la variazione nel tasso di flusso nel registro eventi nella finestra del modulo di controllo (Figura 2A). L'esperimento di lasciare indisturbato al buio per 12 h.
Nota: L'esposizione alla luce e movimento/vibrazioni severamente può ridurre la qualità delle immagini acquisite in tutto l'esperimento. Alla fine dell'esperimento microfluidica, la finestra di modulo imaging non mostrerà tutte le immagini e ritorna a mostrare i moduli SRA, mappa e MDA. Il software di imaging modulo consente di visualizzare le immagini, montare i video e quantificare il biofilm formata (descritto di seguito).
7. analisi dei risultati
- Nella finestra del modulo imaging, selezionare la scheda 'Strumenti di analisi' e fare clic su 'Recensione multi-dimensional dati' (RMD) dal menu a discesa. Nel modulo RMD, fare clic su Seleziona File di Base. Questo aprirà la finestra 'Multi-dimensional Set di dati Utilities'.
- Fare clic sul pulsante 'Seleziona cartella' e scegliere la cartella in cui è stata utilizzata per salvare l'esperimento nel passaggio 5.1. Nell'elenco "Insiemi di dati", selezionare il log file di esperimento (estensione. ND). Una volta caricato il registro, fare clic sul pulsante 'Visualizza'.
- Selezionare la lunghezza d'onda facendo clic su opzioni nel menu a sinistra 'Lunghezze d'onda' e scegliere la posizione di fase per visualizzare un menu a discesa. Scegliere l'immagine da caricare dai numeri sulla parte superiore del modulo facendo clic con il numero di immagine. Una volta selezionato, fare clic sul pulsante 'carica immagini' per caricare le immagini. È possibile visualizzare una sola immagine o tutte le immagini in una sola volta.
- Selezionare tutte le immagini per fare un lasso di tempo video. Le immagini selezionate si aprirà come un video in una nuova finestra. Fare clic sulla scheda 'file' nella finestra del modulo di formazione immagine e scegli 'Salva come' dal menu a discesa. Salvare il video come file predefinito (TIFF/MetaSeries).
- Aprire e caricare il file video salvato utilizzando software ImageJ. In ImageJ, fare clic sulla scheda 'file' e cliccare su 'Salva come'. Scegli 'AVI' dal menu a discesa e convertire il file in un file AVI utilizzando la conversione JPEG impostata a 10 fotogrammi/s.
Nota: La velocità del video può essere regolata modificando i fotogrammi/s. - Per quantificare i biofilm, ripetere i passaggi da 7.2, 7.3 e 7.4.
Nota: La 'zona' per ogni immagine ottenuta durante l'esperimento è identica e quindi la misura 'Con soglia Area' può essere utilizzata per valutare le differenze nella formazione di biofilm tra ceppi wild type e mutanti o valutare l'efficacia della farmaco testato sulla formazione di biofilm.
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Representative Results
Abbiamo effettuato l'analisi di biofilm microfluidici descritto qui utilizzando un selvaggio-tipo ceppo di albicans del c. in condizioni di due media (media RPMI-1640 e Spider), il ceppo di selvaggio-tipo in presenza del noto farmaco antifungino amfotericina B (16 µ g/mL) in RPMI, e due ceppi mutanti precedentemente segnalato di avere difetti nella formazione del biofilm (bcr1Δ/Δ ed efg1 Δ/Δ) in media di ragno.
Video 1 Mostra lo sviluppo di un biofilm di selvaggio-tipo in medium RPMI-1640 e gli effetti del farmaco antifungino, amfotericina B, sulla formazione del biofilm. In condizioni di selvaggio-tipo, parecchie cellule fortemente aderiscano al canale, le cellule formano IFE mentre il tempo progredisce e un biofilm spesso può essere osservato con intercalanti ife e cellule di lievito. Verso la fine dell'esperimento microfluidica, il biofilm di selvaggio-tipo riempie completamente il canale di visualizzazione. La presenza di anfotericina B, tuttavia, ha un marcato effetto sulla riduzione del biofilm. In particolare, l'aderenza delle cellule è diminuita e, a differenza di condizioni non trattate, in presenza di anfotericina B, possono essere visto parecchie cellule che scorre via con il flusso di shear dei media. Come il tempo progredisce, le cellule non riescono a IFE forma e un biofilm non è formate. Queste differenze sono anche mostrate in Figura 3, che raffigura 4 intervalli di tempo da test a 0 h, 2h, 6h e 12 h.
