Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

बहु-उप इकाई प्रोटीन सभाओं की वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए बरकरार प्रोटीन परिसरों के रासायनिक पार से जोड़ने और जन स्पेक्ट्रोमेट्री का मेल

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56747
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Interdisciplinary research center HALOmem, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Chemistry, Kings College London
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का आर्किटेक्चर उनके फंक्शन के लिए जरूरी है । विभिंन जन spectrometric तकनीक का मेल शक्तिशाली साबित करने के लिए अपने विधानसभा का अध्ययन । हम रासायनिक पार से जोड़ने और देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते है और शो कैसे इन पूरक तकनीकों के लिए बहु की वास्तुकला स्पष्ट-यूनिट प्रोटीन सभाओं मदद करते हैं ।

Abstract

प्रोटीन अपने लाइगैंडों के साथ बातचीत करने के लिए सक्रिय और गतिशील विधानसभाओं जो विभिंन सेलुलर कार्यों बाहर ले फार्म । Elucidating इन बातचीत इसलिए सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ के लिए मौलिक है । हालांकि, कई प्रोटीन परिसरों गतिशील विधानसभाओं रहे है और पारंपरिक संरचनात्मक तकनीक तक पहुंच नहीं है । जन स्पेक्ट्रोमेट्री इन विधानसभाओं के संरचनात्मक जांच करने के लिए योगदान देता है, और विशेष रूप से विभिंन मास spectrometric तकनीकों का संयोजन उनके संरचनात्मक व्यवस्था में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि बचाता है ।

इस अनुच्छेद में, हम आवेदन और दो पूरक जन spectrometric तकनीक, अर्थात् रासायनिक पार जन स्पेक्ट्रोमेट्री और देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित जोड़ने के संयोजन का वर्णन । रासायनिक पार जोड़ने रासायनिक रिएजेंट का उपयोग करके करीब निकटता में अमीनो एसिड की आबंध लिंकेज शामिल है । साथ पाचन के बाद, क्रॉस-लिंक्ड डि-पेप्टाइड्स जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान कर रहे हैं और प्रोटीन बातचीत साइटों का पर्दाफाश कर रहे हैं । दूसरी ओर देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री एक मास स्पेक्ट्रोमीटर के गैस चरण में बरकरार प्रोटीन सभाओं का विश्लेषण है । इसमें प्रोटीन stoichiometries के साथ-साथ प्रोटीन और ligand इंटरैक्शन का पता चलता है. दोनों तकनीक इसलिए प्रोटीन की संरचना पर पूरक जानकारी देने ligand विधानसभाओं और उनके संयोजन पिछले अध्ययन में शक्तिशाली साबित कर दिया ।

Introduction

प्रोटीन सभाओं की संरचनात्मक जांच सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गई है । नतीजतन, कई, तकनीक और विकसित किया गया है संरचनात्मक जीवविज्ञान1में सुधार । हालांकि, इन तकनीकों के आकार, लचीलापन, या जांच के तहत प्रोटीन परिसरों के विविधता के कारण अपने आवेदन में कभी भी सीमित हैं । जन स्पेक्ट्रोमेट्री इन चुनौतियों से निपटने के लिए और कर सकते हैं, इसलिए, संरचनात्मक जीवविज्ञान2,3,4,5में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा । मास स्पेक्ट्रोमेट्री का सबसे बड़ा लाभ, तथापि, स्पष्ट रूप से भी जटिल और विषम मिश्रण6में प्रोटीन की पहचान करने की क्षमता है । इस अंत करने के लिए, प्रोटीन आमतौर पर endoproteinases के साथ पचा रहे हैं और परिणामस्वरूप पेप्टाइड मिश्रण तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया जाता है और सीधे मास स्पेक्ट्रोमीटर में eluted. पेप्टाइड मास बाद में निर्धारित कर रहे हैं और अग्रदूत आयनों पेप्टाइड्स के आगे विखंडन के लिए चयनित कर रहे हैं. प्रोटीन तो एक ज्ञात डेटाबेस के खिलाफ पेप्टाइड और इसी टुकड़ा जनता खोज द्वारा की पहचान कर रहे हैं । यह प्रक्रिया न केवल पेप्टाइड्स/प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है, लेकिन यह भी उनके बाद अनुवाद संशोधन जो प्रणेता पेप्टाइड्स के एक बड़े पैमाने पर बदलाव और टुकड़ा7संशोधन ले जा आयनों का कारण. संरचनात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री में कई तकनीकों में से कुछ इस सिद्धांत4,8पर आधारित हैं । उदाहरण के लिए, लेबलिंग तकनीक जैसे हाइड्रोजन ड्यूटेरियम विनिमय9,10, रासायनिक लेबलिंग रणनीतियों11,12, या हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी पैर मुद्रण13,14 , कुछ शर्तों के तहत प्रोटीन की सतह पहुंच में अंतर्दृष्टि दे ।

एक अंय तकनीक है (रासायनिक) पार अपने कार्यात्मक समूहों के माध्यम से करीब निकटता में अमीनो एसिड के आबंध संपर्क को शामिल जोड़ने । इसके लिए केमिकल रिएजेंट, यूवी activatable रिएजेंट, या अमीनो एसिड15,16कार्यरत हैं । पार से जोड़ने के बाद, प्रोटीन आमतौर पर hydrolyzed के साथ कर रहे है और पार से जुड़े di-पेप्टाइड्स तरल क्रोमैटोग्राफी-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । पार से जोड़ने की पहचान डेटाबेस खोज, तथापि, विशेष सॉफ्टवेयर है जो विभिंन प्रोटीन और असमान क्षेत्रों के पेप्टाइड अनुक्रम जोड़ना17,18,19के उपयोग की आवश्यकता है । रासायनिक पार के प्रयोग के लिंक का लाभ है कि यह लगभग हर प्रोटीन ब्याज के परिसर में नियोजित किया जा सकता है और यूवी-activatable अमीनो एसिड, जो केवल जब मेजबान कोशिकाओं में ब्याज की प्रोटीन व्यक्त प्राप्त किया जा सकता है की आवश्यकता नहीं है । जैसे, पार से जोड़ने एक बहुमुखी उपकरण है और सफलतापूर्वक भी बड़े प्रोटीन20विधानसभाओं के कई संरचनात्मक अध्ययन में कार्यरत थे ।

बरकरार प्रोटीन परिसरों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री (कई बार कहा जाता है ' देशी ' जन स्पेक्ट्रोमेट्री), दूसरी ओर, hydrolysis के बिना बरकरार प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण शामिल है । यह संरचना, विविधता, stoichiometry, टोपोलॉजी, और प्रोटीन परिसरों की उपइकाई बातचीत21,22से पता चलता है । आयन गतिशीलता के साथ संयोजन में, देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री आगे अपने अनुरूप23,24के निर्धारण की अनुमति देता है । यह प्रोटीन परिसरों कि पारंपरिक संरचनात्मक तकनीक द्वारा मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल है की संरचनात्मक जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाता है । हालांकि, मूल मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण बफ़र्स जो electrospray ionization के दौरान गैर-आबंध प्रोटीन बातचीत बनाए रखने की आवश्यकता है । यह आमतौर पर जलीय एसीटेट जैसे अमोनियम का उपयोग करके प्राप्त की है, वाष्पशील बफ़र्स25। इसके अलावा, साधन संशोधनों को जन स्पेक्ट्रोमीटर के गैस चरण में संचरण के दौरान पृथक्करण को रोकने के लिए आवश्यक हैं26. इस तरह से लागू, कई (बड़े) प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण किया गया । प्रभावशाली उदाहरण बरकरार ribosomes27, एटीपी synthases28, या वायरस29के अध्ययन कर रहे हैं ।

देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री और परस्पर जोड़ने का संयोजन पिछले अध्ययनों में विशेष रूप से सफल साबित हुआ. मसलन, एक अप्रत्याशित Hsp70 डिमर सहित निगरानी कॉम्प्लेक्सों का stoichiometries, बरकरार प्रोटीन कॉम्प्लेक्सों के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों से प्राप्त किया जा सकता था, जबकि केमिकल क्रॉस जोडऩे में प्रोटीन्स की व्यवस्थाओं का पता चला. सभाओं30,31. एक अलग अध्ययन में, एक बरकरार एटीपी सिंथेस परिसर पर पोस्ट-शोधों संशोधनों के प्रभाव का अध्ययन किया गया. देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री उपस्थिति या फास्फारिलीकरण या acetylation३२,३३की अनुपस्थिति में प्रोटीन जटिल स्थिरता में अंतर्दृष्टि प्रदान की है । एक तुलनात्मक पार से जोड़ने की रणनीति३४ तो विभिंन परिस्थितियों में प्रोटीन परिसर के गठन के परिवर्तन का पता चला ।

यहां, हम जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन की पहचान के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, (रासायनिक) पार से जोड़ने, और देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री, डेटा विश्लेषण और व्याख्या सहित (चित्रा 1) । दो अच्छी तरह से विशेषता प्रोटीन परिसरों की मदद से इन तरीकों से प्राप्त पूरक परिणामों के संयोजन३५का प्रदर्शन किया है । हमारे प्रोटोकॉल किसी भी प्रोटीन विधानसभा जो कुछ शुद्धता और एकाग्रता पर शुद्ध किया जा सकता करने के लिए लागू किया जा सकता है । दृष्टिकोण कुछ मामलों में पार के डेटा विश्लेषण द्वारा सीमित डेटा, यानी, कार्यरत डेटाबेस के आकार, जो आवश्यक खोज स्थान और समय निर्धारित करता है । इसके अलावा, पहचान पार लिंक के मैनुअल सत्यापन अक्सर आवश्यक है और आगे उत्पादन कम कर देता है । देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री ज्यादातर नमूना गुणवत्ता द्वारा सीमित है, उदाहरणके लिए, बफ़र्स और adducts शोधन के दौरान इस्तेमाल किया और उंहें जलीय और अस्थिर बफ़र्स द्वारा विनिमय की संभावना है । हालांकि, प्रोटीन परिसरों संरचनात्मक विश्लेषण के लिए शुद्ध आमतौर पर हमारे प्रोटोकॉल के साथ सफल विश्लेषण के लिए आवश्यक गुणवत्ता है ।

