Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet

Published: December 14, 2017 doi: 10.3791/56743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, School of Natural Sciences, University of California, Merced

Summary

Det här protokollet beskriver användningen av en anpassningsbara automatiserade mikroflödessystem enhet att visualisera biofilm bildning i Candida albicans värd fysiologiska villkor.

Abstract

Candida albicans är den vanligaste svamp patogen av människor, orsakar ca 15% av vårdrelaterade sepsis fall. Ett större virulens attribut av C. albicans är dess förmåga att bilda biofilmer, strukturerade samhällen av celler som bifogas biotiska och abiotiska ytor. C. albicans biofilmer kan bilda på värd vävnader, såsom slemhinnor skikt, och på medicinska enheter, till exempel katetrar, pacemakers, tandproteser och ledproteser. Biofilmer innebär betydande kliniska utmaningar eftersom de är mycket motståndskraftiga mot fysiska och kemiska störningar och kan agera som reservoarer för att utsäde sprida infektioner. Olika in vitro- analyser har använts för att studera C. albicans biofilm bildning, såsom mikrotiter plattan analyser, torr vikt mätningar, cell livskraft analyser och konfokalmikroskopi scanning laser. Alla av dessa analyser är enda slutpunkt analyser, där biofilm bildning bedöms vid en specifik tidpunkt. Här beskriver vi ett protokoll för att studera biofilm bildning i realtid med en automatiserad mikroflödessystem enhet laminär villkor. Denna metod tillåter för observationen av biofilm bildning som biofilmen utvecklas över tid, med anpassningsbara villkor som efterliknar de av värden, som de stött på i vaskulära katetrar. Detta protokoll kan användas för att bedöma de biofilm defekterna av genetiska mutanter samt de hämmande effekterna av antimikrobiella medel på biofilm utveckling i realtid.

Introduction

Candida albicans är en kommensaler medlem av den mänskliga bakterieflora, men det är också en opportunistisk patogen, kan orsaka ytliga och svår svampinfektioner1,2. En större virulens drag av C. albicans är dess förmåga att bilda motståndskraftiga och resistenta biofilmer, samhällen av celler följs en yta och inneslutna i en extracellulär matrix material1,3. C. albicans biofilmer är mycket strukturerad, som innehåller flera lager av flera celltyper (runda spirande jäst-form celler, oval pseudohyphal celler och tubulär hyphal celler)4. C. albicans biofilm utveckling börjar med anslutning runda jäst-form celler till en yta (sådd biofilmen), följt av spridningen av dessa celler på ytan och sedan mognaden av den omogna biofilmen struktur till en fullt bildade biofilm som är omgiven av extracellulärmatrix material4. Den mogna biofilmen består huvudsakligen av avlånga hyphal celler som bildar täta och anslutande nät, den arkitektoniska stabilitet till biofilm4. Under biofilm hela livscykel, runda spirande jäst celler skingra från den mogna biofilmen och kan resa till andra områden av kroppen för att orsaka spridas infektioner eller utsäde nya biofilmer på andra platser4,5. C. albicans kan bilda biofilmer på biotiska ytor, till exempel slemhinnorna och hela värden vävnad, och på abiotiska ytor, såsom katetrar, pacemakers, proteser och proteskomponenter lederna. På grund av biofilmer motsträviga egenskaper, de är extremt svåra att utrota, och i många fall den enda effektiva behandlingsstrategin är avlägsnande av den infektera enheten4. Det är därför avgörande att undersöka biofilm bildning under förhållanden liknande dem som observerats i kliniska inställningar.

Det finns flera kritiska i vivo djurmodeller för att studera C. albicans biofilm bildning6,7,8. dock dessa studier kan vara kostsam och tidskrävande, och begränsas av antalet stammar och antimikrobiella medel som kan provas vid en given tidpunkt. In vitro biofilm analyser, däremot, möjliggör snabb, hög genomströmning bedömningen av svampdödande föreningar och muterade stammar och är mycket mer kostnadseffektiva och etiska än biofilm analyser buret ut i djur modeller9, 10,11,12,13,14. Här beskriver vi ett in vitro- test som vi utvecklat och optimerat för att observera biofilm bildning temporally under laminärt flöde med hjälp av en anpassningsbar mikroflödessystem enhet14,15. Analysen möjliggör visualisering av varje etapp av biofilm bildning, inklusive inledande följsamhet steg, cellproliferation, biofilm mognad och cell spridning. Analysen är också användbart att visualisera morfologi cellförändringar under utvecklingen av en biofilm.

