Summary
Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.
Abstract
Oplosbare N- ethylmaleimide gevoelige fusion eiwit (NSF) bijlage eiwit receptor (SNARE) eiwitten zijn sleutel voor het membraan mensenhandel, zoals zij membraan fusion in eukaryote cellen katalyseren. De SNARE-eiwitten-familie bestaat uit ongeveer 36 verschillende leden. Specifieke intracellulair transportroutes worden gekatalyseerd door bepaalde groepen van 3 of 4 SNARE-eiwitten die aldus bij te aan het specifieke karakter dragen en de trouw van membraan mensenhandel. Echter, het bestuderen van de precieze functie van SNARE-eiwitten is technisch uitdagend, omdat SNAREs zijn zeer overvloedig en functioneel overbodig, met de meeste SNAREs hebben meerdere en overlappende functies. In dit protocol, wordt een nieuwe methode voor de visualisatie van SNARE complexvorming in levende cellen beschreven. Deze methode is gebaseerd op het uiten van SNARE-eiwitten C-terminaal gesmolten aan fluorescerende eiwitten en hun interactie meten door Förster resonance energy transfer (FRET) en fluorescentie levensduur microscopie (FLIM) imaging. Door het aanbrengen van de fluorescentie levensduur histogrammen met een multicomponent verval model, staat FRET-FLIM (semi-) kwantitatieve schatting van de Fractie van de SNARE complexvorming bij verschillende blaasjes. Dit protocol heeft met succes zijn toegepast om te visualiseren SNARE complexvorming op het plasma-membraan en endosomal compartimenten in zoogdiercellen lijnen en primaire immune cellen, en kan gemakkelijk worden uitgebreid om te studeren SNARE functies op andere organellen in dier, plant en schimmel cellen.
Introduction
Membraan mensenhandel is een centraal kenmerk van eukaryote cellen, waar membraan blaasjes bud af van een donor organel en verplaats naar en zekering met een doel organel1,2. Met uitzondering van de mitochondriën, zijn al deze membraan fusion stappen gekatalyseerd door leden van de SNARE-eiwit familie1,2. De SNARE-eiwitten-familie bestaat uit ongeveer 36 leden in zoogdiercellen en ongeveer 20 leden in gist2. SNARE-eiwitten bevatten één of twee ~ 52 residuen durende, native ongestructureerde regio's, genaamd SNARE-motieven. SNARE-eiwitten zijn het vaak vastgebonden aan membranen door een C-terminal transmembraan helix1,2. Strikken kunnen worden ingedeeld op basis van de centrale residuen die zij aan de complexe SNARE in arginine (R) en glutamine (Q) SNAREs1,2 bijdragen. Membraan fusie wordt gedreven door de interactie van 3 of 4 cognaat SNAREs die samen bijdragen 4 SNARE-motieven en zijn verdeeld over zowel de donor en de acceptor membraan1,2. Een SNARE-complex bestaat uit een R-SNARE motief en drie Q-SNARE motieven (zogenaamde Qc, QA- en Qb). Complexvorming begint bij de N-termini van de SNARE-motieven, vormen een zogenaamde trans-SNARE-complex, en de opbrengst naar de C-termini, vormen een strakke α-Helix spiraalsnoer-spoel bundel genoemd een cis-SNARE-complex. De complexvorming van zelfs een enkele SNARE complexe sleept de donor en acceptor membranen samen en overwint de energie barrière voor membraan fusion3.
Verschillende SNARE complexen toe te wijzen aan specifieke transportroutes binnen cellen is vaak technisch uitdagend. Hoewel SNAREs duidelijk aan de specificiteit van membraan mensenhandel bijdragen, ze zijn promiscue, functioneel overbodig, en hun functies overlappen1,2. Vanwege dit, perturbation experimenten gericht op strikken, zoals door gene knock-out, RNA-interferentie, de invoering van het blokkeren van antilichamen of met oplosbare SNARE fragmenten fungeert als dominante negatieven, vaak niet leiden tot duidelijke fenotypen als andere Strikken compenseren2,4. Bovendien, het is moeilijk om te onderscheiden van specifieke membraan fusion stappen van upstream mensenhandel gebeurtenissen, omdat SNAREs kunnen worden betrokken in meerdere vervoer routes2. Studies van de lokalisatie van strikken door microscopie benaderingen, met behulp van immunolabeling of genetische fusion aan fluorescerende verslaggever eiwitten, last hebben van de problemen die: (i) SNAREs vinden om meerdere organellen, zoals zij vaak meerdere mensenhandel stappen, en (ii bemiddelen) hun lokalisaties bedoel niet automatisch dat ze bezig zijn functioneel SNARE complexvorming. Tot slot, SNARE complexen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van immunoprecipitation experimenten met behulp van een van de SNAREs als aas en de andere SNAREs als doelen, maar dit kan geen toewijzing van deze complexen aan specifieke organellen of aanvoerroutes. Er is op dit moment dus niet alternatieve techniek te visualiseren SNARE complexen met organellar resolutie. Immunofluorescentie is niet in staat om te bewijzen SNARE interacties maar prima overweg met alleen de aan- of afwezigheid van co lokalisatie, terwijl immunoprecipitation alleen overweg met SNARE-interacties in de hele cel bevolking maar niet toewijzen de organellen waar deze interacties plaatsvinden.
