Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinere kemisk Cross-linking og massespektrometri af intakt proteinkomplekser at studere arkitektur af multi subunit Protein forsamlinger

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56747
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Interdisciplinary research center HALOmem, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Chemistry, Kings College London
* These authors contributed equally

Summary

Arkitektur af proteinkomplekser er afgørende for deres funktion. Kombinere forskellige massespektrometriske metoder vist sig magtfulde at studere deres forsamling. Vi leverer protokoller for kemiske cross-linking og indfødte massespektrometri og viser hvordan disse supplerende teknikker bidrage til at belyse arkitektur af multi subunit protein forsamlinger.

Abstract

Proteiner interagere med deres ligander form aktiv og dynamisk forsamlinger, som udfører forskellige cellulære funktioner. Belyse disse interaktioner er derfor grundlæggende for forståelsen af cellulære processer. Men mange proteinkomplekser er dynamisk forsamlinger og er ikke tilgængelige af konventionelle strukturelle teknikker. Massespektrometri bidrager til den strukturelle undersøgelse af disse forsamlinger, og især kombinationen af forskellige massespektrometriske metoder leverer værdifuld indsigt i deres strukturelle arrangement.

I denne artikel, vi beskriver anvendelsen og kombination af to supplerende massespektrometriske metoder, nemlig kemiske cross-linking kombineret med massespektrometri og indfødte massespektrometri. Kemiske cross-linking involverer kovalent sammenkoblingen af aminosyrer i umiddelbar nærhed af ved hjælp af kemiske reagenser. Efter fordøjelse med proteaser, tværbundet di-peptider er identificeret ved massespektrometri og protein interaktioner websteder er udækket. Indfødte massespektrometri er til gengæld analysen af intakt protein forsamlinger i gasfasen af et massespektrometer. Det afslører protein stoichiometries samt protein og ligand interaktioner. Begge teknikker derfor levere supplerende oplysninger om strukturen af protein-ligand forsamlinger og deres kombination viste sig magtfulde i tidligere undersøgelser.

Introduction

Den strukturelle undersøgelse af protein forsamlinger er blevet særlig vigtig for forståelsen af cellulære processer. Derfor, mange teknikker har udviklet og forbedret i strukturbiologi1. Men disse teknikker er undertiden begrænset i deres ansøgning på grund af størrelse, fleksibilitet eller heterogenitet af proteinkomplekser under undersøgelsen. Massespektrometri kan håndtere disse udfordringer, og derfor opstod som et kraftfuldt værktøj i strukturbiologi2,3,4,5. Den største fordel ved massespektrometri, men er evnen til at utvetydigt identificere proteiner selv i komplekse og heterogene blandinger6. Med henblik herpå, proteiner er normalt fordøjes med endoproteinases og den resulterende peptid blanding er adskilt af væskekromatografi og direkte elueret i den massespektrometer. Peptid masserne bestemmes efterfølgende og forløber ioner er markeret for yderligere fragmentering af peptider. Proteiner er derefter identificeres ved søgning peptid og tilsvarende fragment masserne mod en kendt database. Denne procedure ikke kun tillader identifikation af peptider/proteiner, men også deres posttranslationelle modifikationer, som forårsager en masse Skift forløber peptider og fragmentioner transporterer ændring7. Nogle af de mange teknikker i strukturelle massespektrometri er baseret på dette princip4,8. For eksempel, fod mærkning teknikker såsom brint deuterium exchange9,10, kemiske mærkning strategier11,12, eller hydroxyl radikale udskrivning13,14 , give indsigt i den overflade tilgængelighed af proteiner under visse betingelser.

En anden teknik er (kemiske) danne tvaerbindinger, der involverer kovalent sammenkoblingen af aminosyrer i umiddelbar nærhed af gennem deres funktionelle grupper. For dette er kemiske reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyrer ansat15,16. Efter danne tvaerbindinger, proteiner er normalt hydrolyseret med proteaser og krydsbundet di-peptider er analyseret af liquid chromatography-koblet massespektrometri. Identifikation af tværbindingsmidler produkter-databasen til søgning, men kræver brugen af specialiseret software, som sammenkæde peptid sekvenser af forskellige proteiner og forskelligartede regioner17,18,19. Brugen af kemiske cross-linkers har den fordel, at det kan anvendes til næsten alle protein kompleks af interesse og ikke kræver indarbejdelse af UV-activatable aminosyrer, som kun kan opnås, når at udtrykke protein af interesse i værtsceller. Som sådan cross-linking er et alsidigt værktøj og var med held ansat i mange strukturelle undersøgelser af selv store protein forsamlinger20.

Massespektrometri af intakt proteinkomplekser (undertiden kaldet 'native' massespektrometri), på anden side indebærer analyse af intakt proteiner og proteinkomplekser uden hydrolyse til peptider. Det afslører sammensætning, heterogenitet, støkiometrisk, topologi og subunit vekselvirkninger mellem protein komplekser21,22. I kombination med ion mobilitet tillader indfødte massespektrometri yderligere bestemmelse af deres kropsbygning23,24. Dette gør det et stærkt værktøj til den strukturelle undersøgelse af proteinkomplekser, der er vanskelige at vurdere af konventionelle strukturelle teknikker. Men indfødte massespektrometri kræver analyse buffere, der fastholder ikke-kovalente protein interaktioner under electrospray Ionisation. Dette opnås normalt ved hjælp af vandig, flygtige buffere såsom ammonium acetat25. Derudover er instrument ændringer nødvendige for at undgå dissociation under transmission i gasfasen af massespektrometer26. Anvendes på denne måde, blev mange (store) proteinkomplekser analyseret. Imponerende eksempler er studier af intakt ribosomer27, ATP synthases28eller vira29.

Kombinationen af indfødte massespektrometri og danne tvaerbindinger succes især i tidligere undersøgelser. For eksempel, stoichiometries af anstandsdame komplekser, herunder en uventet Hsp70 dimer, kunne være fremstillet af massespektrometri eksperimenter af intakt proteinkomplekser, mens kemiske cross-linking afslørede ordningerne af proteiner i den assemblies30,31. I en anden undersøgelse, blev virkningerne af posttranslationelle modifikationer på en intakt ATPsyntase komplekse undersøgt. Native massespektrometri givet indsigt i protein kompleks stabilitet i tilstedeværelse eller fravær af fosforylering eller acetylation32,33. En sammenlignende tværbindingsmidler strategi34 afslørede derefter konformationelle ændringer af protein kompleks under forskellige forhold.

Her give vi protokollerne for protein identifikation af massespektrometri, (kemiske) cross-linking og indfødte massespektrometri, herunder data-analyse og fortolkning (figur 1). Kombinationen af supplerende resultaterne fra disse metoder ved hjælp af to godt karakteriseret proteinkomplekser er demonstreret35. Vores protokol kan anvendes til enhver protein forsamling, som kan renses på visse renhed og koncentration. Metoden er i nogle tilfælde begrænset af dataanalyse for danne tvaerbindinger data, dvs, størrelsen af databasen ansat, som bestemmer den krævede Søg tid og rum. Derudover manuel validering af konstaterede cross-links er ofte nødvendig og yderligere reducerer produktionen. Native massespektrometri er for det meste begrænset af prøven kvalitet, fx, buffere og adukter anvendes under rensning og mulighed for at udveksle dem af vandige og flygtige buffere. Proteinkomplekser renset for strukturel analyse normalt har dog kvalitetskrav for vellykket analyse med vores protokoller.

Protocol

1. rensning af proteinkomplekser

  1. Forberede proteinkompleks ifølge optimeret standardprotokoller.
    Bemærk: Protokollen er vist her med RvB1/B2 komplekse fra Chaetomium thermophilum og carbamoyl phosphat synthetase (CPS) fra Escherichia coli. RvB1/B2 og CPS blev renset som beskrevet36,37. Hver protein kompleks kræver en individuel rensning protokol. Tilpasse protokollen i overensstemmelse hermed. Amine-fri buffere fosfatbufferet saltopløsning (PBS) eller 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syre (HEPES) bør anvendes til kemiske cross-linking. Erstatte bufferen under rensning evt.
    Forsigtig: Anvend ikke nogen metoder eller reagenser, der forstyrrer den indfødte forsamling af protein kompleks.

2. massespektrometri-baseret Protein identifikation

  1. Gelelektroforese
    Bemærk: Der findes forskellige gel-systemer og hvert laboratorium anvender sin egen opsætning. Justere betingelser ifølge gel system. Bære handsker og laboratoriekittel hele protokollen som keratiner er blandt de mest almindelige forureninger i massespektrometrisk analyse.
    1. Anvende 7,5 µL 4 x prøvebuffer og 3 µL 10 x reduktionsmiddel (slutkoncentration 50 mM dithiothreitol (DTT)) til 20 µL protein stikprøve. Bruge 10 µM CPS eller 2,5 µM RvB1/B2. Spin ned til 1 min på 16.200 × g og varme i 10 min. ved 70 ° C.
      Bemærk: Når ved hjælp af en anden gel system justere krævede mængder og varme temperaturer.
    2. Forberede en 4-12% gradient gel elektroforese. Fortyndes den kørende buffer 20 gange med vand og fylde elektroforese kammer. Brug 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer for proteiner af mindre molekylvægt (2-200 kDa) og 3-(N-morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER) buffer for større proteiner (14-200 kDa). Tilføje 0,5 mL antioxidant til indre kammer.
      Bemærk: Når ved hjælp af en anden gel system forberede kører buffer og gel ifølge producentens protokoller.
    3. Indlæse en egnet protein markør (pre farvede, unstained, forskellige molekylære størrelser) i den første hulrum og indlæse protein prøver i resterende hulrum.
    4. Separat proteiner i 35 min. (MES) eller 50 min. (MOPPER) ved 200 V.
      Bemærk: Justere elektroforese gange og spænding for forskellige gel-systemer.
    5. For at pletten protein bands, overføre gel i en gel farvning boksen og dække gel med en vandbaseret Coomassie farvning løsning. Der inkuberes natten over og ved stuetemperatur på en vandret gel shaker.
    6. Destain gel ved at erstatte Farvningsopløsningen med vand. Gentag dette trin flere gange (ca 3 - 5 gange) indtil gel baggrunden vises tydeligt.
  2. I-gel fordøjelsen
    Bemærk: For at undgå kontaminering, brug HPLC grade opløsningsmidler i hele fordøjelsen protokollen og for alle følgende trin (dvs., massespektrometrisk analyse). Forberede alle løsninger før brug og filtratet vand og ammoniumbicarbonat.
    1. Cut protein bands, der er visualiseret ved blå Coomassie pletter fra gel ved hjælp af en skalpel. Skær forsigtigt protein bands i små stykker af ca 1 mm × 1 mm. Skyl skalpel med vand mellem forskellige protein bands. Vaske gel bands med vand og acetonitril (ACN).
    2. Reducere disulphide obligationer med DTT, alkylatbenzin cystein rester med iodoacetamide og fordøje proteiner med trypsin som tidligere beskrevet38; normalt bruges en enzym: protein-forhold på 1:20 op til 1: 100. Bruge 100 mM ammoniumbicarbonat under fordøjelsen protokol.
    3. Uddrag peptider i to trin.
      1. Først Inkuber gel stykker med ammoniumbicarbonat og ACN, og indsamle peptid-holdige supernatanten. For det andet Inkuber gel stykker med 5% (v/v) myresyre og ACN. Inkuber i 15 min. ved hvert trin. Kombinere begge analysere. Tør de udpakkede peptider ved fordamper opløsningsmidler i en vakuum centrifuge.
        Bemærk: Tørret peptider kan opbevares ved-20 ° C i flere måneder.
  3. Liquid chromatography-koblet massespektrometri
    1. Opløses de tørrede peptider i 2% ACN/0.1% myresyre. Opløses peptider i en sonikering bath for 2-3 min. og spin ned i en centrifuge på 16.200 x g i 30 min. overførsel prøverne i autosampler hætteglas.
      Bemærk: Justere lydstyrken efter protein beløb. For godt farvede Coomassie bands bruger vi 20 µL.
    2. Indsprøjtes 5 µL af prøven til nano-LC-MS/MS systemet ved hjælp af autosampler. Indlæse peptid blandingen på en omvendt fase C18 pre kolonne, (C18, 150 µm I.D., 2 cm, 5 µm porestørrelse) til desalt og koncentrere peptider online.
    3. Bruge 0,1% (v/v) myresyre som mobil fase A og 80% ACN/0.1% (v/v) myresyre som mobil fase B. separat peptider på en omvendt fase C18 analytiske kolonne (C18, 75 µm I.D., 50 cm, 3 µm porestørrelse) ved hjælp af en gradient i 4-80% B (der indeholder 0,1% myresyre) på 300 nL / min over 65 min.
      Bemærk: En nanospray ion kilde bruges til at overføre elueret peptider til den massespektrometer.
    4. Bruger (typisk) MS betingelser: spray spænding på 1,6 kV; kapillar temperaturen på 250 ° C; normaliserede kollisionen energi af 30. Betjene massespektrometer i data-afhængige tilstand.
    5. Erhverve MS-spektre i den masse analyzer (fx, orbitrap) (m/z 350−1, 600) med en opløsning på 70.000 og en automatisk gain control mål 3 x 106. Vælg 20 af de mest intense ioner til HCD fragmentering ved en automatisk gain control mål 1 x 105. Dynamisk markerede udelukke tidligere ioner til 30 s. udelukke enkeltvis opkrævet ioner samt ioner med ukendt afgift tilstand.
      Bemærk: Intern kalibrering af de massespektre blev udført ved hjælp af lås masse indstilling39.
  4. Databasen søgning
    Bemærk: Der er forskellige software tilgængelig for søgning i databasen. MaxQuant40, for eksempel, er frit tilgængelige.
    1. Konvertere .raw-filer til .mgf-filer ved hjælp af en pXtract conversion tool (http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html).
    2. Udføre databasesøgning ved hjælp af typiske søgeparametre: Database, swissprot; peptid masse tolerance, 10 ppm; fragment masse tolerance, 0,5 Da; enzym, trypsin; ubesvarede kavalergang websteder, 2; variabel ændringer, carbamidomethylation (cystein) og oxidation (methionin).
      Bemærk: Ændre søgeparametrene overensstemmelse med eksperimentelle indstillingerne.
    3. Inspicere database søgeresultat. Vurdere protein score, antallet af peptider identificeret, peptid scores og masse nøjagtighed; sekvens dækning returnerer protein dækning identificeret.
      Bemærk: Hver søgemaskine har sin individuelle scoring algoritme. Evaluere peptid pointsystem af kvaliteten af de tandem massespektre observeret. De vigtigste signaler af en god spektrum skal vise (komplet) ion serien til at kontrollere den påviste peptid. Normalt peptid score er baseret på sandsynlighed, dvspeptid score er et mål for hvor sandsynligt identificerede peptid rækkefølgen matcher den opnåede spektrum. Protein score er sædvanligvis udvundet fra peptid scores og bruges til at rangere en protein i en liste af identificerede proteiner.

3. massespektrometri af intakt proteinkomplekser (Native massespektrometri)

  1. Forberedelse af guld-belagte udledere for electrospray Ionisation
    1. Bruge en mikropipette aftrækker til at forberede nanoflow udledere fra glas kapillærer som tidligere beskrevet25,41. Bruge borosilicate kapillærer med en indre diameter på 0,78 mm.
      Bemærk: Ved at ændre parametrene for nål trække, tip form og størrelse kan ændres og justeret for prøven. Kapillærer med forskellige indre diameter og væg tykkelse er tilgængelige.
    2. Coat glas kapillærer med ledende materiale (f.eks., guld eller palladium); Brug af en sputter coater genererer en guld plasma er fælles. Følg producentens anvisninger til at opnå god kvalitet belægning.
      Bemærk: Belægningen skal være tilstrækkelige nok til at opnå en stabil spray, når du anvender fælles kapillær spændinger (se nedenfor).
  2. Prøveforberedelse til native massespektrometri
    Bemærk: Salte, rengøringsmidler eller store mængder af glycerol er ikke kompatible med electrospray Ionisation. Derfor, rensning buffer er udvekslet ved en flygtig, vandig buffer. 200 mM ammoniumacetat er almindeligt anvendt. Brug størrelse udstødelse spin kolonner eller ultrafiltrering enheder til buffer exchange. I nogle tilfælde, kan komplekse stabilitet eller aktivitet påvirkes af buffer exchange. Evaluere de massespektre omhyggeligt og kontrollere aktiviteten af komplekset. Tilføje cofaktorer eller tilsætningsstoffer til analyse buffer, hvis nødvendigt.
    1. Bruge størrelse udstødelse spin kolonner for hurtig buffer exchange. Fjern opbevaring buffer ved centrifugering ved 1.000 x g og 4 ° C i 1 min. kassér flow gennem. Vaskes tre gange ved at tilføje 500 µL 200 mM ammoniumacetat, efterfulgt af centrifugering. Indlæse 20 µL af protein prøven over på kolonnen og centrifugeres ved 1.000 x g og 4 ° C i 4 min.
      Bemærk: Koncentrationen af protein kompleks skal være 1-10 µM. Proceduren kan gentages, hvis ikke-flygtige komponenter stadig forstyrrer analysen.
    2. For at koncentrere protein prøven og udveksle bufferen i det samme eksperiment bruge centrifugal filtre. Bruge en filtrering membran af pore størrelse 50% mindre end størrelsen af de proteiner, der analyseres.
      1. Overføre protein prøven til filtrering enhed og tilføje 200 mM ammoniumacetat. Spin ned på 15.000 x g og kassér flow gennem. Tilføje 200 mM ammoniumacetat og gentage centrifugeringen. Gentag dette trin, flere gange. Følg producentens anvisninger for centrifugering hastighed. Udføre centrifugering ved 4 ° C.
        Forsigtighed: Membranproteiner tendens til at udfælde på membranen af filter enhed.
  3. Massespektrometrisk analyse af intakt proteinkomplekser
    Bemærk: Der er forskellige typer af massespektrometre fra forskellige producenter, der kan ændres til oprindelig massespektrometri, f.eks, Quadrupol time of flight (Q-ToF) massespektrometre eller orbitrap massespektrometre. Protokollen beskrevet nedenfor blev udført på en Q-ToF instrument.
    1. Placere en guld-belagt kapillær i kapillær indehaveren og fylde kapillar med 1-4 µL af protein prøve. Åbn spidsen af nålen med en pincet.
    2. Tilslut kapillær indehaveren med nano-electrospray kilde og justere den kapillære holdning. Placer spidsen af kapillar på 0,5-1,5 cm til kegle blænde. Brug 80-150 L/t nanoflow gas til at indlede Sprayen og justere gasstrømmen for at opretholde en stabil spray.
    3. Justere parametre i tune-siden af Q-ToF instrument. Typisk starter betingelser er: kapillær spænding, 1,50 kV; kegle spænding, 80 V; Lens 1 radiofrekvensenergi, 80 V; kollisionen energi, 20 V; Aperture 3, 13.6 V. ændre disse parametre for at få god massespektre. Start erhvervelse ved at klikke på knappen "erhverve" og kombinere så mange scanninger som muligt for at få en god masse spektrum.
      Bemærk: Anbefaler vi at kombinere mindst 100 scanninger.
  4. Tandem massespektrometri af intakt proteinkomplekser
    1. Erhverve den masse spektrum, som beskrevet ovenfor (protokollen afsnit 3.3). Vælg en forløber ion af et proteinkompleks.
    2. Skifte fra MS til MS/MS tilstand i filen erhvervelse. Indstille MS/MS valg til forløberen masse.
    3. Start erhvervelse på lav kollisionen energi. Kombinere flere scanninger (ca. 20 scanninger) for at bekræfte valget af den korrekte forløber masse. Øge kollisionen energi, indtil de proteinkompleks dissocieres. For at opnå god massespektrum kombinere mindst 500 scanninger.
      Bemærk: Strippet komplekser undertiden har lav intensitet. Kombinere så mange scanninger som muligt kan øge opløsning og signal / støj forholdet.
  5. I-løsning dissociation af intakt proteinkomplekser
    Bemærk: For at få yderligere indblik i protein interaktioner i proteinkomplekser, i løsning dissociation kan udføres.
    1. Forberede protein prøven, som beskrevet ovenfor (afsnit 3.2). Tilføje opløsningsmidler til eksemplet protein eller ændre pH for at adskille intakt komplekser i sub komplekser. Typiske opløsningsmidler er methanol, isopropanol og ACN; ændre pH i ammoniumacetat ved tilsætning af eddikesyre eller ammoniakopløsning. Erhverve massespektre, som beskrevet ovenfor (afsnit 3.3 og 3.4).
    2. Variere mængden af opløsningsmiddel eller rækken pH til at generere forskellige sub komplekser. Typisk, mængden opløsningsmiddel er 5-50% (endelig koncentration) og en typisk pH er 4-9. Start med en lav koncentration af opløsningsmidler (5%) eller små ændringer i pH og erhverve massespektrum (Se afsnit 3.3).
    3. Øge mængden af opløsningsmiddel eller ændre pH trinvis indtil sub komplekser er genereret i løsning. Erhverve massespektre for at analysere sub komplekser.
  6. Kalibrere data
    Bemærk: Erhvervede massespektre er kalibreret eksternt ved hjælp af cæsium Iodid (CsI) løsning.
    1. 100 mg CsI i 1 mL vand opløses.
    2. Erhverve massespektrum af CsI. Variere kollisionen energi for at få CsI klynger over samme m/z serie som protein kompleks analyseret ovenfor.
      Forsigtig: CsI hurtigt udfældes på emitter spids og forurener kegle. Erhverve kun så mange scanninger som kræves for at få et tilstrækkeligt spektrum. Fjerne udleder fra kilden, når du er færdig.
    3. Gøre en kalibrering fil ved hjælp af den erhvervede masse spektrum og en CsI reference fil.
    4. Gælde erhvervede massespektre kalibrering.
      Forsigtig: Kalibrering af massespektre kan være en permanent ændring af de rå data. Hvis ikke-kalibreret spectra er nødvendigt, gøre en back-up kopi af filen.
  7. Databehandling og analyse
    Bemærk: Der er mange frit tilgængelige softwareværktøjer til dataanalyse af indfødte massespektre; for eksempel, Massign42 eller UniDec43. Protokollen nedenfor beskriver manuel dataanalyse med hjælp af instrument software samt brugen af Massign til komplekse prøver. Denne software er velegnet til analyse af komplekse massespektre. Følg instruktionerne online for brug af programmet (http://massign.chem.ox.ac.uk/).
    1. Til dataanalyse, glat spectra ved at justere udjævning parametre. Barycentrum spectra ved at justere parametre. Beregne komplekse masserne fra to tilstødende toppe af protein kompleks ' peak kuvert bruger instrument softwareværktøjer.
      Forsigtig: For intensiv udjævning kan medføre tab af data (f.eks., tab af bundet ligander).
    2. Analyse med Massign42, generere en top liste for den masse spektrum. Linearize datapunkter af spektret og glat. Bruge de forskellige software-værktøjer til at tildele proteinkomplekser, beregne komplekse sammensaetning eller simulere komplekse peak konvolutter.

4. kemiske cross-linking sammen med massespektrometri

Bemærk: Der findes mange tværbindingsmidler strategier. Her, beskriver vi brugen af Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), en Amin-reaktiv tværs linker, som er almindeligt anvendt til at undersøge protein-protein interaktioner.

  1. Opløse 1,43 mg BS3 i 100 µL vand til at forberede en 25 mM stamopløsning.
    Bemærk: Andre reagenser som disuccinimidyl suberate (DSS) er ikke vandopløselige og er normalt opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Nogle cross-linkers er også tilgængelige i tunge brændselsfremstilling mærket former. Indarbejdelse af tunge stabile isotoper genererer peak par af krydsbundet di-peptider i MS-spektre, som hjælper under datavurdering. Når du bruger varierende mærket cross-linkers, er stamopløsninger af begge varianter forberedt og blandes 1:1.
    Forsigtig: For at undgå dissociation af proteinkomplekser af DMSO, en højt koncentreret stamopløsning forberedes og fortyndes med vand eller buffer inden den tværbindingsmidler reaktion.
  2. Tilføje BS3 til protein kompleks. Bruge forskellige mængder af BS3 spænder fra 0,5-5 mM til at identificere optimale tværs linker koncentration. Inkuber reaktion blandinger ved 25 ° C i 1 time i en thermomixer. Brug 4-12% gradient geler og udføre SDS-PAGE for at vurdere tværbindingsmidler resultater (Se figur 2 for et eksempel).
    Bemærk: Optimal koncentration af BS3 er nået, når højere molekylvægt protein bands, der ikke er synlige i den ikke-cross-forbundne kontrol, er opnået under SDS-PAGE, mens enkelt underenheder er stadig synlige (figur 2).
  3. Gentag den tværbindingsmidler reaktion med den optimale BS3-koncentration. Inkuber reaktion blandinger ved 25 ° C i 1 time i en thermomixer.
    Bemærk: Nogle proteinkomplekser er ikke stabilt ved stuetemperatur. Den tværbindingsmidler reaktion kan også udføres på isen; reaktionstiden skal dog justeres.
  4. Slukke den tværbindingsmidler reaktion ved at tilføje Amin buffer (f.eks.50-100 mM Tris buffer, pH 7,5, endelige koncentration) eller udføre ethanol nedbør for at fjerne enhver resterende tværbindingsmidler reagens.
    1. Tilføj vand eller buffer til reaktionsblandingen til at nå en endelige mængden af 200 µL. tilføje 600 µL iskold ethanol og 20 µL 3 M natriumacetat, pH 5.3. Blandes grundigt, og der inkuberes ved-20 ° C i 2 timer eller natten over.
      Bemærk: Alternativt proteiner kan være fældet på 80 ° C i 30 min. eller i flydende nitrogen.
    2. Spin ned på 16.200 x g og 4 ° C i 30 min. Fjern forsigtigt supernatanten.
    3. Vask pellet med 1 mL iskold 80% (v/v) ethanol. Spin ned på 16.200 x g og 4 ° C i 30 min. Fjern forsigtigt supernatanten. Tørre pellet i et vakuum centrifuge.
  5. Udføre SDS-PAGE af de krydsrefererede proteiner. Skære gel bands og fordøje protein i-gel som beskrevet ovenfor (afsnit 2.1 og 2.2).
    Bemærk: I løsning fordøjelsen kan også udføres, dog, det kræver normalt yderligere adskillelse trin (f.eks., størrelse udstødelse kromatografi af fordøjet peptider).
  6. Udføre liquid chromatography-koblet massespektrometri, som beskrevet ovenfor (afsnit 2.3). Som krydsbundet peptider er normalt lav rigelige, gælder følgende variationer til massespektrometrisk analysen til at øge analytiske dybde af krydsbundet prøven.
    1. Bruge længere forløb under væskekromatografi adskillelse (f.eks.90 min. i stedet for 65 min, se ovenfor).
    2. Udelukke de dobbelt opladet peptider fra HCD fragmentering.
      Bemærk: Dobbelt opladet peptider er normalt intra-Cross-Country-linked peptider ("løkke peptider" eller "type 1" cross-links).
    3. Når du bruger varierende mærket tværbindingsmidler reagenser, bruge indstillingen "peak picking" under analysen, dvs., HCD fragmentering udløses ved tilstedeværelsen af peak par af definerede masse forskel i de massespektre.
      Bemærk: "peak picking" valgmulighed kan ikke være tilgængelig på hver massespektrometer.
  7. Brug pLink software18 for identifikation af krydsbundet di-peptider. Bruge minimeret databaser til identifikation. Typiske søgeparametre er: instrument spektre, HCD; enzym, trypsin; Max. ubesvarede kavalergang websteder, 3; variabel ændringer, oxidation (methionin) og carbamidomethylation (cystein); tværs linker, BS3; min. peptid længde, 4; Max. peptid længde, 100; min. peptid masse, 400 Da; Max. peptid masse, 10.000 Da; FDR, 1%.
    Bemærk: Når du bruger varierende mærket cross-linkers, masse stigningen skyldes linker skal konfigureres. Der er også andre almindeligt anvendte software til cross-link identifikation, fx, xQuest17, MassMatrix19, eller XlinkX15.
  8. Evaluere database ransage resultater af kvaliteten af fragmentering spektre. Acceptabel spektre af cross-links bør vise ion række begge peptider (mindst 4 tilstødende ioner) på en rimelig signal / støj-forhold.
    Bemærk: Når du bruger varierende mærket tværbindingsmidler reagenser, peak par i MS-spektre kan bruges som en ekstra kvalitetskontrol.
  9. Hvis det er påkrævet, visualisere tværbindingsmidler resultaterne i protein interaktion netværk ved hjælp af softwareværktøjer (f.eks.XVis, XiNET). Brug bar parceller eller cirkulær observationsområder til visualisering af protein interaktioner.
    Bemærk: Begge softwareværktøjer er frit tilgængelige på en web-server. Følg detaljerede anvisninger på de respektive hjemmesider (https://xvis.genzentrum.lmu.de/ og http://crosslinkviewer.org/).

Representative Results

Den strukturelle analyse af proteiner og komplekser danner de er grundlæggende for at forstå deres funktion. Massespektrometri bidrager betydeligt til den strukturelle undersøgelse i, at det kan anvendes på næsten alle kompleks af interesse uanset størrelse eller prøve heterogenitet. Vi eksemplificere protokollen ved hjælp af to godt karakteriseret proteinkomplekser; første, hetero-dodecamer RvB1/B2 fra C. thermophilum og for det andet, den hetero-octameric CPS komplekse fra E. coli.

Først, vi identificeret proteinkomponenter af de to komplekser. For dette, proteiner var adskilt af SDS-PAGE (figur 2) og gel bands blev skåret fra gel. Efter-gel fordøjelsen af proteiner, peptid blandingen blev analyseret af liquid chromatography-koblet massespektrometri og peptid og fragment masserne blev udsat for database søgning. Efter denne arbejdsproces, vi identificeret alle protein underenheder af de to komplekser med høj tillid, dvs., et stort antal af peptider med rimelig peptid scoringer blev observeret giver høj sekvens dækning for alle protein subunits (tabel 1 ).

Derefter analyserede vi den intakte RvB1/B2 kompleks af indfødte massespektrometri (figur 3A). Den masse spektrum afslørede to arter, en på ca 8.000 m/z og en anden arter på ca 11.000-12.000 m/z. De beregnede masserne for disse arter svarer til hexameric (RvB1)3(RvB2)3 ring (cirka 310 kDa) og den dodecameric dobbelt-ring (RvB1)6(RvB2)6 (ca. 620 kDa). Både peak serie viser to befolkninger; disse stammer fra en blanding af hans mærkede og umærkede RvB2 underenheder i komplekser. En krystalstruktur for RvB1/B2 komplekse blev tidligere fremstillet36 og viser placeringen af dobbelt-ring (figur 3B). De indfødte masse spektrum bekræfter derfor støkiometrisk af den intakte dodecamer og desuden afslører en stabil sub kompleks. Derudover er co-eksisterende populationer identificeret.

For at identificere protein interaktion websteder i RvB1/B2 kompleks, tværbunden vi kemisk renset komplekset med BS3 tværs linker. Vi først titreres mængden af BS3 under den tværbindingsmidler reaktion til at bestemme den optimale koncentration. BS3 er Amin-specifikke og kovalent links lysin sidekæder samt N-termini af proteiner. Den tværbindingsmidler reaktion blev fulgt af SDS-PAGE (figur 2A). Den ikke-cross-linked kompleks viste både RvB1 og RvB2 underenheder. Tilføje BS3 til reaktionsmiljøet forårsaget kovalente sammenkobling af de proteiner, hvilket resulterer i protein bands på højere molekylvægt. SDS gel viser, at stigende mængder af BS3 give større mængder af krydsbundet arter, mens ikke-Kors-forbundet protein underenheder er reduceret. Vi så skar protein bånd fra gel og fulgte protokollen i henhold ovenfor for at identificere protein interaktion websteder. Et eksempel spektrum af en krydsbundet di-peptid er vist (figur 3 c). Spektret viser y-ion serie af begge peptider bekræfter dette protein interaktion. I alt, vi fik 14 protein interaktioner, herunder fire cross-links mellem underenheder RvB1 og RvB2 og to cross-links mellem to kopier af RvB2 (tabel 2). Resultater fra BS3 cross-linking er visualiseret i en interaktion netværk (figur 3D) viser intra molekylære interaktioner samt interaktioner mellem forskellige underenheder. Intra molekylære cross-links tyder på, at både RvB1 og RvB2 subunits fold på en måde, at N - og C-terminale domæner er i umiddelbar nærhed. Bemærk, at intra molekylære interaktioner ikke kan skelnes fra Inter molekylære interaktioner af de samme underenheder i dette tilfælde. Inter molekylære cross-links mellem de to subunits blev også observeret. Af disse kunne to indbyrdes molekylære cross-links mellem RvB1 og RvB2 visualiseres i strukturen validerer den tværbindingsmidler tilgang. De andre indbyrdes molekylære cross-links er placeret i fleksible sløjfer, som ikke er medtaget i krystalstruktur. Vi identificerede også to cross-links i RvB2 der indeholder de samme peptid sekvenser. Disse cross-links kan utvetydigt klassificeres som Inter molekylære som de skal stamme fra to kopier af den samme protein (figur 3D). Vores tværbindingsmidler eksperimenter afsløre protein interaktion websteder inden for komplekset, men også inden for protein-underenheder giver indsigt i deres strukturelle arrangement, som kunne også bekræftes af den eksisterende krystalstruktur (figur 3B).

Den anden protein kompleks, som vi studerede var CPS. De indfødte masse spektrum (figur 4A) afsløret tre proteinkomplekser mellem 6.000 og 12.000 m/z. Den største kompleks af 640 kDa svarer til den intakte hetero-octamer. De mindre komplekser repræsenterer to sub komplekser; dimer af små og store CPS underenheder (160 kDa) og en hetero-tetramer indeholdende to kopier af hver af de underenheder (320 kDa). Disse sub komplekser levere første indsigt i protein forsamlingen; dvs., de små og store underenheder er i direkte kontakt (som afsløret af hetero-dimer) og tetramer kan være et produkt af to dimerer. For at få flere oplysninger om den strukturelle arrangement i den intakte CPS komplekse, udførte vi tandem massespektrometri (MS/MS) hetero-octamer og hetero-tetramer. I begge tilfælde, den lille underenhed adskilles fra den forløber, tyder på, at den lille underenhed er beliggende i periferien af forsamlingen (figur 4B). Ja, den lille underenhed er perifere i tilgængelige krystal struktur (figur 4 c)44.

Kemiske danne tvaerbindinger ved hjælp af BS3 tværs linker blev også udført. Ved hjælp af stigende mængder, blev den kovalente sammenkædning af CPS underenheder forbedret. Efter fordøjelsen af proteiner og analyse af peptider som beskrevet ovenfor, var mange protein interaktioner i de store subunit og én cross-link i den lille underenhed opnået (tabel 2). Derudover svarende til RvB1/B2 komplekse, vi fandt to indbyrdes molekylære cross-links mellem to kopier af den store CPS underenhed. Disse cross-links placere de to store underenheder overfor hinanden på deres C-terminal sider. I en tidligere undersøgelse, identificeret kombinerer strukturel massespektrometri og datamodellering35, vi tre yderligere interaktioner i de store subunit, som mest sandsynligt stammer fra interface to kopier af den store subunit valideret af krystalstruktur og den opnåede model (figur 4 c og tabel 2). Disse interaktioner tillade arrangement af CPS core kompleks bestående af fire store underenheder. Dog blev ingen Inter subunit cross-links mellem små og store underenheder observeret. Ved inspektion af de tilgængelige krystalstruktur (figur 4 c), bliver det klart, at interaktion overflade mellem tetramert kernen i komplekset, bestående af store subunit og de perifere lille underenheder er meget lille, hvilket kan forklare manglen indbyrdes subunit interaktioner. Dette bekræftes af indfødte massespektrometri, som viste, at den lille underenhed let tager fra de intakte komplekser mest sandsynligt på grund af en lille bindende interface. Ikke desto mindre tillade protein interaktioner i CPS komplekse kombineret fra kemiske cross-linking og indfødte massespektrometri udlede deres strukturelle arrangement (figur 4D).

Tilsammen, giver kombinationen af indfødte massespektrometri og kemiske cross-linking kombineret med massespektrometriske identifikation af krydsbundet peptider, rekonstituering af den strukturelle arrangement af begge eksempel komplekser. Mens kemiske cross-linking afslørede arrangement af protein-underenheder, for eksempel samspillet mellem RvB1 og RvB2 eller inden for den tetramert kerne af CPS, native massespektrometri leveret protein stoichiometries af de intakte komplekser og udbredte subcomplexes. I forbindelse med CPS, som ikke indbyrdes molekylære interaktioner mellem de to subunits vil kunne bemærkes af kemiske cross-linking, tyder native massespektrometri på, at hver store subunit interagerer med én lille subunit (figur 4D). Tandem massespektrometri foreslog den perifere placering for den lille underenhed i komplekset og en lille interface mellem begge underenheder.

Figure 1
Figur 1: Workflow af indfødte massespektrometri og danne tvaerbindinger. Begge teknikker levere supplerende resultater. Mens indfødte massespektrometri afslører stoichiometries og interaktion moduler, giver danne tvaerbindinger indsigt i protein interaktion websteder inden for komplekser. Bemærk, at kemiske cross-linking kun afslører binære interaktioner. (A) det første skridt i native massespektrometri er buffer exchange til en flygtig og vandig buffer ved hjælp af filteret enheder eller gel filtrering kolonner. Massespektrometri af intakt proteinkomplekser afslører derefter deres støkiometrisk. I tandem massespektrometri eksperimenter, der perifere underenheder dissocieres. (B) For kemiske cross-linking, protein kompleks er inkuberes med en tværbindingsmidler reagens. De krydsrefererede proteiner er derefter fordøjet i peptider, som analyseres efterfølgende af liquid chromatography-koblet massespektrometri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: SDS-PAGE af tværbundet RvB1/B2 (A) og CPS b komplekser. (A) 2,5 µM RvB1/B2 blev indlæst pr. gel lane. Koncentrationen af BS3 blev varieret. Non-cross-knyttet RvB1/B2 viser to protein-underenheder på ca 50 kDa. Tilsætning af BS3 forårsaget kovalente sammenkædning af protein-underenheder resulterer i protein bands på højere molekylvægt. Mængden af krydsbundet arter er steget med højere BS3 koncentrationer. Optimal tværbindingsmidler betingelser er fremhævet (rød). (B) 10 µM CPS blev indlæst pr. gel lane. Den store (90 kDa) og små (40 kDa) CPS underenheder er opnået. Tilsætning af BS3 forårsaget kovalente sammenkædning af protein-underenheder resulterer i protein bands på højere molekylvægt. Optimal tværbindingsmidler betingelser er fremhævet (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: indfødte massespektrometri og kemiske cross-linking af RvB1/B2 komplekse. (A) den oprindelige masse spektrum afslører to arter af RvB1/B2; den intakte dodecamer (dvs., (RvB1)6(RvB2)6) på ca. 11.000 til 12.000 m/z og hexameric ring (RvB1)3(RvB2)3 på ca 8.000 m/z. Begge arter viser to befolkningsgrupper som følge af hans mærkede og umærkede RvB2. Spektret er blevet ændret fra35. (B) krystal struktur af RvB1/B2 er vist (PDB ID 4WVY). Skiftevis RvB1 og RvB2 danner subunits to hexameric ringe. (C) fragmentering spektrum af en krydsbundet di-peptid. N-terminus af RvB1 var tværbundet med K23 af RvB1. y-ion serien blev opnået for både peptider (rød og cyan). (D) samhandelen og Inter-Diesel protein interaktioner er fremstillet i RvB1/B2-komplekset. Intra-Cross-Country-links vises med rødt, inter-cross-links er vist i blåt. Indsatsen viser to indbyrdes molekylære cross-links mellem RvB1 og RvB2 subunits, som kunne visualiseres i krystalstruktur (grøn, Indsæt). Samspil, der stammer fra to RvB2 kopier vises som blå prikkede linjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: indfødte massespektrometri og kemiske cross-linking af CPS. (A) den indfødte masse spektrum af CPS viser tre komplekser. Hetero-dimer (160 kDa), hetero-tetramer (320 kDa) og hetero-octamer (640 kDa). Spektret er blevet ændret fra35. (B) Tandem massespektrometri af tetramert og octameric CPS komplekse afslørede dissociation af små CPS subunit. (C) krystal struktur af CPS er vist (PDB ID 1BXR). De store underenheder udgøre en tetramert kerne og de lille underenheder er placeret i periferien af komplekset. Inter molekylære cross-links mellem to kopier af den store subunit er vist (grøn). (D) vekselvirkninger mellem de store og små CPS underenheder. Native massespektrometri viste subcomplexes og foreslår en perifer beliggenhed i den lille underenhed. Kemiske cross-links angive ordninger i den tetramert kerne af CPS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Database søgeresultater. Proteinerne, der blev identificeret af liquid chromatography-koblet massespektrometri og database søgning. Navnene protein tiltrædelses-nummer, samt beskrivelse og protein masse er givet. Protein score, antallet af observerede spectra pr. protein og antallet af observerede peptid sekvenser er angivet. De fem peptider med højeste Mascot peptider scores er anført for hvert protein-underenheder. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Tabel 2: Cross-links observeret i RvB1/B2 og CPS. Underenheder af komplekser og de krydsrefererede rester er givet. Typen af cross-link (intra - eller Inter Molekylær) blev afsløret fra overlappende peptid sekvenser eller en tidligere undersøgelse35. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Protokoller leveres til massespektrometri-baseret strukturel analyse af multi subunit proteinkomplekser. De to teknikker, beskrevet i protokollen, for det meste levere supplerende resultater og er velegnet til at få indsigt i de strukturelle ordninger inden for protein (-ligand) komplekser, som er vanskelige at studere af konventionelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri leverer indblik i protein stoichiometries samt protein interaktioner ved at analysere subcomplexes og stabil interaktion moduler. Cross-Linking, på den anden side giver oplysninger om direkte kontakt websteder. Afhængigt af tværs linker anvendes en vis fleksibilitet kan eller bør indgå i analysen.

De angivne protokoller er generelt nemme at udføre og ikke tidskrævende. Hele protokollen kan udføres inden for en uge og kan anvendes på næsten alle proteinkomplekser, selv om en vis mængde af protein kompleks er nødvendige for vellykket analyse. Forberedelse af prøver er enkel og kræver ikke specifikt oprenset proteinkomplekser. Dog er én fælles faldgrube kontaminering af prøven under prøveforberedelse til massespektrometri-baseret protein identifikation. Disse forureninger i de fleste tilfælde omfatter keratiner, der stammer fra støv, hud eller hår. Ekstra pleje såsom iført handsker og lab frakker, filtrerende vandig buffere, og ved hjælp af høj renhed opløsningsmidler bør derfor tages under prøveforberedelse til massespektrometri-baseret protein identifikation. Andre forurenende proteiner som chaperoner er som regel indført under protein oprensning, f.eks.når du bruger affinitet tags. I disse tilfælde, bør protein oprensning forbedres, for eksempel ved at øge vaske trin. Under alle omstændigheder protein forureninger i stikprøven er let identificeres under til databasesøgning ved at udelade filteret taksonomi (dvs.søge mod proteiner fra alle arter). Hvis kun et par peptider overholdes (dvs., en lav protein dækning kunne opnås), selv om tilstrækkelig prøven er tilgængelig, det kan være nødvendigt at bruge en anden proteinase under fordøjelsen. Generelt giver Trypsin et tilstrækkeligt antal peptider; men i nogle tilfælde som Membranproteiner eller membran domæner af proteiner, reduceres antallet tryptic kavalergang websteder og andre enzymer målretning hydrofobe aminosyrer er et bedre valg.

Med hensyn til instrumentering kræves en særligt modificerede instrument for indfødte massespektrometri, som bevarer ikke-kovalente interaktioner under overførsel til gas-fase. Flere instrumenttyper er blevet indført, herunder Q-ToF og orbitrap instrumenter. Mens modificerede Q-ToF massespektrometre er kommercielt tilgængelige for indfødte massespektrometri da flere år, sidstnævnte var først for nylig indført og i de fleste tilfælde kræver specialiseret ændring45. Men anvendelsen af høj opløsning instrumenter tilladt at studere binding af flere ligander og deres kvantificering46,47 og er lovende for fremtidige ansøgninger.

For at identificere krydsbundet di-peptider ved liquid chromatography-koblet massespektrometri, kan standard procedurer med få ændringer anvendes. Men til databasesøgning er den begrænsende faktor som specialiseret software kan sjældent behandle store databaser og reduceret databaser indeholdende protein-underenheder af komplekser er påkrævet. Nylige undersøgelser anvendes masse massespektrometri-cleavable cross-linkers målretning protein interaktioner i hele cellen lysates48,49. Brugen af kemiske cross-linkers, der fragmenterer i tandem massespektrometri eksperimenter for det meste giver lineær peptider (ændret ved tværs linker), som kan identificeres ved yderligere fragmentering og database søgning af lineære peptider, og det reducerer Søg efter tid og beregningsmæssige søgning plads. Men for at udføre disse eksperimenter, en ion trap masse analyzer eller en hybrid massespektrometer med en ion trap er påkrævet. I almindelighed, som falske-positiver er et vigtigt spørgsmål, er massespektre af krydsbundet peptider ofte valideret manuelt af kvaliteten af deres fragment spektre, som udvider data analyse tid enormt. Udvikle robuste scoring systemer, der kan anvendes uden yderligere validering trin er derfor potentielle fremtidige applikationer. En måde at forbedre dataanalyse og reducere antallet af falsk-positive var indførelsen af falsk opdagelse sats beregninger og deres anvendelse til cross-linking datasæt50.

Generelt er de teknikker, der beskrives her kan suppleres med yderligere massespektrometri teknikker (f.eks.kovalente mærkning) at øge outputtet fra analysen. Andre ændringer og forbedringer af protokollerne, der kan gennemføres let. Som sådan optrevler sammenlignende tværbindingsmidler34 konformationelle ændringer i protein-forsamling. Yderligere udviklinger i native massespektrometri i dag giver mulighed for analyse af membran proteiner51,52 og deres interaktioner med lipider28,52,53,54 . Nye udviklinger i høj opløsning massespektrometre for indfødte massespektrometri har udvidet den ansøgning og ligand bindende, fx, binding af lipider til Membranproteiner, kan nu medtages i analysen45, 46. i kombination med datamodellering tilgange, disse teknikker kan levere strukturelle modeller af varierende opløsning55. Hvis ingen crystal strukturer er tilgængelige for de intakte komplekse eller enkelt underenheder, kan massespektrometri levere første indsigt i protein interaktioner og topologi af ukendt komplekset. Afhængigt af de anvendte metoder og opnåede resultater, kan lav opløsning modeller af ukendt komplekset opnås56,57,58. Hvis krystal strukturer eller homologi modeller er tilgængelige, kan den strukturelle oplysninger modtaget fra massespektrometri udbytte selv nær-indfødte modeller59.

I forhold til andre strukturelle teknikker, massespektrometri har fordelen, at det kræver lave prøve beløb, det kan håndtere heterogene prøver og gælder for proteinkomplekser af ubegrænset størrelse. Desuden giver massespektrometri undersøgelsen af dynamisk protein systemer. Forskellige populationer af protein eller protein kompleks, der findes i løsningen bliver normalt analyseret sammen og derfor, i modsætning til andre strukturelle teknikker, som kræver udvalg af visse befolkningsgrupper, alle konformationer vedligeholdes under analyse og er evaluerbare i et eksperiment. Kvantitative tværbindingsmidler tilgange blev for nylig indført34,60,61 og er lovende for fremtidige ansøgninger der beskriver konformationelle ændringer under forskellige betingelser.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker vores kolleger for nyttige diskussioner. Vi takker også Ilme Schlichting og Karl-Peter Hopfner for at give proteinkomplekser. Vi anerkender støtte fra Forbundsministeriet for uddannelse og forskning (BMBF, ZIK programmet, 03Z22HN22), den europæiske fond for Regionaludvikling (EFRE, ZS/2016/04/78115) og MLU Halle-Wittenberg C.S. og finansiering fra the Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) at A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, Consumables
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma Aldrich H4034 buffer
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 pH
Acetonitrile Optima LC/MS Fisher Chemicals A955-1 solvent
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) Millipore i.e. UFC500396 buffer exchange, concentration
Ammonium acetate solution Sigma Aldrich A2706 native MS
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830 in-gel digestion
Ammonium solution Sigma Aldrich 9859 pH
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) Thermo Scientific 21590 cross-linker
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) Thermo Scientific 21595 cross-linker
Caesium iodide Sigma Aldrich 203033 calibration
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 in-gel digestion
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) Harvard Apparatus 30-0038 native MS
Disuccinimidyl suberate (DSS) Thermo Scientific 21655 cross-linker
DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich D5545 in-gel digestion
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D8418 solvent
Ethanol Fisher Chemicals BP2818 solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Instant Blue Coomassie staining solution expedeon ISB1L staining solution for gel electrophoresis
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) life technologies NP0323BOX gel electrophoresis
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 In-gel digestion
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Micro BioSpin 6 columns BioRad 732-6222 buffer exchange
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005 running buffer, gel electrophoresis
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) invitrogen NP0007 sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis
NuPAGE MES SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE MOPS SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) invitrogen NP0004 reducing Agent for gel electrophoresis
PBS - phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 buffer
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker invitrogen LC5925 prestained Protein Marker for gel electrophoresis
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889 ethanol precipitation
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma Aldrich 252859 buffer
Trypsin Sigma Aldrich TRYPSEQ-RO (11418475001) in-gel digestion
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) Sartorius i.e. VS0101 buffer exchange, concentration
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge Thermo Scientific 75002425
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 Sutter Instruments P-1000
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell Invitrogen EI0001
Gold Coater Quorum Q150R S Quorum Technologies Ltd. Q150RS
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T Heidolph Instruments 544-41200-00
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade Waters (Micromass) -
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) Thermo Scientific 164570
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) Thermo Scientific 164213
scalpel Fisher Scientifc 10463989
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge Thermo Scientific SPD121DP-230
Thermomixer C Eppendorf 5382000015
Tweezers AA Sigma Aldrich Z680184-1EA
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath VWR 142-0084
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) Thermo Scientific 0726030+
Name Company Catalog Number Comments
Software, Software Tools, Database search
Mascot www.matrixscience.com
Massign http://massign.chem.ox.ac.uk
MassLynx Micromass
MassMatrix Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)
MaxQuant Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)
pLink Yang, B. Nat Methods 9 (2012)
pXtract conversion tool http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html
UniDec Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)
XCalibur Thermo Scientific
XiNET http://crosslinkviewer.org
XLinkX Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)
xQuest Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)
Xvis https://xvis.genzentrum.lmu.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, I. D. Timeline: the march of structural biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 377-381 (2002).
  2. Liko, I., Allison, T. M., Hopper, J. T., Robinson, C. V. Mass spectrometry guided structural biology. Curr Opin Struct Biol. 40, 136-144 (2016).
  3. Robinson, C. V. From molecular chaperones to membrane motors: through the lens of a mass spectrometrist. Biochem Soc Trans. 45 (1), 251-260 (2017).
  4. Lossl, P., van de Waterbeemd, M., Heck, A. J. The diverse and expanding role of mass spectrometry in structural and molecular biology. EMBO J. 35 (24), 2634-2657 (2016).
  5. Wang, L., Chance, M. R. Protein Footprinting Comes of Age: Mass Spectrometry for Biophysical Structure Assessment. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 706-716 (2017).
  6. Steen, H., Mann, M. The ABC's (and XYZ's) of peptide sequencing. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (9), 699-711 (2004).
  7. Olsen, J. V., Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).
  8. Schmidt, C., Robinson, C. V. Dynamic protein ligand interactions--insights from MS. FEBS J. 281 (8), 1950-1964 (2014).
  9. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: what is it and what can it tell us? Anal Bioanal Chem. 397 (3), 967-972 (2010).
  10. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  11. Leitner, A., Lindner, W. Current chemical tagging strategies for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 813 (1-2), 1-26 (2004).
  12. Leitner, A., Lindner, W. Chemistry meets proteomics: the use of chemical tagging reactions for MS-based proteomics. Proteomics. 6 (20), 5418-5434 (2006).
  13. Kiselar, J. G., Chance, M. R. Future directions of structural mass spectrometry using hydroxyl radical footprinting. J Mass Spectrom. 45 (12), 1373-1382 (2010).
  14. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chem Rev. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  15. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  16. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  17. Rinner, O., et al. Identification of cross-linked peptides from large sequence databases. Nat Methods. 5 (4), 315-318 (2008).
  18. Yang, B., et al. Identification of cross-linked peptides from complex samples. Nat Methods. 9 (9), 904-906 (2012).
  19. Xu, H., Hsu, P. H., Zhang, L., Tsai, M. D., Freitas, M. A. Database search algorithm for identification of intact cross-links in proteins and peptides using tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3384-3393 (2010).
  20. Leitner, A., Faini, M., Stengel, F., Aebersold, R. Crosslinking and Mass Spectrometry: An Integrated Technology to Understand the Structure and Function of Molecular Machines. Trends Biochem Sci. 41 (1), 20-32 (2016).
  21. Heck, A. J. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).
  22. Sharon, M., Robinson, C. V. The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes. Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).
  23. Goth, M., Pagel, K. Ion mobility-mass spectrometry as a tool to investigate protein-ligand interactions. Anal Bioanal Chem. , (2017).
  24. Uetrecht, C., Rose, R. J., van Duijn, E., Lorenzen, K., Heck, A. J. Ion mobility mass spectrometry of proteins and protein assemblies. Chem Soc Rev. 39 (5), 1633-1655 (2010).
  25. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).
  26. Sobott, F., Hernandez, H., McCammon, M. G., Tito, M. A., Robinson, C. V. A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies. Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).
  27. Rostom, A. A., et al. Detection and selective dissociation of intact ribosomes in a mass spectrometer. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5185-5190 (2000).
  28. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  29. Uetrecht, C., et al. High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).
  30. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Rep. 11 (5), 759-769 (2015).
  31. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. The joining of the Hsp90 and Hsp70 chaperone cycles yields transient interactions and stable intermediates: insights from mass spectrometry. Oncotarget. 6 (21), 18276-18281 (2015).
  32. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Sci Rep. 7, 44068 (2017).
  33. Schmidt, C., et al. Comparative cross-linking and mass spectrometry of an intact F-type ATPase suggest a role for phosphorylation. Nat Commun. 4, 1985 (2013).
  34. Schmidt, C., Robinson, C. V. A comparative cross-linking strategy to probe conformational changes in protein complexes. Nat Protoc. 9 (9), 2224-2236 (2014).
  35. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Anal Chem. 89 (3), 1459-1468 (2017).
  36. Lakomek, K., Stoehr, G., Tosi, A., Schmailzl, M., Hopfner, K. P. Structural basis for dodecameric assembly states and conformational plasticity of the full-length AAA+ ATPases Rvb1 · Rvb2. Structure. 23 (3), 483-495 (2015).
  37. Mareya, S. M., Raushel, F. M. A molecular wedge for triggering the amidotransferase activity of carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 33 (10), 2945-2950 (1994).
  38. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).
  39. Olsen, J. V., et al. Parts per million mass accuracy on an Orbitrap mass spectrometer via lock mass injection into a C-trap. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 2010-2021 (2005).
  40. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  41. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J Vis Exp. (40), (2010).
  42. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Anal Chem. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  43. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Anal Chem. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  44. Thoden, J. B., Wesenberg, G., Raushel, F. M., Holden, H. M. Carbamoyl phosphate synthetase: closure of the B-domain as a result of nucleotide binding. Biochemistry. 38 (8), 2347-2357 (1999).
  45. Rose, R. J., Damoc, E., Denisov, E., Makarov, A., Heck, A. J. High-sensitivity Orbitrap mass analysis of intact macromolecular assemblies. Nat Methods. 9 (11), 1084-1086 (2012).
  46. Gault, J., et al. High-resolution mass spectrometry of small molecules bound to membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 333-336 (2016).
  47. Mehmood, S., et al. Mass spectrometry captures off-target drug binding and provides mechanistic insights into the human metalloprotease ZMPSTE24. Nat Chem. 8 (12), 1152-1158 (2016).
  48. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  49. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).
  50. Walzthoeni, T., et al. False discovery rate estimation for cross-linked peptides identified by mass spectrometry. Nat Methods. 9 (9), 901-903 (2012).
  51. Barrera, N. P., Di Bartolo, N., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles protect membrane complexes from solution to vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  52. Barrera, N. P., et al. Mass spectrometry of membrane transporters reveals subunit stoichiometry and interactions. Nat Methods. 6 (8), 585-587 (2009).
  53. Laganowsky, A., et al. Membrane proteins bind lipids selectively to modulate their structure and function. Nature. 510 (7503), 172-175 (2014).
  54. Marcoux, J., et al. Mass spectrometry reveals synergistic effects of nucleotides, lipids, and drugs binding to a multidrug resistance efflux pump. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9704-9709 (2013).
  55. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. J Proteomics. , (2017).
  56. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  57. Pukala, T. L., et al. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).
  58. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chem Biol. 22 (1), 117-128 (2015).
  59. Politis, A., et al. A mass spectrometry-based hybrid method for structural modeling of protein complexes. Nat Methods. 11 (4), 403-406 (2014).
  60. Fischer, L., Chen, Z. A., Rappsilber, J. Quantitative cross-linking/mass spectrometry using isotope-labelled cross-linkers. J Proteomics. 88, 120-128 (2013).
  61. Yu, C., et al. Developing a Multiplexed Quantitative Cross-Linking Mass Spectrometry Platform for Comparative Structural Analysis of Protein Complexes. Anal Chem. 88 (20), 10301-10308 (2016).

Tags

Biokemi sag 129 massespektrometri cross-linking native massespektrometri proteinkomplekser protein interaktioner proteiner støkiometrisk protein netværk dataanalyse
Kombinere kemisk Cross-linking og massespektrometri af intakt proteinkomplekser at studere arkitektur af multi subunit Protein forsamlinger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S.,… More

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S., Kostmann, S., Politis, A., Schmidt, C. Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies. J. Vis. Exp. (129), e56747, doi:10.3791/56747 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter