Summary
Este protocolo descreve um método novo, permitindo a visualização quantitativa da formação do complexo de proteínas SNARE, baseado na transferência de energia de ressonância de Förster e vida de fluorescência, microscopia de imagem.
Abstract
Solúvel N- proteà sensível proteína (NSF) acessório da proteína do receptor (SNARE) proteínas da fusão são chave para tráfico de membrana, como eles catalisam a fusão da membrana dentro das células eucarióticas. A família de proteínas SNARE consiste de cerca de 36 membros diferentes. Rotas de transporte intracelular específico são catalisadas por conjuntos específicos de 3 ou 4 proteínas SNARE que contribuam assim para a especificidade e a fidelidade do tráfico de membrana. No entanto, estudando a função precisa de proteínas SNARE é tecnicamente um desafio, porque armadilhas são altamente abundantes e funcionalmente redundante, com a maioria dos laços tendo múltiplos e sobreposição de funções. Neste protocolo, é descrito um novo método para a visualização da formação do complexo SNARE em células vivas. Este método baseia-se em expressar proteínas SNARE fundidas C-terminal de proteínas fluorescentes e medir sua interação por energia de ressonância de Förster transferir vida de fluorescência (FRET) emprega microscopia (FLIM) de imagem. Encaixando os histogramas de vida de fluorescência com um modelo multicomponente decadência, FRET-FLIM permite (semi-) estimativa quantitativa da fração da formação do complexo SNARE em diferentes vesículas. Este protocolo foi aplicado com sucesso para visualizar a formação do complexo SNARE na membrana plasmática e no CDDP compartimentos em linhas de células de mamíferos e principais células do sistema imunológico e pode ser facilmente estendido para estudar funções SNARE em outras organelas em animal, planta e células fúngicas.
Introduction
Tráfico de membrana é uma característica central das células eucarióticas, onde vesículas de membrana bud fora de uma organela do doador e depois mover para e fundem-se com um alvo Organela1,2. Com exceção de mitocôndrias, todos estes passos de fusão de membrana são catalisados por membros da família1,proteínas SNARE2. A família de proteínas SNARE consiste de cerca de 36 em células de mamíferos e cerca de 20 membros em fermento2. Proteínas SNARE contêm um ou dois ~ 52 longa de resíduos, nativamente não estruturadas de regiões, chamadas SNARE-motivos. Proteínas SNARE frequentemente estão amarradas a membranas por uma hélice transmembrana de C-terminal1,2. Armadilhas podem ser categorizadas com base na centrais resíduos contribuem para a armadilha complexa em arginina (R) e glutamina (Q) armadilhas1,2. Fusão da membrana é impulsionado pela interação de 3 ou 4 armadilhas cognatas que juntos contribuem 4 SNARE-motivos e são distribuídos sobre o doador e o aceptor de membrana1,2. Um complexo SNARE é composto por três motivos de Q-SNARE (denominados Qa, Qb e Qc) e um motivo de R-SNARE. Formação do complexo começa com a N-termini de SNARE-motivos, formando um so-called trans-SNARE-complexo e prossegue em direção a C-termini, formando um apertado bundle coiled-coil α-hélice, chamado um cis-SNARE-complexo. A formação do complexo de nem um único laço complexo arrasta as membranas doador e aceptor juntos e supera a barreira de energia para fusão de membrana3.
Muitas vezes tecnicamente é um desafio atribuir distintos complexos SNARE para rotas de transporte específicos dentro das células. Embora ciladas claramente contribuem para a especificidade da membrana de tráfico, são promíscuos, funcionalmente redundante, e suas funções se sobrepõem1,2. Por causa disso, experiências de perturbação definião ciladas, tais como nocaute do gene, interferência do RNA, a introdução de anticorpos de bloqueio, ou com fragmentos SNARE solúveis atuando como dominantes negativos, frequentemente não resultam em fenótipos claros como outro SNAREs compensar2,4. Além disso, é difícil diferenciar as etapas de fusão de membrana específicas de montante eventos de tráfico, porque armadilhas podem estar envolvidas em várias rotas de transporte2. Estudos de localização de armadilhas por microscopia abordagens, usando immunolabeling ou fusão genética de proteínas fluorescentes repórter, sofrem com os problemas que: (i) armadilhas localizar para várias organelas como eles muitas vezes mediam várias etapas de tráfico e (ii) suas localizações não significam automaticamente que eles funcionalmente estão envolvidos na formação do complexo SNARE. Finalmente, complexos SNARE podem ser identificados usando imunoprecipitação experimentos usando um dos laços como isca e as outras armadilhas como alvos, mas isso não permite a atribuição destes complexos de organelas específicas ou rotas de tráfico. Assim, atualmente, não existe alternativa técnica para visualizar complexos SNARE com resolução organellar. Imunofluorescência não é capaz de provar interações SNARE, mas pode mostrar apenas a presença ou ausência de localização co, enquanto imunoprecipitação só pode mostrar interações SNARE em toda a população de células, mas não atribuir as organelas onde estas interações ocorrem.
Para ultrapassar estas limitações, um novo método que permite a visualização quantitativa de complexos SNARE dentro de células vivas com resolução organellar recentemente foi desenvolvido por Verboogen et al . 5 este método baseia-se na expressão de pares de armadilhas com proteínas fluorescentes espectralmente deslocadas fundidas C-terminal para suas hélices transmembranares. Após a conclusão da fusão da membrana e a formação de uma cis-SNARE complexas, estes fluorophores na C-termini das hélices transmembranares são imediatamente justapostos uns aos outros. Os fluorophores então estão bem dentro da distância de Förster (tipicamente < 5 nm), resultando em FRET do fluoróforo dador verde-deslocado para o avermelhado aceitador fluoróforo5,6. FRET resultados em têmpera do fluoróforo dador e uma emissão maior do fluoróforo aceitador que pode ser medido a partir os rácios da emissão doador e aceptor (ratiometric FRET). No entanto, ratiometric FRET entre duas moléculas diferentes é um desafio, por causa dos níveis de cross-talk e diferente de fluorescência do doador e aceptor laços em organelas diferentes e entre células7,8. FRET pode também ser medido desde o tempo de vida de fluorescência, que é o tempo entre a excitação e a emissão de um fóton. Se o fluoróforo dador pode liberar sua energia por FRET, este resultado processo concorrentes em um aparente encurtamento do tempo de vida de fluorescência. Isto pode ser medido por FLIM7,8. Tempo de vida FRET é muito mais robusto do que o ratiometric FRET para medir as interações entre duas moléculas diferentes, como o tempo de vida de fluorescência é uma propriedade intrínseca de um fluoróforo e é insensível à sua concentração. Além disso, o FRET é por aproximação quantitativa, porque a eficiência do traste é inversamente proporcional à sexta potência da distância entre o doador e aceptor fluorophores (essencialmente uma função de passo). Portanto, encaixando os histogramas de vida de fluorescência gravados por FLIM com um modelo de decaimento do dobro-componente, FRET-FLIM permite a estimativa quantitativa (semi-) da fração de SNARE moléculas exerçam de formação do complexo SNARE5.
Recentemente, este método FRET-FLIM foi usado por Verboogen et al . para visualizar a formação do complexo SNARE em células dendríticas primárias do sistema imunológico,5. Foi demonstrado que, ao encontrarmos um estímulo patogênico, células dendríticas redirecionar sua membrana tráfico acompanhada por um aumento complexantes da proteína de membrana associada a vesículas do R-SNARE (VAMP) 3 com o q-SNARE syntaxin 4 especificamente na membrana plasmática. Esta formação do complexo SNARE aumentada provavelmente é necessária para atender o aumento da capacidade secretora para a secreção de citocinas inflamatórias, tais como a interleucina-65. Este protocolo descreve as etapas experimentais necessárias para a aquisição de dados FLIM-FRET para a medição quantitativa e visualização (semi-) de complexos SNARE.É explicado como encaixar os histogramas de vida de fluorescência de células inteiras com funções de decaimento mono e bi-exponencial, originando o ciclo de vida de fluorescência aparente como uma estimativa quantitativa de interações SNARE. Neste protocolo, a linha de célula HeLa amplamente usada é usada como um exemplo, mas o método pode ser facilmente estendido para estudar complexos SNARE em outras células eucarióticas.
Protocol
1. preparação das amostras, microscópio
- Expressão de Qa-SNARE syntaxin 4 fundido ao mCitrine (syntaxin 4-mCitrine; fluoróforo dador) e o R-SNARE VAMP3 fundido ao mCherry (VAMP3-mCherry)
Nota: Também podem ser usadas outras armadilhas com proteínas fluorescentes fundidas para suas hélices transmembranares do C-terminal. Em vez de mCitrine-mCherry, outros pares doador-aceitador de fluorophores espectralmente separado também podem ser usado (por exemplo, PCP-YFP).- Desenvolvem-se células HeLa e dividir 900.000 células HeLa sobre três 35 mm de diâmetro vidro inferior pratos para microscopia.
Nota: Em princípio, este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células eucarióticas e pratos de microscopia.- Manter as culturas de células HeLa T75 frascos com 10 mL de glicose alta Dulbecco é suplementado da águia modificado (DMEM), com 10% de soro fetal bezerro (FCS) e 1% antibiótico antimicótico (contendo anfotericina B, penicilina e estreptomicina) a 37 ° C e 5% CO 2 em uma incubadora de cultura de células.
- Reabastecer o médio duas vezes por semana e dividir as células 01:10, uma vez por semana ou quando as células atingem 85-90% de confluencia de novos frascos T75 (500.000 células/balão, em média).
- Retire o DMEM e lave as monocamadas de HeLa duas vezes com 8 mL de tampão fosfato solução salina estéril (PBS) por 3 min.
- Remover a PBS e adicionar 2 mL de PBS com ácido de 2mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
- Incube as celulas por 5 min a 37 ° C e 5% CO2 incubadora de cultura celular e posteriormente levemente agitar o frasco para separar as células HeLa da parte inferior do frasco.
- Expulsar as células com 10 mL de meio, transfira a suspensão para um tubo de 15 mL e retirar uma alíquota de 10 µ l para a contagem.
- Diluir a 1:1 com mancha de azul de Tripan 0,4% alíquota e contar as células com uma Bürker hemocytometer9.
Nota: Contar duas 4x4 praças e múltiplas o número de células por 10.000 para o número de células/mL. - Depois de célula contando, tomar 900.000 células do tubo de 15 mL, dividi-los sobre os pratos de fundo de 3 vidro (consulte a etapa 1.1.1) e prepare-se para transfeccao.
- Transfect as células por eletroporação10 (ver Tabela de materiais) com syntaxin 4-mCitrine construção (doador somente, amostra #1), syntaxin 4-mCitrine, juntamente com VAMP3-mCherry (amostra #2) e syntaxin 3 fundido a (ambos mCitrine e mCherry Exemplo #3).
Nota: Outros métodos de transfecção celular também podem ser usado11. A construção em tandem na amostra #3 é um controlo positivo para estimar o mais curto tempo de vida expectável (i.e., FRET expectable máxima).
- Desenvolvem-se células HeLa e dividir 900.000 células HeLa sobre três 35 mm de diâmetro vidro inferior pratos para microscopia.
- Cultura que das células durante a noite em alta glicose DMEM fornecido com FCS de 10% e 1% de antibiótico antimicótico a 37 ° C com 5% CO2 em uma incubadora de cultura de células.
- DMEM de aspirar e lavar as células uma vez com célula viva imagem médio (140 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, CaCl2de 1.8 mM, 1 mM MgCl2, 20mm HEPES, pH = 7,4, mOsm = 300; ver Tabela de materiais) por 2 min e posteriormente colocar as células em imagem fresca médio.
2. a gravação dos dados FLIM
- Colocar amostra #2 no domínio do tempo FLIM confocal microscópio com uma fonte de excitação pulsante para o fluoróforo dador (ou seja, mCitrine) e aquisição de dados tempo-resolvido. Manter as células a 37 ° C, com uma fase aquecida.
Nota: O microscópio confocal utilizado neste protocolo é equipado com um objectivo de imersão água at 63 X 1,20, um laser de luz pulsado branco (80 MHz pulsando, < duração do pulso de 100 picosegundo), um tubo de multiplicador de fóton (PMT) e um Time-Correlated único fóton contando (TCSPC ) sistema (consulte Tabela de materiais para instalação específica usada). Outros microscópios FLIM também podem ser usado (por exemplo, diodos de avalanche de fóton único (SPAD) em vez de PMTs, lasers pulsados de single-comprimento de onda em vez de um laser pulsado de luz branca). - Selecione uma célula com a expressão visível da mCitrine e proteínas SNARE mCherry-labeled e gravar uma imagem confocal de 256 × 256 pixels com excitação simultânea de dois fluorophores antes de cada medição FLIM. Um passo de pixel de cerca 2 dobras menores do que a difração limitada resolução espacial, do microscópio (~ 200 nm) deve ser usado. Para mCitrine, excitar a 516 nm e emissão cobrar de 521-565 nm; para mCherry, excite em 610 nm e coletar a emissão de 613-668 nm.
Nota: Fazer não posição o avião de imagens muito perto para o fundo do prato (dentro de ~ 2 µm de distância), pois isso resultará em um pico de reflexão no histograma do tempo de vida de fluorescência. Excitação simultânea do doador e aceptor fluorophores é preferida, como este permite para superar o problema potencial do movimento da amostra. No entanto, a excitação sequencial pode ser usada também. - Registro de uma imagem FLIM clicando Executar FLIM com a imagem FLIM sendo gravada com as mesmas dimensões e resolução espacial, como a imagem confocal gravada no passo 2.2. Grave os fótons da imagem pelo menos 50.000 para análise FLIM de célula inteira, ou pelo menos 400 fótons/pixel. Só excitar o fluoróforo dador de mCitrine e não o fluoróforo aceitador de mCherry e assim excitar em 516 nm e coletar a emissão de 521-565 nm.
- Repita os passos 2.1-2.3 para várias células e para a outra amostra #1 (doador somente) e amostra #3 (construção de conjunto de mCitrine-mCherry).
- Grave uma função de resposta do instrumento (IRF). Sintonizar o monocromador do detector de emissões para o comprimento de onda de excitação (por exemplo, registro de emissão de 510-550 nm) e em seguida, gravar uma imagem FLIM com o espalhamento volta de uma lamela de vidro limpo, clicando no botão Executar FLIM. Use o mesmo comprimento de onda de excitação (516 nm) e laser de potência, usado para a gravação dos dados célula passos 2.1-2.4.
Nota: Se vários picos são visíveis no IRF ou se não pode ser sintonizado a emissão monochromators, IRF pode também ser medido com uma solução de corante fluorescente com vida ultra rápida, por exemplo por fluorescência têmpera de um corante orgânico em um saturado aquoso solução de iodeto de potássio. Além disso, não é estritamente necessário para gravar um IRF, porque a inclinação da decadência dos histogramas de fluorescência também pode ser instalada sem deconvolução de IRF. No entanto, um IRF permite corrigir para as características de sincronismo do detector de fótons utilizado e, assim, faz os ajustes de histogramas a vida mais precisos.
3.Conversão das gravações Photon imagens FLIM
- Baixe e instale o software de conversão de PT32ICS5.
Nota: Os dados de tempo de vida também podem ser analisados por outros softwares, incluindo software de vários fornecedores de microscópio. - Configure o software de PT32ICS.
- Definir o tamanho de 256 × 256 pixels imagem tamanho através de configurações | Tamanho.
- Definir o canal 2 por configurações | Tamanho.
Nota: O canal das emissões mCitrine é exclusivamente dependente da configuração do microscópio. Um canal errado resultará em uma imagem FLIM com nenhum fótons (i.e., preto, imagem) e como resultado um vazio 'LifetimeTable.txt'-arquivo. O canal correto pode ser identificado por tentativa e erro. - Defina a saída como ImageJ (xyz) (ou TRI2 (xyt)) para gerar imagens FLIM (passo 3.4).
- Pressione converter e carregar um ou mais traços de fótons (os arquivos de .pt3). Para selecionar vários vestígios de fóton, mantenha a tecla Ctrl pressionada.
Nota: O formato de .ptu de 64 bits mais recente também pode ser convertido. - Certifique-se de que o software de PT32ICS gera os seguintes arquivos na mesma pasta onde os arquivos de pt3 são salvos: uma pilha de fótons por rastreamento de fóton .pt3 no formato padrão da citometria de imagem (ICS), arquivo de um bitmap por rastreamento de fóton de .pt3 (. bmp), um arquivo de texto por conversão (_Report.txt) contendo informações sobre as estatísticas de fóton (ou seja, o número total de fótons em cada traço de fóton de .pt3, o tempo de resolução do detector) e um segundo arquivo de texto por conversão (_LifetimeTable.txt) que contém o total histogramas de vida de fluorescência em formato delimitado por tabulação para cada traço de fóton de .pt3.
Nota: O arquivo ICS pode ser usado para um único pixel encaixe para gerar imagens FLIM, por exemplo, com TRI2 software12,13 ou a biblioteca em FIJI ImageJ14,15de encaixe de curva para SLIM. Este arquivo pode também ser usado para análise de fasor16, por exemplo com o plugin de tempo Gated fasor para FIJI de Spechron. O arquivo de bitmap não contém nenhuma informação de tempo de vida. O segundo arquivo de texto é usado para a análise FLIM de células inteiras na etapa 4.
4. montagem de histogramas de vida de fluorescência para análise de células inteiras FLIM
Nota: Este passo (montagem de IRF deconvoluted) requer o software capaz de caber deconvoluted. Encaixe as encostas dos histogramas de fluorescência sem deconvolução de IRF pode ser feito com outros softwares também.
- Abra o programa de software de análise de dados capaz de caber com deconvolução (Tabela de materiais) e importar o arquivo de texto contendo o histograma para cada traço de fóton (_LifetimeTable.txt) através de arquivo | Importação | Único ASCII.
- Reorganize a tabela tal que o IRF é na segunda coluna da tabela (usando copiar e colar). Coloque o IRF na segunda coluna B ao lado os valores de tempo na primeira coluna A.
- Determinar a qualidade dos traços gravados fóton selecionando todas as colunas pressionando Ctrl + A e selecionando enredo | Painel multi | 9 painel. Não analise vestígios de fótons com um pico de alta reflexão (Figura 4F).
- Selecione todas as colunas que contêm os histogramas de controle de qualidade de vida que serão equipados bem como o IRF na coluna B usando Ctrl chave e carregar a montagem não-linear através de análise de | Montagem | Ajuste não linear da curva | Abrir caixa de diálogo.
- Carregar a função de ajuste deconvoluted (disponível no arquivo complementar 1) adicionando essa função para o software de análise (através de categoria | Definidos pelo usuário | Função | Adicionar). Selecione o arquivo de ajuste função 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Esta função se encaixa os histogramas de vida de fluorescência com uma função de decaimento exponencial mono deconvoluted com o IRF (ou seja, a segunda coluna B na tabela) (equação 1):
(Equação 1)
com t o tempo, τ a fluorescência aparente vida, A amplitude e y0 o deslocamento.
Nota: Outra opção é para caber os histogramas de vida com uma função de ajuste bi-exponencial (equação 2):
(Equação 2)
Fixando-se o tempo de vida do componente lento (τ1) para a condição de único doador (passo 1.1.2: amostra #1) e que do componente rápido (τ2) para a construção em tandem (amostra #3), isto permite a estimativa da fração de Proteínas SNARE no complexo (F) a partir as amplitudes de lento (A1) e componentes rápidos (A2; ver discussão; Equação 3):
(Equação 3)
O arquivo de função ajuste de encaixe bi-exponencial deconvoluted 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' está disponível no arquivo complementar 2. - Selecione cabido curvas | Tipo de dados x como mesmo como dados de entrada.
Nota: Isto irá resultar no apropriado x-eixo dimensionamento das curvas do cabido. - Ajuste as curvas pressionando caber.
Nota: Isto irá converter o ajuste e gerar uma folha de' relatório' na matriz com uma tabela que contém o tempo de vida de fluorescência, deslocamentos e amplitudes. Ele também irá gerar uma folha de dados com as curvas cabidas e os resíduos do ajuste.
(Equação 1)
(Equação 2)
(Equação 3)Representative Results
A lógica do ensaio para medir interações SNARE por FRET-FLIM é mostrada na Figura 1. O C-termini das hélices transmembranares de cognatas proteínas SNARE é fundidos a um par de proteínas fluorescentes espectralmente deslocadas (por exemplo, mCitrine e mCherry). A formação de uma cis-SNARE complexo nos resultados da fusão da membrana nestas proteínas fluorescentes, tornando-se imediatamente justapostos uns aos outros e se IRRITE. A Figura 2 mostra imagens confocal representativas de células HeLa expressando proteínas SNARE fluorescente-labeled. Mostrado uma célula, manifestam a syntaxin 4-mCitrine (fluoróforo dador) com VAMP3-mCherry (aceitador fluoróforo), bem como condições de controle de células expressando apenas a syntaxin construção de 4-mCitrine (doador somente; nenhum traste) e syntaxin 3 fundido a ambos os mCitrine e mCherry em tandem (FRET expectable máxima). A Figura 3 mostra o tempo de vida de fluorescência que acompanha e imagens FLIM geradas por encaixe os histogramas de vida de cada pixel com funções de decaimento mono-exponencial (Figura 3A–.B) e bi-exponencial de decaimento funções ( Figura 3 - D). a figura 4A mostra o IRF de nossa configuração medida por dispersão de trás de um vidro de tampa de microscópio. Na Figura 4B–E, histogramas de vida representativo da fluorescência da célula toda análise FLIM junto com ajuste de acompanhamento são mostradas curvas para funções de mono-exponencial de decaimento. Figura 4F mostra um histograma de vida fluorescente de um experimento cuja imagem muito próximo à superfície do vidro para cobrir microscópio, resultando em um pico de reflexão proeminente. A Figura 4 mostra um histograma do tempo de vida com representante que se encaixam com uma função de decaimento bi-exponencial.
Figura 1: esquema da justificativa para a visualização de complexos SNARE por FRET. (A) modelo estrutural da proteína neuronal SNAREs (proteína de banco de dados 3HD717) associada a vesículas de membrana (VAMP) 2 (azul; R), syntaxin 1 (vermelho; Qa-SNARE) e SNAP25 (verde; contém ambos um motivo Qb e Qc-SNARE). O C-terminal da hélice transmembrana de syntaxin-1 é conjugado com mCitrine (fluoróforo dador; banco de dados de proteínas 3DQ118). O C-terminal da hélice transmembrana de VAMP2 é conjugado com mCherry (aceitador fluoróforo; banco de dados de proteínas 2H5Q19). (B) esquema de SNARE mediada por fusão da membrana resultando em FRET. Após a fusão da membrana pela formação de uma cis-complexo SNARE, as armadilhas são imediatamente justapostos uns aos outros resultando em FRET. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: expressão de proteínas SNARE fundidos para proteínas fluorescentes. Primeira coluna: fluoróforo dador, animado com 516 nm. Segunda coluna: aceitador fluoróforo, animado com 610 nm. (A) doador somente condição. Imagem confocal representativa de uma célula HeLa expressando syntaxin 4-mCitrine (fluoróforo dador; verde em direta). O canal de aceitador (segunda coluna) mostra a fluorescência cross-talk. (B) controle negativo (sem traste). Imagem confocal representativa de uma célula HeLa expressando ambos syntaxin 4-mCitrine com VAMP3-mCherry (aceitador fluoróforo; magenta em direta). (C) controle positivo (FRET expectable máxima). Construir uma imagem confocal representativa de uma célula HeLa expressando o tandem de 3-mCitrine-mCherry syntaxin. Note que o sinal de fluorescência do mCitrine e mCherry sinais faz não completamente sobreposição, provavelmente por causa de uma baixa resistência de mCitrine a degradação lisossomal comparada com mCherry (consulte a seção de discussão). BF: campo claro. Escala de bares, 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens FLIM de formação do complexo SNARE. (A) imagens de vida representativo da fluorescência das células mostradas na Figura 2. As imagens foram geradas pelo primeiro converter os vestígios de fóton gravados por um sistema TCSPC (.pt3) para a imagem cytometry padrão (ICS) utilizando o software PT32ICS. Único pixel equipado imagens então foram geradas usando o software de TRI212,13 com limites de 15-100% de intensidade, pixel binning circular 7 e algoritmo de ajuste de monoexponential (Marquardt) tempo de vida de fluorescência. A cor indica a média aparente vida fluorescente. (B) FLIM imagens onde as imagens do tempo de vida de fluorescência (mostrado no painel A) foram complicadas com as intensidades de fluorescência do fluoróforo dador de mCitrine (mostrado na Figura 2). A convolução foi realizada com FIJI ImageJ usando uma macro sob medida (consulte Tabela de materiais). (C) tempo de vida de fluorescência e FLIM imagens da célula HeLa expressando tanto syntaxin 4-mCitrine e VAMP3-mCherry de painéis A-B, mas agora com encaixe com curvas de decaimento bi-exponencial (com vidas que fixa as condições de controle; ver passo em 4,4 Protocolo). As cores de pixel indicam as frações estimadas F de syntaxin 4 em complexo com VAMP3 (equação 3). (D) caber igual painel B, mas para o bi-exponencial. A convolução foi realizada com FIJI ImageJ usando uma macro sob medida (consulte Tabela de materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: toda célula análise FLIM. (A) a função de resposta do instrumento (IRF) da instalação. O IRF foi medido utilizando o espalhamento volta na interface água-de-vidro (usando um prato de microscopia limpa vidro contendo água).(B–E) Toda célula histogramas de vida para as células, mostradas na Figura 2 e Figura 3. Todos os fótons presentes nas imagens foram agrupados. As curvas foram deconvoluted com o IRF e equipadas com funções de decaimento mono-exponencial (equação 1). Para essas células, vidas de fluorescência foram obtidas de 2,82 ns (células expressando apenas syntaxin 4-mCitrine; doador somente; painel B), 2.09 ns (células expressando co syntaxin 4-mCitrine com VAMP3-mCherry; painel C) e 2,08 ns (células expressando a syntaxin 3 - mCitrine-mCherry em tandem construir; controle FRET expectable máxima; painel D). Os embutimentos mostram os mesmos gráficos, mas agora com escala logarítmica do eixo y. Painel E mostra uma sobreposição das curvas de decaimento de painéis B-D. (F) exemplo de um histograma do tempo de vida fluorescente gravado perto demais para a superfície de deslizamento da tampa do microscópio. Isso resulta em um pico de grande reflexão (representado pela área sombreada amarela). (G) mesmo que painel C, mas agora encaixe com uma curva de decaimento bi-exponencial com vidas fixa as condições de controle (consulte a etapa 4.4 no protocolo). As amplitudes de jejum (A1) e lento (A2) componentes foram 14,42 e 0,01, respectivamente, resultando em uma fração de estimado de armadilhas no complexo F de 0,99 (equação 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar arquivo 1. Arquivo de função FLIM_convoluted_IRF por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Complementar arquivo 2. Arquivo de função FLIM_convoluted_IRF_biexp por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Este protocolo demonstra o uso do FRET-FLIM para visualização de interações SNARE entre syntaxin 4 e VAMP3 em células HeLa vivas. Syntaxin 4 é uma proteína de Qa-SNARE localização predominantemente na membrana plasmática onde ele Medeia exocitose1,2,20,21. VAMP3 é um R-SNARE, que é descrita principalmente para localizar a reciclagem CDDP compartimentos e Medeia tráfico para outros endossomos, bem como para a membrana plasmática1,2,20. No entanto, o ensaio de FRET-FLIM pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas SNARE. A única condição é que essas armadilhas contêm uma hélice transmembrana do C-terminal, que é o caso para a maioria das proteínas SNARE por longe1,2. Além disso, o protocolo descrito aqui pode ser adaptado para visualização de complexos SNARE em qualquer tipo de célula eucariótica, incluindo plantas e leveduras. Neste protocolo, usamos o encurtamento do tempo de vida de fluorescência do fluoróforo dador como uma medida de traste. Como uma abordagem complementar, o tempo de vida de fluoróforo o aceitador poderia ser analisado, porque a emissão sensibilizada causa uma fase de ascensão distintas que fornece prova inequívoca essa transferência de energia de ressonância ocorre.
Atualmente, a técnica de FRET-FLIM não poderá visualizar complexos SNARE em compartimentos dos lisossomos. Para a construção de 3-mCitrine-mCherry em tandem syntaxin, a fluorescência de mCherry pode ser encontrada mais acumulada em uma área de juxtanuclear, que provavelmente corresponde a compartimentos de depósito lisossômicas, Considerando que o sinal de mCitrine é mais abundante no celular periferia5. Um acúmulo de juxtanuclear semelhante de mCherry comparado com mCitrine observou-se, quando as mesmas proteínas SNARE fundidas para estas proteínas fluorescentes foram expressas co5. Lisossomos são caracterizados por um extremamente baixo pH (< 4) e uma alta atividade de enzimas proteolíticas. O acúmulo de juxtanuclear de mCherry é provavelmente causado por uma resistência mais elevada do fluoróforo mCherry a degradação lisossomal, em comparação com o fluoróforo mCitrine. Não é devido ao pH-têmpera de mCitrine, como acúmulo de juxtanuclear de mCherry também ocorre após a fixação das células5. Assim, a técnica de FRET-FLIM subestima a quantidade de FRET nas regiões juxtanuclear (lysosomal) e isso exigiria outras proteínas fluorescentes repórter que sobrevivem as condições adversas de lisossomos dentro os lúmens.
FRET-FLIM em princípio permite para obter uma estimativa quantitativa (semi-) da fração de armadilhas em complexo de5. Como explicado no presente protocolo, isto requer a instalação dos histogramas de vida de fluorescência com funções de decaimento exponencial-Duplo (equação 2), onde a amplitude do componente rápido é proporcional a fração de armadilhas no complexo ( Equação 3). No entanto, tal encaixe com um modelo de dois componentes é tecnicamente desafiador. Montagem com vários parâmetros de ajuste livre (dois tempos de vida de fluorescência e duas amplitudes) requer um grande número de fótons, especialmente desde que os parâmetros influenciam uns aos outros e pequenos erros em tempo de vida afetará as amplitudes e vice versa. Para superar estes problemas de montagem, os tempos de vida de fluorescência do componente lento podem ser corrigidos para o tempo de vida da única condição doador (ou seja, não FRET; só mCitrine presente) e que o componente rápido para o tempo de vida do tandem construir ( FRET expectable máxima). No entanto, isto também deve ser interpretado com cuidado, porque os tempos de vida de fluorescência podem não ser o mesmo que esses Estados de controle e podem desviar-se por causa de vários motivos (auto que extingue, orientação do dipolo, variações no microambiente). Vários complexos SNARE nas proximidades (< 10 nm) pode resultar em traste dependente da distância, o mesmo princípio que permite FRET ser usado como uma "régua molecular", mas neste caso, obscurece a quantificação de complexos SNARE. Além disso, uma estimativa quantitativa não é sempre significativa, porque as ciladas rotuladas competem com endógenas SNAREs (sem rótulo). Como consequência, o nível de expressão de mCherry-rotulado SNARE é um determinante principal para o percentual FRET5. Por causa de todas essas advertências, é recomendável para caber os histogramas de vida fluorescente com uma função de decaimento mono-exponencial (equação 1). Isto tem a vantagem que não exige qualquer conhecimento a priori de tempo de vida e a vida fluorescente média aparente resultante fornece uma medida sólida para SNARE complexantes5.
No entanto, espera-se que a imagem de FRET-FLIM quantitativa por modelos de encaixe do dois-componente terá potentes aplicações futuras. LAÇO-codificação de genes dentro do cromossomo podem ser fundidos com proteínas fluorescentes repórter, por exemplo pelo CRISPR/CAS9. Isso resulta na rotulagem fluorescente de endógenas proteínas SNARE, com níveis de proteína endógena e sem fundo de armadilhas sem rótulo e desse modo permite uma estimativa quantitativa significativa da fração de complexos SNARE por FRET-FLIM. Enquanto os níveis de expressão de armadilhas endógenas podem ser bastante baixo e dar relativamente baixos sinais fluorescentes, espera-se que um número suficiente de fótons pode ser obtido, especialmente para a célula inteira FLIM (que requer apenas alguns 1, 000s de fótons). Além disso, estas medições FRET-FLIM podem ser executadas com detectores de fotodiodo avalanche mais sensíveis que também resultará em sinais de fluorescência maiores e melhor estatística de fóton.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Hypatia da Radboud University Medical Center, um prêmio de desenvolvimento de carreira do programa ciência humana da fronteira, a gravitação Programa 2013 da organização de países baixos para a investigação científica (NWO; ICI-024.002.009), um VIDI conceder da NWO (ALW VIDI 864.14.001) e uma bolsa a partir do Conselho Europeu de investigação (CEI), no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (Grant acordo número 336479).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
| Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
| Hela cells | |||
| 35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
| Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
| Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
| Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
| Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
| PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
| data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
| Fiji ImageJ | |||
| Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
| Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
| EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
| NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |
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