Mikrotiter plattor, som vanligtvis används för in vitro- biofilm analyser, medan hög genomströmning, tillåter inte för kontrollerat flöde villkorar. Traditionella laminärt flöde cellsystem tillåter kontinuerlig bedömning av biofilm bildning i kontrollerat flöde villkor, men dessa är ofta tidskrävande att ställa in och tenderar att ha begränsat dynamiskt omfång kontroll och genomströmning. Mikroflödessystem enheten utnyttjas här övervinner dessa begränsningar genom att kombinera hög genomströmning plattor (innehållande 48 brunnar) med en inbyggd laminär kammare och är mycket reproducerbara, mångsidig och anpassningsbar.

Här beskriver vi ett protokoll för användning i ett kommersiellt tillgängliga automatiserade mikroflödessystem att bedöma biofilm bildning av en vild typ C. albicans stam, effekterna av en känd svampdödande agent på utvecklingen av en biofilm och biofilm bildning i två muterade stammar (bcr1Δ/Δ och efg1 Δ/Δ) som tidigare redovisats har biofilm defekter in vitro- och in-vivo16,17,18. Protokollet beskrivs kan användas för att testa effekten av antimikrobiella medel i att hämma biofilm bildning under utvecklingen av en biofilm, och att identifiera gener som krävs för normal biofilm utveckling av screening mutant bibliotek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. svamp Cell kultur förberedelse

Obs: Beteende cellkultur fungerar (dvs öppning kryogen lager rör, cell kultur rör och kolvar) inom en biosäkerhet skåp. Slå på skåpets ultraviolett (UV) bakteriedödande lampa minst 1 h före arbete och Stäng av UV-lampan medan du aktivt arbetar i skåpet. Bär handskar, skyddsglasögon och lämplig personlig skyddsutrustning, och sanera ytan av bänk och pipetter med 70% etanol före starten av experimentet. Användning av sterila filter tips och förtrogenhet med grundläggande aseptisk mikrobiologisk teknik rekommenderas.

  1. Strimma C. albicans stammar (vildtyp, bcr1 Δ/Δ och efg1 Δ/Δ) på jäst extrakt pepton dextros (YPD) medium (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos; pH 6,8) agarplattor. Inkubera vid 30 ° C för 48 h, följande mikrobiologiska standardpraxis19.
  2. Välj en enda isolerad koloni från plattan till Inokulera i 4 mL YPD flytande medium (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos; pH 6,8) och inkubera vid 30 ° C under skakning på 225 rpm i en standard som skakar inkubator för 12-15 h, följande standard mikrobiologiska prac lingsverksamhet19.
  3. Bestämma cell densiteten av kulturen genom att mäta optisk densitet (OD) på 600 nm i en kyvetten (1 mL, 1 cm sökvägens längd), följande standard mikrobiologiska metoder19.
  4. Späd cellkulturen till en slutlig OD600 av 0,5, motsvarande 2 x 107 celler/mL, i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium (som innehåller 165 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonsyra (moppar), L-glutamin, och utan natrium bikarbonat, pH 7,0) eller Spider medium (1% näringsämne buljong, 1% mannitol, 0,4% K2HPO4, pH 7,2).
    Obs: Alternativa media kan användas för att stödja specifik tillväxt av stammar av intresse.
    Obs: Gör inte cell utspädningar alltför långt i förväg. Det rekommenderas att börja utspädningar efter steg 3.3 (beskrivs nedan) för att förhindra att inledandet av hyfer bildas före celler som dirigeras i visningskanal.

2. beredning av mikroflödessystem kanaler Skyltens mikrofabricerade

Obs: Se bruksanvisning mikroflödessystem system (se tabell material) för information om plattor och instrumentet setup.

  1. Innan du kör mikroflödessystem experimentet, varma 20 mL RPMI-1640 medietyp eller Spider media i en inkubator vid 37 ° C. Ytterligare media volym kan krävas baserat på beräkningar i steg 2,8. Före uppvärmningen media förhindrar bildandet av luftbubblor under experimentet.
  2. Slå på mikrofluidik systemet som innehåller registeransvarige, de två nätaggregat, Mikroskop, kamera och dator ansluten till systemet. Öppna det program som styr systemet (se tabell av material) från programmenyn på datorn. Två fönster kommer att visas när programmet öppnas.
  3. Leta upp numret streckkod av plattan används och mata in numret när du uppmanas av programvaran. Använda två separata datorskärmar för att se programmet på de två fönstren. Ett fönster (kontrollmodul) innehåller kontroller för plattan och det andra fönstret (Montage, imaging modul) innehåller kontroller för Mikroskop och kamera.
  4. Slå på värmaren power-knappen på handkontrollen och ange mikrofluidik systemtemperatur till 37 ° C med hjälp av pilknapparna på tempereringsaggregatet.
  5. Ren den anslutningsram (figur 1) med sterilt vatten enligt följande. Spraya på botten av plattan med sterilt vatten och använda objektiv papper att ta bort smuts/damm. Vila gränssnitt plattan ansiktet ner på ren lins papper lufttorka. Ren toppen av gränssnittet plattan använder 70% isopropanol och objektiv papper.
    Obs: Anslutningsram ansluter mikroflödessystem systemet till plattan som ska innehålla de celler och media. Se till att ingen vätska finns kvar och att alla fibrer och smuts avlägsnas. Felaktig rengöring kan resultera i låg kvalitetsbilder och videor.
  6. Ta bort kondens från rören på gränssnittet plattan.
    1. Låt plattan ansiktet ner vilar på objektiv papperet. I kontrollen modulfönstret Klicka på det manuella läget för plattan. I avsnittet skjuvning-menyn, klicka på den flytande markeringen för kolumnerna 1-4 och 5-8 och välj 37 ° C från droppa-ned menyn. I avsnittet skjuvning, ställa in flödet läge till konstant och anger den max skjuvning 2 dyn/cm2 (0,2 Pa) (figur 2A).
    2. Klicka på inlopp brunnarna att starta flödet av steril luft genom gränssnittet plattan rören ta bort kondens. Efter 5 min, klicka på stoppknappen i avsnittet väl plattan (figur 2A). Iaktta rören i gränssnittet plattan att bekräfta att alla kondens har tagits. Om droppar är fortfarande synliga, upprepa flödet av steril luft, som nämnts ovan, för en annan 5 min.
      Obs: Inlopp rören är kopplade till 0,22 micron filter för att säkerställa att endast steril luft introduceras till mikrofluidik systemet. Flödet kan övervakas av händelseloggen på skärmen i fönstret control module.
  7. Placera 48-väl 0-20 dyne mikroflödessystem plattan på Mikroskop scenen.

3. candida albicans Biofilm bildning i systemet simuleras

  1. För att spela in biofilm bildning, lägga till 600 µL före värmde RPMI-1640 medium eller spindel medium inlopp brunnarna (se figur 1 för plattan layout). Har två replikat för varje experimentella villkor.
    1. För att testa biofilm bildning av C. albicans vildtyp och muterade stammar, lägga till 600 µL Spider medium inlopp brunnar i experiment plattan.
    2. För att testa biofilm bildning i närvaro av svampdödande läkemedel (eller andra föreningar av intresse), lägga till 600 µL RPMI-1640 medium som två brunnar (negativ kontroll) och 600 µL av RPMI-1640 medium kompletteras med amfotericin B (16 µg/mL) (eller drogen av primat på önskad koncentration) till två andra inlopp brunnar.
      Obs: För en 12 h biofilm bildning experiment, tillsätt 600 µL av pre värmde media till inlopp brunnarna. Lägga till ytterligare media (50 µL/h) inlopp brunnarna för längre experiment. Överskrid inte den maximala volymen av brunnen (1 500 µL).
  2. Långsamt sänka den rengjorda anslutningsram ovanpå 48 väl mikroflödessystem plattan. Skjut anslutningsram något till vänster tills rören på interphase plattan placeras ovanpå inlopp och utlopp brunnarna.
Sväng spaken på gränssnittet plattan från vänster till höger för att låsa gränssnitt plattan i position, säkerställa experimentet är lufttät.
Obs: Sterila luftflödet från rören i gränssnittet plattan kommer att driva vätskan i inlopp eller utlopp brunnarna (beroende på riktningen valt med hjälp av programvaran på datorn), så att vätskan rinner genom visningskanal mellan inlopp och utlopp brunnar i anpassade riktning och hastighet som dikteras av användaren.
  • I avsnittet skjuvning, ställa in flödet läge till konstant och anger den max skjuvning 1 dyn/cm2 (0,1 Pa). Klicka på inlopp brunnar med media att börja flödet av media från inlopp till utlopp brunnar (figur 2A) till prime kanalen. Efter 5 min Klicka på stoppknappen i avsnittet väl plattan. Ta bort anslutningsram och observera mikroflödessystem plattan brunnarna. Efter grundning kanaler, bör bara en liten droppe av media vara synlig i outlet brunnarna. Om rullgardinsmenyn inte är synlig, prime kanalerna i steg om 2 min tills liten droppe av media i outlet brunnarna är synliga.
    Obs: Priming krävs att avlägsna luft från visning kanaler och se till att kanaler är fyllda med önskad media.
  • Avlägsna gränssnitt plattan från mikroflödessystem plattan och ställ den åt sidan på en steril yta. Tillsätt 50 µL av cellkultur (som beskrivs i steg 1,5) till varje uttag väl.
    1. För att testa C. albicans tillsätt vildtyp och muterade stammar, 50 μl av vildtyp (SC5314) cellkultur i Spider media till två utlopp brunnar, bcr1 Δ/Δ i Spider media till två utlopp brunnar och efg1 Δ/Δ i Spider media till två utlopp brunnar. Placera gränssnittet plattan tillbaka på mikroflödessystem plattan och lås locket (se figur 1 för plattan layout).
      Obs: Enligt beskrivningen i steg 3.1.1, alla motsvarande ingående brunnar innehåller Spider media.
    2. Tillsätt 50 µL av vildtyp (SC5314) cellkultur för testning C. albicans biofilm bildning i närvaro av amfotericin B eller annan förening av intresse, i RPMI-1640 medium fyra utlopp brunnar. Placera gränssnittet plattan tillbaka på mikroflödessystem plattan och lås locket (se figur 1 för plattan layout).
      Obs: Enligt beskrivningen i steg 3.1.2, alla motsvarande ingående brunnar innehåller RPMI-1640 media med och utan amfotericin B eller annan förening av intresse.
  • I avsnittet skjuvning, ställa in flödet läge till konstant och anger den max skjuvning 2 dyn/cm2 (0,2 Pa). Klicka på outlet brunnar med celler börjar flödet av media från inlopp till utlopp brunnar (figur 2A) för att börja sådd av C. albicans. Efter 3 s-Klicka på stoppknappen i kontrollen väl plattan avsnitt för att förhindra celler från att ange indata brunnarna.
    Obs: Cellerna flyttas från outlet brunnarna mot inloppet brunnarna; Det är viktigt att flödet stoppas innan cellerna når inlopp brunnarna. Detta säkerställer att inloppet brunnarna inte få smittade med cellkultur och att medierna i inlopp brunnarna förblir sterila under hela försöket. De tvärkraft och tidsåtgången är baserad på viskositeten av media som används och storleken på cellerna.
  • Att cellerna att stå stilla med inget flöde (0 dyn/cm2) i 10-20 min i visningskanal för inledande cell följsamhet. Under 10-20 min följsamhet steg, ställa in datorn för att fånga de scenen kamerapositioner och påbörja pre spola bilder (beskrivs i detalj i avsnitt 4-6).

    • 4. ställa in scenen positionerna för mikroflödessystem experimentet

    Obs: Scenen positioner och plattan kalibrering bör ställas in precis innan experimentet. Denna inställning gör att datorn kan lagra positionerna för varje visningskanal för att fånga bilder under experimentet. Mikroflödessystem plattan bör inte störas efter inställning scenen positioner. Om plattan flyttas, måste scenen positioner återställas före början av experimentet.

    1. Använd programmet visualisering analys (se tabell material) att göra scenen positioner; varje visningskanal är en fas (1-24) (figur 1 d) och varje steg har tre sub steg (1-3) för bild fånga på olika positioner längs efter visningskanal (figur 1 c). Imaging modulfönstret öppna modulen 'Multi-dimensional förvärv' (MDA) genom att klicka på fliken MDA (figur 2B).
    2. I MDA modul klickar du på fliken 'Stadium' i menyn till vänster (figur 2B). I avsnittet scenen Ladda listan master scenen för 48 väl 0 - 20 dyne mikroflödessystem plattan. Varje visningskanal bör ha tre etapper för bild förvärv.
    3. Öppna 'Prov Reload justering' (SRA) och 'Flytta scenen till absolut Position' (karta) moduler genom att klicka på fliken SRA och fliken karta (figur 2B). Tryck på knappen 'Live' att se en förhandsvisning med hårkorset i SRA-modulen.
    4. Med hjälp av joysticken, placera den väl plattan så att spetsen på pilen (fysiskt placerad på plattan) intill tittar på kanal 4 justerar med hårkorset på programvaran. I menyn karta, tryck på knappen 'Ange ursprung' (figur 2B). Den aktuella positionen ska nu läsa 0 i X, Y och Z.
    5. I SRA-modulen, klicka på avsnittet 'Initial referenspunkter' i menyn till vänster (figur 2B). Klicka på 'Ladda inställningar' och läsa in filen för 48 väl 0 - 20 dyne mikroflödessystem plattan.
    6. På scenen del av modulen MDA, dubbelklicka på ' scenen Position 22,2'. Denna position indikerar mitten (sub steg 2) för visning kanalnummer 22. Detta tar mikroskopet visar scenen och kamerans fokus i nära närhet till piltangenterna markör av tittar på kanal 22. Med hjälp av joysticken, placera den väl plattan så att spetsen på pilen (fysiskt placerad på plattan) intill tittar på kanal 22 justerar med hårkorset.
    7. Kopiera Y-koordinaten i modulen MDA till Y-position i punkt 2 på fliken 'Uppdatering referenspunkter' i modulen SRA (figur 2B).
    8. I fliken 'Uppdatera scenen befattningar' Vägverket, klicka på 'Verkställ på MDA scenen lista' (figur 2B).
      Obs: Detta kommer att uppdatera alla som tittar på scenen positioner i plattan (1-24) kalibreras till specifika mikroflödessystem plattan position på Mikroskop scenen.
    Plattan är nu klar för bild förvärv och kommer att använda kalibrerade scenen positioner för att flytta samtidigt fånga bilder från tre positioner i alla 24 Visa kanaler.

    5. Konfigurera förvärv för bild fånga under mikroflödessystem experimentet

    1. I imaging modulfönstret MDA med modulen och klicka på fliken 'Spara' i menyn till vänster (figur 2B). Välj filnamnet för experimentet och mapp att lagra förvärvade bilderna på datorn.
    2. I den MDA-modulen, klicka på fliken 'Timelapse' i menyn till vänster och ange det att förvärva 145 totala bilder; Ange timelapse mellan bilder till 5 min. Detta kommer att resultera i 1 bild varje 5 min för en 12 h biofilm utveckling experiment.
      Obs: Tidsintervallet mellan bilder och det totala antalet bilder kan justeras baserat på experimentella krav. Om imaging längre än 12 h, lägga till ytterligare media till inlopp brunnarna vid steg 3.1 för att säkerställa att brunnarna inte kör torrt. För längre experiment lägga till ytterligare media, som behövs (50 µL/h) till inlopp brunnarna.
    3. I MDA-modulen, klicka på fliken 'våglängder' i menyn till vänster (figur 2B) och ange antalet våglängd för experimentet som 1. Ställ in våglängden till fånga vid 50% Brightfield och 50% kamera med en exponeringstid på 12-20 ms, 0.6 vinst och 20 MHz digitizer.
      Obs: Ytterligare våglängder kan användas, och den skall inklusive våglängder för fluorescens imaging (till exempel, vi har framgångsrikt visualiseras mCherry och god Jordbrukarsed taggade C. albicans stammar använder denna mikroflödessystem enhet). Parametrarna för förvärv kan också ändras baserat på experimentella krav. Till exempel ställa in en andra våglängd och välja 'Autofokus vid varje tidpunkt' och en tredje våglängd och välja 'Exponeringsautomatiken vid varje tidpunkt' rekommenderas för nybörjare att maximera bilden förvärvsmöjligheter som är i fokus.
    4. I modulen MDA Välj scenen lista flikarna i menyn till vänster. Steg 1,1 – visas 24,3. En efter en, klicka på varje steg och använda fina fokus inställningar manuellt fokusera på cellerna i visningskanal för varje etapp. När synfältet är i fokus, klicka på den svarta pilen bredvid listan scenen att uppdatera och spara inställningarna för varje etapp. Datorn kommer att använda dessa manuellt definierade positionsinställningar och fokal inställningar för att förvärva bilder vid varje tidpunkt. Ta bort alla oanvända steg från listan med pilen 'Ta bort'.
      Obs: Modulen MDA och programmet avser Visa kanaler som arrangerar omväxlande, och samma terminologi används av programvaran.

    6. kör mikroflödessystem experimentet

    1. I modulfönstret imaging med MDA-modulen, Välj 'Acquire' att börja fånga pre spola bilder av vidhäftat celler för alla sub stadier (figur 2B).
      Obs: Imaging modulfönstret och kamerakontrollerna visas nu bilder som är fångas och modulen karta, SRA och MDA syns inte längre. Bilderna tagna kommer också att visa en timer på sidan, ange antalet bild fångas och tidsfördröjning innan nästa bild fånga cykel startar. Vänta en omgång av bilder innan du fortsätter med nästa steg.
      Obs: Använd inte knapparna 'Paus' eller 'Mark Event' på fönsterskärmen tänkbar modul. Från denna punkt på under experimentet, håll musen bara på fönstret kontroll modul på andra skärm (figur 2A). Detta är viktigt att undvika att störa imaging modulfönstret.
    2. I kontroll modul fönster vistelse på det manuella läget för plattan. I avsnittet skjuvning, ställa in flödet läge till konstant och anger den max skjuvning 1 dyn/cm2 (0,1 Pa). Klicka på outlet brunnar O1, O7, O13 och O19 att börja flödet av media från inlopp till utlopp brunnar (figur 2A) för att avlägsna icke-följs celler. Efter 5 min Klicka på stoppknappen i avsnittet väl plattan. Möjliggöra en andra omgång av bilder att förvärvas. Bilder kan visualiseras och tidsfördröjning kan övervakas på den andra skärmen i imaging modulfönstret.
    3. I avsnittet skjuvning, justera max skjuvning flödet till 0,5 dyn/cm2 (0,5 Pa) genom att klicka på siffran i max skeva kolumn och använda tangentbordet för att ange 0,5. Tryck på Enter på tangentbordet och bekräfta ändringen i flödet i händelseloggen i fönstret control module (figur 2A). Låt experimentet ostört i mörkret för 12 h.
      Obs: Exponering för ljus och rörelse/vibrationer kan kraftigt minska kvaliteten på bilder som förvärvats under hela försöket. I slutet av mikrofabricerade experiment, imaging modulfönstret kommer inte att visa några bilder och återgår till visar SRA, karta och MDA modulerna. Avbildningsprogrammet modul kan användas för att visa bilderna, montera videor och kvantifiera biofilmer som bildas (beskrivs nedan).

    7. analysera resultaten

    1. I imaging modulfönstret, Välj fliken 'Verktyg' och klicka 'Granskning Multi-dimensional Data' (RMD) från droppa ned menyn. I modulen RMD Klicka på 'Välj Base fil'. Detta öppnar fönstret 'Flerdimensionell datauppsättning Utilities'.
    2. Klicka på knappen 'Välj katalog' och välj mappen som användes för att spara experimentet i steg 5.1. I listan 'Datauppsättningar' Markera experiment fil logga (nd förlängning). När loggen läses in, klicka på knappen 'Visa'.
    3. Välj våglängd genom att klicka på alternativen i menyn till vänster 'Våglängder' och den scen ståndpunkten att visa från en droppa-ned menyn. Välj bilden att ladda från nummer på toppen av modulen genom att högerklicka på bildnumret. När valt, klicka på knappen 'load bild(er)' att ladda bilderna. Du kan visa en bild eller alla bilder på en gång.
    4. Välj alla bilder för att göra en tid förfaller video. De valda bilderna kommer att öppna en video i ett nytt fönster. Klicka på fliken 'Arkiv' i imaging modulfönstret och välj 'Spara som' från droppa-ned menyn. Spara den färdiga videon som standardfilen (TIFF/Metaserie).
    5. Öppna och ladda sparade videofilen med ImageJ programvara. I ImageJ, klicka på fliken 'Arkiv' och klicka på 'Spara som'. Välj '.avi' från droppa-ned menyn och konvertera filen till en AVI-fil som använder JPEG konvertering inställd på 10 ramar/s.
      Obs: Hastigheten på videon kan justeras genom att ändra de bildrutor/s.
    6. För att kvantifiera biofilmer, upprepa steg 7.2, 7.3 och 7.4.
    Välj den sista bilden (nummer 144) och klicka på 'load bilder'-knappen för att läsa in bilden. Bilden öppnas i ett nytt fönster. Klicka på knappen 'tröskel bild' och välj 'Inclusive' tröskel. Flytta markören tills biofilm cellerna färgas röd och regioner med inga celler inte är färgade.
  • Klicka på knappen 'Öppna logg' logga mätningar (knappen visas 'Öppna logg' bara inledningsvis, när en logg är aktiv knappen kommer att döpas om till ' F9: loggdata '). Välj 'Dynamic Data Exchange' 'Öppen Data Log' i fönstret och klicka på 'ok'.
  • Imaging modulfönstret, Välj fliken 'Verktyg' och klicka på 'Visa Region statistik'. Detta öppnar ett nytt fönster som visar mätningar från bilden. Välj 'Hela bild' i 'Åtgärd' alternativen och klicka på ' F9: loggdata.' En excel-fil med alla mätningar kommer att visas. Leta upp värden för 'Området' och ' Thresholded' och dividera den senare med den tidigare att få ett siffervärde för den areal som upptas av biofilmen.
    Obs: 'Området' för varje bild som erhållits under experimentet är identiska och därmed 'Thresholded Area' mätning kan användas för att utvärdera skillnader i biofilm bildning mellan vildtyps-stammar och muterade stammar eller utvärdera effektiviteten i de testade drogen på biofilm bildning.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Vi utförde mikroflödessystem biofilm analysen beskrivs här med ett vildtyps- C. albicans stam två media villkor (RPMI-1640 och Spider media), vildtyps-stammen i närvaro av det kända svampdödande läkemedlet amfotericin B (16 µg/mL) i RPMI, och två muterade stammar tidigare rapporterats ha defekter i biofilm bildning (bcr1Δ/Δ och efg1 Δ/Δ) i Spider media.

    Video 1 visar utvecklingen av en vildtyp biofilm i RPMI-1640 medium och effekterna av svampdödande läkemedel, amfotericin B, på biofilm bildning. Vildtyp villkor, flera celler följer starkt kanalen, cellerna bildar hyfer allteftersom tiden går, och en tjock biofilm kan observeras med infoga hyfer och jäst celler. Mot slutet av mikrofabricerade experiment fyller den vildtyp biofilmen helt visningskanal. Förekomsten av amfotericin B, har dock en uttalad effekt på att minska biofilmen. Specifikt, efterlevnaden av celler är minskat, och, till skillnad från obehandlade villkor, i närvaro av amfotericin B, flera celler kan ses flyter bort med skeva flödet av media. Som tiden går, om cellerna inte bildar hyfer och en biofilm bildas inte. Dessa skillnader är också visas i figur 3, som skildrar 4 tidpunkter från analysen vid 0 h, 2 h, 6 h och 12 h.

    Video 2 visar utvecklingen av en vildtyp biofilm och två tidigare rapporterat biofilm-defekta mutanter (bcr1 Δ/Δ och efg1 Δ/Δ) i Spider media. Båda bcr1 Δ/Δ och efg1 Δ/Δ stammar visar allvarligt nedsatt biofilm bildning jämfört med syngena vildtyps-stammen. För efg1 Δ/Δ stam konstaterade vi att vidhäftat cellerna bildar inte hyfer och den resulterande biofilmen är allvarligt skadad. För bcr1 Δ/Δ stam, observerade vi att inte bara är bcr1 Δ/Δ stammen defekt i biofilm bildning, men det också visar en tydlig följsamhet defekt, där celler kan ses drifting i riktning mot skjuvning flödet eftersom de inte följer den visningskanal. Dessa skillnader är också visas i figur 4, som skildrar 4 tidpunkter från analysen vid 0 h, 2 h, 6 h och 12 h.

    Figure 1
    Figur 1: mikroflödessystem instrument som används i detta experiment. Panel A visar mikroflödessystem mätdonet, panel B visar gränssnittet plattan, panel C visar en Schematisk beskrivning av en enda visningskanal (scenen) och tre sub steg tagits med kameran under experimentet, och panelen D visar en schematisk översikt av 48-väl mikroflödessystem plattan används med en schematisk utlopp och inlopp brunnar och synglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 2
    Figur 2: Välj skärmdumpar av imaging modulesoftware och mikroflödessystem plattan styrsystem. Panel A visar den modul, som innehåller kontroller för mikroflödessystem plattan, och panel B visar imaging modulfönstret 'Flytta scenen till absolut Position' (karta) modul, modulen 'Multi-dimensional förvärv' (MDA) och modulen 'Prov Reload justering' (SRA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3: exponering för amfotericin B resulterar i biofilm bildas defekter. Tid beroende av visualisering av biofilm bildning i RPMI-1640 media (kolumn 1) och RPMI-1640 media kompletteras med 16 µg/mL amfotericin B (kolumn 2) under dynamiska flöde (0,5 dyn/cm2) vid 37 ° C i 12 h efter följsamhet i systemet simuleras. Representativa 0 h (efter följsamhet och inledande tvätt), 2 h, 6 h och 12 h bilder (uppifrån och ned) visas för syngena vildtyps-stammen SN250 (kolumn 1 och 2). Skala barer är 20 µm i varje panel. Motsvarande tid förflutit videor av biofilm bildning finns i Video 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4: Borttagande av BCR1 eller EFG1 resulterar i biofilm bildas defekter. Tid beroende av visualisering av biofilm bildning i Spider media (kolumnerna 1-3) under dynamiska flöde (0,5 dyn/cm2) vid 37 ° C för 12 h efter följsamhet i systemet simuleras. Representativa 0 h (efter följsamhet och inledande tvätt), 2 h, 6 h och 12 h bilder (uppifrån och ned) visas för syngena vildtyps-stammen SN250 (kolumn 1), bcr1Δ/Δ stam (kolumn 2) och efg1 Δ/Δ stam (kolumn 3). Skala barer är 20 µm i varje panel. Motsvarande tid förflutit videor av biofilm bildning finns i Video 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Video 1: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

    Video 2: Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Anpassningsbara mikroflödessystem biofilm analysen beskrivs här möjliggör visualisering av biofilm bildning i realtid på en enda cellnivå när de utsätts för en fast ränta laminärt flöde och konstant temperatur. Det ger ett kraftfullt medel för att studera utvecklingen av biofilmer i vildtyp och muterade stammar och effekterna av antimikrobiellt medel behandlingar på biofilmer under förhållanden som efterliknar fysiologiska förhållanden observerade i kliniska inställningar. Till skillnad från de flesta i vitro biofilm analyser, tillåter denna metod för undersökning av en utvecklande biofilm i realtid eftersom det utgör.

    Denna metod kan användas på ett sätt som hög genomströmning, där upp till 24 prover kan köras samtidigt för att bedöma biofilm bildning. Metoden kan också användas för att utföra genetiska skärmar av muterade bibliotek att identifiera gener som krävs för normal biofilm utveckling och kan användas för att bedöma effektivitet mot biofilmer av antimikrobiella föreningar av intresse förening bibliotek skärmar. Vi räknar med att framtida tillämpningar av mikrofabricerade enheten kommer att omfatta sådana skärmar. Vi noterar dock att vissa behandling drogtester kommer att begränsas av tjockleken av den biofilm som bildas med mikroflödessystem enheten som biofilmer som odlas för > 16 h tenderar att täppa visningskanal. Således, drogtester experiment kommer att behöva utföras för < 16 h.

    Sammantaget denna enhet är mycket anpassningsbar och mångsidig och kan justeras för att bedöma olika mikrobiella arter över riken, flöden, temperaturer, inkubationstider och media. Den beskrivna metoden ger information om ett antal olika aspekter av biofilm bildning, inklusive inledande cell följsamhet, biofilm mognad och cell spridning. Även om vi rapportera endast resultat för enskilda arter biofilm bildning här, kan detta protokoll också anpassas till studera dubbla och blandade djurarter biofilm bildning.

    Två steg är avgörande för att lyckas utföra detta protokoll. Först, luftbubblor i systemet måste undvikas genom förvärmning media vid experimentell temperatur. Ett vanligt felsteg är utspädning av celler i media som inte var förvärmd. Celler ska spädas i samma media som används för inlopp brunnarna. Andra, flödet av celler från uttaget till inlopp brunnar måste övervakas noga; om cellerna flow för långt, inlopp media kommer blivit förorenat och experimentet kommer inte ge tolkningsbara resultat. Däremot, om cellerna inte får flytta ända till efter visningskanal, då inga celler blir synliga i kanalen under experimentet, vilket leder till tomma bilder. Ytterligare viktiga punkter att komma ihåg är att den volym och rörelse mellan brunnar i ultrakalla plattan länkas samman för varje kolumn, och det är viktigt att så mycket media konsekvent som möjligt (med liknande viskositet, cell densitet, och sammansättning) och likaså stora celler (om möjligt), eftersom olika media och annan cell storlekar kommer att ha olika flöden i kolumnen. Under experimentet övervakas återflödet av cellerna med Mikroskop; dock kan bara två kanaler ses på en gång (med en 10 X-objektiv). Således, det rekommenderas att utföra en mock experiment för att mäta den tid som krävs att flöda från uttaget till inlopp brunnarna med cellerna och media planeras att användas i det faktiska experimentet.

    I allmänhet rekommenderar vi användning av denna mikroflödessystem biofilm analys som ett in vitro- test för att utnyttjas före i vivo djurförsök. Analysen, men är fortfarande ett in vitro- test, och resultaten kommer att behöva verifieras i relevanta djurmodeller. I våra erfarenheter, resultaten av denna mikroflödessystem biofilm analys har haft det bästa prediktiva värdet för i vivo biofilm analyser jämfört med andra in vitro- analyser har vi bedömt14.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Clarissa J. Nobile är en grundare av BioSynesis, Inc., ett företag som utvecklar hämmare och diagnostik av C. albicans biofilmer.

    Acknowledgments

    Vi tackar alla medlemmar för Nobile lab för bra diskussioner om biofilm analyser. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) grant R21 AI125801 (till C.J.N.). Tunnelbanestation stöddes av en doktorand stipendium från University of California Institute för Mexiko och Förenta staterna (UC-MEXUS) och Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
    48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
    Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
    ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
    Yeast Extract Criterion C7341
    Bacto Peptone BD Biosciences 211677
    Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
    Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
    RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
    MOPS Sigma-Aldrich M3183
    Nutrient Broth Criterion C6471
    Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
    Agar Criterion C5001
    Amphotericin B Corning 30-003-CF
    Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
    Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
    Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
    Lens Paper VWR 52846-001
    Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
    Shaking Incubator Eppendorf M12820004

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
    2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
    3. Fox, E. P., Nobile, C. J. Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. , Nova Science Publishers. 1-24 (2013).
    4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
    5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
    6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
    7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
    8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
    9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
    10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
    11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
    12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
    13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
    14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
    15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
    16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
    17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
    18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
    19. Baker, K. At the bench: A laboratory navigator. 27, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

    Tags

    Infektionssjukdomar fråga 130 Biofilm Candida albicans visualisering ultrakalla enhet in vitro- biofilm analyser biofilm metoder biofilm protokoll biofilm skärmar laminärt flöde
    Visualisering av Biofilm bildning i <em>Candida albicans</em> med en automatiserad mikroflödessystem enhet
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, … More

    Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter