Summary
Denne protokollen beskriver en ny metode som tillater for den kvantitative visualiseringen av komplekse dannelsen av SNARE proteiner, basert på han selvmord resonans energioverføring og fluorescens levetid imaging mikroskopi.
Abstract
Løselig N- ethylmaleimide følsom fusion protein (NSF) vedlegg protein reseptor (SNARE) proteiner er nøkkelen for membran menneskehandel, som de katalysere membran fusion i eukaryote celler. SNARE består protein av 36 ulike medlemmer. Bestemt intracellulære transportveier er katalysert av bestemte sett med 3 eller 4 SNARE proteiner som dermed bidrar til spesifisitet og gjengivelse av membran menneskehandel. Imidlertid er studere presis funksjon SNARE proteiner teknisk utfordrende, fordi snarer er svært rikt og funksjonelt overflødig, med de fleste snarer har flere og overlappende funksjoner. En ny metode for visualisering av SNARE komplekse formasjon i lever celler er beskrevet i denne protokollen. Denne metoden er basert på uttrykke SNARE proteiner C-terminalt smeltet fluorescerende proteiner og måle deres samspill av han selvmord resonans energi overføring (bånd) ansette fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). Ved montering fluorescens levetid histogrammer med en multicomponent forfall, tillater bånd-FLIM (semi-) kvantitative estimering av brøkdelen av SNARE komplekse dannelsen på ulike blemmer. Denne protokollen har vært anvendt for å visualisere SNARE komplekse formasjonen i plasma membranen og endosomal rom i pattedyr linjer og primære immunceller, og kan lett utbygget for å studere SNARE funksjoner på andre organeller i dyr, plante og fungal cellene.
Introduction
Membran menneskehandel er en sentral funksjon i eukaryote celler, der membran blemmer bud av fra en donor organelle flytte til og fusjonere med et mål organelle1,2. Bortsett fra mitokondriene, er alle disse membran fusion trinnene katalysert av medlemmer av SNARE protein familie1,2. SNARE består protein av 36 medlemmer i pattedyrceller og 20 i gjær2. SNARE proteiner inneholde ett eller to ~ 52 rester lang, innfødt ustrukturert områder, kalt SNARE-motiver. SNARE proteiner er ofte bundet til membraner ved C-terminalen transmembrane helix1,2. Snarer kan kategoriseres basert på sentrale rester bidrar til SNARE kompleks i arginine (R) og glutamin (Q) snarer1,2. Membran fusion er drevet av samspillet av 3 eller 4 beslektet snarer som sammen bidra 4 SNARE skipsverft og fordeles over både giver og acceptor membran1,2. En SNARE komplekset består av en R-SNARE motiv og tre Q-SNARE motiver (kalt Qa Qb og Qc). Komplekse formasjon starter på N-termini av SNARE-motiver, danner en såkalt trans-SNARE-kompleks, og fortsetter mot C-termini, danner en tett α-spiralformede coiled-coil bunt kalt cis-SNARE-kompleks. Komplekse dannelsen av selv en enkelt SNARE komplekse drar giver og acceptor membraner sammen og overvinner energien barrieren for membran fusion3.
Tilordne forskjellige SNARE komplekser til bestemte transportveier i celler er ofte teknisk utfordrende. Snarer tydelig bidra til spesifisiteten av membran handel, de er promiskuøse, funksjonelt redundant og deres funksjoner overlapper1,2. Derfor føre forstyrrelsene eksperimenter målretting snarer, som av genet knockout, RNA-interferens, innføring av blokkering antistoffer eller med løselig SNARE fragmenter som dominerende negativer, ofte ikke klar fenotyper som andre Snarer kompensere2,4. Dessuten er det vanskelig å skille bestemt membran fusion skritt fra oppstrøms menneskehandel hendelser, fordi snarer kan være involvert i flere transport ruter2. Lokalisering studier av snarer av mikroskopi tilnærminger, bruke immunolabeling eller genetisk fusion fluorescerende reporter proteiner, lider av problemer som: (i) snarer finne til flere organelles som de ofte megle flere menneskehandel trinn, og (ii) deres steder bety ikke automatisk de er funksjonelt engasjert i SNARE komplekse formasjonen. Til slutt, SNARE komplekser kan identifiseres ved hjelp immunoprecipitation eksperimenter med en av alle hans snarer som agn og de andre snarer som mål, men dette muliggjør ikke tildeling av disse kompleksene bestemt organeller eller smuglerrutene. Dermed foreløpig er det ingen alternativ teknikk å visualisere SNARE komplekser med organellar oppløsning. Immunofluorescence er ikke kunne bevise SNARE interaksjoner, men kan bare vise tilstedeværelse eller fravær av co lokalisering, mens immunoprecipitation bare kan vise SNARE interaksjoner i hele celle befolkningen, men ikke tilordne organeller der disse interaksjoner skje.
