Summary
Este protocolo describe el uso de un dispositivo microfluídico automatizado personalizable para visualizar la formación de biopelículas de Candida albicans en condiciones fisiológicas de host.
Abstract
Candida albicans es el hongo más común patógeno de seres humanos, causando aproximadamente el 15% de los casos de sepsis adquirida en el hospital. Un atributo importante de la virulencia de C. albicans es su capacidad de forma biofilms, comunidades estructuradas de células a superficies bióticas y abióticas. Pueden formar biopelículas de C. albicans en los tejidos del anfitrión, como capas de mucosa y en dispositivos médicos, tales como catéteres, marcapasos, prótesis y prótesis mixtas. Biofilms plantean desafíos clínicos significativos ya que son altamente resistentes a las perturbaciones físicas y químicas y pueden actuar como reservorios a semilla habían diseminada infecciones. Varios ensayos en vitro se han utilizado para estudiar la formación de biopelículas de C. albicans , como ensayos de placa de microtitulación, mediciones de peso seco, ensayos de viabilidad celular y la microscopia confocal de exploración láser. Todos estos ensayos son ensayos de punto final único, donde se evalúa la formación del biofilm en un punto de tiempo específico. Aquí, describimos un protocolo para estudiar la formación de biopelículas en tiempo real usando un dispositivo microfluídico automatizado bajo condiciones de flujo laminar. Este método permite la observación de la formación de biopelículas, el biofilm se convierte con el tiempo, usando condiciones personalizables que imitan a los del huésped, tales como los encontrados en catéteres vasculares. Este protocolo puede utilizarse para evaluar los defectos de biofilm de mutantes genéticos, así como los efectos inhibitorios de agentes antimicrobianos en el desarrollo de biofilm en tiempo real.
Introduction
Candida albicans es un comensal miembro de la microbiota humana, sin embargo, es también un patógeno oportunista, capaz de causar infecciones fúngicas superficiales y graves1,2. Un rasgo importante de la virulencia de C. albicans es su capacidad de forma resistente y biofilms resistentes a los fármacos, comunidades de células adhirieron a una superficie y encerrado en una matriz extracelular de material1,3. Biopelículas de C. albicans son altamente estructurados, que contiene varias capas de varios tipos de células (alrededor de florecimiento levadura forma células, ovales células pseudohyphal y células hyphal tubulares)4. Desarrollo de biopelículas de C. albicans se inicia con la adherencia de las células de levadura-forma redonda a una superficie (siembra el biofilm), seguida de la proliferación de estas células en la superficie, y luego de la maduración del biofilm inmaduro la estructura en un biofilm formado completamente rodeada por material de matriz extracelular4. El biofilm madurito se compone predominante de las células hyphal alargadas que forman redes densas y comunicadas, proporcionando la estabilidad arquitectónica al biofilm4. Durante todo el ciclo de vida del biofilm, levadura de florecimiento las células dispersan de la biopelícula madura y pueden viajar a otras regiones del cuerpo para causar infecciones diseminadas o semilla nuevos biofilms en otros sitios4,5. C. albicans puede formar biofilms en superficies bióticas, tales como superficies de la mucosa y tejido anfitrión y en superficies abióticas, como catéteres, marcapasos, prótesis y articulaciones protésicas. Debido a las propiedades recalcitrantes de biopelículas, que son extremadamente difíciles de erradicar y en muchos casos la estrategia del único tratamiento eficaz es retiro del dispositivo infectado4. Por lo tanto es crucial investigar formación de biopelículas en condiciones similares a los observados en contextos clínicos.
Hay varias críticas en vivo modelos animales usados para el estudio de C. albicans biofilm formación6,7,8; sin embargo, estos estudios pueden ser costoso, desperdiciador de tiempo y están limitados por el número de cepas y de agentes antimicrobianos que se pueden probar en un momento dado. In vitro biofilms ensayos, por el contrario, permiten la evaluación rápida, alto rendimiento de compuestos antifúngicos y de cepas mutantes y son mucho más rentables y ético que biofilm ensayos llevados hacia fuera en animales modelos9, 10,11,12,13,14. Aquí se describe un ensayo en vitro que hemos desarrollado y optimizado para observar la formación de biopelículas temporal bajo flujo laminar utilizando dispositivo microfluídico personalizable14,15. El ensayo permite la visualización de cada etapa de formación de biopelículas, como el paso de adherencia inicial, proliferación celular, maduración de la biopelícula y dispersión de células. El ensayo también es útil para visualizar cambios de morfología de la célula durante el desarrollo de un biofilm.
Las placas de microtitulación, que normalmente se utilizan para en vitro los ensayos de biofilm, mientras que de alto rendimiento, no se permiten para condiciones de flujo controlado. Flujo laminar tradicional célula sistemas permiten la evaluación continua de la formación de biofilm en condiciones de controlar el flujo, pero éstos a menudo son lentos y suelen tener limitados rendimiento y control de rango dinámico. El dispositivo de microfluidos utilizado aquí supera estas limitaciones mediante la combinación de placas de alto rendimiento (contiene 48 pozos) con una cámara de flujo laminar incorporado y es altamente reproducible, versátil y personalizable.
Aquí, describimos un protocolo para el uso de un dispositivo microfluídico automatizado disponible en el mercado para evaluar la formación de biopelículas de un tipo salvaje C. albicans cepa, los efectos de un agente antifúngico conocido en el desarrollo de un biofilm y biofilm defectos de formación en dos cepas mutantes (bcr1Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) que se reportaron anteriormente que biofilm in vitro e in vivo16,17,18. El protocolo descrito puede utilizarse para probar la eficacia de los agentes antimicrobianos en la inhibición de formación de biopelículas en el desarrollo de un biofilm y para identificar los genes requeridos para el desarrollo de biofilm normal por detección mutantes bibliotecas.
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Protocol
1. fungicidas de la célula cultura preparación
Nota: Cultivo de células de conducta trabajo (es decir, la abertura criogénicos stock tubos, tubos de cultivo celular y frascos) dentro de un gabinete de bioseguridad. Abra ultravioleta (UV) lámpara germicida al menos 1 h del gabinete antes de la obra y apagar la lámpara UV mientras trabajaba activamente en el gabinete. Utilizar guantes, gafas de seguridad y equipos de protección personal y descontaminar la superficie del Banco y pipetas con etanol al 70% antes del inicio del experimento. Se recomienda el uso de puntas de filtro estériles y familiaridad con técnicas microbiológicas asépticas básicas.
- Cepas de C. albicans de racha (tipo salvaje, bcr1 Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) en levadura extracción medio de dextrosa (YPD) peptona (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% glucosa; pH 6.8) placas de agar. Incubar a 30 ° C por 48 h, siguientes prácticas microbiológicas estándar19.
- Seleccione una sola Colonia aislada de la placa para inocular en 4 mL de medio líquido YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% glucosa; pH 6.8) e incubar a 30 ° C con agitación a 225 rpm en un estándar que sacude la incubadora para 12 a 15 h, siguientes prácticas microbiológicas estándar u19.
- Determinar la densidad celular de la cultura mediante la medición de densidad óptica (OD) a 600 nm en una cubeta (1 mL, 1 cm de longitud de ruta de acceso), microbiológico siguiente estándar practica19.
- Diluir el cultivo celular para un final de OD600 de 0,5, equivalente a 2 x 107 células/mL, en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (que contiene ácido 3-morpholinopropane-1-sulfónico (MOPS), L-glutamina, de 165 mM y sin sodio bicarbonato, pH 7.0) o araña medio (caldo nutritivo 1%, 1% manitol, 0.4% K2HPO4, pH 7,2).
Nota: Los medios de comunicación alternativa pueden utilizarse para apoyar el crecimiento de cepas de interés.
Nota: No haga diluciones de células de muy lejos por adelantado. Se recomienda comenzar las diluciones después paso 3.3 (se describe a continuación) para prevenir la iniciación de la formación de hifas antes de ser cabeza de serie en el canal de visualización de las células.
2. preparación de microfluidos canales de la placa microfluídica
Nota: Refiérase al manual de usuario del sistema de microfluidos (véase tabla de materiales) para obtener información sobre las placas y configuración del instrumento.
- Antes de ejecutar el experimento de microfluidos, tibio 20 mL de Medio RPMI-1640 o medios de araña en una incubadora a 37 ° C. Volumen del contenido multimedia adicional puede ser necesario basado en cálculos de paso 2.8. Precalentamiento de los medios de comunicación impide la formación de burbujas de aire durante el experimento.
- Encienda el sistema de microfluidos que incluye el controlador, las dos unidades de alimentación, el microscopio, la cámara y el ordenador conectado al sistema. Abra el software que controla el sistema (véase tabla de materiales) en el menú de programa en la computadora. Una vez abierto el programa aparecen dos ventanas.
- Localice el número de código de barras de la placa en el uso y el número cuando se le pregunte por el software de la entrada. Utilizar dos pantallas de ordenador independiente para ver el software en las dos ventanas. (Módulo de control) de una ventana contiene los controles para la placa y la segunda ventana (montaje, módulo de proyección de imagen) contiene los controles para el microscopio y la cámara.
- Encienda el interruptor del calentador del controlador y seleccione la microfluídica sistema temperatura 37 ° C utilizando los botones de flecha en el controlador de temperatura.
- Limpie la placa de la interfaz (figura 1) utilizando agua estéril como sigue. Rocíe la parte inferior de la placa con agua estéril y use papel de lente para eliminar suciedad y polvo. Descansar la interfaz placa boca abajo sobre papel limpia lente al aire seco. Limpie la parte superior de la placa de interfaz utilizando 70% isopropanol y lente de papel.
Nota: La placa de interfaz conecta el sistema de microfluidos para la placa que contiene las células y los medios de comunicación. Asegúrese de que ningún líquido se mantiene y que todas las fibras y la suciedad se eliminan. Una limpieza inadecuada puede resultar en vídeos e imágenes de baja calidad. - Eliminar la condensación de los tubos en la placa de interfaz.
- Deja la cara de la placa hacia abajo descansando en el papel de lente. En el control de ventana del módulo hacer clic en el modo manual de la placa. En la sección de menú de control de corte, haga clic en la selección de fluidos para las columnas 1-4 y 5-8 y seleccionar a 37 ° C en el menú desplegable. En la sección de control de la corte, establece el modo de flujo constante y el esfuerzo cortante máximo en 2 Dina/cm2 (0,2 Pa) (figura 2A).
- Haga clic en los pozos de entrada para iniciar el flujo de aire estéril a través de los tubos de la placa de interfaz para eliminar la condensación. Después de 5 minutos, haga clic en el botón de stop en la sección de control de placa bien (figura 2A). Observar los tubos en la placa de interfaz para confirmar que se ha eliminado toda condensación. Si las gotas son todavía visibles, repita el flujo de aire estéril, como se mencionó anteriormente, por otros 5 minutos.
Nota: Los tubos de entrada están conectados a filtros de 0,22 micras para garantizar sólo el aire estéril se introduce en el sistema de microfluídica. El flujo puede controlarse por el registro de eventos en la pantalla en la ventana de módulo de control.
- Coloque la placa de microfluidos Dina de 0-20 de 48 pozos en la platina del microscopio.
3. formación de Biofilm de candida albicans en el sistema de microfluidos
- Para registrar la formación de biopelículas, añadir 600 μl de medio de araña o con Medio RPMI-1640 a los pozos de entrada (ver figura 1 para el diseño de la placa). Tienen dos réplicas para cada condición experimental.
- Para las pruebas de formación de biopelículas de C. albicans las cepas tipo salvaje y mutantes, añadir 600 μl de medio de araña a los pozos de entrada de la placa del experimento.
- Para las pruebas de formación de biopelículas en presencia de fármacos antimicóticos (u otros compuestos de interés), añadir 600 μl de Medio RPMI-1640 a dos pozos (control negativo) y 600 μl de RPMI-1640 suplementado con anfotericina B (16 μg/mL) (o fármaco de elección en concentración) a otros dos pozos de entrada.
Nota: Para una experiencia de formación de biofilm de 12 h, añadir 600 μl de medio precalentado a los pozos de entrada. Para más experimentos añadir multimedia adicionales (50 μl/h) a los pozos de entrada. No exceder el volumen máximo del pozo (1.500 μl).
- Lentamente baje la placa de interfaz limpia encima de la placa microfluídica bien 48. Deslice la placa de interfaz un poco hacia la izquierda hasta que los tubos en la placa de interfase se colocan encima de los pozos de entrada y salida.
Nota: Flujo de aire estéril de los tubos en la placa de interfaz empujará el líquido en los pozos de entrada o salida (dependiendo de la dirección seleccionada utilizando el software en el equipo), para que el líquido fluye a través del canal de visión entre la entrada y salida pozos en la dirección personalizada y velocidad dictada por el usuario.
Nota: Cebado es necesario para eliminar el aire de los canales de visualización y asegúrese de que los canales están llenos de los medios de comunicación deseado.
- Para las pruebas de C. albicans las cepas tipo salvaje y mutantes, añadir 50 μl de cultivo de células de tipo salvaje (SC5314) en medios de araña dos pozos de la toma de corriente, bcr1 Δ/Δ en medios de araña para dos pozos de la toma de corriente y efg1 Δ/Δ en medios de araña para dos pozos de la toma de corriente. Coloque la placa de interfaz en la placa de microfluidos y bloquear la tapa (ver figura 1 para el diseño de la placa).
Nota: Como se describe en el paso 3.1.1, todos los pozos de entrada correspondientes contienen medios de araña. - Para las pruebas de formación de biopelículas de C. albicans en presencia de anfotericina B u otros compuestos de interés, añadir 50 μl de cultivo de células de tipo salvaje (SC5314) en Medio RPMI-1640 a cuatro pozos de la toma de corriente. Coloque la placa de interfaz en la placa de microfluidos y bloquear la tapa (ver figura 1 para el diseño de la placa).
Nota: Como se describe en el paso 3.1.2, todos los pozos de entrada correspondientes contienen medios RPMI-1640 con o sin anfotericina B u otros compuestos de interés.
Nota: Las células se mueven de los pozos de salida hacia los pozos de entrada; es esencial que el flujo se detiene antes de que las células llegar a los pozos de entrada. Esto asegura que los pozos de entrada no consigue contaminados con cultivo de células y que los medios de comunicación en los pozos de entrada permanece estéril por la duración del experimento. La fuerza de esquileo y el tiempo necesario se basa en la viscosidad de los medios utilizados y el tamaño de las células.
4. configuración de las posiciones de la etapa para el experimento de microfluidos
Nota: Las posiciones de la etapa y calibración de la placa deben establecerse antes de comenzar el experimento. Esta configuración permite que el equipo almacenar las posiciones de cada canal de visión para capturar las imágenes durante el experimento. La placa microfluídica no debe ser perturbada después de configurar las posiciones de la etapa. Si la placa se mueve, las posiciones de la etapa debe restablecerse antes del inicio del experimento.
- Utilizar el software de análisis de la visualización (ver tabla de materiales) establecer la etapa de posiciones; cada canal de visualización es una etapa (1-24) (figura 1) y cada etapa tiene tres subestadios (1-3) para captura de imágenes en diferentes posiciones a lo largo del canal de visualización (figura 1). En la ventana del módulo proyección de imagen, abra el módulo de 'Multidimensional adquisición' (MDA) haciendo clic en la ficha MDA (figura 2B).
- En el MDA módulo haga clic en la pestaña de 'Stage' en el menú del lado izquierdo (figura 2B). En la sección de la etapa, cargar la lista de escenario principal para la placa de microfluidos Dina 20 bien 0 - 48. Cada canal de visualización debe tener tres etapas para la adquisición de la imagen.
- Abrir la 'Muestra de recarga ajuste' (SRA) y 'Etapa mover a posición absoluta' módulos (mapa) haciendo clic en el tab de la SRA y el mapa (figura 2B). En el módulo de la SRA, presione el botón de 'En vivo' para ver una previsualización de la imagen con el punto de mira.
- Utilizando el joystick, coloque la placa de la pozo tal que la punta de la flecha (ubicada físicamente en la placa) adyacente a ver canal 4 se alinea con el punto de mira en el software. En el menú de mapa, pulse el botón de 'Configurar origen' (figura 2B). Ahora debe leer la posición actual 0 en X, Y y Z.
- En el módulo de la SRA, haga clic en la sección 'Puntos de referencia inicial' en el menú de la izquierda (figura 2B). Haga clic en configuración de carga y carga el archivo de la placa de microfluidos Dina 20 bien 0 - 48.
- En la sección de la etapa del módulo MDA, haga doble clic en ' posición de 22,2'. Esta posición indica la media (sub-etapa 2) de la visualización de canales el número 22. Esto traerá el microscopio viendo el escenario y el foco de la cámara en proximidad cercana al marcador flecha viendo Canal 22. Utilizando el joystick, coloque la placa de la pozo tal que la punta de la flecha (ubicada físicamente en la placa) adyacente a ver Canal 22 se alinea con el punto de mira.
- Copie la coordenada Y en el módulo MDA en la posición Y del punto 2 en la pestaña de 'Puntos de referencia de actualización' del módulo de SRA (figura 2B).
- En la pestaña de 'Posiciones de la etapa de actualización' de la SRA, haga clic en 'Aplicar a MDA etapa lista' (figura 2B).
Nota: Esto actualizará todos viendo posiciones de etapa en la placa (1-24) para calibrar la posición de placa microfluídica específico sobre la platina del microscopio.
5. configuración de adquisiciones para la imagen de captura durante el experimento de microfluidos
- En la ventana imagen de módulo, utilice el módulo MDA y haga clic en la pestaña de 'Guardar' en el menú de la izquierda (figura 2B). Seleccione el nombre de archivo para el experimento y la carpeta para guardar las imágenes adquiridas en el equipo.
- En el módulo MDA, haga clic en la ficha 'Timelapse' en el menú de la izquierda y a adquirir imágenes total 145; establecer el lapso de tiempo entre imágenes a 5 min. Esto resultará en 1 imagen cada 5 min para un experimento de desarrollo de biofilm de 12 h.
Nota: El intervalo de tiempo entre las imágenes y el número total de imágenes se puede ajustar según requisitos experimentales. Si la proyección de imagen por más de 12 h, añadir contenido multimedia adicional a los pozos de entrada en el paso 3.1 para asegurar que los pozos no funcione en secos. Para más experimentos añadir multimedia adicionales, según sea necesario (50 μl/h) a los pozos de entrada. - En el módulo MDA, haga clic en la ficha «longitudes de onda» en el menú de la izquierda (figura 2B) y establecer el número de longitud de onda para el experimento 1. Seleccionar la longitud de onda para capturar 50% Brightfield y 50% la cámara con un tiempo de exposición de 12-20 ms, aumento 0,6 y digitalizador de 20 MHz.
Nota: Las longitudes de onda adicionales se pueden utilizar, incluyendo longitudes de onda para la proyección de imagen de la fluorescencia (por ejemplo, nos hemos con éxito visualizado GFP etiquetado C. albicans cepas usando este dispositivo de microfluidos y mCherry). Los parámetros de adquisición pueden también modificarse basado en requisitos experimentales. Por ejemplo, configurar una segunda longitud de onda y seleccionar 'Autofocus en cada punto de tiempo' y una tercera longitud de onda y seleccionando 'Autoexposure en cada punto de tiempo' se recomienda para que principiantes maximizar las oportunidades de adquisición de imagen en foco. - En el módulo MDA, seleccione las fichas de la lista de etapa en el menú de la izquierda. Etapas 1,1 – 24,3 aparecerá. Uno por uno, haga clic en cada etapa y utilizar los ajustes de foco fino para enfocar manualmente en las células en el canal de visualización para cada etapa. Una vez que el campo de visión está en foco, haga clic en la flecha negra junto a la lista de la etapa para actualizar y guardar los ajustes para cada etapa. El equipo utilizará estas configuraciones de posición definida manualmente y focal para adquirir imágenes en cada momento. Eliminar cualquier etapas sin usar de la lista utilizando las flechas de la 'Quitar'.
Nota: El módulo MDA y el programa se refieren a ver canales como etapas indistintamente, y la misma terminología es utilizada por el software.
6. ejecutar el experimento de microfluidos
- En la ventana del módulo proyección de imagen, mediante el módulo MDA, seleccione 'Adquisición' para comenzar la captura de imágenes pre-ras de células adheridas todas las sub etapas (figura 2B).
Nota: La ventana de módulo de proyección de imagen y los controles de la cámara aparecen imágenes que están siendo capturados y el módulo de mapa, SRA y MDA ya no será visible. Las imágenes captadas también mostrará un contador de tiempo en el lado, para indicar el número de imagen ser capturado y el lapso de tiempo antes de que se iniciará el próximo ciclo de captura de imagen. Esperar una ronda de imágenes para ser capturado antes de proceder con el siguiente paso.
Nota: No use los botones 'Pause' o 'Marca Event' en la pantalla imágenes de la ventana del módulo. Partir de este punto durante el experimento, mantenga el ratón en la ventana de módulo de control en la segunda pantalla del ordenador (figura 2A). Esto es importante para evitar perturbar la imagen ventana de módulo. - En la estancia de control módulo ventana en el modo manual de la placa. En la sección de control de la corte, establece el modo de flujo constante y el esfuerzo cortante máximo en 1 Dina/cm2 (0.1 Pa). Haga clic en pozos de la salida O1, O7, O13 y O19 para comenzar el flujo de los medios de comunicación de la entrada a los pozos de salida (figura 2A) para eliminar las células no adheridas. Después de 5 minutos, haga clic en el botón de stop en la sección de control de placa bien. Permiten una segunda ronda de imágenes que se adquirirá. Imágenes pueden ser visualizadas y el lapso de tiempo puede ser monitoreado en la segunda pantalla en la ventana de módulo de proyección de imagen.
- En la sección de control de corte, ajustar el flujo de cizalla máximo 0,5 Dina/cm2 (0,5 Pa) haciendo clic en el número en el máximo esfuerzo cortante columna y utilizando el teclado para entrar en 0.5. Presione la tecla enter en el teclado y confirme el cambio en la tasa de flujo en el registro de eventos en la ventana de módulo de control (figura 2A). El experimento deje reposar en la oscuridad durante 12 h.
Nota: La exposición a la luz y movimiento/vibraciones pueden reducir seriamente la calidad de las imágenes adquiridas durante todo el experimento. Al final del experimento de microfluidos, la ventana de módulo de proyección de imagen no mostrará ninguna imagen y vuelve a mostrar los módulos SRA, mapa y MDA. El software de módulo de proyección de imagen puede utilizarse para ver las imágenes, montar los videos y cuantificar los biofilms formados (se describe a continuación).
7. analizar los resultados
- En la ventana del módulo proyección de imagen, seleccione la pestaña 'Herramientas de análisis' y 'Revisión multidimensional Data' (RMD) en el menú, haga clic en menú. En el módulo de revisión, haga clic en 'Seleccionar archivo de Base'. Se abrirá la ventana de 'Utilidades de conjunto de datos multidimensional'.
- Haga clic en el botón 'Seleccionar Directory' y seleccione la carpeta que se utiliza para guardar el experimento en el paso 5.1. En la lista de 'Conjuntos de datos', seleccione el registro de archivo de experimento (.nd extensión). Una vez cargado el registro, haga clic en el botón 'vista'.
- Seleccione la longitud de onda haciendo clic en las opciones en el menú de la izquierda 'Longitudes de onda' y elegir la posición para ver un menú desplegable. Elegir la imagen a cargar desde los números en la parte superior del módulo pulsando el número de la imagen. Una vez seleccionado, haga clic en el botón 'cargar imágenes' para cargar las imágenes. Usted puede ver una sola imagen o todas las imágenes a la vez.
- Seleccione todas las imágenes de vídeo para un lapso de tiempo. Las imágenes seleccionadas se abrirán como un video en una ventana nueva. Haga clic en la pestaña de 'archivo' en la ventana de módulo de proyección de imagen y elija 'guardar como' desde el menú desplegable. Guardar el vídeo resultante como el archivo predeterminado (TIFF/MetaSeries).
- Abrir y cargar el archivo de vídeo guardado utilizando el software ImageJ. En ImageJ, haga clic en la pestaña 'archivos' y haga clic en 'guardar como'. Elija '. avi' en el menú desplegable y convertir el archivo a un archivo .avi mediante la conversión de JPEG a 10 frames/seg.
Nota: La velocidad del vídeo se puede ajustar alterando los fotogramas/s. - Para cuantificar los biofilms, repita los pasos 7.2, 7.3 y 7.4.
Nota: El 'área' para cada imagen obtenida durante el experimento es idéntica y así la medida del 'Área Thresholded' puede utilizarse para evaluar diferencias en formación de biopelículas en cepas de tipo salvaje y mutantes cepas o evaluar la efectividad de la droga probada en formación de biopelículas.
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Representative Results
Realizamos microfluídicos biofilm ensayo descrito aquí usando un tipo de salvaje cepa de C. albicans bajo condiciones de dos medios de comunicación (medios RPMI-1640 y araña), la cepa de tipo salvaje en presencia de los conocidos antimicóticos anfotericina B (16 μg/mL) en RPMI, y dos cepas mutantes previamente divulgados a tener defectos en la formación de biopelículas (bcr1Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) en los medios de la araña.
Video 1 muestra el desarrollo de una biopelícula de tipo salvaje en Medio RPMI-1640 y los efectos de la droga antihongos, anfotericina B, en la formación de biopelículas. Condiciones de tipo salvaje, varias células se adhieren fuertemente al canal, las células forman hifas as time avanza y una espesa biopelícula puede observarse intercalando hifas y células de levadura. Hacia el final del experimento de microfluidos, el biofilm de tipo salvaje llena completamente el canal de visión. La presencia de la anfotericina B, sin embargo, tiene un efecto pronunciado sobre la reducción de la biopelícula. Específicamente, se disminuye la adherencia de las células y, a diferencia de las condiciones sin tratar, en presencia de la anfotericina B, se pueden ver varias células que fluye lejos con el flujo del esquileo de los medios de comunicación. Como el tiempo progresa, la células no hifas de forma y un biofilm no está formados. Estas diferencias también se muestran en la figura 3, que representa a 4 puntos de tiempo de ensayo en 0 h, 2 h, 6 h y 12 h.
Video 2 muestra el desarrollo de una biopelícula de tipo salvaje y dos previamente divulgados a mutantes defectuosos de biofilm (bcr1 Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) en los medios de la araña. Ambas cepas Δ/Δ Δ/Δ y efg1 bcr1 muestran formación de biofilm severamente reducido en comparación con la cepa de tipo salvaje isogénicas. Para la cepa Δ/Δ efg1 , observamos que las células adheridas no forman hifas y el biofilm resultante es seriamente defectuoso. Para la cepa Δ/Δ bcr1 , observamos que no sólo es la cepa Δ/Δ de bcr1 defecto de formación del biofilm, sino que también muestra una clara adherencia defecto, donde se observan células deriva en la dirección del flujo de corte ya que no se adhieren a la Viendo el canal. Estas diferencias también se muestran en la figura 4, que representa a 4 puntos de tiempo de ensayo en 0 h, 2 h, 6 h y 12 h.
Figura 1: microfluídicos instrumento utilizado en este experimento. Panel A muestra el instrumento de microfluidos utilizado, el panel B muestra la placa de interfaz, panel C muestra un Resumen esquemático de un canal de solo visualización (etapa) y tres subestadios, capturados por la cámara durante el experimento, y panel D muestra un Resumen esquemático de la placa de 48 pozos microfluídicos con un esquema de los pozos de entrada y salida y la ventana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: sistema de control de seleccionarlos imágenes de imágenes de placa modulesoftware y microfluídicos. Panel A muestra el módulo de Control, que contiene los controles para la placa microfluídica, y el panel B muestra la ventana del módulo proyección de imagen, la 'etapa mover a posición absoluta' (mapa) módulo, el módulo de 'Multidimensional adquisición' (MDA), y el módulo de 'Ajuste de recarga muestra' (SRA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: exposición a la anfotericina B produce defectos de formación de biofilm. Visualización dependiente del tiempo de formación de biopelículas en Medio RPMI-1640 (columna 1) y los medios RPMI-1640 complementados con anfotericina B (columna 2) bajo flujo dinámico (0,5 Dina/cm2) de 16 μg/mL a 37 ° C para la adhesión después de 12 h en el sistema de microfluidos. 12 h imágenes (arriba a abajo), 2 h, 6 h y representante 0 h (lavado posterior adherencia e inicial) se muestran para la cepa de tipo salvaje isogénicas SN250 (columnas 1 y 2). Barras de escala son 20 μm en cada panel. Correspondientes vídeos de lapso de tiempo de formación de biopelículas se proporcionan en el Video 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Eliminación de BCR1 o EFG1 resultados en defectos de formación del biofilm. Tiempo de visualización depende de la formación de biofilm en medios de la araña (columnas 1-3) bajo flujo dinámico (0,5 Dina/cm2) a 37 ° C para adherencia después de 12 h en el sistema de microfluidos. 12 h imágenes (arriba a abajo), 2 h, 6 h y representante 0 h (lavado posterior adherencia e inicial) se muestran para la cepa de tipo salvaje isogénicas SN250 (columna 1), bcr1Δ/Δ tensión (columna 2) y efg1 Δ/Δ tensión (columna 3). Barras de escala son 20 μm en cada panel. Correspondientes vídeos de lapso de tiempo de formación de biopelículas se proporcionan en el Video 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El ensayo de biofilm microfluídicos personalizable aquí descrito permite la visualización de la formación de biofilm en tiempo real a un nivel unicelular cuando se expone a una tasa fija de flujo laminar y temperatura constante. Proporciona un medio poderoso para el desarrollo de biopelículas en cepas de tipo salvaje y mutantes, y los efectos de los tratamientos de agente antimicrobiano en biofilms bajo condiciones que imitan las condiciones fisiológicas observaron en entornos clínicos. A diferencia de la mayoría en vitro ensayos biofilm, este método permite la examinación de un biofilm en vías de desarrollo en tiempo real como de forma.
Este método puede utilizarse de un modo de alto rendimiento, donde hasta 24 muestras se pueden ejecutar simultáneamente para evaluar la formación de biopelículas. El método también puede utilizarse para llevar a cabo pantallas genéticas de mutantes bibliotecas para identificar los genes necesarios para el desarrollo de biofilm normal y puede utilizarse para evaluar la efectividad contra los biofilms de compuestos antimicrobianos de interés en las pantallas de la biblioteca compuesto. Esperamos que futuras aplicaciones de este dispositivo de microfluidos incluirá dichas pantallas. Sin embargo, observamos que ciertas pruebas de tratamiento de drogas estará limitada por el espesor de la biopelícula formada con este dispositivo de microfluidos como biofilms cultivados para > 16 h tienden a obstruir el canal de visión. Por lo tanto, experimentos de prueba de la droga tendrá que realizar para < h 16.
En general, este dispositivo es altamente adaptable y versátil y puede ajustarse para evaluar diferentes especies microbianas en reinos, caudales, temperaturas, tiempos de incubación y los medios de comunicación. El método descrito proporciona información sobre un número de diferentes aspectos de la formación de biopelículas, como adhesión celular inicial, maduración de la biopelícula y dispersión de células. Aunque sólo Divulgamos resultados para formación de biofilm de especies individuales aquí, este protocolo también podría ser adaptado para el estudio de formación de biopelículas de especies mixtas y dual.
Dos pasos son fundamentales para realizar con éxito este protocolo. En primer lugar, deben evitarse las burbujas de aire en el sistema por los medios de comunicación a la temperatura experimental de precalentamiento. Un error común es la dilución de las células en medios de comunicación que no se precalentó. Las células deben ser diluidas en el mismo medio que se utiliza para los pozos de entrada. Segundo, el flujo de las células de salida a entrada de pozos deben ser supervisados cuidadosamente; Si las células fluyen demasiado lejos, los medios de comunicación de entrada a contaminar, el experimento no dará resultados interpretables. Por otro lado, si las células no se les permite moverse en el canal de visualización, entonces ningunas células será visibles en el canal durante el experimento, dando lugar a imágenes en blanco. Puntos claves adicionales a tener en cuenta están que el volumen y el movimiento entre pozos en la placa de microfluidos se unen para cada columna, y es importante mantener la mayor consistencia de los medios de comunicación como sea posible (con similar viscosidad, densidad, de la célula y composición) y del mismo modo las células (si es posible), como células diferentes tamaños y diferentes medios de comunicación tendrán caudales diferentes en la columna. Durante el experimento, se controla el reflujo de las células utilizando un microscopio; sin embargo, sólo dos canales pueden verse al mismo tiempo (usando un objetivo de X 10). Así, se recomienda llevar a cabo un experimento simulado para medir el tiempo requerido para el flujo de corriente a los pozos de entrada usando las células y los medios de comunicación previsto ser utilizado en el experimento real.
En general, recomendamos uso de este ensayo de microfluidos biofilm como un ensayo en vitro a utilizarse antes en vivo los ensayos con animales. El ensayo, sin embargo, sigue siendo un ensayo en vitro y resultados tendrán que ser validadas en modelos animales relevantes. En nuestra experiencia, los resultados de este ensayo de biofilm de microfluidos han tenido el mejor valor predictivo para en vivo los ensayos de biofilm en comparación con otros ensayos en vitro hemos determinado14.
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Disclosures
Clarissa J. Nobile es uno de los fundadores de BioSynesis, Inc., una empresa de desarrollo de inhibidores y diagnósticos de C. albicans biofilms.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Nobile para discusiones útiles en ensayos de biofilm. Este estudio fue apoyado por los institutos nacionales de salud (NIH) subsidio AI125801 R21 (C.J.N.). D.L.R. fue apoyado por una Beca doctoral de la Universidad de California y el Instituto para México y los Estados Unidos (UC MEXUS) y el Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
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