Video 2 Mostra lo sviluppo di un biofilm di selvaggio-tipo e due precedentemente segnalati mutanti difettivi biofilm (bcr1 Δ/Δ ed efg1 Δ/Δ) in media di ragno. Due ceppi Δ/Δ Δ/Δ ed efg1 bcr1 Visualizza formazione di biofilm si è notevolmente ridotta rispetto al ceppo selvaggio-tipo isogeniche. Per il ceppo Δ/Δ efg1 , abbiamo osservato che le cellule aderite non formano ife e biofilm risultante è severamente difettoso. Per il ceppo Δ/Δ bcr1 , abbiamo osservato che non solo è il ceppo Δ/Δ bcr1 difettoso nella formazione di biofilm, ma anche schermi una chiara adesione difetto, dove sono visibili le cellule alla deriva nella direzione del flusso di shear come riescono a rispettare il canale di visualizzazione. Queste differenze sono anche mostrate in Figura 4, che raffigura 4 intervalli di tempo da test a 0 h, 2h, 6h e 12 h.
Figura 1: strumento di microfluidica utilizzato in questo esperimento. Pannello A Mostra lo strumento di microfluidica utilizzato, pannello B Mostra la piastra di interfaccia, pannello C Mostra una struttura schematica di un canale di visualizzazione singola (fase) e tre sotto-fasi catturati dalla fotocamera durante l'esperimento, e pannello D Mostra una struttura schematica della piastra microfluidica 48 pozzetti utilizzata con uno schema dei pozzi di ingresso e di uscita e la finestra di visualizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sistema di controllo Select screenshots di imaging piastra modulesoftware e microfluidica. Pannello A Mostra il modulo di controllo, che contiene i controlli per la piastra microfluidica, e pannello B Mostra la finestra di modulo imaging, 'Fase spostare a posizione assoluta' modulo (mappa), il modulo di 'Multi-dimensional acquisizione' (MDA), e il modulo di «Campione Reload adeguamento» (SRA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: l'esposizione ad amfotericina B provoca difetti di formazione di biofilm. Visualizzazione in tempo dipendente della formazione di biofilm in RPMI-1640 media (colonna 1) e media di RPMI-1640 completati con amfotericina B (colonna 2) sotto flusso dinamico (0,5 dyne/cm2) 16 µ g/mL a 37 ° C per post-aderenza 12h nel sistema microfluidico. H 0 rappresentativo (lavaggio post-adesione e iniziale), 2 h, 6 h e h 12 immagini (alto verso il basso) sono indicati per il ceppo selvaggio-tipo isogeniche SN250 (colonne 1 e 2). Barre della scala sono 20 µm in ogni pannello. Corrispondente video di lasso di tempo di formazione del biofilm sono forniti nel Video 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Eliminazione di BCR1 o EFG1 provoca difetti di formazione di biofilm. Tempo dipendente dalla visualizzazione della formazione di biofilm nei media di ragno (colonne 1-3) sotto flusso dinamico (0,5 dyne/cm2) a 37 ° C per post-aderenza 12h nel sistema microfluidico. H 0 rappresentativo (lavaggio post-adesione e iniziale), 2 h, 6 h e h 12 immagini (alto verso il basso) sono indicati per il ceppo selvaggio-tipo isogeniche SN250 (colonna 1), bcr1Δ/Δ ceppo (colonna 2) ed efg1 Δ/Δ ceppo (colonna 3). Barre della scala sono 20 µm in ogni pannello. Corrispondente video di lasso di tempo di formazione del biofilm sono forniti nel Video 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il dosaggio di biofilm microfluidici personalizzabile descritto qui permette per la visualizzazione della formazione del biofilm in tempo reale a livello di singola cellula quando esposti ad un tasso fisso a flusso laminare e temperatura costante. Fornisce un mezzo potente per studiare lo sviluppo di biofilm in ceppi wild-type e mutanti, e gli effetti dei trattamenti di agente antimicrobico su biofilm in condizioni che mimano condizioni fisiologiche osservate nelle regolazioni cliniche. A differenza della maggior parte in vitro biofilm saggi, questo metodo consente per l'esame di un biofilm in via di sviluppo in tempo reale come si forma.
