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Immunology and Infection

प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा visualizing Intracellular जाल ्े

Published: December 29, 2017 doi: 10.3791/56745
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Tumor Immunology, Radboud University Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल जाल प्रोटीन के जटिल गठन के मात्रात्मक दृश्य के लिए अनुमति देता है एक नई विधि का वर्णन, Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण के आधार पर, और प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी.

Abstract

घुलनशील N-ethylmaleimide संवेदनशील संलयन प्रोटीन (NSF) अनुलग्नक प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) प्रोटीन झिल्ली की तस्करी के लिए महत्वपूर्ण हैं, के रूप में वे युकेरियोटिक कोशिकाओं के भीतर झिल्ली संलयन उत्प्रेरित । जाल प्रोटीन परिवार के बारे में ३६ विभिंन सदस्यों के होते हैं । विशिष्ट intracellular परिवहन मार्गों 3 या 4 के विशिष्ट सेट से catalyzed कर रहे हैं जाल प्रोटीन कि जिससे विशिष्टता और झिल्ली की तस्करी के प्रति निष्ठा में योगदान । हालांकि, जाल प्रोटीन की सटीक समारोह का अध्ययन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि उच्च प्रचुर मात्रा में है और कार्यात्मक रूप से बेमानी, कई और अतिव्यापी कार्यों होने जाल के साथ । इस प्रोटोकॉल में, लाइव कोशिकाओं में जाल जटिल गठन के दृश्य के लिए एक नई विधि वर्णित है । इस विधि को व्यक्त करने पर आधारित है जाल प्रोटीन सी-टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े और Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) को रोजगार से उनकी बातचीत को मापने । एक multicomponent क्षय मॉडल के साथ प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम फिटिंग करके, झल्लाहट-FLIM अलग बुलबुले में जाल जटिल गठन के अंश का (अर्द्ध) मात्रात्मक आकलन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक प्लाज्मा झिल्ली में और स्तनधारी सेल लाइनों और प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में endosomal डिब्बों पर जाल जटिल गठन कल्पना करने के लिए लागू किया गया है, और आसानी से अन्य organelles में जाल कार्यों का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है पशु, संयंत्र, और कवक कोशिकाओं ।

Introduction

झिल्ली की तस्करी युकेरियोटिक कोशिकाओं की एक केंद्रीय सुविधा है, जहां झिल्ली बुलबुले एक दाता organelle से कली और फिर चाल और एक लक्ष्य organelle के साथ फ्यूज1,2। mitochondria के लिए छोड़कर, इन सभी झिल्ली संलयन कदम जाल प्रोटीन परिवार1,2के सदस्यों द्वारा catalyzed हैं । जाल प्रोटीन परिवार के बारे में ३६ स्तनधारी कोशिकाओं में सदस्यों और खमीर में 20 सदस्यों के बारे में2होते हैं । जाल प्रोटीन एक या दो ~ ५२ अवशेषों-लंबे, natively unस्ट्रक्चर्ड क्षेत्रों, जाल रूपांकनों बुलाया होते हैं । जाल प्रोटीन अक्सर एक सी-टर्मिनल transmembrane कुंडलित से झिल्ली को सीमित कर रहे हैं1,2. जाल वे arginine (आर) में जाल परिसर में योगदान केंद्रीय अवशेषों के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है और glutamine (क्यू)1जाल,2. झिल्ली फ्यूजन 3 या 4 cognate जाल की बातचीत से प्रेरित है कि एक साथ 4 जाल रूपांकनों योगदान और दोनों दाता और स्वीकारकर्ता झिल्ली1,2पर वितरित कर रहे हैं । एक जाल जटिल एक आर जाल आकृति और तीन क्यू जाल रूपांकनों (अवधि के क्यूए, Qb, और Qc) के होते हैं । जटिल गठन जाल रूपांकनों के एन-टर्मिनी में शुरू होता है, एक तथाकथित ट्रांसजाल जटिल गठन, और सी टर्मिनी की ओर आय, एक तंग α-पेचदार कुंडलित-कुंडल बंडल एक सीआईएस-जाल-परिसर नामक बनाने । यहां तक कि एक भी एक जाल जटिल के जटिल गठन दाता और स्वीकारकर्ता झिल्ली को एक साथ खींचता है और झिल्ली संलयन3के लिए ऊर्जा बाधा पर काबू ।

कोशिकाओं के भीतर विशिष्ट परिवहन मार्गों के लिए अलग जाल परिसर निर्दिष्ट अक्सर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. हालांकि जाल स्पष्ट रूप से झिल्ली की तस्करी की विशिष्टता के लिए योगदान, वे, संकीर्ण कार्यात्मक बेमानी हैं, और उनके कार्यों1,2ओवरलैप । इस वजह से, गड़बड़ी प्रयोगों लक्ष्यीकरण, इस तरह के जीन नॉकआउट, आरएनए हस्तक्षेप, अवरुद्ध एंटीबॉडी, या घुलनशील जाल के साथ की शुरूआत के रूप में जाल, प्रमुख नकारात्मक के रूप में अभिनय टुकड़े, अक्सर अन्य के रूप में स्पष्ट phenotypes में परिणाम नहीं है जाल2क्षतिपूर्ति,4. इसके अलावा, यह ऊपर की तस्करी की घटनाओं से विशिष्ट झिल्ली संलयन कदम अंतर करने के लिए मुश्किल है, क्योंकि जाल कई परिवहन मार्गों में शामिल किया जा सकता है2. सूक्ष्म दृष्टिकोण से जाल का स्थानीयकरण अध्ययन, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के लिए immunolabeling या आनुवंशिक संलयन का उपयोग, समस्याओं से ग्रस्त है कि: (मैं) जाल कई organelles को खोजने के रूप में वे अक्सर कई तस्करी कदम मध्यस्थता, और (द्वितीय) उनके स्थानीयकरण स्वचालित रूप से वे कार्यात्मक जटिल गठन जाल में लगे हुए हैं मतलब नहीं है । अंत में, जाल परिसरों चारा के रूप में जाल में से एक का उपयोग कर immunoprecipitation प्रयोगों का उपयोग कर पहचाना जा सकता है और अन्य ठिकानों के रूप में जाल, लेकिन यह विशिष्ट organelles या तस्करी मार्गों के लिए इन परिसरों के असाइनमेंट की अनुमति नहीं है. इस प्रकार, वर्तमान में, वहाँ कोई वैकल्पिक तकनीक organellar संकल्प के साथ जाल परिसरों कल्पना करने के लिए है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस जाल बातचीत साबित करने के लिए सक्षम नहीं है, लेकिन केवल उपस्थिति या सह स्थानीयकरण की अनुपस्थिति दिखा सकते हैं, जबकि immunoprecipitation केवल पूरे सेल आबादी में जाल बातचीत लेकिन organelles आवंटित नहीं दिखा सकते हैं, जहां इन इंटरैक्शन होते हैं.

इन सीमा पर काबू पाने के लिए, एक उपंयास विधि organellar संकल्प के साथ जीना कोशिकाओं के भीतर जाल परिसरों के मात्रात्मक दृश्य के लिए अनुमति हाल ही में Verboogen एट अल द्वारा विकसित किया गया था । 5 इस विधि के साथ जाल के जोड़े की अभिव्यक्ति पर आधारित है वर्णक्रमीय फ्लोरोसेंट प्रोटीन उनके transmembrane helices के लिए सी-टर्मिनल से जुड़े हुए स्थानांतरित कर दिया । झिल्ली संलयन और एक सीआईएसजाल परिसर के गठन के पूरा होने के बाद, transmembrane helices के सी-टर्मिनी पर इन fluorophores तुरंत एक दूसरे के लिए झकझोरता हैं. fluorophores तो Förster दूरी के भीतर अच्छी तरह से कर रहे हैं (आमतौर पर & #60; 5 एनएम), हरी पाली दाता fluorophore से झल्लाहट में जिसके परिणामस्वरूप लाल पाली स्वीकारकर्ता fluorophore5,6। दाता fluorophore के शमन में परिणाम झल्लाहट और स्वीकार fluorophore कि दाता और स्वीकारकर्ता उत्सर्जन (ratiometric झल्लाहट) के अनुपात से मापा जा सकता है की एक वृद्धि उत्सर्जन । हालांकि, दो अलग अणुओं के बीच ratiometric झल्लाहट चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि प्रतिदीप्ति पार बात और दाता और स्वीकारकर्ता के विभिंन स्तरों के विभिंन organelles और कोशिकाओं के बीच में जाल7,8। झल्लाहट भी प्रतिदीप्ति जीवनकाल, जो उत्तेजना और एक फोटॉन के उत्सर्जन के बीच समय है से मापा जा सकता है । यदि दाता fluorophore झल्लाहट से अपनी ऊर्जा जारी कर सकते हैं, यह प्रतिदीप्ति जीवन भर के एक स्पष्ट छोटा में इस प्रतिस्पर्धा की प्रक्रिया परिणाम । यह FLIM7,8द्वारा मापा जा सकता है । लाइफटाइम झल्लाहट और अधिक मजबूत है दो अलग अणुओं के बीच बातचीत को मापने के लिए ratiometric झल्लाहट से, के रूप में प्रतिदीप्ति जीवनकाल एक fluorophore की एक आंतरिक संपत्ति है और अपनी एकाग्रता के प्रति असंवेदनशील है । इसके अलावा, झल्लाहट संनिकटन मात्रा से है, क्योंकि झल्लाहट की क्षमता व्युत्क्रम दाता और स्वीकारकर्ता fluorophores के बीच की दूरी की छठी शक्ति के लिए आनुपातिक है (मूलतः एक कदम समारोह) । इसलिए, फिटिंग द्वारा प्रतिदीप्ति जीवनकाल एक डबल घटक क्षय मॉडल के साथ FLIM द्वारा दर्ज की गई हिस्टोग्राम, झल्लाहट-FLIM जाल जटिल गठन में लगे अणुओं के अंश के (अर्द्ध) मात्रात्मक आकलन के लिए अनुमति देता है5.

हाल ही में इस झल्लाहट-FLIM विधि का इस्तेमाल Verboogen एट अल ने किया था. प्रतिरक्षा प्रणाली के प्राथमिक वृक्ष कोशिकाओं में जाल जटिल गठन की कल्पना5. यह दिखाया गया है कि एक रोगजनक उत्तेजना का सामना करने पर, वृक्ष कोशिकाओं को उनकी झिल्ली आर-जाल पुटिका-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन (खलनायिका) 3 के साथ एक वृद्धि हुई जटिल के साथ अवैध रूप से re-जाल syntaxin 4 में विशेष रूप से प्लाज्मा झिल्ली । इस वृद्धि हुई जाल जटिल गठन की संभावना interleukin-65जैसे भड़काऊ साइटोकिंस के स्राव के लिए वृद्धि हुई स्रावी क्षमता को पूरा करने के लिए आवश्यक है । इस प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक दृश्य के लिए झल्लाहट-FLIM डेटा के अधिग्रहण के लिए आवश्यक कदम और (अर्द्ध) जाल परिसरों की मात्रात्मक माप का वर्णन ।यह समझाया गया है कि कैसे पूरे सेल प्रतिदीप्ति जीवन भर मोनो और द्वि-घातीय क्षय कार्यों के साथ फिट करने के लिए, एक मात्रात्मक अनुमान के रूप में स्पष्ट प्रतिदीप्ति जीवनकाल में जिसके परिणामस्वरूप बातचीत जाल । इस प्रोटोकॉल में, व्यापक रूप से इस्तेमाल किया हेला सेल लाइन एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन विधि आसानी से अंय युकेरियोटिक कोशिकाओं में जाल परिसर का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

Protocol

1. माइक्रोस्कोप के नमूनों की तैयारी

  1. क्यूए की अभिव्यक्ति-जाल syntaxin 4 mCitrine से जुड़े (syntaxin 4-mCitrine; दाता fluorophore) और आर जाल VAMP3 mCherry (VAMP3-mCherry) से जुड़े
    नोट: अपने सी-टर्मिनल transmembrane helices से जुड़े फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ अन्य जाल भी इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके बजाय mCitrine-mCherry, अंय दाता-वर्णक्रमीय रूप से अलग fluorophores के स्वीकार जोड़े भी इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे,-YFP) ।
    1. हेला कोशिकाओं को विकसित और ३ ३५ मिमी व्यास गिलास नीचे सूक्ष्म के लिए उपयुक्त व्यंजन पर ९००,००० हेला कोशिकाओं को विभाजित ।
      नोट: सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल अन्य युकेरियोटिक कोशिका प्रकार और सूक्ष्म व्यंजन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
      1. उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) के 10 मिलीलीटर के साथ T75 कुप्पी में हेला सेल संस्कृतियों को बनाए रखने, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) और 1% एंटीबायोटिक-antimycotic (युक्त amphotericin बी, पेनिसिलिन, और streptomycin) ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह के साथ पूरक एक सेल संस्कृति मशीन में 2 ।
      2. एक सप्ताह में दो बार मध्यम भरपाई और कोशिकाओं 1:10 एक बार एक सप्ताह में विभाजित है या जब कोशिकाओं 85-90% नए T75 कुप्पी (५००,००० कोशिकाओं/कुप्पी, औसत पर) को प्रभावित तक पहुंचने ।
      3. DMEM निकालें और 3 मिनट के लिए हेला monolayers दो बार बाँझ फॉस्फेट-खारा (पंजाब) के 8 मिलीलीटर के साथ धो लें ।
      4. पंजाबियों को हटा दें और 2 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ पंजाब के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
      5. ३७ ° c पर 5 मिनट और 5% सेल संस्कृति मशीन में सह2 के लिए कोशिकाओं की मशीन और बाद में हल्के से कुप्पी के नीचे से हेला कोशिकाओं को अलग करने के लिए कुप्पी आंदोलन ।
      6. कक्षों को 10 मिलीलीटर से बाहर फ्लश करें, निलंबन को 15 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें और गिनती के लिए 10 µ l aliquot निकालें ।
      7. ०.४% trypan नीले दाग के साथ aliquot 1:1 पतला और एक Bürker hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना9।
        नोट: कक्षों की संख्या के लिए १०,००० द्वारा दो 4 x 4 चौकोरों और एकाधिक कक्ष संख्या की गणना करें ।
      8. सेल गिनती के बाद, 15 मिलीलीटर ट्यूब से ९००,००० कोशिकाओं को ले लो, उंहें 3 गिलास नीचे व्यंजन पर विभाजित (1.1.1 कदम देखें), और अभिकर्मक के लिए तैयार करते हैं ।
    2. Transfect electroporation द्वारा कोशिकाओं को10 (देखें सामग्री की तालिका) के साथ syntaxin 4-mCitrine का निर्माण (दाता केवल, नमूना #1), syntaxin 4-mCitrine के साथ एक साथ VAMP3-mCherry (नमूना #2), और syntaxin 3 दोनों mCitrine और mCherry से जुड़े ( नमूना #3) ।
      नोट: अंय कक्ष अभिकर्मक विधियों का उपयोग11भी किया जा सकता है । मिलकर नमूना #3 में निर्माण सबसे कम जीवन की उंमीद (यानी, अधिकतम उंमीद झल्लाहट) का आकलन करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण है ।
  2. संस्कृति उच्च ग्लूकोज DMEM में रातोंरात कोशिकाओं को 10% FCS और 1% एंटीबायोटिक-antimycotic के साथ ३७ ° c में 5% सह एक सेल संस्कृति मशीन में2 % के साथ आपूर्ति की ।
  3. महाप्राण DMEM और कोशिकाओं को एक बार धोने के साथ लाइव सेल इमेजिंग मध्यम (१४० mM NaCl, २.५ मिमी KCl, १.८ मिमी CaCl2, 1 मिमी MgCl2, 20 मिमी HEPES, पीएच = ७.४, mOsm = ३००; सामग्री की तालिकादेखें) 2 मिनट के लिए और बाद में ताजा इमेजिंग में कोशिकाओं जगह मध्यम.

2. FLIM डेटा की रिकॉर्डिंग

  1. दाता fluorophore (अर्थात, mCitrine) के लिए स्पंदित उत्तेजना स्रोत के साथ एक समय-डोमेन FLIM फोकल माइक्रोस्कोप के अंतर्गत जगह का नमूना #2 और समय-समाधान डेटा प्राप्ति । कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म अवस्था के साथ रखें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त फोकल माइक्रोस्कोप एक 63X १.२० ना जल विसर्जन उद्देश्य से सुसज्जित है, एक स्पंदित सफेद प्रकाश लेजर (८० मेगाहर्ट्ज स्पंदन, & #60; १०० ps पल्स अवधि), एक फोटॉन गुणक ट्यूब (PMT), और एक समय-संबंधित एकल फोटॉन गिनती (TCSPC ) प्रणाली (विशिष्ट सेटअप इस्तेमाल के लिए सामग्री की तालिका देखें). अन्य FLIM सूक्ष्मदर्शी भी इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, एक सफेद प्रकाश स्पंदित पराबैंगनीकिरण के बजाय PMTs, एकल तरंग दैर्ध्य स्पंदित पराबैंगनीकिरण के बजाय एकल फोटॉन हिमस्खलन डायोड (SPAD) ।
  2. mCitrine और mCherry-लेबल जाल प्रोटीन की दिखाई अभिव्यक्ति के साथ एक सेल का चयन करें और प्रत्येक FLIM माप से पहले दोनों fluorophores के एक साथ उत्तेजना के साथ २५६ × २५६ पिक्सल की एक फोकल छवि रिकॉर्ड । के बारे में 2 गुना के एक पिक्सेल कदम विवर्तन (~ २०० एनएम) माइक्रोस्कोप का सीमित स्थानिक संकल्प से छोटे इस्तेमाल किया जाना चाहिए । mCitrine के लिए, ५१६ एनएम पर उत्तेजित और 521-565 एनएम से उत्सर्जन इकट्ठा; mCherry के लिए, ६१० एनएम पर उत्तेजित और 613-668 एनएम उत्सर्जन से इकट्ठा ।
    नोट: इमेजिंग विमान भी पकवान के नीचे (~ 2 µm दूरी के भीतर) की स्थिति नहीं है, के रूप में यह प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम में एक प्रतिबिंब चोटी में परिणाम होगा । दाता और स्वीकारकर्ता fluorophores के एक साथ उत्तेजना पसंद है, के रूप में यह नमूना आंदोलन की संभावित समस्या को दूर करने की अनुमति देता है । हालांकि, अनुक्रमिक उत्तेजना के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता ।
  3. FLIM छवि के साथ एक ही आयाम और २.२ कदम पर दर्ज की गई फोकल छवि के रूप में स्थानिक संकल्प के साथ दर्ज किया जा रहा है के साथ FLIM भागो क्लिक करके एक FLIM छवि रिकॉर्ड । छवि को रिकॉर्ड करें पूरे सेल FLIM विश्लेषण, या कम से कम ४०० फोटॉनों/पिक्सेल के लिए ५०,००० फोटॉनों । केवल उत्तेजित mCitrine दाता fluorophore और नहीं mCherry स्वीकारकर्ता fluorophore, और इस तरह ५१६ एनएम पर उत्तेजित और 521-565 एनएम उत्सर्जन से इकट्ठा ।
  4. दोहराएं चरण 2.1-2.3 एकाधिक कक्षों के लिए और अंय नमूना #1 के लिए (केवल दाता) और #3 नमूना (mCitrine-mCherry मिलकर निर्माण) ।
  5. एक साधन प्रतिक्रिया समारोह (IRF) रिकॉर्ड. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए उत्सर्जन डिटेक्टर के monochromator ट्यून (उदा., रिकॉर्ड उत्सर्जन से 510-550 एनएम) और फिर वापस के साथ एक FLIM छवि रिकॉर्ड एक साफ ग्लास कवर स्लिप से बटन भागो FLIMक्लिक करके । एक ही उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (५१६ एनएम) और लेजर शक्ति का प्रयोग के रूप में कदम 2.1-2.4 पर सेल डेटा रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया ।
    नोट: यदि कई चोटियों IRF में दिखाई दे रहे हैं या अगर उत्सर्जन monochromators नहीं देखते हैं, IRF भी ultrafast जीवन भर के साथ फ्लोरोसेंट डाई का एक समाधान के साथ मापा जा सकता है, उदाहरण के लिए एक संतृप्त जलीय में एक कार्बनिक डाई के प्रतिदीप्ति शमन द्वारा पोटेशियम आयोडाइड का समाधान । इसके अलावा, यह सख्ती से एक IRF रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक नहीं है, क्योंकि प्रतिदीप्ति हिस्टोग्रामs के क्षय ढलान भी IRF के deconvolution बिना फिट किया जा सकता है । हालांकि, एक IRF उपयोग फोटॉन डिटेक्टर के समय विशेषताओं के लिए सही करने के लिए सक्षम बनाता है और इस तरह जीवनभर की फिट बैठता है और अधिक सटीक हिस्टोग्राम बनाता है ।

3.FLIM छवियों के लिए फोटॉन रिकॉर्डिंग का रूपांतरण

  1. डाउनलोड और PT32ICS रूपांतरण सॉफ्टवेयर5स्थापित करें ।
    नोट: लाइफटाइम डेटा भी कई सूक्ष्मदर्शी विक्रेताओं से सॉफ्टवेयर सहित अंय सॉफ्टवेयर, द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
  2. PT32ICS सॉफ़्टवेयर को कॉंफ़िगर करें ।
    1. सेट आकार के लिए २५६ × २५६ पिक्सेल छवि आकार के माध्यम से सेटिंग्स । आकार।
    2. सेटिंग के माध्यम से चैनल को 2 पर सेट करें | आकार।
      नोट: mCitrine उत्सर्जन के चैनल विशेष रूप से माइक्रोस्कोप के विंयास पर निर्भर है । एक गलत चैनल कोई फोटॉनों के साथ एक FLIM छवि में परिणाम होगा (यानी, काली छवि) और एक परिणाम के रूप में एक खाली ' LifetimeTable. txt '-फ़ाइल । सही चैनल परीक्षण और त्रुटि से पहचाना जा सकता है ।
    3. आउटपुट सेट करने के लिए ImageJ (xyz) (या TRI2 (xyt)) FLIM छवियों (चरण ३.४) पैदा करने के लिए ।
  3. Convert दबाएं और एक या अधिक फोटॉन अंश (. pt3 फ़ाइलें) लोड करें । एकाधिक फोटॉन अंश का चयन करने के लिए, Ctrl कुंजी को दबाए रखें ।
    नोट: नए ६४ बिट. ptu स्वरूप भी कनवर्ट किया जा सकता है ।
  4. सुनिश्चित करें कि PT32ICS सॉफ़्टवेयर निंन फ़ाइलों को उसी फ़ोल्डर में उत्पंन करता है जहां pt3 फ़ाइलें सहेजी जाती हैं: एक फोटॉन स्टैक प्रति. pt3 फोटॉन ट्रेस छवि cytometry मानक स्वरूप (. ics) में, एक बिटमैप फ़ाइल प्रति. pt3 फोटॉन ट्रेस (. bmp), प्रति कनवर्ज़न एक पाठ फ़ाइल (_Report. txt) फोटॉन आँकड़ों पर जानकारी युक्त (अर्थात, प्रत्येक में फोटॉनों की कुल संख्या. pt3 फोटॉन ट्रेस, डिटेक्टर के समय संकल्प), और रूपांतरण के प्रति एक दूसरी पाठ फ़ाइल (_LifetimeTable. txt) कुल युक्त प्रत्येक के लिए टैब-सीमांकित स्वरूप में प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम. pt3 फोटॉन ट्रेस ।
    नोट: आईसीएस फ़ाइल एकल पिक्सेल फिटिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है FLIM छवियों को उत्पंन करने के लिए, उदाहरण के लिए TRI2 सॉफ्टवेयर के साथ12,13 या फिजी ImageJ14में पतली वक्र फिटिंग पुस्तकालय,15। इस फ़ाइल को भी phase विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है16, उदाहरण के लिए Spechron से फिजी के लिए समय Gated phaser प्लगइन के साथ । बिटमैप फ़ाइल में कोई जीवनकाल जानकारी नहीं है । दूसरी पाठ फ़ाइल चरण 4 में पूरे-कक्ष FLIM विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है ।

4. पूरे सेल FLIM विश्लेषण के लिए प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम की फिटिंग

नोट: इस कदम (IRF की deconvoluted फिटिंग) deconvoluted फिटिंग में सक्षम सॉफ्टवेयर की आवश्यकता है । फिटिंग IRF के deconvolution के बिना प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम की ढलानों अंय सॉफ्टवेयर के साथ के रूप में अच्छी तरह से किया जा सकता है ।

  1. deconvolution (सामग्री की तालिका) के साथ फिटिंग करने में सक्षम डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें और फ़ाइल के माध्यम से प्रत्येक फोटॉन ट्रेस (_LifetimeTable. txt) के लिए हिस्टोग्राम युक्त पाठ फ़ाइल आयात करें | आयात । एकल ASCII।
  2. तालिका को पुनर्व्यवस्थित करें, जैसे कि IRF तालिका के दूसरे स्तंभ में है ( प्रतिलिपि और चिपकाएं का उपयोग करके) । IRF को पहले स्तंभ A में समय मानों के आगे दूसरे स्तंभ B में रखें ।
  3. Ctrl + A दबाकर और प्लॉट का चयन करके सभी स्तंभों का चयन करके रिकॉर्ड किए गए फोटॉन अंश की गुणवत्ता का निर्धारण करें | मल्टी पैनल । 9 पैनल। एक उच्च प्रतिबिंब चोटी (चित्रा 4F) के साथ फोटॉन निशान का विश्लेषण मत करो ।
  4. उन सभी स्तंभों का चयन करें जिनमें गुणवत्ता नियंत्रित जीवनकाल हिस्टोग्राम होंगे और साथ ही स्तंभ B में IRF Ctrl कुंजी का उपयोग करके और गैर-रेखीय फिटिंग को विश्लेषण के माध्यम से लोड करेंगे । फिटिंग । रैखिक वक्र फ़िट । संवाद खोलें।
  5. deconvoluted fit फ़ंक्शन लोड करें ( अनुपूरक फ़ाइल 1में उपलब्ध) विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में इस फ़ंक्शन को जोड़कर ( श्रेणी द्वारा । यूज़र डिफ़ाइंड । समारोह । जोड़ें) । फ़िट फ़ंक्शन फ़ाइल का चयन करें ' FLIM_convoluted_IRF. fdf ' । इस समारोह के साथ एक मोनो घातीय क्षय समारोह deconvoluted के साथ प्रतिदीप्ति जीवन भर में फिट बैठता है IRF (यानी, तालिका में दूसरा कॉलम बी) (समीकरण 1):
    Equation 1(समीकरण 1)
    टी समय के साथ, स्पष्ट प्रतिदीप्ति जीवनकाल, एक आयाम, और y0 ऑफसेट τ ।
    नोट: एक और विकल्प द्वि-घातांक फ़िट फ़ंक्शन (समीकरण 2) के साथ जीवनकाल हिस्टोग्राम को फ़िट करने के लिए है:
    Equation 2(समीकरण 2)
    धीरे घटक के जीवनकाल फिक्सिंग (τ1) दाता ही हालत (1.1.2 कदम: नमूना #1) और तेजी से घटक (τ2) के लिए मिलकर निर्माण (नमूना #3) के लिए, इस के अंश का अनुमान की अनुमति देता है धीमी (एक1) और तेजी से घटकों (एक2; चर्चादेखने के आयाम से जटिल (एफ) में प्रोटीन जाल; समीकरण 3):
    Equation 3(समीकरण 3)
    deconvoluted द्वि-घातांक फिटिंग ' FLIM_convoluted_IRF_biexp. fdf ' के लिए फ़िट फ़ंक्शन फ़ाइल अनुपूरक फ़ाइल 2में उपलब्ध है ।
  6. फिट घटता चुनें । X डेटा प्रकार इनपुट डेटा के समान।
    नोट: यह फिट घटता के उपयुक्त x-अक्ष स्केलिंग में परिणाम होगा ।
  7. फिटदबाकर घटता फिट.
    नोट: यह फ़िट कनवर्ट करें और एक ' रिपोर्ट पत्रक ' सरणी में प्रतिदीप्ति जीवनभर, ऑफ़सेट, और आयाम युक्त तालिका के साथ जनरेट करेगा । यह भी सज्जित घटता और फिट के अवशिष्ट के साथ एक डेटा पत्रक उत्पन्न होगा.

Representative Results

झल्लाहट-FLIM द्वारा जाल बातचीत को मापने के लिए परख की तर्क चित्रा 1में दिखाया गया है । सी-टर्मिनी के transmembrane helices के cognate जाल प्रोटीन की एक जोड़ी के लिए जुड़े हुए है वर्णक्रम में फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उदा, mCitrine और mCherry) स्थानांतरित कर दिया । एक सीआईएसके गठन-इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक दूसरे को और झल्लाहट के लिए तुरंत झकझोरता बनने में झिल्ली संलयन परिणाम पर जाल जटिल । चित्रा 2 हेला कोशिकाओं के प्रतिनिधि फोकल छवियों फ्लोरोसेंट-लेबल जाल प्रोटीन व्यक्त दिखाता है । दिखाया एक सेल syntaxin व्यक्त कर रहे है 4-mCitrine (दाता fluorophore) के साथ VAMP3-mCherry (स्वीकारकर्ता fluorophore), के रूप में अच्छी तरह के रूप में केवल syntaxin 4-mCitrine का निर्माण (दाता ही, कोई झल्लाहट) व्यक्त कोशिकाओं के नियंत्रण की शर्तों और syntaxin 3 दोनों से जुड़े mCitrine और मिलकर में mCherry (अधिकतम उंमीद झल्लाहट) । चित्रा 3 के साथ प्रतिदीप्ति जीवन भर और FLIM मोनो के साथ प्रत्येक पिक्सेल के जीवन भर के हिस्टोग्राम फिटिंग द्वारा उत्पंन छवियां दिखाता है घातीय क्षय कार्य (आंकड़ा3ए-बी) और द्वि-घातीय क्षय कार्य ( चित्र 3 सी - घ). चित्रा 4a हमारे सेटअप के IRF से पता चलता है एक खुर्दबीन कवर ग्लास के पीछे बिखरने से मापा । चित्रा 4B-ईमें, पूरे सेल FLIM विश्लेषण के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति जीवन भर के हिस्टोग्राम के साथ साथ फिट curves मोनो-घातीय क्षय कार्यों के लिए दिखाया जाता है । चित्रा 4F एक फ्लोरोसेंट जीवनकाल एक प्रयोग के हिस्टोग्राम दिखाता है भी माइक्रोस्कोप कवर कांच की सतह के करीब, एक प्रमुख प्रतिबिंब चोटी में जिसके परिणामस्वरूप । चित्रा 4g एक द्वि-घातीय क्षय समारोह के साथ प्रतिनिधि फिट के साथ एक जीवनकाल हिस्टोग्राम दिखाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: झल्लाहट से जाल परिसरों visualizing के लिए तर्क की योजना है । (क) के संरचनात्मक मॉडल के ंयूरॉन जाल (प्रोटीन डाटाबेस 3HD717) पुटिका-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन (खलनायिका) 2 (नीला; R), syntaxin 1 (लाल; क्यूए-जाल), और SNAP25 (हरा; दोनों एक Qb और Qc-जाल आकृति) शामिल हैं । syntaxin-1 के transmembrane कुण्डली के सी-टर्मिनस को संयुग्मित से mCitrine (दाता fluorophore; प्रोटीन डाटाबेस 3DQ118) है । VAMP2 के transmembrane कुण्डली के सी-टर्मिनस को संयुग्मित mCherry (स्वीकारकर्ता fluorophore; प्रोटीन डाटाबेस 2H5Q19) है । (ख) झल्लाहट में जिसके परिणामस्वरूप जाल मध्यस्थता झिल्ली संलयन की योजना है । एक सीआईएस-जाल परिसर के गठन से झिल्ली संलयन के बाद, जाल तुरंत झल्लाहट में जिसके परिणामस्वरूप एक दूसरे के लिए झकझोरता हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े जाल प्रोटीन की अभिव्यक्ति. पहला कॉलम: दाता fluorophore, ५१६ एनएम पर उत्तेजित । दूसरा कॉलम: स्वीकारकर्ता fluorophore, ६१० एनएम पर उत्तेजित । (क) दाता ही हालत. syntaxin 4-mCitrine (दाता fluorophore, हेला में हरा) के प्रतिनिधि का फोकल इमेज । स्वीकारकर्ता चैनल (द्वितीय स्तंभ) प्रतिदीप्ति क्रॉस-टॉक दिखाता है. (B) नकारात्मक नियंत्रण (कोई झल्लाहट नहीं) । दोनों syntaxin 4-mCitrine के साथ VAMP3-mCherry (स्वीकारकर्ता fluorophore, मर्ज में रानी) के साथ व्यक्त एक हेला सेल की प्रतिनिधि फोकल छवि । (ग) सकारात्मक नियंत्रण (अधिकतम उंमीद झल्लाहट) । syntaxin 3-mCitrine-mCherry मिलकर निर्माण की एक हेला सेल व्यक्त की प्रतिनिधि फोकल छवि । ध्यान दें कि mCitrine और mCherry संकेतों के प्रतिदीप्ति संकेत पूरी तरह से ओवरलैप नहीं करता है, mCitrine की एक कम प्रतिरोध की संभावना लाइसोसोमल की तुलना में mCherry गिरावट के लिए (चर्चा अनुभाग देखें). BF: ब्राइट फील्ड. स्केल बार्स, 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जाल जटिल गठन के FLIM छवियों । (A) प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति चित्रा 2में दिखाया गया कोशिकाओं की लाइफटाइम छवियां । छवियों पहले फोटॉन एक TCSPC प्रणाली (. pt3) द्वारा छवि cytometry मानक (. आईसीएस) PT32ICS सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दर्ज अंश परिवर्तित द्वारा उत्पंन किया गया । एकल पिक्सेल लगे प्रतिदीप्ति लाइफटाइम छवियां तो TRI2 सॉफ्टवेयर12,15-100% तीव्रता, 7 पिक्सेल परिपत्र बिन्नी और monoexponential फिटिंग एल्गोरिथ्म (Marquardt) से थ्रेसहोल्ड के साथ13 का उपयोग कर उत्पंन किया गया । रंग औसत स्पष्ट फ्लोरोसेंट जीवन भर इंगित करता है । (ख) FLIM छवियां जहां प्रतिदीप्ति लाइफटाइम छवियां (पैनल ए में दिखाया गया है) mCitrine दाता fluorophore के प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ जटिल थे ( चित्रा 2में दिखाया गया है) । कनवल्शनफ़िल्टर्स एक कस्टम-निर्मित मैक्रो का उपयोग ImageJ फिजी के साथ किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें). (ग) प्रतिदीप्ति लाइफटाइम और हेला सेल के FLIM छवियों दोनों syntaxin 4-mCitrine और VAMP3-mCherry से एक-बी पैनलों, लेकिन अब द्वि-घातीय क्षय curves के साथ फिटिंग के साथ (नियंत्रण की स्थिति के लिए तय जीवन भर के साथ; देखें ४.४ चरण में प्रोटोकॉल) । पिक्सेल रंग VAMP3 (समीकरण 3) के साथ जटिल में syntaxin 4 के अनुमानित अंशों को F इंगित करते हैं । (D) पैनल B के समान, लेकिन द्वि-घातांक फ़िट के लिए । कनवल्शनफ़िल्टर्स एक कस्टम-निर्मित मैक्रो का उपयोग ImageJ फिजी के साथ किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पूरे सेल FLIM विश्लेषण । (क) सेटअप का इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन (IRF) । IRF गिलास पानी अंतरफलक पर पीछे बिखरने का उपयोग कर मापा गया था (एक साफ कांच माइक्रोस्कोपी पानी युक्त पकवान का उपयोग) ।(ख-ङ) चित्रा 2 और चित्रा 3में दिखाए गए कक्षों के लिए पूरे सेल जीवनकाल हिस्टोग्राम । छवियों में उपस्थित सभी फोटॉनों को परित किया गया । curves IRF के साथ deconvoluted और मोनो-घातीय क्षय कार्यों (समीकरण 1) के साथ सज्जित थे. इन कक्षों के लिए, प्रतिदीप्ति जंमों २.८२ एनएस (केवल syntaxin 4-mCitrine; दाता केवल; पैनल बी), २.०९ एनएस (कोशिकाओं सह व्यक्त syntaxin 4-mCitrine VAMP3-mCherry; पैनल सी के साथ), और २.०८ एन एस (कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए प्राप्त किया गया syntaxin 3- mCitrine-mCherry मिलकर निर्माण; अधिकतम उंमीद झल्लाहट नियंत्रण; पैनल डी) । inlays एक ही रेखांकन दिखाने के लिए, लेकिन अब y-अक्ष के लघुगणकीय स्केलिंग के साथ । पैनल ई पैनलों बी डी के क्षय curves के एक ओवरले से पता चलता है । (च) एक फ्लोरोसेंट जीवनकाल हिस्टोग्राम का उदाहरण भी माइक्रोस्कोप कवर स्लिप की सतह के करीब दर्ज की गई । एक बड़े प्रतिबिंब चोटी में यह परिणाम (पीला छायांकित क्षेत्र द्वारा चित्रित) । (G) पैनल सी के रूप में ही, लेकिन अब एक द्वि-घातीय नियंत्रण शर्तों के लिए तय जंमों के साथ क्षय वक्र के साथ फिटिंग (प्रोटोकॉल में ४.४ कदम देखें) । तेजी के आयाम (एक1) और धीमी गति से (एक2) घटक १४.४२ और ०.०१, क्रमशः थे, ०.९९ (समीकरण 3) के जटिल एफ में जाल के एक अनुमानित अंश में जिसके परिणामस्वरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 1. फ़ंक्शन फ़ाइल FLIM_convoluted_IRF कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 2. फ़ंक्शन फ़ाइल FLIM_convoluted_IRF_biexp कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल लाइव हेला कोशिकाओं में syntaxin 4 और VAMP3 के बीच जाल बातचीत के दृश्य के लिए झल्लाहट-FLIM के उपयोग को दर्शाता है. Syntaxin 4 एक क्यूए-जाल प्रोटीन मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली पर पता लगाने जहां यह मध्यस्थता exocytosis1,2,20,21है । VAMP3 एक आर-जाल जो मुख्य रूप से endosomal डिब्बों रीसाइक्लिंग और अंय endosomes के लिए और साथ ही प्लाज्मा झिल्ली1,2,20के लिए तस्करी की मध्यस्थता में पता लगाने के लिए वर्णित है । हालांकि, झल्लाहट-FLIM परख आसानी से अंय जाल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । केवल शर्त यह है कि इन जाल एक सी-टर्मिनल transmembrane कुंडलित होते हैं, जो अब तक सबसे जाल प्रोटीन के लिए मामला है1,2. इसके अलावा, प्रोटोकॉल यहां वर्णित किसी भी युकेरियोटिक कोशिका प्रकार, पौधों और खमीर सहित में जाल परिसरों के दृश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम झल्लाहट का एक उपाय के रूप में दाता fluorophore के प्रतिदीप्ति जीवनकाल के छोटा इस्तेमाल किया । एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में, स्वीकारकर्ता fluorophore के जीवनकाल की जांच की जा सकता है, क्योंकि संवेदनशील उत्सर्जन एक अलग वृद्धि चरण जो स्पष्ट सबूत है कि प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण होता है प्रदान करता है ।

वर्तमान में, झल्लाहट-FLIM तकनीक लाइसोसोमल डिब्बों में जाल परिसरों कल्पना करने में सक्षम नहीं हो सकता है । syntaxin 3-mCitrine-mCherry मिलकर निर्माण के लिए, mCherry प्रतिदीप्ति अक्सर एक juxtanuclear क्षेत्र में अधिक संचित पाया जा सकता है, जो संभावना लाइसोसोमल डिब्बों से मेल खाती है, जबकि mCitrine संकेत सेलुलर में और अधिक प्रचुर मात्रा में है परिधि५. mCitrine की तुलना में mCherry के एक समान juxtanuclear संचय मनाया गया, जब एक ही जाल प्रोटीन इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े हुए थे सह5व्यक्त की । Lysosomes एक अत्यंत कम पीएच (& #60; 4) और proteolytic एंजाइमों की एक उच्च गतिविधि की विशेषता है । mCherry के juxtanuclear संचय की संभावना लाइसोसोमल mCitrine की तुलना में fluorophore क्षरण के लिए mCherry fluorophore के एक उच्च प्रतिरोध के कारण होता है । यह mCitrine के पीएच शमन के कारण नहीं है, के रूप में mCherry के juxtanuclear संचय भी कोशिकाओं के निर्धारण पर होता है5। इस प्रकार, झल्लाहट-FLIM तकनीक juxtanuclear (लाइसोसोमल) क्षेत्रों में झल्लाहट की राशि का अनुमान है और यह अंय फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन है कि lysosomes के लुमेन के भीतर कठोर शर्तों जीवित रहने की आवश्यकता होगी ।

झल्लाहट-FLIM सिद्धांत में एक (अर्द्ध) जटिल में जाल के अंश का मात्रात्मक अनुमान प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है5. जैसा कि हम इस प्रोटोकॉल में समझाया, यह डबल-घातीय क्षय कार्यों के साथ प्रतिदीप्ति जीवनकाल हिस्टोग्राम की फिटिंग की आवश्यकता है (समीकरण 2), जहां तेजी से घटक के आयाम परिसर में जाल के अंश के लिए आनुपातिक है ( समीकरण 3) । हालांकि, एक दो घटक मॉडल के साथ इस तरह फिटिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । कई मुफ्त फिट मापदंडों के साथ फिटिंग (दो प्रतिदीप्ति जंमों और दो आयाम) फोटॉनों की एक बहुत बड़ी संख्या की आवश्यकता है, विशेष रूप से मापदंडों के बाद से एक दूसरे को प्रभावित करेगा और जीवन में छोटे त्रुटियों आयाम और उपाध्यक्ष को प्रभावित करेगा विपरीत। इन फिटिंग समस्याओं को दूर करने के लिए, धीमी घटक के प्रतिदीप्ति जंमों दाता केवल हालत (अर्थात्के जीवनकाल के लिए तय किया जा सकता है, कोई झल्लाहट; केवल mCitrine वर्तमान) और है कि मिलकर के जीवनकाल के लिए तेजी से घटक का निर्माण ( अधिकतम उंमीद झल्लाहट) । हालांकि, यह भी ध्यान के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, क्योंकि प्रतिदीप्ति जंमों इन नियंत्रण राज्यों में के रूप में ही नहीं हो सकता है, और क्योंकि कई कारणों से विचलित सकता है (स्वयं शमन, द्विध्रुवीय अभिविंयास, microenvironment में रूपांतरों) । एकाधिक बंद निकटता के भीतर जाल परिसरों (& #60; 10 एनएम) दूरी पर निर्भर झल्लाहट में परिणाम कर सकते हैं, एक ही सिद्धांत है कि झल्लाहट की अनुमति देता है एक "आणविक शासक" के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस मामले में, जाल परिसर के ठहराव अस्पष्ट । इसके अलावा, एक मात्रात्मक अनुमान हमेशा सार्थक नहीं है, क्योंकि लेबल जाल अंतर्जात (unलेबल्ड) जाल के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं । एक परिणाम के रूप में, mCherry-लेबल जाल की अभिव्यक्ति स्तर5झल्लाहट प्रतिशत के लिए एक मुख्य निर्धारक है । इन सभी निरंतर के कारण, यह एक मोनो-घातीय क्षय समारोह (समीकरण 1) के साथ फ्लोरोसेंट जीवनकाल हिस्टोग्राम फिट करने के लिए सिफारिश की है. यह लाभ है कि यह जीवन भर के किसी भी प्राथमिकताओं ज्ञान की आवश्यकता नहीं है और जिसके परिणामस्वरूप स्पष्ट औसत फ्लोरोसेंट जीवन भर के लिए एक ठोस उपाय5परिसर जाल प्रदान करता है ।

फिर भी, यह अपेक्षित है कि मात्रात्मक झल्लाहट-FLIM इमेजिंग द्वारा दो घटक फिटिंग मॉडल शक्तिशाली भविष्य अनुप्रयोगों होगा । गुणसूत्र के भीतर जाल एंकोडिंग जीन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के साथ जुड़े हुए हो सकता है, उदाहरण के लिए CRISPR/CAS9 द्वारा । अंतर्जात के फ्लोरोसेंट लेबलिंग में यह परिणाम अंतर्जात प्रोटीन के स्तर के साथ और unलेबल्ड जाल की कोई पृष्ठभूमि, जाल प्रोटीन, और इस तरह झल्लाहट-FLIM द्वारा जाल परिसरों के अंश का एक सार्थक मात्रात्मक अनुमान के लिए अनुमति देता है. जबकि अंतर्जात जाल की अभिव्यक्ति का स्तर काफी कम हो सकता है और अपेक्षाकृत कम फ्लोरोसेंट संकेत दे, यह आशा की जाती है कि फोटॉनों की एक पर्याप्त संख्या विशेष रूप से पूरे सेल FLIM के लिए प्राप्त किया जा सकता है (जो केवल कुछ 1, फोटॉनों की वारदातों की आवश्यकता है) । इसके अलावा, इन झल्लाहट-FLIM माप और अधिक संवेदनशील हिमस्खलन photodiode डिटेक्टरों जो भी उच्च प्रतिदीप्ति संकेतों और बेहतर फोटॉन आंकड़ों में परिणाम होगा के साथ किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को Radboud यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर से एक Hypatia फेलोशिप, ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम से कॅरियर डेवलपमेंट अवार्ड, नीदरलैंड्स के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए संस्था से २०१३ का बढऩा कार्यक्रम (NWO; आईसीआई-024.002.009), NWO (ALW विडि 864.14.001) से एक विडि अनुदान, और यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (अनुदान समझौते संख्या ३३६४७९) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से एक प्रारंभिक अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' Addgene ID 92422 Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' Addgene ID 92423 Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' Addgene ID 92426 Positive control for maximum achievable FRET.
Hela cells
35 mm glass bottom dishes  Willco Wells HBST-3522 Other live cell imaging chambers will work as a substitute
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco, Life Technologies 31966-021
Fetal calf serum Greiner Bio-one 758093
Antibiotic-antimycotic solution Gibco, Life Technologies 15240-062 Pen/Strep will work as a substitute
Live cell imaging medium Thermo Fisher Scientific A14291DJ Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective Leica SP8 Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used
Pulsed white light laser Leica SP8 Other pulsed laser sources can also be used
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system PicoQuant PicoHarp 300
PT32ICS conversion software Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
data analysis software programme capable of deconvolution Originlabs OriginPro 2016
Fiji ImageJ
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity Fiji ImageJ Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com
Bürker Haemocytometer VWR 630-1541
HeLa cells ATCC ATCC CCL-2
PBS B Braun Melsungen  AG 362 3140
EDTA 2 mM Merck 108417 CAS: 60-00-4
15 mL tubes Greiner Bio-one 188271
Trypan blue Sigma Aldrich 93595 CAS: 72-57-1
NEON cell electroporation device Thermo Fisher Scientific MPK5000S

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References

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प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा visualizing Intracellular जाल ्े
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