Om deze beperking ondervangen ontstond een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van SNARE complexen in levende cellen met organellar resolutie waardoor onlangs door Verboogen et al. 5 deze methode is gebaseerd op de expressie van paren van strikken met spectraal verschoven fluorescente proteïnen gesmolten C-terminaal aan hun transmembraan helices. Na voltooiing van de membraan kernversmelting en de vorming van een GOS-complexe SNARE, deze fluorophores op de C-termini voor de transmembrane helices zijn onmiddellijk naast elkaar. De fluorophores zijn dan ruim binnen de Förster-afstand (meestal < 5 nm), resulterende in FRET uit de fluorophore van de donor groen-verschoven naar de rood-verschoven acceptor fluorophore5,6. FRET resultaten in het blussen van de donor fluorophore en een verhoogde uitstoot van de acceptor-fluorophore die kan worden gemeten vanaf de verhoudingen van de donor en acceptor emissie (ratiometric FRET). Echter ratiometric FRET tussen twee verschillende moleculen is uitdagend, vanwege fluorescentie cross-talk en verschillende niveaus van de donor en acceptor SNAREs op verschillende organellen en tussen cellen7,8. FRET kan ook worden gemeten vanaf de levensduur van de fluorescentie, die de tijd tussen de excitatie en de emissie van een foton is. Als de donor fluorophore kan het vrijgeven van zijn energie door FRET, dit concurrerende resultaat van het proces in een schijnbare verkorting van de levensduur van de fluorescentie. Dit kan worden gemeten door FLIM7,8. Levensduur FRET is veel krachtiger dan ratiometric FRET voor het meten van interacties tussen twee verschillende moleculen, zoals de levensduur van de fluorescentie een intrinsieke eigenschap van een fluorophore is en ongevoelig voor de concentratie is. Bovendien is de FRET door onderlinge aanpassing kwantitatieve, omdat de efficiëntie van de FRET omgekeerd evenredig met de zesde kracht van de afstand tussen de donor en acceptor fluorophores (in wezen een stap-functie is). Dus, door het aanbrengen van de fluorescentie levensduur histogrammen opgenomen door FLIM met een dubbel-component verval model, FRET-FLIM voorziet in de (semi-) kwantitatieve schatting van de Fractie van de SNARE moleculen die zich bezighouden met SNARE complexvorming5.
Onlangs, deze methode FRET-FLIM werd gebruikt door Verboogen et al. om te visualiseren SNARE complexvorming in primaire dendritische cellen van het immuunsysteem-5. Het bleek dat na het ontmoeten van een pathogene stimulans, dendritische cellen omleiden hun membraan handel gepaard met een verhoogde complexvormers verwijderd van de R-SNARE membraan van het vesikel-geassocieerde proteïne (VAMP) 3 met de Qa-SNARE-syntaxin 4 specifiek gericht is op de Plasmamembraan. Deze verhoogde SNARE complexvorming is waarschijnlijk nodig om te voldoen aan de verhoogde secretoire capaciteit voor de afscheiding van inflammatoire cytokinen zoals Interleukine-65. Dit protocol beschrijft de experimentele stappen die nodig zijn voor de verwerving van FRET-FLIM gegevens voor de visualisatie en (semi-) kwantitatieve meting van SNARE complexen.Hoe passen de histogrammen levensduur geheel-cel fluorescentie met mono - en bi-exponentiële functies van verval, wat resulteert in de schijnbare fluorescentie levensduur als een kwantitatieve schatting te SNARE interacties wordt uitgelegd. In dit protocol, de gebruikte HeLa cellenvariëteit wordt gebruikt als een voorbeeld, maar de methode kan gemakkelijk worden uitgebreid bestuderen SNARE complexen in andere eukaryotische cellen.
Protocol
1. bereiding van de monsters van de Microscoop
- Expressie van Qa-SNARE syntaxin 4 gesmolten tot mCitrine (syntaxin 4-mCitrine; donor fluorophore) en de R-SNARE-VAMP3 gesmolten tot mCherry (VAMP3-mCherry)
Opmerking: Andere SNAREs met fluorescerende eiwitten gesmolten aan hun C-terminal transmembraan helices kunnen ook worden gebruikt. In plaats van mCitrine-mCherry, kunnen andere donor-acceptor paren van spectraal gescheiden fluorophores ook worden gebruikt (bijvoorbeeldGVB-YFP)- HeLa cellen groeien en 900.000 HeLa cellen verdelen over drie 35 mm-diameter glas onder gerechten geschikt voor microscopie.
Opmerking: In principe dit protocol kan worden aangepast voor andere soorten eukaryotische cellen en microscopie gerechten.- Handhaven van HeLa celculturen in T75 flacons met 10 mL hoge glucose Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) is, aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% antibioticum-antimycotic (met amfotericine B, penicilline en streptomycine) bij 37 ° C en 5% CO 2 in een cel cultuur incubator.
- Aanvullen van het medium twee keer per week en de cellen 1:10 keer per week of wanneer de cellen bereiken 85-90% confluency naar new T75 kolven (500.000 cellen/kolf, gemiddeld) splitsen.
- Verwijder de DMEM en wassen van de HeLa monolayers tweemaal met 8 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 3 minuten.
- Verwijder de PBS en voeg toe 2 mL PBS met 2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA).
- Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 in cel cultuur incubator en vervolgens licht doorroeren de kolf te scheiden van HeLa cellen vanaf de onderkant van de kolf.
- De cellen spoelen met 10 mL van medium, spoel de suspensie voor een tube van 15 mL en een hoeveelheid van 10 µL voor het tellen van verwijderen.
- Verdun het afgepipetteerde deel 1:1 met 0,4% trypan blauwe vlek en cellen met een Bürker hemocytometer9tellen.
Opmerking: Tellen twee 4 x 4 pleinen en meerdere het celaantal 10.000 voor het aantal cellen/mL. - Nadat de cel tellen, neem 900.000 cellen uit de tube van 15 mL, verdeel ze over de 3 glazen bodem gerechten (zie stap 1.1.1), en voor te bereiden voor Transfectie.
- Transfect van de cellen door electroporation10 (Zie Tabel van materialen) met syntaxin 4-mCitrine construct (donor alleen, Sample #1), syntaxin 4-mCitrine samen met VAMP3-mCherry (monster #2), en syntaxin 3 gesmolten aan zowel mCitrine als mCherry () Voorbeeld #3).
Opmerking: Andere cel transfectie methoden kunnen ook gebruikte11. De constructie van de tandem in monster #3 is een positieve controle voor het inschatten van de kortste levensduur verwachten (dat wil zeggen, maximale verwachten FRET).
- HeLa cellen groeien en 900.000 HeLa cellen verdelen over drie 35 mm-diameter glas onder gerechten geschikt voor microscopie.
- Cultuur die de cellen overnachting in hoge glucose DMEM geleverd met 10% FCS en 1% antibioticum-antimycotic bij 37 ° C met 5% CO2 in een cel cultuur incubator.
- Gecombineerd DMEM en wassen van de cellen een keer met levende cel imaging medium (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300; Zie Tabel of Materials) voor 2 min en plaatst u vervolgens de cellen in verse imaging medium.
2. opname van de gegevens van de FLIM
- Plaats monster #2 onder een tijdsdomein FLIM confocal microscoop met een gepulseerde excitatie-bron voor de donor fluorophore (d.w.z., mCitrine) en de tijd-resolved data-acquisitie. Houd de cellen bij 37 ° C met een verwarmde podium.
Opmerking: De confocal microscoop gebruikt in dit protocol is uitgerust met een 63 X 1.20 nb water onderdompeling doelstelling, een gepulseerde witte lichte laser (80 MHz pulserende, < 100 ps impulstijd), een foton multiplier buis (PMT), en een Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC ) systeem (Zie Tabel van materialen voor specifieke setup wordt gebruikt). Andere FLIM microscopen kunnen ook worden gebruikt (bijvoorbeeldéén-foton lawine diodes (SPAD) in plaats van PMTs, één-golflengte gepulste lasers in plaats van een wit-licht gepulste lasers). - Selecteer een cel met zichtbare uitdrukking van de mCitrine en de mCherry-geëtiketteerden SNARE-eiwitten en een confocal beeld van 256 × 256 pixels met gelijktijdige excitatie van beide fluorophores vóór elke meting van de FLIM opnemen. De stap van een pixel van ongeveer 2-fold kleiner dan de diffractie Spatiële resolutie van de Microscoop beperkte (~ 200 nm) moet worden gebruikt. Voor mCitrine, prikkelen op 516 nm en verzamelen emissie van 521-565 nm; voor mCherry, prikkelen bij 610 nm en verzamelen emissie van 613-668 nm.
Opmerking: Geen standpunt het imaging vliegtuig te dicht bij de bodem van de schotel (binnen ~ 2 µm afstand), aangezien dit in een reflectie piek in het histogram fluorescentie levensduur resulteren zal. Gelijktijdige excitatie van de donor en acceptor fluorophores heeft de voorkeur, aangezien dit toestaat te overwinnen van het potentiële probleem van monster beweging. Sequentiële excitatie kan echter ook worden gebruikt. - Record een FLIM afbeelding door te klikken op Uitvoeren FLIM met de afbeelding van de FLIM wordt opgenomen met de dezelfde afmetingen en ruimtelijke resolutie als de confocal afbeelding bij stap 2.2 opgenomen. Het opnemen van de afbeelding tenminste 50.000 fotonen voor geheel-cel FLIM analyse, of ten minste 400 fotonen/pixel. Alleen wekken de mCitrine donor fluorophore en niet de fluorophore van de mCherry acceptor, en dus prikkelen op 516 nm en verzamelen emissie van 521-565 nm.
- Herhaal stap 2.1-2.3 voor meerdere cellen en voor de andere Sample #1 (alleen donor) en monster #3 (de constructie van de tandem mCitrine-mCherry).
- Het opnemen van een instrument reactie functie (IRF). De monochromator van de emissie-detector af te stemmen op de excitatie golflengte (bijvoorbeeld, record emissie van 510-550 nm) en noteer een FLIM beeld met de terug verstrooiing van een schone glazen cover slip door te klikken op de knop Uitvoeren FLIM. Gebruik dezelfde excitatie golflengte (516 nm) en vermogen zoals gebruikt voor het opnemen van de celgegevens stappen 2.1-2.4 laser.
Opmerking: Als meerdere pieken zichtbaar in het IRF zijn of als de emissie-monochromators kan niet worden afgestemd, de IRF kan ook worden gemeten met een oplossing van fluorescente kleurstof met ultrasnelle levensduur, bijvoorbeeld door fluorescentie blussen van een organische kleurstof in een verzadigde waterige oplossing van kaliumjodide. Bovendien, het is niet strikt noodzakelijk is om op te nemen een IRF, omdat de helling van het verval van de fluorescentie histogrammen kan ook worden gemonteerd zonder deconvolutie van het IRF. Echter een IRF laat toe om te corrigeren voor de kenmerken van de timing van het foton detector gebruikt en daarmee maakt de buien van de levensduur histogrammen nauwkeuriger.
3.Omzetting van de Photon opnamen naar FLIM beelden
- Download en installeer de PT32ICS conversie software5.
Opmerking: De gegevens van de levensduur kan ook door andere software, met inbegrip van software van verschillende leveranciers van Microscoop worden geanalyseerd. - Configureren van de software van de PT32ICS.
- De grootte ingesteld op 256 × 256 pixels Afbeeldingsgrootte via instellingen | Grootte.
- Het kanaal ingesteld op 2 via instellingen | Grootte.
Opmerking: Het kanaal van de mCitrine-emissie is uitsluitend afhankelijk van de configuratie van de Microscoop. Een verkeerde kanaal zal resulteren in een FLIM beeld met geen fotonen (d.w.z., zwarte afbeelding) en dientengevolge een lege 'LifetimeTable.txt'-bestand. Het juiste kanaal kan worden geïdentificeerd door trial-and-error. - Uitgang ingesteld op ImageJ (xyz) (of TRI2 (xyt)) voor het genereren van de FLIM beelden (stap 3.4).
- Druk op converteren en laden van een of meer foton sporen (de .pt3-bestanden). Schakel meerdere foton sporen, houd de Ctrl -toets ingedrukt.
Opmerking: De nieuwe 64-bits .ptu indeling kan ook worden geconverteerd. - Zorgen dat de PT32ICS-software de volgende bestanden in dezelfde map genereert als waar de pt3-bestanden worden opgeslagen: één foton stack per .pt3 foton trace in beeld cytometry standaard indeling (.ics), één bitmapbestand per .pt3 foton trace (.bmp), een tekstbestand per conversie (_Report.txt) dat informatie bevat betreffende de statistieken van het foton (dat wil zeggen, het totale aantal fotonen in elke .pt3 foton trace, de resolutie van de tijd van de detector), en een tweede tekstbestand per conversie (_LifetimeTable.txt) met de totale fluorescentie levensduur histogrammen in tabgescheiden indeling voor elke .pt3 foton tracering.
Opmerking: Het .ics dossier kan worden gebruikt voor enkele pixel passend om te genereren van beelden van de FLIM, bijvoorbeeld met TRI2 software12,13 of de SLANKE curve passend bibliotheek in FIJI ImageJ14,15. Dit bestand kan ook worden gebruikt voor Fasor analyse16, bijvoorbeeld met de tijd Gated Fasor plugin voor FIJI van Spechron. De bitmapbestand bevat geen informatie van de levensduur. De tweede tekstbestand wordt gebruikt voor de analyse van de FLIM geheel-cel in stap 4.
4. montage van fluorescentie levensduur histogrammen geheel-cel FLIM p.a.
Opmerking: Deze stap (deconvoluted montage van het IRF) software staat deconvoluted montage vereist. Montage van de hellingen van de fluorescentie histogrammen zonder deconvolutie van het IRF kan worden gedaan met andere software ook.
- Opent de data analyse softwareprogramma geschikt voor montage met deconvolutie (Tabel van materialen) en importeert u het tekstbestand met het histogram voor elke foton-tracering (_LifetimeTable.txt) via bestand | Import | Eén ASCII.
- Reorganiseren van de tabel zodanig dat het IRF in de tweede kolom van de tabel is (met behulp van kopiëren en Plakken). Plaats de IRF in de tweede kolom B naast de tijd-waarden in de eerste kolom A.
- Bepalen van de kwaliteit van de opgenomen foton sporen door alle kolommen selecteren door op Ctrl + A te drukken en te selecteren Plot | Multi panel | 9 paneel. Niet analyseren foton sporen met een hoge reflectie piek (figuur 4F).
- Selecteer alle kolommen met de kwaliteit-gecontroleerde levensduur histogrammen die zal worden gemonteerd evenals de IRF in kolom B met behulp van de Ctrl toets en laden van de niet-lineaire montage via analyse | Montage | Niet-lineaire Curve Fit | Open dialoog.
- De deconvoluted fit functie (beschikbaar in de aanvullende bestand 1) laden door deze functie toe te voegen aan de analysesoftware (via categorie | Door de gebruiker gedefinieerde | Functie | Toevoegen). Selecteer het bestand fit functie 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Deze functie past de fluorescentie levensduur histogrammen met een mono-exponentiële afname functie deconvoluted met het IRF (dat wil zeggen, de tweede kolom B in de tabel) (vergelijking 1):
(Vergelijking 1)
met t de tijd, τ de schijnbare fluorescentie levensduur, A de amplitude en y0 de offset.
Opmerking: Een andere optie is om te passen de levensduur histogrammen met een bi-exponentiële fit functie (vergelijking 2):
(Vergelijking 2)
Door de vaststelling van de levensduur van de langzame component (τ1) enige voorwaarde van de donor (stap 1.1.2: Sample #1) en dat van de snelle component (τ2) aan de tandem construct (monster #3), hierdoor schatting van het gedeelte van SNARE-eiwitten in complex (F) uit de amplitudes van detraag (1)en snel onderdelen (per2; Zie discussie; Vergelijking 3):
(Vergelijking 3)
Het bestand fit functie voor deconvoluted bi-exponentiële montage 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' is beschikbaar in de aanvullende File 2. - Selecteer uitgerust curven | X gegevenstype als hetzelfde als invoergegevens.
Opmerking: Dit zal leiden tot de juiste x-as wilt schalen de ingerichte bochten. - Passen de curven door te drukken op passen.
Opmerking: Dit converteert de pasvorm en het genereren van een 'verslag vel' in de matrix met een tabel die de levensduur van de fluorescentie, verschuivingen en amplitudes. Het zal ook het genereren van een gegevensblad met de ingerichte bochten en de verschillen van de pasvorm.
(Vergelijking 1)
(Vergelijking 2)
(Vergelijking 3)Representative Results
De grondgedachte van de test voor het meten van de SNARE interacties door FRET-FLIM is afgebeeld in Figuur 1. De C-termini voor de transmembrane helices van cognaat SNARE-eiwitten worden gesmolten tot een paar spectraal verschoven fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld, mCitrine en mCherry). De vorming van een GOS-SNARE complex van membraan fusion resultaten in deze fluorescente proteïnen steeds onmiddellijk naast elkaar en FRET. Figuur 2 toont representatieve confocal beelden van HeLa cellen uiten fluorescently-geëtiketteerden SNARE-eiwitten. Een cel uiten syntaxin 4-mCitrine (donor fluorophore) met VAMP3-mCherry (acceptor fluorophore), weergegeven evenals controlevoorwaarden van cellen alleen de syntaxin 4-mCitrine construct (donor alleen; geen FRET) en de syntaxin 3 gesmolten aan beide mCitrine en mCherry in tandem (maximale verwachten FRET). Figuur 3 toont de begeleidende fluorescentie levensduur en FLIM afbeeldingen gegenereerd door het aanbrengen van de histogrammen van de levensduur van elke pixel met mono-exponentiële afname functies (figuur 3A-B) en bi-exponentiële afname functies ( Figuur 3 c - D). figuur 4A toont het IRF van onze setup gemeten door terug verstrooiing van een Microscoop cover glas. In figuur 4B-E, vertegenwoordiger fluorescentie histogrammen van de levensduur van de hele cel FLIM analyse samen met bijbehorende pasvorm curven voor mono-exponentiële afname functies weergegeven. Figuur 4F toont een histogram fluorescerende levensduur van een experiment dat beeld te dicht aan de oppervlakte van de Microscoop cover glas, wat resulteert in een prominente reflectie piek. Figuur 4 g toont een levensduur histogram met vertegenwoordiger die passen bij de functie van een bi-exponentiële afname.
Figuur 1: schema van de beweegredenen voor het visualiseren van de SNARE complexen door FRET. (A) structurele model van de neuronale SNAREs (eiwit database 3HD717) membraan van het vesikel-geassocieerde proteïne (VAMP) 2 (blauw; R), syntaxin 1 (rood; Qa-SNARE), en SNAP25 (groen; bevat zowel een Qb - en Qc-SNARE-motief). De C-terminus van de transmembrane helix van syntaxin-1 is geconjugeerd met mCitrine (fluorophore van de donor; eiwit database 3DQ118). De C-terminus van de transmembrane helix van VAMP2 is geconjugeerd met mCherry (acceptor fluorophore; eiwit database 2H5Q19). (B) regeling van SNARE gemedieerde membraan fusion resulteert in FRET. Na membraan fusie door oprichting van een GOS-SNARE complex, de SNAREs zijn onmiddellijk naast elkaar wat resulteert in FRET. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: uitdrukking van SNARE-eiwitten gesmolten aan fluorescerende eiwitten. Eerste kolom: donor fluorophore, opgewonden op 516 nm. Tweede kolom: acceptor fluorophore, enthousiast bij 610 nm. (A) Donor alleen voorwaarde. Representatieve confocal afbeelding van een cel van de HeLa uiting van syntaxin 4-mCitrine (fluorophore van de donor; groen bij samenvoegen). Het kanaal van de acceptor (tweede kolom) bevat de fluorescentie cross-talk. (B) negatieve controle (geen FRET). Representatieve confocal afbeelding van een cel van de HeLa uiting van beide syntaxin 4-mCitrine met VAMP3-mCherry (acceptor fluorophore; magenta in samenvoegen). (C) positieve controle (maximale verwachten FRET). Representatieve confocal afbeelding van een cel van de HeLa uiting geven aan de syntaxin 3-mCitrine-mCherry-tandem construeren. Merk op dat het signaal van de fluorescentie van de mCitrine en de mCherry signalen doet niet volledig overlapping, waarschijnlijk vanwege een lagere weerstand van mCitrine tot lysosomale verslechtering ten opzichte van mCherry (zie sectie discussie). BF: helder veld. Schaal van bars, 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: FLIM beelden van SNARE complexvorming. (A) representatieve fluorescentie levensduur beelden van de cellen die zijn afgebeeld in Figuur 2. De beelden werden gegenereerd door eerste het omzetten van het sporen van de foton opgenomen door een TCSPC systeem (.pt3) aan de afbeelding cytometry standaard (.ics) met behulp van de PT32ICS software. Enkele pixel uitgerust fluorescentie levensduur beelden werden vervolgens gegenereerd met behulp van de TRI2 software12,13 met drempelmethode van 15-100% intensiteit, 7 pixel circulaire weggooien en monoexponential montage algoritme (Marquardt). De kleur geeft aan dat de gemiddelde schijnbare fluorescerende levensduur. (B) FLIM beelden waar de fluorescentie levensduur beelden (getoond in het deelvenster A) met de intensiteit van de fluorescentie van de mCitrine donor fluorophore ingewikkelde waren (Zie Figuur 2). De convolutie werd uitgevoerd met FIJI ImageJ met een op maat gemaakte macro (Zie Tabel van materialen). (C) fluorescentie levensduur en FLIM beelden van de cel van de HeLa uiting van zowel syntaxin 4-mCitrine en VAMP3-mCherry uit panelen A-B, maar nu met de montage met bi-exponentiële afname curven (met levensduur bevestigd aan de controlevoorwaarden; Zie stap 4.4 in Protocol). De pixel kleuren geven aan de geschatte breuken F van syntaxin 4 in complex met VAMP3 (vergelijking 3). (D) hetzelfde als paneel B, maar voor de bi-exponentiële passen. De convolutie werd uitgevoerd met FIJI ImageJ met een op maat gemaakte macro (Zie Tabel van materialen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: hele cel FLIM analyse. (A) de instrument reactie functie (IRF) van de installatie. De IRF werd gemeten met behulp van de verstrooiing terug op de interface van de glas-water (met behulp van een schone glazen microscopie schotel met water).(B--E) Hele cel levensduur histogrammen voor de cellen weergegeven in Figuur 2 en Figuur 3. Alle fotonen aanwezig in de beelden werden gebundeld. De krommen werden deconvoluted met het IRF en uitgerust met mono-exponentiële afname functies (vergelijking 1). Voor deze cellen, fluorescentie levens werden verkregen van 2,82 ns (cellen uiten enige syntaxin 4-mCitrine, de donor alleen; deelvenster B), 2.09 ns (cellen samen uiting geven aan de syntaxin 4-mCitrine met VAMP3-mCherry; deelvenster C) en 2.08 ns (cellen uiting geven aan de syntaxin 3 - mCitrine-mCherry tandem construeren; maximale verwachten FRET controle; deelvenster D). De inlays blijkt de dezelfde grafieken, maar nu met logaritmische schalen van de y-as. Paneel E toont een overlay van de bochten verval van panelen B-D. (F) voorbeeld van een fluorescerende levensduur histogram opgenomen te dicht aan de oppervlakte van de Microscoop cover slip. Dit resulteert in een grote reflectie piek (afgebeeld door het geel gearceerde gebied). (G) hetzelfde als deelvenster C, maar nu montage met een bi-exponentiële afname curve met een levensduur bevestigd aan de controlevoorwaarden (zie stap 4.4 in protocol). De amplitudes van de snel(1)en langzaam (A2) onderdelen waren 14.42 en 0,01, respectievelijk, resulterend in een geschatte Fractie van strikken in complexe F van 0,99 (vergelijking 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1. Functie bestand FLIM_convoluted_IRF Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende bestand 2. Functie bestand FLIM_convoluted_IRF_biexp Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Dit protocol demonstreert het gebruik van de FRET-FLIM voor visualisatie van SNARE interacties tussen syntaxin 4 en VAMP3 in levende HeLa cellen. Syntaxin 4 is een Qa-SNARE-eiwit overwegend lokaliseren op het plasma-membraan waar het bemiddelt exocytose1,,2,,20,21. VAMP3 is een R-SNARE, die voornamelijk wordt beschreven om te zoeken op recycling endosomal compartimenten en bemiddelt mensenhandel aan andere Endosomen alsook over het plasmamembraan1,2,20. De FRET-FLIM bepaling kan echter gemakkelijk aangepast voor het bestuderen van andere SNARE-eiwitten. De enige voorwaarde is dat deze SNAREs een C-terminal transmembraan helix bevatten, dat is het geval voor de meeste SNARE-eiwitten door ver1,2. Bovendien is het protocol hier beschreven kan worden aangepast voor visualisatie van SNARE complexen in elk type van eukaryotische cel, met inbegrip van planten en gist. In dit protocol gebruikten we de verkorting van de levensduur van de fluorescentie van de donor fluorophore als een maatregel van de FRET. Als een complementaire aanpak, de levensduur van de acceptor-fluorophore kan worden bestudeerd, omdat de gesensibiliseerde emissie veroorzaakt een duidelijke stijging fase waarin ondubbelzinnig bewijs dat energie-overdracht van resonantie plaatsvindt.
Op dit moment kan de FRET-FLIM techniek niet kunnen visualiseren SNARE complexen in lysosomale compartimenten. Voor 3-mCitrine-mCherry tandem constructie voor de syntaxin kan de mCherry-fluorescentie vaak worden gevonden meer geaccumuleerde in een gebied van juxtanuclear, die waarschijnlijk overeenkomt met lysosomale compartimenten, overwegende dat het mCitrine signaal meer overvloedig in de mobiele periferie5. Een soortgelijke juxtanuclear accumulatie van mCherry ten opzichte van mCitrine werd waargenomen, toen de dezelfde SNARE-eiwitten aan deze TL eiwitten gesmolten mede uitgedrukt5 waren. Lysosomen worden gekenmerkt door een extreem lage pH (< 4) en een hoge activiteit van Proteolytische enzymen. De accumulatie van de juxtanuclear van mCherry wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een hogere weerstand van de mCherry fluorophore tot lysosomale verslechtering ten opzichte van de mCitrine fluorophore. Het is niet te wijten aan de pH-blussen van mCitrine, zoals juxtanuclear accumulatie van mCherry treedt ook op bij fixatie van de cellen5. Dus, de FRET-FLIM techniek onderschat de hoeveelheid FRET in de juxtanuclear (lysosomale) regio's en dit zou vereisen andere tl verslaggever eiwitten die de barre omstandigheden binnen de lumen van lysosomen overleven.
FRET-FLIM in beginsel kunt verkrijgen van een (semi-) kwantitatieve schatting van de Fractie van de SNAREs in complexe5. Zoals we hebben uitgelegd in dit protocol, moet de montage van de fluorescentie levensduur histogrammen met dubbele-exponentiële afname functies (vergelijking 2), waar de amplitude van de snelle component is evenredig aan de Fractie van de SNAREs in complexe) Vergelijking 3). Dergelijke montage met een tweecomponenten-model is echter technisch uitdagende. Montage met meerdere gratis fit parameters (twee fluorescentie levens en twee amplitudes) vereist een zeer groot aantal fotonen, vooral omdat de parameters elkaar beïnvloeden zullen en kleine fouten in het leven zal van invloed zijn op de amplitudes en vice versa. Om deze problemen van de montage, de levensduur van de fluorescentie van de langzame component kunnen worden vastgesteld om de levensduur van de donor enige voorwaarde (dat wil zeggen, geen FRET; alleen mCitrine aanwezig) en die van de snelle component aan de levensduur van de tandem bouwen) maximale verwachten FRET). Echter, dit moet ook worden uitgelegd met zorg, omdat de levensduur van de fluorescentie mogelijk niet hetzelfde als in de Staten van deze controle, en vanwege meerdere redenen (zelf blussen, dipool oriëntatie, variaties in de communicatie afwijken kunnen). Meerdere SNARE complexen in de nabijheid (< 10 nm) kan leiden tot afstand-afhankelijke FRET, hetzelfde principe waarmee FRET moet worden gebruikt als een "moleculaire heerser", maar in dit geval, verduistert de kwantificering van de SNARE complexen. Bovendien, een kwantitatief in te schatten is niet altijd zinvol, omdat de gelabelde SNAREs met endogene (labelloze) strikken concurreren. Het niveau van de expressie van mCherry-label SNARE is dientengevolge een belangrijkste determinant voor het percentage FRET5. Vanwege al deze kanttekeningen, is het aanbevolen om passen de fluorescerende levensduur histogrammen met een mono-exponentiële afname functie (vergelijking 1). Dit heeft het voordeel dat het vereist niet enige een priori kennis van de levensduur en de resulterende schijnbare gemiddelde TL levensduur een solide maatregel voorziet in SNARE complexvormers5.
Verwacht wordt echter dat kwantitatieve FRET-FLIM beeldvorming door tweecomponenten montage modellen potente toekomstige toepassingen zal hebben. SNARE-encoding genen binnen het chromosoom kunnen worden gesmolten met fluorescerende verslaggever eiwitten, bijvoorbeeld door CRISPR/CAS9. Dit resulteert in de fluorescerende etikettering van endogene SNARE-eiwitten, met endogene eiwitniveaus en geen achtergrond van labelloze strikken, en daarmee zorgt voor een zinvolle kwantitatieve schatting van de Fractie van de SNARE complexen door FRET-FLIM. Terwijl de expressie niveaus van endogene SNAREs kunnen worden vrij laag en geven relatief lage fluorescerende signalen, de verwachting is dat een voldoende aantal fotonen kan worden verkregen, vooral voor de hele cel FLIM (die vereist slechts een paar 1,000s van fotonen). Bovendien, deze FRET-FLIM metingenmogen met gevoeliger lawine fotodiode detectoren die ook in hogere fluorescentie signalen en betere statistieken van het foton resulteren zal.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Hypatia fellowship van het Radboud universitair medisch centrum, een carrière ontwikkeling Award van het Human Frontier Science Program, de zwaartekracht programma 2013 van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijkonderzoek (NWO; ICI-024.002.009), een VIDI-subsidie van NWO (ALW VIDI 864.14.001), en een Starting Grant van de Europese Onderzoeksraad (EOR) onder het zevendekaderprogramma van de Europese Unie (Grant overeenkomst nummer 336479).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
| Hela cells | |||
| 35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
| Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
| Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
| Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
| Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
| PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
| data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
| Fiji ImageJ | |||
| Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
| Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
| EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
| NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |
References
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs - engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).
- Hong, W. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).
- van den Bogaart, G., Jahn, R. Counting the SNAREs needed for membrane fusion. J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).
- Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking. Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).
- Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation. eLife. 6, (2017).
- Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses. J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , (2017).
- Thermo Fisher Scientific. NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM. Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).
- Barber, P., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).
- Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane. Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).
- Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift. PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).
- Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).
- Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration. Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).
- Gómez-Jaramillo, L., et al. Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells. J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).