Questo metodo può essere utilizzato in un modo ad alta velocità, dove fino a 24 campioni possono essere eseguiti contemporaneamente per valutare la formazione di biofilm. Il metodo può essere utilizzato anche per condurre schermi genetici delle librerie mutante per identificare geni richiesti per la sviluppo di biofilm normale e può essere utilizzato per valutare l'efficacia contro il biofilm di composti antimicrobici di interesse nelle schermate di biblioteca composto. Possiamo anticipare che le future applicazioni di questo dispositivo microfluidico includerà tali schermi. Si nota, tuttavia, che alcuni test di trattamento anti-droga sarà limitato dallo spessore del biofilm formato utilizzando questo dispositivo microfluidico come biofilm cresciuti per > 16h tendono ad intasare il canale di visualizzazione. Così, droga test esperimenti devono essere eseguite per < h 16.
Nel complesso, questo dispositivo è altamente personalizzabile e versatile e può essere registrato per valutare diverse specie microbiche nei regni, portate, temperature, tempi di incubazione e media. Il metodo descritto fornisce informazioni su una serie di diversi aspetti della formazione del biofilm, inclusi l'adesione iniziale delle cellule, maturazione del biofilm e dispersione delle cellule. Anche se Segnaliamo solo risultati per formazione di biofilm di singolo-specie qui, questo protocollo potrebbe anche essere adattato per studiare la formazione di biofilm dual e mista.
Due passaggi sono fondamentali per eseguire correttamente questo protocollo. In primo luogo, le bolle d'aria nel sistema devono essere evitate dai media alla temperatura sperimentale di preriscaldamento. Un passo falso comune è la diluizione delle cellule nei media che non è stato preriscaldato. Le cellule devono essere diluite nei media stessi che viene utilizzati per i pozzi di aspirazione. Secondo, il flusso delle cellule dalla presa per aspirazione pozzetti devono essere attentamente monitorati; Se le cellule di flusso troppo lontano, i media di ingresso sarà contaminati e l'esperimento non produrrà risultati interpretabili. D'altra parte, se le cellule non sono autorizzate a spostare tutto in del canale di visualizzazione, quindi nessuna cella sarà visibile nel canale durante l'esperimento, che porta a immagini vuote. Ulteriori punti chiave da tenere a mente sono il volume e movimento tra pozzetti della piastra microfluidica sono collegati tra loro per ogni colonna, che è importante mantenere la coerenza media quanto più possibile (con viscosità simili, cellula densità, e composizione) e dimensioni simili cellule (se possibile), come diversi media e formati di cella diversa avrà diverse portate nella colonna. Durante l'esperimento, il riflusso delle cellule è controllato mediante un microscopio; Tuttavia, solo due canali possono essere visualizzati contemporaneamente (utilizzando un obiettivo 10x). Pertanto, si consiglia vivamente di effettuare un esperimento finto per misurare il tempo necessario a fluire dalla presa ai pozzi di aspirazione usando le cellule e multimediali progettate per essere impiegate nell'esperimento vero e proprio.
In generale, consigliamo vivamente l'uso di questo test di biofilm microfluidici come un'analisi in vitro per essere utilizzato prima in vivo test sugli animali. Il dosaggio, tuttavia, è ancora un test in vitro , e risultati dovrà essere convalidato in modelli animali pertinenti. Nelle nostre esperienze, i risultati di questo test di biofilm microfluidici hanno avuto il miglior valore predittivo per in vivo biofilm saggi confrontati con altri saggi in vitro abbiamo valutato14.
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Disclosures
Clarissa J. Nobile è dei fondatori di BioSynesis, Inc., una società di sviluppo di inibitori e diagnostica dei albicans del c. biofilm.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Nobile per utili discussioni su saggi di biofilm. Questo studio è stato finanziato dal National Institutes of Health (NIH) sovvenzione R21 AI125801 (C.J.N.). DLR è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato presso l'Università di California Institute per il Messico e gli Stati Uniti (UC-MEXUS) e il Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