For å overvinne disse begrensning, ble en roman metode gir kvantitative visualisering av SNARE komplekser i levende celler med organellar oppløsning nylig utviklet av Verboogen et al. 5 denne metoden er basert på uttrykk for par snarer med spectrally skiftet fluorescerende proteiner smeltet C-terminal til deres transmembrane helikser. Etter ferdigstillelse av membran fusion og dannelsen av cis-FELLE komplekse, disse fluorophores på C-termini av transmembrane helikser er umiddelbart sidestilt med hverandre. Fluorophores er så godt innenfor han selvmord avstanden (vanligvis < 5 nm), resulterer i bånd fra green-forskjøvet donor fluorophore til rød-skiftet acceptor fluorophore5,6. SLITE resultater i slukke donor-fluorophore og en økte utslipp acceptor fluorophore som kan måles fra prosenter av giver og acceptor utslipp (ratiometric bånd). Men ratiometric bånd mellom to ulike molekyler er utfordrende, grunn av fluorescens cross-talk og ulike nivåer av giver og acceptor snarer på ulike organeller og blant celler7,8. BÅNDET kan også måles fra fluorescens levetid, som er tiden mellom magnetisering og utstråling av et foton. Hvis giveren fluorophore kan frigjøre sin energi av bånd, konkurrerende prosessen resultatet i en tilsynelatende forkortelse av fluorescens levetiden. Dette kan måles ved FLIM7,8. Levetid bånd er mye mer robust enn ratiometric bånd for å måle interaksjoner mellom to ulike molekyler, som fluorescens levetiden er en iboende egenskap av en fluorophore og er ufølsomme for sin konsentrasjon. Videre er bånd av tilnærming kvantitativ, fordi effektiviteten av bånd er omvendt proporsjonal med sjette makt avstanden mellom giver og acceptor fluorophores (i hovedsak en step-funksjonen). Derfor ved montering fluorescens levetid histogrammer spilt inn av FLIM med en dobbel-komponent forfall, tillater bånd-FLIM (semi-) kvantitative estimering av brøkdelen av SNARE molekyler i SNARE komplekse formasjon5.
Nylig, denne bånd-FLIM metoden ble brukt av Verboogen et al. visualisere SNARE komplekse formasjon i primære dendrittiske celler av immunsystemet5. Det ble vist at på møter en sykdomsfremkallende stimulans, dendrittiske celler omdirigere deres membran menneskehandel ledsaget av en økt complexing av R-SNARE vesicle-assosiert membran protein (VAMP) 3 med Qa-SNARE syntaxin 4 spesielt på den plasma membran. Denne økte SNARE komplekse formasjonen kreves sannsynlig å møte økt sekretoriske kapasiteten for utskillelsen av inflammatoriske cytokiner som interleukin-6-5. Denne protokollen beskriver eksperimentelle trinnene nødvendig for oppkjøpet av bånd-FLIM data visualisering og (semi-) kvantitativ måling av SNARE komplekser.Det forklares hvordan å passe hele celle fluorescens levetid histogrammer med mono - og bi-forfall eksponentialfunksjoner, noe som tydelig fluorescens levetiden som et kvantitativt overslag SNARE interaksjoner. I denne protokollen, mye brukt HeLa celle linjen brukes som et eksempel, men metoden kan lett utvides for å studere SNARE blant andre eukaryotic celler.
Protocol
1. forberedelse av mikroskopet prøvene
- Uttrykk for Qa-SNARE syntaxin 4 del mCitrine (syntaxin 4-mCitrine, giver fluorophore) og R-SNARE VAMP3 del mCherry (VAMP3-mCherry)
Merk: Andre snarer med fluorescerende proteiner smeltet til deres C-terminalen transmembrane helikser kan også brukes. I stedet for mCitrine-mCherry kan andre donor-acceptor par spectrally atskilt fluorophores også brukes (f.eksCFP-YFP).- Vokse HeLa celler og dele 900 000 HeLa celler over tre 35 mm-diameter glass bunn retter egnet for mikroskopi.
Merk: I prinsippet denne protokollen kan tilpasses for andre eukaryote celletyper og mikroskopi retter.- Opprettholde HeLa cellekulturer i MT75 flasker med 10 mL av høy glukose Dulbecco er endret Eagle's medium (DMEM), supplert med 10% fosterets kalv serum (FCS) og 1% antibiotika-antimycotic (inneholder amfotericin B, penicillin og streptomycin) på 37 ° C og 5% CO 2 i en celle kultur inkubator.
- Etterfylle mediet to ganger i uken og dele celler 1:10 en gang i uken eller når cellene nå 85-90% confluency nye MT75 flasker (500.000 celler/kolbe, i gjennomsnitt).
- Fjerne DMEM og vask HeLa monolayers to ganger med 8 mL steril fosfat-bufret saltløsning (PBS) i 3 minutter.
- Fjern PBS og legge 2 mL PBS med 2 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA).
- Inkuber celler for 5 min på 37 ° C og 5% CO2 i celle kultur inkubator og deretter lett agitere kolbe å skille HeLa celler fra bunnen av flasken.
- Skyll cellene med 10 mL av medium, overføre suspensjon slik 15 mL og fjerne en 10 µL aliquot for opptelling.
- Fortynn aliquot 1:1 med 0,4% trypan blå flekken og telle celler med en Bürker hemocytometer9.
Merk: Telle to 4 x 4 ruter og flere celle nummer 10 000 for antall celler/mL. - Etter at cellen teller, ta 900 000 celler fra 15 mL røret, dele dem over 3 glass bunn retter (se trinn 1.1.1), og forberede transfection.
- Transfect cellene med electroporation10 (se Tabell for materiale) med syntaxin 4-mCitrine konstruere (donor, eksempel #1), syntaxin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (eksempel #2), og syntaxin 3 smeltet til både mCitrine og mCherry ( Eksempel #3).
Merk: Andre cellen transfection metoder kan også være brukt11. Tandem Konstruer i eksempel #3 er en positiv kontroll for å estimere den korteste levetiden expectable (dvs., maksimal expectable bånd).
- Vokse HeLa celler og dele 900 000 HeLa celler over tre 35 mm-diameter glass bunn retter egnet for mikroskopi.
- Kultur cellene overnatting i høy glukose DMEM leveres med 10% FCS og 1% antibiotika-antimycotic på 37 ° C med 5% CO2 i en celle kultur inkubator.
- Sug opp DMEM og vaske cellene gang med levende celle imaging medium (140 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300, se Tabellen for materiale) i 2 minutter, og deretter legger cellene i frisk bildebehandling medium.
2. opptak av FLIM Data
- Sted eksempel #2 under en gang-domene FLIM AC confocal mikroskop med en pulserende excitation kilde for donor fluorophore (dvs., mCitrine) og tid-løst datainnsamling. Hold cellene på 37 ° C med en oppvarmet scene.
Merk: AC confocal mikroskopet brukes i denne protokollen er utstyrt med et 63 X 1,20 NA vann nedsenking mål, en pulserende hvitt lys laser (80 MHz pulserende, < 100 hk puls varighet), et foton multiplikator rør (betaling) og et Time-Correlated singel Foton teller (TCSPC ) systemet (se Tabellen for materiale for bestemte installasjonen brukes). Andre FLIM mikroskop kan også være brukt (f.eksenkelt-fotonet skred dioder (SPAD) i stedet for PMTs, enkelt-bølgelengde pulserende lasere i stedet for et hvitt lys pulserende lasere). - Merk en celle med synlige uttrykk for mCitrine og mCherry-merket SNARE proteiner og registrere et AC confocal bilde av 256 × 256 piksler med samtidige magnetisering av begge fluorophores før hver FLIM måling. En piksel trinn om 2-fold mindre enn Diffraksjon begrenset romlig oppløsning på mikroskopet (~ 200 nm) skal brukes. For mCitrine, opphisse 516 nm og samle utslipp fra 521-565 nm; for mCherry, opphisse på 610 nm og samle utslipp fra 613-668 nm.
Merk: Gjør ikke posisjon tenkelig flyet for nær bunnen av parabolen (innenfor ~ 2 µm avstand), da dette vil resultere i en refleksjon topp i fluorescens levetid histogrammet. Samtidige magnetisering av giver og acceptor fluorophores er foretrukket, som kan løse potensielle problemet prøven bevegelse. Sammenhengende excitation kan imidlertid brukes også. - Post en FLIM bildet ved å klikke Kjør FLIM med FLIM bildet blir registrert med samme mål og romlig oppløsning som AC confocal bildet lagret på trinn 2.2. Registrere bildet minst 50.000 fotoner for hele-celle FLIM analyse eller minst 400 fotoner/bildepunkt. Bare opphisse mCitrine donor fluorophore og ikke mCherry acceptor fluorophore, og dermed opphisse på 516 nm og samle utslipp fra 521-565 nm.
- Gjenta trinnene 2.1-2.3 for flere celler og andre eksempel #1 (bare donor) og prøve #3 (mCitrine-mCherry tandem Konstruer).
- Spille en instrument svar funksjon (IRF). Still monokromator av utslipp detektor eksitasjon bølgelengde (f.eks, posten utslipp fra 510-550 nm) og deretter registrere en FLIM bildet med den tilbake spredning fra en ren glass cover slip ved å klikke Kjør FLIM. Bruk samme excitation bølgelengde (516 nm) og laser makt som brukes for registrering av celledataene skritt 2.1-2,4.
Merk: Hvis flere topper er synlige i IRF eller utslipp monochromators ikke kan være innstilt, IRF kan også måles med en løsning på fluorescerende farge med ultrafast levetid, for eksempel ved fluorescens slukke en organisk fargestoff i en mettet vandig løsning av kalium iodide. Dessuten, det er ikke strengt nødvendig å registrere en IRF, fordi forfallet stigningstallet til fluorescens histogrammer kan også være utstyrt uten deconvolution av IRF. Men en IRF kan korrigere timing kjennetegner Foton detektoren brukes og gjør dermed anfall av levetid histogrammer mer nøyaktig.
3.Konvertering av Foton opptakene til FLIM bilder
- Dataoverføre og installere PT32ICS konvertering programvare5.
Merk: Levetid dataene kan også analyseres av annen programvare, inklusive programvare fra flere mikroskop leverandører. - Konfigurere programmet PT32ICS.
- Angi størrelsen til 256 × 256 piksler bildestørrelse via Innstillinger | Størrelse.
- Konfigurer kanal 2 via Innstillinger | Størrelse.
Merk: Kanalen mCitrine utslipp er utelukkende avhengig av konfigurasjonen av mikroskopet. En feil kanal vil resultere i en FLIM bilde med ingen fotoner (dvs.svart bilde) og som et resultat en tom "LifetimeTable.txt"-filen. Riktig kanal kan identifiseres ved prøving og feiling. - Angi utgang til ImageJ (xyz) (eller TRI2 (xyt)) for å generere FLIM bilder (trinn 3.4).
- Trykk konvertere og laste inn én eller flere Foton spor (.pt3-filer). Hvis du vil velge flere Foton spor, Hold Ctrl -tasten nede.
Merk: Nyere 64 bit .ptu formatet kan også konverteres. - Sikre at PT32ICS programvaren genererer følgende filer i samme mappe som der pt3 filene lagres: en Foton bunke per .pt3 Foton spor i bildet cytometri standardformat (.ics), en punktgrafikkfil per .pt3 Foton spor (BMP), en tekstfil per konvertering (_Report.txt) som inneholder informasjon om Foton statistikken (dvs., totalt antall fotoner i hver .pt3 Foton spor, tid oppløsningen av detektor) og en andre tekst arkiv per konvertering (_LifetimeTable.txt) som inneholder totalsummen fluorescens levetid histogrammer i tabulatordelt format for hver .pt3 Foton spor.
Merk: ICS-fil kan brukes til enkelt piksel passer for å generere FLIM bilder, for eksempel med TRI2 programvare12,13 eller SLIM kurven passende biblioteket i FIJI ImageJ14,15. Denne filen kan også brukes Phasor analyse16, for eksempel med tid Gated Phasor plugg for Internett fra Spechron. Punktgrafikkfilen inneholder ingen levetid informasjon. Andre tekstfilen brukes for hele celle FLIM analyse i trinn 4.
4. montering av fluorescens levetid histogrammer for hele celle FLIM analyse
Merk: Dette trinnet (deconvoluted montering av IRF) krever programvare som kan deconvoluted montering. Montering av fluorescens histogrammer uten deconvolution av IRF kan gjøres med annen programvare.
- Åpne data analyseprogrammet kan passer med deconvolution (Tabell for materiale) og importere tekstfilen som inneholder histogrammet for hvert Foton spor (_LifetimeTable.txt) via fil | Importer | Enkel ASCII.
- Omorganisere tabellen slik at IRF i den andre kolonnen i tabellen (med Kopier og Lim inn). Plass IRF i andre kolonne B ved time-verdier i første kolonne A.
- Bestemme kvaliteten på de innspilte Foton sporene ved å velge alle kolonner ved å trykke Ctrl + A og velge Plot | Flere panelet | 9 panelet. Ikke analysere Foton spor med en høy refleksjon topp (figur 4F).
- Velg alle kolonner som inneholder kvalitetssikrede levetid histogrammer som skal monteres og IRF i kolonne B bruker Ctrl nøkkel og laste ulineær montering via analyse | Passende | Lineær kurve Fit | Åpne dialogboksen.
- Last deconvoluted passer funksjonen (tilgjengelig i supplerende fil 1) ved å legge denne funksjonen til analyseprogramvare (via Kategori | Brukerdefinerte | Funksjonen | Legge til). Velg Tilpass funksjonen filen 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Denne funksjonen passer fluorescens levetid histogrammer med mono-eksponensiell decay funksjon deconvoluted med IRF (dvs., den andre kolonnen B i tabellen) (Formel 1):
(Formel 1)
med t tiden τ tilsynelatende fluorescens levetid, A amplituden og y0 forskyvningen.
Merk: Et annet alternativ er å passe levetid histogrammer med bi-eksponentiell fit funksjon (ligning 2):
(Formel 2)
Ved å feste levetiden til langsom komponenten (τ1) til donor bare tilstanden (trinn 1.1.2: eksempel #1) og at av rask komponenten (τ2) til tandem Konstruer (eksempel #3), dette gjør estimering av brøkdelen av SNARE proteiner i komplekse (F) fra amplituder langsom (A1) og rask komponenter (en2, se diskusjon; Formel 3):
(Formel 3)
Filen fit funksjon for deconvoluted bi-eksponentiell montering 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' er tilgjengelig i supplerende fil 2. - Velg utstyrt kurver | X datatypen som samme som inndata.
Merk: Dette vil resultere i riktig x-akseskaleringen av montert kurver. - Passe kurver ved å trykke passer.
Merk: Dette konverterer passer og generere en rapport ark i matrisen med en tabell som inneholder den fluorescens levetid, forskyvninger og amplituder. Det vil også generere et dataark med montert kurvene og resterende på plass.
(Formel 1)
(Formel 2)
(Formel 3)Representative Results
Begrunnelsen av analysen for å måle SNARE interaksjoner av bånd-FLIM er vist i figur 1. C-termini av transmembrane helikser beslektet SNARE proteiner er smeltet til et par spectrally skiftet fluorescerende proteiner (f.eks, mCitrine og mCherry). Dannelsen av cis-FELLE komplekse på membran fusion resultater i disse fluorescerende proteiner blir umiddelbart sidestilt med hverandre og SLITE. Figur 2 viser representant AC confocal bilder av HeLa celler uttrykke fluorescently-merket SNARE proteiner. Vises en celle uttrykker syntaxin 4-mCitrine (donor fluorophore) med VAMP3-mCherry (acceptor fluorophore), samt kontroll forhold celler uttrykke bare syntaxin 4-mCitrine konstruksjon (donor bare; ingen bånd) og syntaxin 3 smeltet til begge mCitrine og mCherry parallelt (maksimal expectable bånd). Figur 3 viser den tilhørende fluorescens levetid og FLIM bilder generert av passende levetid histogrammer for hver piksel med mono-eksponensiell decay funksjoner (figur 3A-B) og bi-eksponensiell decay funksjoner ( Figur 3 c - D). figur 4A viser IRF av våre oppsett målt ved tilbake spredning av et mikroskop cover glass. Kurver for mono-eksponensiell decay funksjoner vises i figur 4B-E, representant fluorescens levetid histogrammer for hele cellen FLIM analyse med tilhørende passform. Figur 4F viser et fluorescerende levetid histogram for et eksperiment fotografert for nær til overflaten av mikroskopet dekket glasset, som resulterer i en fremtredende refleksjon topp. Figur 4G viser en levetid histogram med representant med bi-eksponensiell decay funksjon.
Figur 1: ordningen med begrunnelsen for å visualisere SNARE komplekser av bånd. (A) strukturelle modellen av neuronal snarer (protein databasen 3HD717) vesicle-assosiert membran protein (VAMP) 2 (blått. R), syntaxin 1 (rød; Qa-SNARE), og SNAP25 (grønn, inneholder både en Qb - og Qc-SNARE motiv). C-terminus av transmembrane spiralen syntaxin-1 er konjugert til mCitrine (donor fluorophore, protein databasen 3DQ118). C-terminus av transmembrane spiralen av VAMP2 er konjugert til mCherry (acceptor fluorophore, protein databasen 2H5Q19). (B) ordningen av SNARE mediert membran fusion resulterer i bånd. Etter membran fusjon av dannelse av cis-SNARE komplekse, alle hans snarer er umiddelbart sidestilt med hverandre som resulterer i bånd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: uttrykk for SNARE proteiner smeltet fluorescerende proteiner. Første kolonne: donor fluorophore, spent på 516 nm. Andre kolonne: acceptor fluorophore, spent på 610 nm. (A) Donor bare tilstand. Representant AC confocal bilde av en HeLa celle uttrykke syntaxin 4-mCitrine (donor fluorophore, grønn i utskriftsfletting). Acceptor kanalen (andre kolonnen) viser fluorescens kryss-snakk. (B) negativ kontroll (ingen bånd). Representant AC confocal bilde av en HeLa celle uttrykker begge syntaxin 4-mCitrine med VAMP3-mCherry (acceptor fluorophore, magenta i utskriftsfletting). (C) Positive kontroll (maksimal expectable bånd). Representativt AC confocal bilde av en HeLa celle uttrykke syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem konstruere. Merk at fluorescens signalet av mCitrine og mCherry signaler er ikke fullstendig overlapping, sannsynligvis på grunn av en lavere motstand av mCitrine til lysosomale fornedrelse sammenlignet med mCherry (se drøftingen). BF: lysende felt. Skalere barer, 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: FLIM bilder SNARE komplekse formasjonen. (A) representant fluorescens levetid bilder av cellene vist i figur 2. Bildene ble generert ved først å konvertere Foton spor spilt av et TCSPC system (.pt3) til det bildet cytometri standard (.ics) ved hjelp av PT32ICS programvare. Enkelt piksel utstyrt fluorescens levetid bildene ble deretter generert TRI2 programvare12,13 med terskelverdi fra 15-100% intensitet, 7 pixel sirkulær binning og monoexponential passende algoritmen (Marquardt). Farge angir gjennomsnittlig tilsynelatende fluorescerende levetiden. (B) FLIM bilder der fluorescens levetid bildene (vist i panel A) var convoluted med fluorescens intensiteten av mCitrine donor fluorophore (vist i figur 2). Convolution ble utført med FIJI ImageJ bruker en skreddersydd makro (se Tabell for materiale). (C) fluorescens levetid og FLIM bilder av HeLa cellen uttrykke både syntaxin 4-mCitrine og VAMP3-mCherry fra panelene A-B, men nå med passer med bi-eksponensiell decay kurver (med levetid fast kontroll vilkårene, kan du se trinn 4.4 i Protocol). Pixel fargene angir anslått fraksjoner F på syntaxin 4 i kompleks med VAMP3 (formel 3). (D) som B-panelet, men for bi-eksponenten passer. Convolution ble utført med FIJI ImageJ bruker en skreddersydd makro (se Tabell for materiale). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: hele cellen FLIM analyse. (A) instrument responsen funksjon (IRF) av oppsettet. IRF ble målt ved hjelp av tilbake-spredning på glass-vann-grensesnittet (med et rent glass mikroskopi rett som inneholder vann).(B--E) Hele celle levetid histogrammer for cellene som vist i figur 2 og Figur 3. Alle fotoner stede i bildene ble samlet. Kurvene var deconvoluted med IRF og utstyrt med mono-eksponensiell decay funksjoner (Formel 1). For disse cellene, fluorescens levetid ble innhentet av 2.82 ns (celler uttrykke bare syntaxin 4-mCitrine; donor bare panelet B), 2.09 ns (celler som uttrykker co syntaxin 4-mCitrine med VAMP3-mCherry, C-panelet), og 2.08 ns (celler uttrykke syntaxin 3 - mCitrine-mCherry tandem konstruere; maksimal expectable bånd kontroll; panel D). Inlays viser samme grafene, men nå med logaritmisk skalering av y-aksen. Panelet E viser et overlegg av forfall kurver av B-D. (F) eksempel på et fluorescerende levetid histogram registrert for nær til overflaten av mikroskopet cover slip. Dette resulterer i en stor refleksjon topp (avbildet av den gule skyggelagt). (G) samme som panelet C, men nå passer med en bi-eksponensiell decay kurve med levetid fast kontroll vilkårene (se trinn 4.4 i protokollen). Amplituder rask (A1) og treg (A2) komponenter var 14.42 og 0,01, henholdsvis som resulterer i en estimert brøkdel av snarer i komplekse F av 0,99 (formel 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende fil 1. Funksjonen fil FLIM_convoluted_IRF Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende filen 2. Funksjonen fil FLIM_convoluted_IRF_biexp Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Denne protokollen demonstrerer bruken av bånd-FLIM for visualisering av SNARE interaksjoner mellom syntaxin 4 og VAMP3 i live HeLa celler. Syntaxin 4 er et Qa-SNARE protein hovedsakelig finne i plasma membranen der det formidler exocytosis1,2,20,21. VAMP3 er en R-SNARE som er hovedsakelig beskrevet Finn gjenvinning endosomal rom og formidler handel til andre endosomes også som plasma membranen1,2,20. BÅND-FLIM analysen kan imidlertid være lett tilpasses for å studere andre SNARE proteiner. Den eneste betingelsen er at disse snarer inneholde en C-terminalen transmembrane helix, som er tilfelle for de fleste SNARE proteiner av langt1,2. I tillegg kan protokollen beskrevet her tilpasses for visualisering av SNARE blant alle eukaryote celle type, inkludert planter og gjær. I denne protokollen brukte vi forkortelsen av fluorescens levetid donor fluorophore som et mål på bånd. Som en komplementær tilnærming, levetid acceptor fluorophore kan undersøkes, fordi sensitized utslipp forårsaker en distinkt stige fase som gir entydige bevis at resonans energioverføring skjer.
Foreløpig kan bånd-FLIM teknikken kanskje ikke visualisere SNARE blant lysosomale avdelinger. Syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem Konstruer finnes mCherry fluorescens ofte mer samlet i en juxtanuclear området, som trolig tilsvarer lysosomale avdelinger, mens mCitrine signalet er mer rikelig i mobilnettet periferien5. En lignende juxtanuclear opphopning av mCherry sammenlignet med mCitrine ble observert, når samme SNARE proteiner smeltet disse fluorescerende proteiner var co uttrykt5. Lysosomer er preget av en ekstremt lav pH (< 4) og en høy aktivitet av proteolytiske enzymer. Juxtanuclear akkumulering av mCherry er sannsynlig forårsaket av en høyere motstand av det mCherry fluorophore til lysosomale fornedrelse sammenlignet med mCitrine fluorophore. Det er ikke på grunn av pH-slukker av mCitrine, som juxtanuclear opphopning av mCherry oppstår også på fiksering av celler5. Dermed bånd-FLIM teknikken undervurderer hvor mye bånd i juxtanuclear (lysosomale) områder og dette vil kreve andre fluorescerende reporter proteiner som de harde forholdene i lumen lysosomer.
BÅND-FLIM i prinsippet kan få en (semi-) kvantitativt overslag av brøkdelen av snarer i komplekse5. Som vi forklart i denne protokollen, krever dette montering av fluorescens levetid histogrammer med dobbel-eksponensiell decay funksjoner (ligning 2), der amplituden til rask komponenten er proporsjonalt med brøkdel av snarer i komplekse ( Formel 3). Men er slike montering med en to-komponent teknisk utfordrende. Montering med flere gratis passer parametere (to fluorescens levetid og to amplituder) krever et stort antall fotoner, spesielt siden parameterne vil påvirke hverandre og små feil i livet vil påvirke amplitudes og vice omvendt. For å overvinne problemene montering, fluorescens levetid av langsom komponenten kan festes til levetiden til donor bare tilstand (dvs.ingen bånd, bare mCitrine tilstede) og for rask komponenten til levetiden til tandem konstruere) maksimal expectable bånd). Men bør dette også tolkes med forsiktighet, fordi fluorescens levetid ikke kan være det samme som disse kontroll stater, og kan avvike flere årsaker (selv slukke, dipol orientering, variasjoner i microenvironment). Flere SNARE komplekser i nærheten (< 10 nm) kan resultere i avstand-avhengige bånd, samme prinsipp som tillater bånd som en "molekylær hersker", men i dette tilfellet tilslører kvantifisering av SNARE komplekser. Videre er et kvantitativt overslag ikke alltid mening, fordi de merket snarer konkurrere med endogene (umerkede) snarer. Som en konsekvens, er uttrykket mCherry-merket SNARE et programvareprodukt for ønsket bånd5. På grunn av alle disse ting anbefales det å passe fluorescerende levetid histogrammer med mono-eksponensiell decay funksjon (Formel 1). Dette har fordelen at det krever ikke en priori kunnskap om levetid og den resulterende tilsynelatende gjennomsnittlig fluorescerende levetiden gir et solid mål for SNARE complexing5.
Likevel er det forventet at kvantitative bånd-FLIM bildebehandling av to-komponent passende modeller har potente fremtidige anvendelser. SNARE-koding gener innenfor kromosomet kan være sammensluttet med fluorescerende reporter proteiner, for eksempel ved CRISPR/CAS9. Dette resulterer i fluorescerende merkingen av endogene SNARE proteiner, med endogene protein nivå og ingen bakgrunn av umerkede snarer, og gir dermed en meningsfull kvantitative estimering av brøkdelen av SNARE komplekser av bånd-FLIM. Mens uttrykket nivåer av endogen snarer kan være lav og gi lav relativt fluorescerende signaler, er det forventet at et tilstrekkelig antall fotoner kan oppnås, spesielt for hele cellen FLIM (som krever bare noen 1,000 s av fotoner). Videre kan disse bånd-FLIM målingene utføres med mer følsomme skred photodiode detektorer som vil også resultere i høyere fluorescens signaler og bedre Foton statistikk.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Hypatia fellowship fra Radboud University Medical Center, en karriere Development Award fra menneskelige Frontier Science Program, gravitasjon program 2013 fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO; ICI-024.002.009), en VIDI grant fra NWO (ALW VIDI 864.14.001), og starte stipend fra europeiske Research Council (ERC) under EUs syvende rammeprogram (Grant avtale antallet 336479).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
| Hela cells | |||
| 35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
| Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
| Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
| Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
| Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
| PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
| data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
| Fiji ImageJ | |||
| Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
| Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
| EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
| NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |
References
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs - engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).
- Hong, W. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).
- van den Bogaart, G., Jahn, R. Counting the SNAREs needed for membrane fusion. J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).
- Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking. Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).
- Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation. eLife. 6, (2017).
- Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses. J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , (2017).
- Thermo Fisher Scientific. NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM. Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).
- Barber, P., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).
- Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane. Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).
- Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift. PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).
- Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).
- Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration. Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).
- Gómez-Jaramillo, L., et al. Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells. J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).