Protocol

1. प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का शुद्धिकरण

  1. अनुकूलित मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन कॉम्प्लेक्स तैयार करें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां RvB1/B2 परिसर से Chaetomium thermophilum और carbamoyl फॉस्फेट सिंथेस (सीपीएस) से ई कोलाईके साथ प्रदर्शन किया है । RvB1/B2 और सीपीएस३६,३७वर्णित के रूप में शुद्ध किया गया । हर प्रोटीन जटिल एक व्यक्तिगत शुद्धि प्रोटोकॉल की आवश्यकता है । तदनुसार प्रोटोकॉल समायोजित करें । अमीन-मुक्त बफ़र्स जैसे फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) या 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethanesulfonic एसिड (HEPES) का उपयोग केमिकल क्रॉस-लिंकिंग के लिए किया जाना चाहिए । यदि संभव हो तो शुद्धि के दौरान बफ़र बदलें ।
    चेतावनी: किसी भी तरीके या एजेंट है कि प्रोटीन परिसर के मूल विधानसभा परेशान लागू नहीं है ।

2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटीन पहचान

  1. जेल ट्रो
    नोट: अलग जेल सिस्टम उपलब्ध है और हर प्रयोगशाला अपने स्वयं के सेटअप का उपयोग करता है । जेल प्रणाली के अनुसार शर्तों को समायोजित करें । keratins के रूप में प्रोटोकॉल भर में दस्ताने और लैब कोट पहनें मास spectrometric विश्लेषण में सबसे आम दूषित पदार्थों में से एक हैं ।
    1. ७.५ µ एल 4x नमूना बफर और 3 µ एल 10x कम करने एजेंट (अंतिम एकाग्रता ५० mM dithiothreitol (डीटीटी)) 20 µ एल प्रोटीन नमूना लागू करें । उपयोग 10 µ एम सीपीएस या २.५ µ एम RvB1/ ७० डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १६,२०० × जी और गर्मी में 1 मिनट के लिए नीचे स्पिन ।
      नोट: एक अलग जेल प्रणाली का उपयोग करते समय आवश्यक मात्रा को समायोजित और तापमान हीटिंग.
    2. ट्रो के लिए 4-12% ढाल जेल तैयार करें । चल रहे बफ़र को पानी से 20 बार पतला करें और ट्रो कक्ष भरें । छोटे आणविक भार (2-200 केडीए) के प्रोटीन के लिए 2-(एन-morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) बफर का उपयोग करें और बड़ा प्रोटीन (14-200 केडीए) के लिए 3-(n-morpholino) propanesulfonic एसिड (MOPS) बफर. इनर चैंबर में ०.५ एमएल एंटीऑक्सीडेंट जोड़ें ।
      नोट: एक अलग जेल प्रणाली का उपयोग करते समय बफर और जेल निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार चल रहा है ।
    3. पहली गुहा में एक उपयुक्त प्रोटीन मार्कर (पूर्व सना हुआ, दाग, अलग आणविक आकार) लोड और शेष गुहाओं में प्रोटीन के नमूने लोड ।
    4. ३५ मिनट (एमईएस) या ५० मिनट (MOPS) पर २०० वी के लिए अलग प्रोटीन ।
      नोट: ट्रो बार और वोल्टेज अलग जेल प्रणालियों के लिए समायोजित करें ।
    5. प्रोटीन बैंड दाग, एक जेल धुंधला बॉक्स में जेल हस्तांतरण और एक पानी आधारित Coomassie धुंधला समाधान के साथ जेल कवर । एक क्षैतिज जेल शेखर पर रात भर और कमरे के तापमान पर मशीन ।
    6. पानी के साथ दाग समाधान की जगह से जेल दाग । इस चरण को दोहराएँ कई बार (लगभग 3-5 बार) जब तक कि जेल पृष्ठभूमि स्पष्ट दिखाई देता है.
  2. जेल में पाचन
    नोट: संक्रमण से बचने के लिए, पाचन प्रोटोकॉल भर में HPLC ग्रेड सॉल्वैंट्स का उपयोग करें और सभी निंनलिखित चरणों के लिए (यानी, मास spectrometric विश्लेषण) । उपयोग और पानी और अमोनियम बिकारबोनिट को छानने से पहले सभी समाधान तैयार करें ।
    1. एक स्केलपेल का उपयोग कर जेल से नीले Coomassie दाग द्वारा कल्पना कर रहे हैं कि प्रोटीन बैंड में कटौती. ध्यान से प्रोटीन बैंड लगभग 1 मिमी × 1 मिमी के छोटे टुकड़ों में कटौती । विभिन्न प्रोटीन बैंड के बीच पानी के साथ स्केलपेल कुल्ला । जेल बैंड को पानी और acetonitrile (ACN) से धोएं ।
    2. iodoacetamide के साथ डीटीटी, alkylate cysteine अवशेषों के साथ disulphide बांड को कम करें, और trypsin के साथ प्रोटीन को पचाने के रूप में पहले वर्णित३८; आमतौर पर एक एंजाइम: 1:20 1:100 तक के प्रोटीन अनुपात का प्रयोग किया जाता है । पाचन प्रोटोकॉल के दौरान १०० mM अमोनियम बिकारबोनिट का प्रयोग करें ।
    3. दो चरणों में पेप्टाइड्स निकालें ।
      1. पहले अमोनियम बिकारबोनिट और ACN के साथ जेल टुकड़े मशीन, और पेप्टाइड युक्त supernatant इकट्ठा । दूसरा, 5% (v/v) फार्मिक एसिड और ACN के साथ जेल टुकड़े की मशीन । हर कदम पर 15 मिनट के लिए मशीन । दोनों supernatants का मिश्रण । सूखी एक वैक्यूम केंद्रापसारक में सॉल्वैंट्स वाष्पीकरण द्वारा निकाले पेप्टाइड्स ।
        नोट: सूखे पेप्टाइड कई महीनों के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. तरल क्रोमैटोग्राफी-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री
    1. 2% ACN/0.1% फार्मिक एसिड में सूखे पेप्टाइड भंग । 2-3 मिनट के लिए एक sonication स्नान में पेप्टाइड्स भंग और 30 मिनट के लिए १६,२०० एक्स जी में एक केंद्रापसारक में नीचे स्पिन नमूने नमूना शीशियों में स्थानांतरण ।
      नोट: मात्रा को प्रोटीन की मात्रा के अनुसार समायोजित करें । अच्छी तरह से सना हुआ Coomassie बैंड के लिए हम 20 µ का उपयोग करें l
    2. नमूना का उपयोग कर नैनो-LC-ms/एमएस प्रणाली के लिए नमूने के 5 µ एल इंजेक्षन. एक उलट-चरण C18 पूर्व कॉलम (C18, १५० µm आईडी, 2 सेमी, 5 µm ताकना आकार) को नमक और पेप्टाइड्स ऑनलाइन ध्यान केंद्रित पर पेप्टाइड मिश्रण लोड ।
    3. मोबाइल चरण A और ८०% ACN/0.1% (v/v) फार्मिक एसिड के रूप में मोबाइल फेज़ बी के रूप में ०.१% (v/v) फार्मल एसिड का उपयोग करें । एक उलट-चरण C18 विश्लेषणात्मक कॉलम पर पेप्टाइड्स अलग (C18, ७५ µm आईडी, ५० सेमी, 3 µm ताकना आकार) 4-80% बी के एक ढाल का उपयोग (०.१% फार्मिक एसिड युक्त) पर ३०० nL/ ६५ मिनट से अधिक मिनट ।
      नोट: एक nanospray आयन स्रोत मास स्पेक्ट्रोमीटर में eluted पेप्टाइड्स हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    4. (ठेठ) एमएस शर्तों का उपयोग करें: १.६ केवी के स्प्रे वोल्टेज; २५० ° c के केशिका तापमान; 30 की सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा । डेटा-निर्भर मोड में मास स्पेक्ट्रोमीटर संचालित है ।
    5. मास विश्लेषक में MS स्पेक्ट्रा प्राप्त करें (उदा., orbitrap) (m/z 350 − 1600) ७०,००० के एक संकल्प के साथ और 3 x 106में से एक स्वत: प्राप्त नियंत्रण लक्ष्य । 1 x 105के एक स्वत: प्राप्त नियंत्रण लक्ष्य पर HCD विखंडन के लिए सबसे तीव्र आयनों के 20 का चयन करें । गतिशील रूप से 30 एस के लिए पहले से चयनित आयनों बाहर निकाले जाने के साथ ही नहीं अपरिचित प्रभारी राज्य के साथ आयनों का आरोप लगाया ।
      नोट: बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा के आंतरिक अंशांकन ताला जन विकल्प३९का उपयोग कर किया गया था ।
  4. डेटाबेस खोज
    नोट: डेटाबेस खोज के लिए उपलब्ध अलग सॉफ्टवेयर है । MaxQuant४०, उदाहरण के लिए, आज़ादी से उपलब्ध है ।
    1. कंवर्ट. raw-फ़ाइलों में. mgf-फ़ाइलें एक pXtract रूपांतरण उपकरण (http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html) का उपयोग कर ।
    2. विशिष्ट खोज पैरामीटर का उपयोग कर डेटाबेस खोज निष्पादित करें: डेटाबेस, swissprot; पेप्टाइड जन सहिष्णुता, 10 पीपीएम; टुकड़ा जन सहिष्णुता, ०.५ डा; एंजाइम, trypsin; याद दरार साइटों, 2; चर संशोधन, carbamidomethylation (cysteine) और ऑक्सीकरण (मिथीयोनाईन) ।
      नोट: खोज पैरामीटर्स को प्रायोगिक सेटिंग्स के अनुसार परिवर्तित करें ।
    3. डेटाबेस खोज परिणाम का निरीक्षण । प्रोटीन स्कोर, पहचाने गए पेप्टाइड्स की संख्या, पेप्टाइड स्कोर, और बड़े पैमाने पर सटीकता का मूल्यांकन; अनुक्रम कवरेज प्रोटीन कवरेज की पहचान देता है ।
      नोट: हर खोज इंजन अपने व्यक्तिगत स्कोरिंग एल्गोरिथ्म है । मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता के द्वारा पेप्टाइड स्कोरिंग प्रणाली का मूल्यांकन मनाया. एक अच्छा स्पेक्ट्रम के मुख्य संकेतों को दिखाना चाहिए (पूर्ण) आयन श्रृंखला पहचान पेप्टाइड सत्यापित करने के लिए. आम तौर पर पेप्टाइड स्कोर संभावना आधारित है, अर्थात, पेप्टाइड स्कोर कैसे की संभावना पहचान पेप्टाइड अनुक्रम प्राप्त स्पेक्ट्रम से मेल खाता है के लिए एक उपाय है. प्रोटीन स्कोर आमतौर पर पेप्टाइड स्कोर से प्राप्त होता है और एक प्रोटीन की पहचान की एक सूची में रैंक करने के लिए प्रयोग किया जाता है प्रोटीन ।

3. बरकरार प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री (नेटिव मास स्पेक्ट्रोमेट्री)

  1. electrospray ionization के लिए गोल्ड कोटेड उत्सर्जक की तैयारी
    1. पहले25,४१वर्णित के रूप में कांच केशिकाओं से nanoflow उत्सर्जन को तैयार करने के लिए एक micropipette खींचने का उपयोग करें । ०.७८ मिमी के भीतरी व्यास के साथ borosilicate केशिकाओं का उपयोग करें ।
      नोट: सुई पुलिंग के लिए मापदंडों को बदलकर, टिप आकार और आकार संशोधित किया जा सकता है और नमूने के लिए समायोजित । विभिन्न भीतरी व्यास और दीवार मोटाई के साथ केशिकाओं उपलब्ध हैं ।
    2. कोट प्रवाहकीय सामग्री के साथ कांच केशिकाओं (उदा, सोना या पैलेडियम); एक धूम एक सोने के प्लाज्मा पैदा कोट का उपयोग आम है । अच्छी गुणवत्ता कोटिंग प्राप्त करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
      नोट: कोटिंग पर्याप्त एक स्थिर स्प्रे प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए जब आम केशिका वोल्टेज लागू (नीचे देखें).
  2. देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयार
    नोट: लवण, डिटर्जेंट, या ग्लिसरॉल की बड़ी मात्रा electrospray ionization के साथ संगत नहीं हैं । इसलिए, शुद्धि बफर एक अस्थिर, जलीय बफर द्वारा विमर्श किया है । २०० मिमी अमोनियम एसीटेट आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है । बफ़र exchange के लिए आकार बहिष्करण स्पिन स्तंभों या ultrafiltration डिवाइस का उपयोग करें । कुछ मामलों में, जटिल स्थिरता या गतिविधि बफ़र exchange द्वारा प्रभावित हो सकता है । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा सावधानी से मूल्यांकन और परिसर की गतिविधि की जांच करें । यदि आवश्यक हो, तो विश्लेषण बफ़र में cofactors या additives जोड़ें ।
    1. तेजी से बफर एक्सचेंज के लिए आकार अपवर्जन स्पिन स्तंभों का उपयोग करें । १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा भंडारण बफर निकालें और 4 ° c 1 मिनट के लिए के माध्यम से प्रवाह त्यागें । ५०० µ एल २०० mM अमोनियम एसीटेट जोड़कर तीन बार धो, केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया । स्तंभ पर प्रोटीन नमूने के 20 µ एल लोड और 4 मिनट के लिए १,००० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक ।
      नोट: प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की एकाग्रता 1-10 µ मीटर होनी चाहिए । प्रक्रिया दोहराया जा सकता है अगर गैर वाष्पशील घटक अभी भी विश्लेषण परेशान ।
    2. प्रोटीन नमूना ध्यान केंद्रित करने और एक ही प्रयोग में बफर मुद्रा केंद्रापसारक फिल्टर का उपयोग करें । का प्रयोग करें एक निस्पंदन झिल्ली का आकार ताकना ५०% प्रोटीन के आकार से छोटे विश्लेषण किया ।
      1. निस्पंदन डिवाइस में प्रोटीन नमूना हस्तांतरण और २०० mM अमोनियम एसीटेट जोड़ें । १५,००० x g पर नीचे स्पिन और प्रवाह के माध्यम से त्यागें । जोड़ें २०० mM अमोनियम एसीटेट और दोहराने के केंद्रापसारक । इस चरण को कई बार दोहराएं । केंद्रापसारक गति के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक प्रदर्शन ।
        सावधानी: झिल्ली प्रोटीन फिल्टर डिवाइस की झिल्ली पर हाला करने के लिए करते हैं ।
  3. बरकरार प्रोटीन कॉंप्लेक्स का मास spectrometric विश्लेषण
    नोट: देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए संशोधित किया जा सकता है कि विभिन्न निर्माताओं से सामूहिक स्पेक्ट्रोमीटर के विभिन्न प्रकार हैं, जैसे, quadrupole समय की उड़ान (क्यू-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमीटर या orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर. प्रोटोकॉल के नीचे वर्णित एक Q-तोफ साधन पर प्रदर्शन किया गया ।
    1. केशिका धारक में एक सोने की लेपित केशिका प्लेस और प्रोटीन के नमूने के 1-4 µ एल के साथ केशिका भरें । एक नोचना के साथ सुई की नोक खोलो ।
    2. नैनो-electrospray स्रोत के साथ केशिका धारक कनेक्ट और केशिका स्थिति को समायोजित । शंकु छिद्र करने के लिए 0.5-1.5 सेमी पर केशिका की नोक की स्थिति । उपयोग 80-150 एल/एच nanoflow गैस स्प्रे आरंभ करने के लिए और एक स्थिर स्प्रे बनाए रखने के लिए गैस के प्रवाह को समायोजित ।
    3. क्यू-तोफ लिखत के तारतम्य-पृष्ठ में मापदंडों को समायोजित करें. ठेठ प्रारंभिक स्थितियां हैं: केशिका वोल्टेज, १.५० केवी; शंकु वोल्टेज, ८० V; आरएफ लेंस 1 ऊर्जा, ८० V; टक्कर ऊर्जा, 20 वी; एपर्चर 3, १३.६ V. अच्छे मास स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए इन मापदंडों को संशोधित करें । "मोल" बटन पर क्लिक करके अधिग्रहण शुरू और एक अच्छा बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए संभव के रूप में कई स्कैन के रूप में गठबंधन ।
      नोट: हम अनुशंसा करते हैं कम से मेल १०० स्कैन ।
  4. बरकरार प्रोटीन परिसरों के मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री
    1. ऊपर वर्णित के रूप में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम प्राप्त (प्रोटोकॉल धारा ३.३) । एक प्रोटीन परिसर के अग्रदूत आयन चुनें ।
    2. एमएस में एमएस/एमएस मोड में अधिग्रहण फ़ाइल में बदलें । के प्रणेता जन के लिए ms/
    3. कम टकराव ऊर्जा पर अधिग्रहण शुरू करते हैं । कई स्कैन का मिश्रण (लगभग 20 स्कैन) सही अग्रदूत जन के चयन की पुष्टि करने के लिए । प्रोटीन कॉम्प्लेक्स dissociates तक टकराव की ऊर्जा बढ़ाएं । एक अच्छा बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम को प्राप्त करने के लिए गठबंधन कम से ५०० स्कैन ।
      नोट: कभी-कभार जटिल रूप से कम तीव्रता के होते हैं । संभव के रूप में कई स्कैन के संयोजन के रूप में संकल्प और संकेत करने वाली शोर अनुपात में वृद्धि हो सकती है ।
  5. बरकरार प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के समाधान पृथक्करण में
    नोट: प्रोटीन परिसरों के भीतर प्रोटीन बातचीत में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, में समाधान पृथक्करण किया जा सकता है ।
    1. ऊपर वर्णित के रूप में प्रोटीन नमूना तैयार (धारा ३.२) । प्रोटीन नमूने के लिए सॉल्वैंट्स जोड़ें या उप परिसरों में बरकरार परिसरों अलग करने के लिए पीएच बदल जाते हैं । ठेठ सॉल्वैंट्स मेथनॉल, isopropanol, और ACN हैं; एसिटिक एसिड या अमोनिया समाधान के अलावा द्वारा अमोनियम एसीटेट का पीएच बदलें । ऊपर वर्णित के रूप में मास स्पेक्ट्रा प्राप्त (वर्गों ३.३ और ३.४).
    2. विभिंन उप परिसरों उत्पंन करने के लिए विलायक या पीएच रेंज की राशि बदलती हैं । आमतौर पर, विलायक की राशि 5-50% (अंतिम एकाग्रता) और एक ठेठ पीएच रेंज 4-9 है । विलायक के एक कम एकाग्रता (5%) या पीएच में मामूली परिवर्तन के साथ शुरू और एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम प्राप्त (३.३ अनुभाग देखें) ।
    3. विलायक की मात्रा में वृद्धि या उप परिसरों समाधान में उत्पंन होते है जब तक पीएच stepwise बदल जाते हैं । जन स्पेक्ट्रा मोल उप परिसरों का विश्लेषण करने के लिए ।
  6. डेटा जांचना
    नोट: अधिग्रहीत मास स्पेक्ट्रा सीज़ियम आयोडाइड (सीएसआई) समाधान का उपयोग कर बाहरी तौर पर तुले हुए हैं ।
    1. 1 मिलीलीटर पानी में १०० मिलीग्राम सीएसआई भंग ।
    2. सीएसआई के एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम प्राप्त । टक्कर ऊर्जा के लिए एक ही एम पर सीएसआई समूहों को प्राप्त करने के लिए भिंनता / प्रोटीन परिसर के रूप में ऊपर विश्लेषण किया ।
      चेतावनी: सीएसआई जल्दी से उत्सर्जक टिप पर हाला और शंकु दूषित । पर्याप्त स्पेक्ट्रम हासिल करने के लिए आवश्यक के रूप में केवल के रूप में कई स्कैन मोल । समाप्त होने पर स्रोत से उत्सर्जक निकालें ।
    3. एक अंशांकन अधिग्रहीत बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम और एक सीएसआई संदर्भ फ़ाइल का उपयोग कर फ़ाइल बनाओ ।
    4. अधिग्रहीत विपुल स्पेक्ट्रा के लिए अंशांकन लागू करें ।
      चेतावनी: बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा के अंशांकन कच्चे डेटा का एक स्थायी परिवर्तन हो सकता है. यदि गैर-तुले स्पेक्ट्रा की आवश्यकता है, तो फ़ाइल की बैक-अप प्रतिलिपि बनाएं ।
  7. डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण
    नोट: मूल मास स्पेक्ट्रा के डेटा विश्लेषण के लिए कई स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर उपकरण हैं; मसलन, Massign४२ या UniDec४३. नीचे दिए गए प्रोटोकॉल उपकरण सॉफ्टवेयर की मदद से मैनुअल डेटा विश्लेषण के साथ ही जटिल नमूनों के लिए Massign के उपयोग का वर्णन करता है । यह सॉफ्टवेयर अच्छी तरह से जटिल मास स्पेक्ट्रा के विश्लेषण के लिए अनुकूल है । प्रोग्राम (http://massign.chem.ox.ac.uk/) के उपयोग के लिए ऑनलाइन दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
    1. डेटा विश्लेषण के लिए, स्मूथिंग पैरामीटर्स को समायोजित करके स्मूथ स्पेक्ट्रा करें. केन्द्रक स्पेक्ट्रा मापदंडों का समायोजन करके । साधन सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग कर प्रोटीन ' परिसर पीक लिफाफा के दो आसंन चोटियों से जटिल जनता की गणना ।
      चेतावनी: बहुत गहन स्मूथिंग के कारण हो सकता है डेटा हानि (जैसे, बाउंड लाइगैंडों की हानि) ।
    2. Massign४२के साथ विश्लेषण के लिए, जन स्पेक्ट्रम के लिए एक पीक सूची बनाएं । Linearize स्पेक्ट्रम और चिकनी के डेटा अंक । प्रोटीन कॉंप्लेक्स आवंटित, जटिल संरचना की गणना, या जटिल चोटी लिफाफे अनुकरण करने के लिए विभिन्न सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग करें ।

4. रासायनिक पार-जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित जोड़ने

नोट: कई पार से जोड़ने रणनीतियों उपलब्ध हैं । यहां, हम बीआईएस (sulfosuccinimidyl) suberate (बीएस3), एक अमीन-प्रतिक्रियाशील पार कड़ी है जो सामांयतः प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है के उपयोग का वर्णन ।

  1. भंग १.४३ १०० µ एल पानी में मिलीग्राम बीएस3 एक 25 मिमी स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए ।
    नोट: disuccinimidyl suberate (DSS) जैसे अन्य रिएजेंट पानी में घुलनशील नहीं होते हैं और आमतौर पर dimethyl sulfoxide (DMSO) में घुल जाते हैं । कुछ परस्पर लिंकर भारी isotopically-लेबल वाले प्रपत्रों में भी उपलब्ध हैं । भारी स्थिर आइसोटोप का निगमन एमएस स्पेक्ट्रा में क्रॉस-लिंक्ड डि-पेप्टाइड्स के पीक जोड़े उत्पन्न करता है, जो डेटा मूल्यांकन के दौरान मदद करता है. जब परस्पर लिंकर लेबल का उपयोग कर, दोनों वेरिएंट के शेयर समाधान तैयार कर रहे हैं और मिश्रित 1:1.
    चेतावनी: DMSO द्वारा प्रोटीन परिसरों के पृथक्करण से बचने के लिए, एक उच्च केंद्रित स्टॉक समाधान तैयार है और पार से पहले प्रतिक्रिया जोड़ने के लिए पानी या बफर के साथ पतला है ।
  2. प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में बीएस3 जोड़ें । 0.5 से लेकर बीएस3 की मात्रा अलग-5 मिमी का उपयोग करने के लिए इष्टतम पार-linker एकाग्रता की पहचान । एक thermomixer में 1 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण की मशीन । 4-12% ग्रैडिएंट जैल का उपयोग करें और क्रॉस-लिंक करने वाले परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए एसडीएस-पृष्ठ निष्पादित करना ( चित्र 2 को उदाहरण के लिए देखें) ।
    नोट: बीएस3 की इष्टतम एकाग्रता तक पहुंच जाता है जब उच्च आणविक वजन प्रोटीन बैंड, जो गैर पार से जुड़े नियंत्रण में दिखाई नहीं दे रहे हैं, एसडीएस-पृष्ठ के दौरान प्राप्त कर रहे है जबकि एकल उपइकाई अभी भी दिखाई दे रहे है (चित्रा 2) ।
  3. इष्टतम बीएस3 एकाग्रता के साथ पार जोड़ने की प्रतिक्रिया दोहराएँ. एक thermomixer में 1 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण की मशीन ।
    नोट: कुछ प्रोटीन कॉंप्लेक्स कमरे के तापमान पर स्थिर नहीं हैं । पार से जोड़ने की प्रतिक्रिया भी बर्फ पर प्रदर्शन किया जा सकता है; हालांकि, प्रतिक्रिया समय को समायोजित करने की आवश्यकता है ।
  4. , 50-100 mM Tris बफर, पीएच ७.५, अंतिम एकाग्रता) या किसी भी अवशिष्ट पार-जोड़ने के एजेंट को हटाने के लिए इथेनॉल वर्षण प्रदर्शन को जोड़कर पार की प्रतिक्रिया शमन ।
    1. पानी या प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए बफर जोड़ें २०० के एक अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए µ एल जोड़ें ६०० µ एल बर्फ-शीत इथेनॉल और 20 µ एल 3 एम सोडियम एसीटेट, पीएच ५.३ । 2 ज या रात भर के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिश्रण और गर्मी ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन 30 मिनट के लिए या तरल नाइट्रोजन में ८० डिग्री सेल्सियस पर उपजी जा सकता है ।
    2. १६,२०० x g पर नीचे स्पिन और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस ध्यान से supernatant निकालें ।
    3. 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा ८०% (v/वी) इथेनॉल के साथ गोली धो लो । १६,२०० x g पर नीचे स्पिन और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस ध्यान से supernatant निकालें । एक वैक्यूम केंद्रापसारक में गोली सूखी ।
  5. प्रदर्शन एसडीएस-पार से जुड़े प्रोटीन के पृष्ठ । जेल बैंड कट और प्रोटीन जेल में पचाने के रूप में ऊपर वर्णित (वर्गों २.१ और २.२) ।
    नोट: में समाधान पाचन भी किया जा सकता है, तथापि, यह आम तौर पर अतिरिक्त पृथक्करण चरणों की आवश्यकता है (उदा., आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफीed पेप्टाइड्स की) ।
  6. (धारा २.३) ऊपर वर्णित के रूप में तरल क्रोमैटोग्राफी-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री करते हैं । क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स आमतौर पर कम प्रचुर मात्रा में हैं के रूप में, क्रॉस-लिंक किए गए नमूने की विश्लेषणात्मक गहराई बढ़ाने के लिए मास-spectrometric विश्लेषण करने के लिए निम्न भिन्नता लागू करें ।
    1. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी पृथक्करण के दौरान लंबे ग्रेडिएंट का उपयोग करें (उदा., ९० min के बजाय ६५ min, ऊपर देखें) ।
    2. HCD विखंडन से दोगुना चार्ज किए गए पेप्टाइड को छोड़ दें ।
      नोट: डबल चार्ज किए गए पेप्टाइड्स आमतौर पर इंट्रा-क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स ("लूप पेप्टाइड्स" या "प्रकार 1" क्रॉस-लिंक) हैं ।
    3. जब अंतर को पार से जोड़ने के लिए लेबल का उपयोग कर रिएजेंटों, विश्लेषण के दौरान "चोटी उठा" विकल्प का उपयोग करें, यानी, HCD विखंडन मास स्पेक्ट्रा में परिभाषित जन अंतर के शिखर जोड़े की उपस्थिति से शुरू हो रहा है ।
      नोट: "पीक खरीदना" विकल्प प्रत्येक मास-स्पेक्ट्रोमीटर पर उपलब्ध नहीं हो सकता है ।
  7. क्रॉस-लिंक्ड डि-पेप्टाइड्स की पहचान के लिए pLink software18 का उपयोग करें । पहचान के लिए छोटा डेटाबेस का उपयोग करें । ठेठ खोज मापदंडों हैं: साधन स्पेक्ट्रा, HCD; एंजाइम, trypsin; अधिकतम. याद दरार साइटों, 3; परिवर्तनीय संशोधन, ऑक्सीकरण (मिथीयोनाईन) और carbamidomethylation (cysteine); क्रॉस-linker, बीएस3; min. पेप्टाइड लंबाई, 4; अधिकतम. पेप्टाइड लंबाई, १००; min. पेप्टाइड मास, ४०० डा; अधिकतम. पेप्टाइड मास, १०,००० डा; एफडीआर, 1%.
    नोट: जब परस्पर लिंकर लेबल का उपयोग कर, बड़े पैमाने पर लिंकर के कारण वृद्धि को विंयस्त किया जाना चाहिए । वहां भी है परस्पर लिंक पहचान के लिए अंय सामांय रूप से इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर, जैसे, xQuest17, MassMatrix19, या XlinkX15।
  8. फ़्रेग्मेंटेशन स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता द्वारा डेटाबेस खोज परिणामों का मूल्यांकन करें । क्रॉस-लिंक के स्वीकार्य स्पेक्ट्रा दोनों पेप्टाइड्स की आयन श्रृंखला दिखाने चाहिए (एक उचित संकेत करने के लिए शोर अनुपात में कम से कम 4 आसंन आयनों).
    नोट: क्रॉस-लिंकिंग एजेंट अंतर लेबल का उपयोग करते समय, MS स्पेक्ट्रा में पीक जोड़े एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है ।
  9. यदि आवश्यक हो, पार-प्रोटीन संपर्क नेटवर्क में परिणाम सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग कर कल्पना (उदा, XVis, XiNET) । प्रोटीन इंटरैक्शन के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए बार प्लॉट या गोलाकार भूखंडों का उपयोग करें.
    नोट: दोनों सॉफ्टवेयर उपकरण एक वेब सर्वर पर आसानी से उपलब्ध हैं । संबंधित वेबसाइटों (https://xvis.genzentrum.lmu.de/ और http://crosslinkviewer.org/) पर विस्तृत निर्देशों का पालन करें ।

Representative Results

प्रोटीन के संरचनात्मक विश्लेषण और परिसरों वे फार्म अपने कार्य को समझने के लिए मौलिक है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री काफी है कि यह ब्याज की लगभग हर जटिल आकार या नमूना विविधता की परवाह किए बिना लागू किया जा सकता है में संरचनात्मक जांच करने के लिए योगदान देता है । हम दो अच्छी तरह से विशेषता प्रोटीन परिसरों का उपयोग करके प्रोटोकॉल उदाहरण; पहला, hetero-dodecamer RvB1/B2 से C. thermophilum और दूसरा, hetero-octameric सीपीएस परिसर से ई. कोलाई.

सबसे पहले, हम दो परिसरों के प्रोटीन घटकों की पहचान की । इसके लिए प्रोटीन्स को एसडीएस से अलग किया गया-पेज (figure 2) और जेल बैंड्स को जेल से काट दिया गया । जेल में प्रोटीन के पाचन के बाद, पेप्टाइड मिश्रण तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया गया था-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री और पेप्टाइड और टुकड़ा जनता डेटाबेस खोज के अधीन थे. इस कार्यप्रवाह के बाद, हम उच्च विश्वास के साथ दो परिसरों के सभी प्रोटीन उपइकाइयों की पहचान की, यानी, उचित पेप्टाइड स्कोर के साथ पेप्टाइड्स की एक उच्च संख्या सभी प्रोटीन उपइकाईयों के लिए उच्च अनुक्रम कवरेज उपज देखा गया था (तालिका 1 ).

हम तो देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री (चित्रा 3) द्वारा बरकरार RvB1/ जन स्पेक्ट्रम दो प्रजातियों में से एक, लगभग ८,००० m/z और एक अंय प्रजातियों में लगभग 11000 से पता चला-12000 m/ इन प्रजातियों के लिए गणना द्रव्यमान hexameric (RvB1)3(RvB2)3 अंगूठी (लगभग ३१० केडीए) और dodecameric डबल-रिंग (RvB1)6(RvB2)6 (लगभग ६२० केडीए) के अनुरूप है । दोनों शिखर श्रृंखला शो दो आबादी; इन परिसरों में अपने टैग और untagged RvB2 उपइकाइयों के मिश्रण से उत्पंन । RvB1/B2 कॉम्प्लेक्स के लिए एक क्रिस्टल संरचना पहले३६ प्राप्त किया गया था और डबल-रिंग (चित्र बी) की व्यवस्था दिखाता है । देशी जन स्पेक्ट्रम इसलिए बरकरार dodecamer के stoichiometry की पुष्टि करता है और इसके अलावा एक स्थिर उप जटिल पता चलता है । इसके अलावा, सह मौजूदा आबादी की पहचान कर रहे हैं ।

RvB1/B2 परिसर में प्रोटीन इंटरेक्शन साइटों की पहचान करने के लिए, हम रासायनिक पार से बीएस3 पार लिंकर के साथ शुद्ध परिसर से जुड़े । हम सबसे पहले titrated के दौरान बीएस3 की मात्रा को परस्पर जोड़ने की प्रतिक्रिया के लिए इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करते हैं । बीएस3 अमीन-विशिष्ट है और covalently लिंक lysine साइड चेन के साथ ही प्रोटीन के एन टर्मिनी । क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रिया एसडीएस-पृष्ठ (चित्र 2a) के बाद की गई थी । गैर-पार से जुड़े जटिल दोनों RvB1 और RvB2 उपइकाईयों दिखाया । प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए बीएस3 जोड़ना प्रोटीन उच्च आणविक भार में बैंड में जिसके परिणामस्वरूप के आबंध संबंध का कारण बना । एसडीएस जेल से पता चलता है कि बीएस3 की मात्रा में वृद्धि पार से जुड़े प्रजातियों के उच्च मात्रा उपज जबकि गैर पार से जुड़े प्रोटीन उपइकाई कम कर रहे हैं । हम तो जेल से प्रोटीन बैंड में कटौती और ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल के बाद प्रोटीन संपर्क साइटों की पहचान । क्रॉस-लिंक्ड डि-पेप्टाइड का एक उदाहरण स्पेक्ट्रम दिखाया गया है (चित्र 3सी) । स्पेक्ट्रम दोनों पेप्टाइड्स इस प्रोटीन बातचीत की पुष्टि की y-आयन श्रृंखला से पता चलता है । कुल में, हमने 14 प्रोटीन इंटरैक्शन प्राप्त किए, जिनमें चार क्रॉस-लिंक के बीच उप-इकाईयां RvB1 और RvB2 और दो परस्पर-लिंक के बीच RvB2 की दो प्रतियां (तालिका 2) शामिल हैं । बीएस3 क्रॉस-लिंक से परिणाम एक बातचीत नेटवर्क में कल्पना कर रहे है (चित्रा 3 डी) अंतर आणविक बातचीत दिखा और साथ ही विभिंन उपइकाईयों के बीच बातचीत । अंतर आणविक पार-लिंक सुझाव है कि दोनों RvB1 और RvB2 उप इकाई एक तरह से गुना है कि एन और सी-टर्मिनल डोमेन करीब निकटता में हैं । ध्यान दें, कि इंट्रा-आणविक बातचीत को इस मामले में समान उपइकाई की अंतर-आणविक सहभागिता से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता. दोनों उपइकाईयों के बीच अंतर-आणविक परस्पर-संबंध भी देखा गया. इनमें से, RvB1 और RvB2 के बीच दो अंतर आणविक पार-लिंक को पार से जोड़ने दृष्टिकोण मांय संरचना में visualized किया जा सकता है । अंय अंतर-आणविक पार लिंक लचीला छोरों जो क्रिस्टल संरचना में शामिल नहीं है में स्थित हैं । हम भी एक ही पेप्टाइड अनुक्रम युक्त RvB2 में दो पार लिंक की पहचान की । ये परस्पर लिंक स्पष्ट रूप से अंतर के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है आणविक के रूप में वे एक ही प्रोटीन की दो प्रतियां (चित्रा 3 डी) से शुरू होगा । हमारे पार से जोड़ने के प्रयोगों के भीतर प्रोटीन संपर्क साइटों को पता चलता है, लेकिन यह भी प्रोटीन उप उनके संरचनात्मक व्यवस्था है कि मौजूदा क्रिस्टल संरचना (चित्र बी) द्वारा पुष्टि की जा सकती है में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के भीतर ।

दूसरा प्रोटीन कॉम्प्लेक्स जिसका हमने अध्ययन किया वह सीपीएस था । देशी जन स्पेक्ट्रम (फिगर 4a) के बीच तीन प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से पता चला ६,००० और १२,००० m/ ६४० केडीए का सबसे बड़ा कॉम्प्लेक्स बरकरार hetero-octamer के अनुरूप है. छोटे परिसरों दो उप परिसरों का प्रतिनिधित्व करते हैं; डिमर में लघु एवं वृहद सीपीएसई उपइकाईयों (१६० केडीए) तथा प्रत्येक उपइकाई की दो प्रतियां (३२० केडीए) युक्त hetero-tetramer की गई है. इन उप परिसरों प्रोटीन विधानसभा में पहली अंतर्दृष्टि उद्धार; अर्थात, बड़े और छोटे उपइकाईयों के सीधे संपर्क में हैं (जैसा कि hetero-डिमर द्वारा प्रगट किया जाता है) और tetramer दो dimers का उत्पाद हो सकता है. बरकरार सीपीएस परिसर में संरचनात्मक व्यवस्था के बारे में अधिक जानकारी हासिल करने के लिए, हमने hetero-octamer और hetero-tetramer के सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री (ms/ दोनों ही मामलों में छोटी उपइकाई असंबद्ध के प्रणेता से सुझाव देती है कि छोटी उपइकाई विधानसभा की परिधि में स्थित है (चित्रा 4B). दरअसल, छोटी सी इकाई उपलब्ध क्रिस्टल संरचना (चित्रा 4c)४४में परिधीय है ।

बीएस3 क्रॉस-लिंकर का उपयोग करते हुए केमिकल क्रॉस को जोडऩे का भी प्रदर्शन किया गया । बढ़ती हुई मात्रा का उपयोग करते हुए सीपीएसई उपइकाईयों के आबंध लिंकेज को बढ़ाया गया । प्रोटीन और पेप्टाइड्स के विश्लेषण के रूप में ऊपर वर्णित के पाचन के बाद, बड़ी उपइकाई के भीतर कई प्रोटीन बातचीत और एक क्रॉस-लिंक छोटी उपइकाई में प्राप्त किया गया (तालिका 2) । इसके अलावा, RvB1/B2 कॉम्प्लेक्स के समान, हमने दो अंतर-आण्विक क्रॉस-लिंक को बड़ी सीपीएसई उपइकाई की दो प्रतियों के बीच पाया । ये क्रॉस-लिंक्स अपने सी-टर्मिनल पक्षों में एक-दूसरे का सामना करने वाली दो बड़ी उपइकाईयों को स्थान देता है । पिछले एक अध्ययन में, संरचनात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री और गणनात्मक मॉडलिंग३५के संयोजन में, हमने बड़ी उपइकाई में तीन अतिरिक्त इंटरैक्शन की पहचान की जो सबसे अधिक संभावना से मान्य बड़ी उपइकाई की दो प्रतियों के इंटरफेस से उत्पन्न क्रिस्टल संरचना और प्राप्त मॉडल (चित्र 4c और तालिका 2) । ये बातचीत सीपीएस कोर कॉम्प्लेक्स की व्यवस्था को चार बड़ी उपइकाईयों से मिलकर करने की अनुमति देती है. हालांकि, छोटे और बड़े उपइकाईयों के बीच कोई अंतर-उपइकाई क्रॉस-लिंक नहीं देखी गई । उपलब्ध क्रिस्टल संरचना (चित्र 4c) का निरीक्षण करके, यह स्पष्ट हो जाता है कि जटिल के tetrameric कोर के बीच संपर्क की सतह, बड़े उपइकाई से मिलकर, और परिधीय छोटे उपइकाई बहुत छोटा है, जो समझा सकता है अंतर-उपइकाई सहभागिता का अभाव है. यह देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पुष्टि की है जो पता चला है कि छोटे उपइकाई आसानी से बरकरार परिसरों से dissociates सबसे एक छोटे से बाध्यकारी अंतरफलक के कारण की संभावना है । बहरहाल, रासायनिक परस्पर जोड़ने और देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री से संयुक्त सीपीएस परिसर में प्रोटीन बातचीत उनके संरचनात्मक व्यवस्था (चित्रा 4d) को कम करने की अनुमति देते हैं ।

एक साथ ले लिया, देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री और पार से जुड़े पेप्टाइड्स की जन spectrometric पहचान के साथ युग्मित रासायनिक पार के संयोजन, दोनों उदाहरण परिसरों की संरचनात्मक व्यवस्था के पुनर्गठन की अनुमति देता है । जबकि रासायनिक पार से जोड़ने प्रोटीन उपइकाईयों की व्यवस्था का पता चला, उदाहरण के लिए RvB1 और RvB2 के बीच या सीपीएस के tetrameric कोर के भीतर बातचीत के लिए, देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री बरकरार परिसरों के प्रोटीन stoichiometries दिया और प्रचलित उपपरिसरों । सीपीएस के मामले में, जिसके लिए दो उपयूनिटों के बीच कोई अंतर-आणविक बातचीत रासायनिक पार से जोड़कर देखा जा सकता है, देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री पता चलता है कि प्रत्येक बड़ी उपइकाई एक छोटी सी उपइकाई (चित्रा 4d) के साथ इंटरैक्ट करती है । मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री परिसर में छोटे उपइकाई के परिधीय स्थान और दोनों उपइकाईयों के बीच एक छोटे इंटरफेस का प्रस्ताव किया ।

Figure 1
चित्र 1: मूल मास स्पेक्ट्रोमेट्री और परस्पर जोड़ने का कार्यप्रवाह. दोनों तकनीक पूरक परिणाम प्रदान करते हैं । जबकि देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री पता चलता है stoichiometries और संपर्क मॉड्यूल, पार जोड़ने परिसरों के भीतर प्रोटीन संपर्क साइटों में अंतर्दृष्टि देता है । ध्यान दें कि रासायनिक पार से जोड़ने केवल द्विआधारी बातचीत से पता चलता है । (क) देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री में पहला कदम फिल्टर इकाइयों या जेल निस्पंदन कॉलम का उपयोग कर एक अस्थिर और जलीय बफर करने के लिए बफर एक्सचेंज है । विपुल स्पेक्ट्रोमेट्री बरकरार प्रोटीन कॉम्प्लेक्स तो उनके stoichiometry का पता चलता है. मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों में परिधीय उपइकाईयों को असंबद्ध जाता है. (ख) रासायनिक पार से जोड़ने के लिए, प्रोटीन परिसर एक पार से जोड़ने के एजेंट के साथ मशीन है । पार से जुड़े प्रोटीन तो पेप्टाइड्स जो बाद में तरल क्रोमैटोग्राफी-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण कर रहे है में पचा रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: एसडीएस-क्रॉस-लिंक्ड RvB1/B2 (A) और सीपीएस (B) परिसरों का पृष्ठ. (A) २.५ µ m RvB1/B2 प्रति जेल लेन लोड किए गए थे । बीएस3 की एकाग्रता विविध थी । गैर-पार से जुड़े RvB1/B2 लगभग ५० केडीए में दो प्रोटीन उपइकाईयों को दिखाता है. बीएस3 के अलावा प्रोटीन उपइकाई उच्च आणविक वजन में प्रोटीन बैंड में जिसके परिणामस्वरूप के आबंध संबंध के कारण । पार से जुड़ी प्रजातियों की मात्रा उच्च बीएस3 सांद्रता के साथ वृद्धि हुई है । इष्टतम पार से जोड़ने की स्थिति (लाल) हाइलाइट कर रहे हैं । (ख) 10 µ एम सीपीएस जेल लेन प्रति लोड किया गया । बड़े (९० केडीए) और छोटे (४० केडीए) सीपीएस उपइकाई प्राप्त कर रहे हैं । बीएस3 के अलावा प्रोटीन उपइकाई उच्च आणविक वजन में प्रोटीन बैंड में जिसके परिणामस्वरूप के आबंध संबंध के कारण । इष्टतम पार से जोड़ने की स्थिति (लाल) हाइलाइट कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री और रासायनिक पार-RvB1/ (क) देशी जन स्पेक्ट्रम RvB1 की दो प्रजातियों का पता चलता है/ बरकरार dodecamer (अर्थात, (RvB1)6(RvB2)6) लगभग ११,००० से १२,००० m/z और hexameric रिंग (RvB1)3(RvB2)3 पर लगभग ८,००० m/ दोनों प्रजातियों के दो अपने टैग और untagged RvB2 से उत्पंन आबादी दिखाओ । स्पेक्ट्रम को३५से संशोधित किया गया है । (B) RvB1/B2 की क्रिस्टल संरचना (PDB ID 4WVY) दर्शाई गई है । अदल RvB1 और RvB2 उपइकाईयों के रूप में दो hexameric बजती है । (C) क्रॉस-लिंक्ड डि-पेप्टाइड का विखंडन स्पेक्ट्रम । RvB1 का N-टर्मिनस RvB1 के K23 के साथ क्रॉस-लिंक्ड था । y-आयन श्रृंखला दोनों पेप्टाइड्स (लाल और सियान) के लिए प्राप्त किया गया था । (घ) RvB1/B2 कॉम्प्लेक्स में अंतर-और अन्तर-प्रोटीन इंटरैक्शन प्राप्त किया जाता है. इंट्रा-क्रॉस-लिंक में दिखाए जाते हैं लाल, अंतर-पार-लिंक नीले रंग में दिखाए जाते हैं । डालने के दो अंतर आणविक पार-RvB1 और RvB2 उपइकाई जो क्रिस्टल संरचना में visualized किया जा सकता है (हरे, डालने) के बीच लिंक से पता चलता है । दो RvB2 प्रतियों से उत्पन्न होने वाले इंटरैक्शन को नीले डॉटेड रेखाओं के रूप में दिखाया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री और रासायनिक पार-सीपीएस के जोड़ने । (क) सीपीएस के मूल जन स्पेक्ट्रम तीन परिसरों से पता चलता है । hetero-डिमर (१६० केडीए), hetero-tetramer (३२० केडीए) और hetero-octamer (६४० केडीए) हैं. स्पेक्ट्रम को३५से संशोधित किया गया है । (ख) मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री के tetrameric और octameric सीपीएस परिसर में लघु सीपीएसई उपइकाई के पृथक्करण का पता चला. (ग) सीपीएस की क्रिस्टल संरचना (PDB ID 1BXR) दर्शाई गई है । बड़ी उपइकाईयों के रूप में एक tetrameric कोर और छोटे उपइकाईयों परिसर की परिधि में स्थित हैं । अंतर आणविक पार-बड़ी उपइकाई की दो प्रतियां के बीच लिंक (हरी) दिखाया जाता है । (D) बड़े और छोटे सीपीएस उपइकाईयों की सहभागिता । देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री से पता चला उपपरिसरों और छोटे उपइकाई के एक परिधीय स्थान का पता चलता है । रासायनिक पार लिंक सीपीएस के tetrameric कोर में व्यवस्थाओं का संकेत देते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1: डेटाबेस खोज परिणाम. प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री और डेटाबेस खोज द्वारा की पहचान की गई । प्रोटीन नाम, उपयोग संख्या, और विवरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन द्रव्यमान दिया जाता है । प्रोटीन स्कोर, प्रोटीन के प्रति मनाया स्पेक्ट्रा की संख्या, और मनाया पेप्टाइड दृश्यों की संख्या सूचीबद्ध हैं । उच्चतम शुभंकर पेप्टाइड्स स्कोर के साथ पांच पेप्टाइड प्रत्येक प्रोटीन उपइकाई के लिए सूचीबद्ध हैं । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

तालिका 2: Cross-links RvB1/B2 और सीपीएस में मनाया । परिसरों की उपइकाईयों और परस्पर जुड़े हुए अवशेषों को दिया जाता है. परस्पर लिंक के प्रकार (इंट्रा या अंतर आणविक) अतिव्यापी पेप्टाइड दृश्यों या एक पिछले अध्ययन३५से पता चला था । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल बहु-इकाई प्रोटीन परिसरों के जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक विश्लेषण के लिए प्रदान की जाती हैं । दो तकनीकों, प्रोटोकॉल में वर्णित है, ज्यादातर पूरक परिणाम देने और अच्छी तरह से प्रोटीन के भीतर संरचनात्मक व्यवस्था में अंतर्दृष्टि लाभ (-ligand) परिसरों जो पारंपरिक संरचनात्मक तकनीक से अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो अनुकूल हैं । देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन stoichiometries में अंतर्दृष्टि उद्धार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपपरिसरों और स्थिर संपर्क मॉड्यूल का विश्लेषण करके प्रोटीन बातचीत । पार से जोड़ने, दूसरी ओर, सीधे संपर्क साइटों पर पैदावार जानकारी । क्रॉस-linker इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है, एक निश्चित लचीलापन कर सकते है या विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए ।

प्रदान की प्रोटोकॉल सामांय में आसान प्रदर्शन करने के लिए और समय लेने वाली नहीं हैं । पूरे प्रोटोकॉल एक सप्ताह के भीतर निष्पादित किया जा सकता है और लगभग सभी प्रोटीन परिसरों के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि, सफल विश्लेषण के लिए प्रोटीन परिसर की एक निश्चित राशि की आवश्यकता है । नमूना तैयारी सरल है और विशेष रूप से शुद्ध प्रोटीन परिसरों की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, एक आम ख़तरा मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटीन पहचान के लिए नमूना तैयार करने के दौरान नमूने का संदूषण है । ज्यादातर मामलों में इन संदूषणों keratins जो धूल से उत्पंन, त्वचा, या बाल शामिल हैं । इसलिए, इस तरह के दस्ताने और प्रयोगशाला कोट पहने हुए, जलीय बफ़र्स निस्पंदन, और उच्च शुद्धता सॉल्वैंट्स का उपयोग कर के रूप में अतिरिक्त देखभाल बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटीन पहचान के लिए नमूना तैयारी के दौरान लिया जाना चाहिए । chaperones जैसे अंय दूषित प्रोटीन आमतौर पर प्रोटीन शुद्धि के दौरान शुरू की, जैसे, जब संबंध टैग का उपयोग कर रहे हैं । इन मामलों में, प्रोटीन शुद्धि सुधार किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए धोने कदम बढ़ाने के द्वारा । किसी भी मामले में, प्रोटीन के नमूने में संक्रमण आसानी से वर्गीकरण फ़िल्टर (यानी, सभी प्रजातियों से प्रोटीन के खिलाफ खोज) का लोप करके डेटाबेस खोज के दौरान पहचाने जाते हैं । यदि केवल कुछ पेप्टाइड्स मनाया (यानी, एक कम प्रोटीन कवरेज प्राप्त किया जा सकता है), भले ही पर्याप्त नमूना उपलब्ध है, यह पाचन के दौरान एक अलग proteinase का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. सामान्य Trypsin में पर्याप्त संख्या में पेप्टाइड की पैदावार; हालांकि, झिल्ली प्रोटीन या प्रोटीन की झिल्ली डोमेन के रूप में कुछ मामलों में, tryptic क्लीवेज साइटों की संख्या कम हो गई है और अन्य एंजाइमों hydrophobic अमीनो एसिड लक्ष्यीकरण एक बेहतर विकल्प हैं.

इंस्ट्रूमेंटेशन के संदर्भ में, एक विशेष रूप से संशोधित साधन देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री जो गैस चरण में स्थानांतरण के दौरान गैर आबंध बातचीत का कहना है के लिए आवश्यक है. क्यू-तोफ और orbitrap इंस्ट्रूमेंट्स सहित कई साधन प्रकार पेश किए गए हैं । जबकि संशोधित Q-तोफ मास स्पेक्ट्रोमीटर कई वर्षों के बाद से देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, बाद में ही हाल ही में शुरू किए गए थे और ज्यादातर मामलों में विशेष संशोधन४५की आवश्यकता है । हालांकि, उच्च संकल्प उपकरणों के आवेदन एकाधिक लाइगैंडों और उनके ठहराव४६के बंधन का अध्ययन करने की अनुमति दी,४७ और भविष्य अनुप्रयोगों के लिए वादा कर रहा है ।

तरल क्रोमैटोग्राफी-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा क्रॉस-लिंक्ड डि-पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए, कुछ संशोधनों के साथ मानक कार्यविधियां लागू की जा सकती हैं । हालांकि, डेटाबेस खोज विशेष सॉफ़्टवेयर शायद ही कभी बड़े डेटाबेस के साथ सौदा कर सकते है के रूप में सीमित कारक है, और कम प्रोटीन वाले परिसरों के उपइकाईयों युक्त डेटाबेस आवश्यक हैं । हाल के अध्ययनों से पूरे सेल lysates४८,४९में प्रोटीन बातचीतकोलक्षित जन स्पेक्ट्रोमेट्री-सट क्रॉस-लिंकर्स का इस्तेमाल किया । रासायनिक पार से लिंकर का उपयोग करें कि मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों में टुकड़ा ज्यादातर रैखिक पेप्टाइड्स पैदावार (क्रॉस-linker द्वारा संशोधित), जो आगे विखंडन और डेटाबेस रैखिक पेप्टाइड्स की खोज द्वारा पहचाना जा सकता है, और यह कम कर देता है खोज समय और गणना की खोज अंतरिक्ष । हालांकि, इन प्रयोगों, एक आयन ट्रैप जन विश्लेषक या एक आयन जाल के साथ एक संकर जन स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए आवश्यक है. सामांय में, के रूप में झूठी-सकारात्मक एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, पार से जुड़े बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा पेप्टाइड्स अक्सर अपने टुकड़ा स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता है जो डेटा विश्लेषण समय काफी विस्तार से मैंयुअल रूप से मांय हैं । मजबूत स्कोरिंग प्रणालियों है कि आगे सत्यापन कदम के बिना लागू किया जा सकता है इसलिए संभावित भविष्य अनुप्रयोगों के विकास । एक तरह से डेटा विश्लेषण में सुधार करने के लिए और झूठी-सकारात्मक की संख्या को कम करने के लिए झूठी खोज दर गणना और उनके आवेदन को पार करने के लिए डेटा सेट५०का परिचय था ।

सामांय में, यहां वर्णित तकनीकों को आगे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों के साथ पूरित किया जा सकता है (उदा, आबंध लेबलिंग) विश्लेषण से उत्पादन बढ़ाने के लिए । अंय संशोधनों और प्रोटोकॉल के सुधार आसानी से लागू किया जा सकता है । इस तरह के तुलनात्मक पार से जोड़ने के रूप में३४ प्रोटीन विधानसभा में संरचना परिवर्तन सुलझाना । देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री में आगे की घटनाओं आजकल झिल्ली प्रोटीन के विश्लेषण की अनुमति दें५१,५२ और लिपिड के साथ उनकी बातचीत28,५२,५३,५४ . देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर के नए विकास आवेदन और ligand बंधन बढ़ा दिया है, जैसे, झिल्ली प्रोटीन के लिए लिपिड के बंधन, अब विश्लेषण४५में शामिल किया जा सकता है, ४६. गणनात्मक मॉडलिंग के दृष्टिकोण के साथ संयोजन में, इन तकनीकों अलग संकल्प५५के संरचनात्मक मॉडल वितरित कर सकते हैं । यदि कोई क्रिस्टल संरचनाओं बरकरार परिसर या एकल उपइकाईयों के लिए उपलब्ध हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन बातचीत और अज्ञात परिसर की टोपोलॉजी में पहली अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । इस्तेमाल तकनीक और परिणाम प्राप्त के आधार पर, अज्ञात परिसर के कम संकल्प मॉडल प्राप्त किया जा सकता है५६,५७,५८। यदि क्रिस्टल संरचनाओं या समरूपता मॉडल उपलब्ध हैं, संरचनात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री से प्राप्त जानकारी भी निकट देशी मॉडल५९उपज सकते हैं ।

अंय संरचनात्मक तकनीक के साथ तुलना में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री लाभ है कि यह कम नमूना मात्रा की आवश्यकता है, यह विषम नमूनों के साथ सौदा कर सकते है और असीमित आकार के प्रोटीन परिसरों के लिए लागू है । इसके अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री गतिशील प्रोटीन प्रणालियों की जांच की अनुमति देता है । प्रोटीन या प्रोटीन जटिल है कि समाधान में मौजूद के विभिंन आबादी आम तौर पर एक साथ विश्लेषण कर रहे है और इसलिए, अंय संरचनात्मक तकनीक है जो कुछ आबादी के चयन की आवश्यकता के साथ विपरीत, सभी संरचनाओं के दौरान बनाए रखा जाता है विश्लेषण और एक प्रयोग में assessable हैं । मात्रात्मक पार से जोड़ने के दृष्टिकोण हाल ही में३४,६०,६१ शुरू किए गए और भविष्य के विभिंन परिस्थितियों में गठन के परिवर्तन का वर्णन अनुप्रयोगों के लिए वादा कर रहे हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए हमारे सहयोगियों को धंयवाद । हम प्रोटीन कॉम्प्लेक्स प्रदान करने के लिए Ilme Schlichting और कार्ल-पीटर Hopfner का भी शुक्रिया अदा करते हैं । हम शिक्षा और अनुसंधान के लिए संघीय मंत्रालय से धन स्वीकार करते है (BMBF, ZIK कार्यक्रम, 03Z22HN22), यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधियों (EFRE, ZS/2016/04/78115) और MLU हाले-विटेनबर्ग को सीएस और धन से वेलकम ट्रस्ट (109854/658 z/15/z) एपी करने के लिए

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, Consumables
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma Aldrich H4034 buffer
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 pH
Acetonitrile Optima LC/MS Fisher Chemicals A955-1 solvent
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) Millipore i.e. UFC500396 buffer exchange, concentration
Ammonium acetate solution Sigma Aldrich A2706 native MS
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830 in-gel digestion
Ammonium solution Sigma Aldrich 9859 pH
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) Thermo Scientific 21590 cross-linker
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) Thermo Scientific 21595 cross-linker
Caesium iodide Sigma Aldrich 203033 calibration
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 in-gel digestion
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) Harvard Apparatus 30-0038 native MS
Disuccinimidyl suberate (DSS) Thermo Scientific 21655 cross-linker
DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich D5545 in-gel digestion
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D8418 solvent
Ethanol Fisher Chemicals BP2818 solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Instant Blue Coomassie staining solution expedeon ISB1L staining solution for gel electrophoresis
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) life technologies NP0323BOX gel electrophoresis
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 In-gel digestion
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Micro BioSpin 6 columns BioRad 732-6222 buffer exchange
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005 running buffer, gel electrophoresis
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) invitrogen NP0007 sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis
NuPAGE MES SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE MOPS SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) invitrogen NP0004 reducing Agent for gel electrophoresis
PBS - phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 buffer
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker invitrogen LC5925 prestained Protein Marker for gel electrophoresis
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889 ethanol precipitation
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma Aldrich 252859 buffer
Trypsin Sigma Aldrich TRYPSEQ-RO (11418475001) in-gel digestion
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) Sartorius i.e. VS0101 buffer exchange, concentration
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge Thermo Scientific 75002425
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 Sutter Instruments P-1000
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell Invitrogen EI0001
Gold Coater Quorum Q150R S Quorum Technologies Ltd. Q150RS
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T Heidolph Instruments 544-41200-00
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade Waters (Micromass) -
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) Thermo Scientific 164570
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) Thermo Scientific 164213
scalpel Fisher Scientifc 10463989
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge Thermo Scientific SPD121DP-230
Thermomixer C Eppendorf 5382000015
Tweezers AA Sigma Aldrich Z680184-1EA
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath VWR 142-0084
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) Thermo Scientific 0726030+
Name Company Catalog Number Comments
Software, Software Tools, Database search
Mascot www.matrixscience.com
Massign http://massign.chem.ox.ac.uk
MassLynx Micromass
MassMatrix Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)
MaxQuant Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)
pLink Yang, B. Nat Methods 9 (2012)
pXtract conversion tool http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html
UniDec Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)
XCalibur Thermo Scientific
XiNET http://crosslinkviewer.org
XLinkX Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)
xQuest Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)
Xvis https://xvis.genzentrum.lmu.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, I. D. Timeline: the march of structural biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 377-381 (2002).
  2. Liko, I., Allison, T. M., Hopper, J. T., Robinson, C. V. Mass spectrometry guided structural biology. Curr Opin Struct Biol. 40, 136-144 (2016).
  3. Robinson, C. V. From molecular chaperones to membrane motors: through the lens of a mass spectrometrist. Biochem Soc Trans. 45 (1), 251-260 (2017).
  4. Lossl, P., van de Waterbeemd, M., Heck, A. J. The diverse and expanding role of mass spectrometry in structural and molecular biology. EMBO J. 35 (24), 2634-2657 (2016).
  5. Wang, L., Chance, M. R. Protein Footprinting Comes of Age: Mass Spectrometry for Biophysical Structure Assessment. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 706-716 (2017).
  6. Steen, H., Mann, M. The ABC's (and XYZ's) of peptide sequencing. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (9), 699-711 (2004).
  7. Olsen, J. V., Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).
  8. Schmidt, C., Robinson, C. V. Dynamic protein ligand interactions--insights from MS. FEBS J. 281 (8), 1950-1964 (2014).
  9. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: what is it and what can it tell us? Anal Bioanal Chem. 397 (3), 967-972 (2010).
  10. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  11. Leitner, A., Lindner, W. Current chemical tagging strategies for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 813 (1-2), 1-26 (2004).
  12. Leitner, A., Lindner, W. Chemistry meets proteomics: the use of chemical tagging reactions for MS-based proteomics. Proteomics. 6 (20), 5418-5434 (2006).
  13. Kiselar, J. G., Chance, M. R. Future directions of structural mass spectrometry using hydroxyl radical footprinting. J Mass Spectrom. 45 (12), 1373-1382 (2010).
  14. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chem Rev. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  15. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  16. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  17. Rinner, O., et al. Identification of cross-linked peptides from large sequence databases. Nat Methods. 5 (4), 315-318 (2008).
  18. Yang, B., et al. Identification of cross-linked peptides from complex samples. Nat Methods. 9 (9), 904-906 (2012).
  19. Xu, H., Hsu, P. H., Zhang, L., Tsai, M. D., Freitas, M. A. Database search algorithm for identification of intact cross-links in proteins and peptides using tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3384-3393 (2010).
  20. Leitner, A., Faini, M., Stengel, F., Aebersold, R. Crosslinking and Mass Spectrometry: An Integrated Technology to Understand the Structure and Function of Molecular Machines. Trends Biochem Sci. 41 (1), 20-32 (2016).
  21. Heck, A. J. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).
  22. Sharon, M., Robinson, C. V. The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes. Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).
  23. Goth, M., Pagel, K. Ion mobility-mass spectrometry as a tool to investigate protein-ligand interactions. Anal Bioanal Chem. , (2017).
  24. Uetrecht, C., Rose, R. J., van Duijn, E., Lorenzen, K., Heck, A. J. Ion mobility mass spectrometry of proteins and protein assemblies. Chem Soc Rev. 39 (5), 1633-1655 (2010).
  25. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).
  26. Sobott, F., Hernandez, H., McCammon, M. G., Tito, M. A., Robinson, C. V. A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies. Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).
  27. Rostom, A. A., et al. Detection and selective dissociation of intact ribosomes in a mass spectrometer. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5185-5190 (2000).
  28. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  29. Uetrecht, C., et al. High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).
  30. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Rep. 11 (5), 759-769 (2015).
  31. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. The joining of the Hsp90 and Hsp70 chaperone cycles yields transient interactions and stable intermediates: insights from mass spectrometry. Oncotarget. 6 (21), 18276-18281 (2015).
  32. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Sci Rep. 7, 44068 (2017).
  33. Schmidt, C., et al. Comparative cross-linking and mass spectrometry of an intact F-type ATPase suggest a role for phosphorylation. Nat Commun. 4, 1985 (2013).
  34. Schmidt, C., Robinson, C. V. A comparative cross-linking strategy to probe conformational changes in protein complexes. Nat Protoc. 9 (9), 2224-2236 (2014).
  35. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Anal Chem. 89 (3), 1459-1468 (2017).
  36. Lakomek, K., Stoehr, G., Tosi, A., Schmailzl, M., Hopfner, K. P. Structural basis for dodecameric assembly states and conformational plasticity of the full-length AAA+ ATPases Rvb1 · Rvb2. Structure. 23 (3), 483-495 (2015).
  37. Mareya, S. M., Raushel, F. M. A molecular wedge for triggering the amidotransferase activity of carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 33 (10), 2945-2950 (1994).
  38. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).
  39. Olsen, J. V., et al. Parts per million mass accuracy on an Orbitrap mass spectrometer via lock mass injection into a C-trap. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 2010-2021 (2005).
  40. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  41. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J Vis Exp. (40), (2010).
  42. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Anal Chem. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  43. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Anal Chem. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  44. Thoden, J. B., Wesenberg, G., Raushel, F. M., Holden, H. M. Carbamoyl phosphate synthetase: closure of the B-domain as a result of nucleotide binding. Biochemistry. 38 (8), 2347-2357 (1999).
  45. Rose, R. J., Damoc, E., Denisov, E., Makarov, A., Heck, A. J. High-sensitivity Orbitrap mass analysis of intact macromolecular assemblies. Nat Methods. 9 (11), 1084-1086 (2012).
  46. Gault, J., et al. High-resolution mass spectrometry of small molecules bound to membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 333-336 (2016).
  47. Mehmood, S., et al. Mass spectrometry captures off-target drug binding and provides mechanistic insights into the human metalloprotease ZMPSTE24. Nat Chem. 8 (12), 1152-1158 (2016).
  48. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  49. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).
  50. Walzthoeni, T., et al. False discovery rate estimation for cross-linked peptides identified by mass spectrometry. Nat Methods. 9 (9), 901-903 (2012).
  51. Barrera, N. P., Di Bartolo, N., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles protect membrane complexes from solution to vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  52. Barrera, N. P., et al. Mass spectrometry of membrane transporters reveals subunit stoichiometry and interactions. Nat Methods. 6 (8), 585-587 (2009).
  53. Laganowsky, A., et al. Membrane proteins bind lipids selectively to modulate their structure and function. Nature. 510 (7503), 172-175 (2014).
  54. Marcoux, J., et al. Mass spectrometry reveals synergistic effects of nucleotides, lipids, and drugs binding to a multidrug resistance efflux pump. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9704-9709 (2013).
  55. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. J Proteomics. , (2017).
  56. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  57. Pukala, T. L., et al. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).
  58. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chem Biol. 22 (1), 117-128 (2015).
  59. Politis, A., et al. A mass spectrometry-based hybrid method for structural modeling of protein complexes. Nat Methods. 11 (4), 403-406 (2014).
  60. Fischer, L., Chen, Z. A., Rappsilber, J. Quantitative cross-linking/mass spectrometry using isotope-labelled cross-linkers. J Proteomics. 88, 120-128 (2013).
  61. Yu, C., et al. Developing a Multiplexed Quantitative Cross-Linking Mass Spectrometry Platform for Comparative Structural Analysis of Protein Complexes. Anal Chem. 88 (20), 10301-10308 (2016).

Tags

जैव रसायन अंक १२९ मास स्पेक्ट्रोमेट्री क्रॉस-लिंकिंग नेटिव मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन कॉम्प्लेक्स प्रोटीन इंटरैक्शन प्रोटीन stoichiometry प्रोटीन नेटवर्क डेटा विश्लेषण
बहु-उप इकाई प्रोटीन सभाओं की वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए बरकरार प्रोटीन परिसरों के रासायनिक पार से जोड़ने और जन स्पेक्ट्रोमेट्री का मेल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S.,… More

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S., Kostmann, S., Politis, A., Schmidt, C. Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies. J. Vis. Exp. (129), e56747, doi:10.3791/56747 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter