Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinere kjemisk Cross-linking og massespektrometri av intakt Protein komplekser å studere arkitektur multi delenhet Protein samlinger

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56747
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Interdisciplinary research center HALOmem, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Chemistry, Kings College London
* These authors contributed equally

Summary

Arkitekturen av protein komplekser er nødvendig for sin funksjon. Kombinere ulike masse spectrometric teknikker vist seg kraftig å studere forsamlingen deres. Vi tilbyr protokoller for kjemiske cross-linking og innfødt massespektrometri og Vis hvordan disse utfyllende teknikker bidra til å belyse arkitektur multi delenhet protein samlinger.

Abstract

Proteiner samhandle med deres ligander til skjemaet aktiv og dynamisk samlinger som utfører ulike cellulære funksjoner. Klargjørende disse interaksjonene er derfor grunnleggende for forståelsen av cellulære prosesser. Men mange protein komplekser er dynamiske samlinger og er ikke tilgjengelig med konvensjonelle strukturelle teknikker. Massespektrometri bidrar til strukturelle etterforskningen av disse samlingene, og spesielt kombinasjonen av ulike masse spectrometric teknikker gir verdifull innsikt i deres strukturelle arrangement.

I denne artikkelen vi beskriver programmet og kombinasjon av to utfyllende masse spectrometric teknikker, nemlig kjemiske cross-linking kombinert med massespektrometri og innfødt massespektrometri. Kjemisk cross-linking innebærer kovalente sammenhengen av aminosyrer i nærheten ved hjelp av kjemiske reagenser. Etter fordøyelsen med proteaser, krysskoblet di-peptider identifiseres massespektrometri og protein interaksjoner nettsteder er avdekket. Native massespektrometri er derimot analysen av intakt protein samlinger i gassform av en masse spectrometer. Det avslører protein stoichiometries som protein og ligand interaksjoner. Begge teknikkene derfor gir utfyllende informasjon om strukturen i protein-ligand samlinger og kombinasjonen vist seg kraftig i tidligere studier.

Introduction

Strukturelle etterforskningen av protein samlinger har blitt spesielt viktig for forståelsen av cellulære prosesser. Følgelig er mange teknikker utviklet og forbedret i strukturell biologi1. Men er disse teknikkene noen ganger begrenset i sitt program på grunn av størrelse, fleksibilitet eller heterogenitet protein komplekser under etterforskning. Massespektrometri kan håndtere disse utfordringene, og derfor dukket opp som et kraftig verktøy i strukturell biologi2,3,4,5. Den største fordelen av massespektrometri, er imidlertid muligheten til å entydig identifisere proteiner i komplekse og heterogene blandinger6. Dette proteiner er vanligvis fordøyd med endoproteinases og resulterende peptid blandingen er atskilt med flytende kromatografi og direkte elut i masse spectrometer. Peptid massene bestemmes senere og forløper ioner velges for ytterligere fragmentering av peptider. Proteiner identifiseres deretter søker peptid og tilsvarende fragment massene mot en kjent database. Denne prosedyren ikke bare lar identifikasjon av peptider/proteiner, men også deres post-translasjonell endringer som forårsaker en masse forskyvning av forløperen peptider og fragment ioner bærer endring7. Noen av de mange teknikkene i strukturelle massespektrometri er basert på dette prinsippet4,8. For eksempel fot merking teknikker som hydrogen deuterium exchange9,10, kjemiske merking strategier11,12eller hydroksyl radikale utskrift13,14 , gir innsikt i overflaten tilgjengelighet av proteiner under visse betingelser.

En annen teknikk er (kjemisk) cross-linking involverer kovalente sammenhengen av aminosyrer i nærheten gjennom deres funksjonelle grupper. For dette er kjemiske reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyrer ansatt15,16. Etter cross-linking, proteiner er vanligvis hydrolyzed med proteaser og krysskoblet di-peptider analyseres av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri. Identifikasjon av cross-linking produkter av database søker, men krever bruk av spesialisert programvare som sammenhengende peptid sekvenser av ulike proteiner og ulike regioner17,18,19. Bruk av kjemiske cross-linkers har fordelen at det kan brukes til nesten alle protein kompleks av interesse og krever ikke innlemmelse av UV-activatable aminosyrer, som bare kan nås når uttrykke protein interesse vertsceller. Slik cross-linking er et allsidig verktøy og var vellykket ansatt i mange strukturelle studier selv store protein samlinger20.

Massespektrometri av intakt protein komplekser (også kalt "native" massespektrometri), derimot, omfatter analyse av intakt proteiner og protein komplekser uten hydrolyse i peptider. Det avslører komposisjon, heterogenitet, støkiometri, topologi og delenhet interaksjoner protein komplekser21,22. I kombinasjon med ion mobilitet lar innfødt massespektrometri videre fastsettelse av deres konformasjon23,24. Dette gjør det et kraftig verktøy for strukturelle etterforskningen av protein komplekser som er vanskelig å vurdere av konvensjonelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri krever imidlertid analyse buffere som opprettholde ikke-kovalente protein interaksjoner under electrospray ionisering. Dette oppnås vanligvis ved hjelp av vandig, flyktige buffere som ammonium acetate25. I tillegg er instrument endringer nødvendig for å hindre dissosiasjon under overføring i gassform masse spectrometer26. Brukt på denne måten, ble mange (stor) protein komplekser analysert. Imponerende eksempler er studiene intakt ribosomer27, ATP synthases28eller virus29.

Kombinasjonen av innfødte massespektrometri og cross-linking vist på tidligere studier. For eksempel stoichiometries av Anstandsdame komplekser, inkludert en uventet Hsp70 dimer, kan hentes fra massespektrometri eksperimenter av intakt protein komplekser, mens kjemiske cross-linking avslørt arrangementer av proteiner i den samlinger30,31. I en annen studie, ble effekter av post-translasjonell modifikasjoner på en intakt ATP syntase komplekse studert. Native massespektrometri gitt innsikt i protein kompleks stabiliteten i tilstedeværelse eller fravær av fosforylering eller acetylation32,33. En komparativ cross-linking strategi34 da avslørt conformational endringer av proteinet under forskjellige betingelser.

Her gir vi protokollene for protein identifikasjon av massespektrometri, (kjemisk) cross-linking og innfødt massespektrometri, inkludert dataanalyse og fortolkning (figur 1). Kombinasjonen av utfyllende resultatene fra disse metodene med hjelp av to godt karakterisert protein komplekser er demonstrert35. Våre protokollen kan brukes til alle protein samling som kan renses på visse renhet og konsentrasjon. Tilnærmingen er i noen tilfeller begrenset av data analysen av cross-linking data, dvs., størrelsen på databasen ansatt, som bestemmer de nødvendige søke plass og tid. I tillegg manualen godkjenningen av identifiserte cross-links er ofte nødvendig og ytterligere reduserer produksjonen. Innfødt massespektrometri er stort sett begrenset av prøven kvalitet, f.eks, buffere og addukter brukes under rensing og muligheten til å utveksle dem av vandige og flyktige buffere. Protein komplekser renset for strukturell analyse vanligvis har imidlertid kvaliteten kreves for vellykket analyse med våre protokoller.

Protocol

1. rensing av Protein komplekser

  1. Forberede protein kompleks ifølge optimalisert standardprotokoller.
    Merk: Protokollen er vist her med RvB1/B2 komplekse fra Chaetomium thermophilum og carbamoyl fosfat syntase (CPS) fra Escherichia coli. RvB1/B2 og CPS ble renset som beskrevet36,37. Hver proteinet krever en personlige rensing protokoll. Protokollen, justeres tilsvarende. Amin-fri buffere som fosfat-bufret saltvann (PBS) eller 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syre (HEPES) skal brukes for kjemiske cross-linking. Erstatte bufferen under renselsen hvis mulig.
    Advarsel: Ikke bruk alle metoder eller reagensene som forstyrrer innfødt montering av proteinet.

2. masse massespektrometri-basert Protein identifikasjon

  1. Gel geleelektroforese
    Merk: Det er ulike gel systemer tilgjengelig hvert laboratorium bruker egne oppsett. Justere betingelsene etter gel systemet. Bruke hansker og Laboratoriefrakk gjennom protokollen som keratins er blant de vanligste forurensningene i masse spectrometric analyse.
    1. Bruke 7,5 µL 4 x prøve buffer og 3 µL 10 x reduksjonsmiddel (siste konsentrasjon 50 mM dithiothreitol (DTT)) 20 µL protein utvalg. Bruk 10 µM CPS eller 2,5 µM RvB1/B2. Nedspinning for 1 min på 16,200 × g og varme i 10 minutter til 70 ° C.
      Merk: Ved å bruke en annen gel når justere nødvendig volumer og oppvarming temperatur.
    2. Forberede en 4-12% gradient gel geleelektroforese. Fortynne kjører bufferen 20 ganger med vann og fyll geleelektroforese kammeret. Bruk 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer for proteiner av mindre molekylvekt (2-200 kDa) og 3-(N-morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER) buffer for større proteiner (14-200 kDa). Legg til 0,5 mL antioksidant det indre kammeret.
      Merk: Ved å bruke en annen gel når forberede kjører buffer og gel i henhold til produsentens protokoller.
    3. Laste inn en passende protein markør (pre farget, unstained kvinne, ulike molekylær størrelse) i første hulrom og laste inn protein prøvene i gjenværende hulrom.
    4. Separate proteiner 35 min (MES) eller 50 min (MOPPER) 200 V.
      Merk: Justere geleelektroforese ganger og spenning for ulike gel systemer.
    5. Til stain protein bandene, overføre gel i en gel flekker boksen og dekke gel med en vannbasert Coomassie flekk løsning. Ruge over natten, og ved romtemperatur på en vannrett gel shaker.
    6. Destain gel ved å erstatte flekker løsningen med vann. Gjenta dette flere ganger (ca 3 - 5 ganger) til gel bakgrunnen synes klart.
  2. I-gel fordøyelse
    Merk: For å unngå forurensning, løsemidler HPLC klasse gjennom fordøyelsen protokollen og for alle følgende (dvs., masse spectrometric analyse). Forberede alle løsninger før og filtratet vann og ammonium bikarbonat.
    1. Kutt protein bandene som er visualisert ved blå Coomassie flekker fra gel ved hjelp av en skalpell. Kutt forsiktig skyll protein bandene i små biter av ca 1 mm × 1 mm. skalpell med vann mellom annet protein band. Vask gel band med vann og acetonitrile (ACN).
    2. Redusere disulphide obligasjoner med DTT, alkylate cystein rester med iodoacetamide og fordøye proteiner med trypsin som tidligere beskrevet38; vanligvis brukes en enzym: protein forholdet 1:20 til 1: 100. Bruke 100 mM ammonium bikarbonat under fordøyelsen protokollen.
    3. Ekstra peptider i to trinn.
      1. Først ruge gel bitene med ammonium bikarbonat og ACN, og samle peptid inneholder nedbryting. Andre ruge gel bitene med 5% (v/v) maursyre og ACN. Inkuber i 15 min på hvert trinn. Kombinere begge supernatants. Tørke de utpakkede peptidene ved fordamper løsemidler i et vakuum sentrifuge.
        Merk: Tørket peptider kan lagres på 20 ° C i flere måneder.
  3. Flytende kromatografi-kombinert massespektrometri
    1. Oppløse de tørkede peptidene i 2% ACN/0.1% maursyre. Oppløses peptider i et sonication bad for 2-3 minutter og spinn ned i en centrifuge 16,200 x g for 30 min. overføring prøvene i autosampler ampuller.
      Merk: Lydstyrken til protein så mye. For godt farget Coomassie band bruker vi 20 µL.
    2. Injisere 5 µL av utvalget nano-LC--MS-/ MS systemet ved hjelp av autosampler. Last peptid blandingen på en tilbakeført-fase C18 pre kolonne (C18, 150 µm ID, 2 cm, 5 µm porestørrelse) desalt og konsentrere peptidene online.
    3. Bruke 0,1% (v/v) maursyre mobile fase A og 80% ACN/0.1% (v/v) maursyre som mobil fase B. Separate peptidene på en tilbakeført-fase C18 analytisk kolonne (C18, 75 µm ID, 50 cm, 3 µm porestørrelse) ved hjelp av en gradient 4-80% B (inneholder 0,1% maursyre) på 300 nL / min over 65 min.
      Merk: En nanospray ion kilde til å overføre elut peptider i masse spectrometer.
    4. Bruk (typisk) MS forhold: spray for 1.6 kV; kapillær temperatur på 250 ° C; normalisert kollisjon energi 30. Operer på masse spectrometer i data-avhengige modus.
    5. Skaffe til MS spectra i masse analyzer (f.eks, orbitrap) (m/z 350−1, 600) med en oppløsning på 70 000 og en automatisk få kontroll målet på 3 x 106. Velg 20 av de mest intense ionene for HCD fragmentering på automatisk få kontroll mål 1 x 105. Dynamisk valgt utelukke tidligere ioner for 30 s. utelukke enkeltvis belastet ioner som ioner med ukjent anklagen tilstanden.
      Merk: Intern kalibrering av til masse spectra ble utført lås masse alternativet39.
  4. Databasen søker
    Merk: Det er annen programvare tilgjengelig for database søk. MaxQuant40, for eksempel, er fritt tilgjengelig.
    1. Konvertere *.Raw-filer til .mgf-filer ved hjelp av et pXtract konverteringsverktøyet (http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html).
    2. Utføre databasesøk med typiske søkeparameterne: Database, swissprot; peptid masse toleranse, 10 ppm; fragment masse toleranse, 0,5 Da; enzym, trypsin; tapte cleavage nettsteder, 2; variabel modifikasjoner, carbamidomethylation (cystein) og oksidasjon (metionin).
      Merk: Endre søkeparameterne de eksperimentelle innstillinger.
    3. Undersøk databasen søkeresultatet. Vurdere protein score, antall peptider identifisert, peptid score, og masse nøyaktighet; sekvensen dekningen returnerer protein dekningen identifisert.
      Merk: Hver søkemotor har sin personlige scoring algoritme. Evaluere peptid poengsystem av kvaliteten på til sammen masse spectra observert. Viktigste signaler om et godt spekter bør vise (fullført) ion serie å bekrefte den identifiserte peptid. Vanligvis peptid er sannsynlighet-basert, dvspeptid er et mål for hvor sannsynlig identifiserte peptid sekvensen tilsvarer innhentet spekteret. Protein score er vanligvis avledet fra peptid score og brukes til å rangere et protein i en identifisert proteiner.

3. massespektrometri av intakt Protein komplekser (Native massespektrometri)

  1. Utarbeidelse av gull-belagt emittere for electrospray ionization
    1. Bruk en brønnene avtrekker for å forberede nanoflow emittere fra glass kapillærene som beskrevet tidligere25,41. Bruk borosilicate kapillærene med en diameter på 0.78 mm.
      Merk: Ved å endre parameterne for p trekking, form og størrelse kan endres og justert for prøven. Kapillærene med ulike indre diameter og veggen tykkelse er tilgjengelig.
    2. Pels glass kapillærene med ledende materiale (f.eks, gull eller palladium); Bruk av en frese coater genererer en gull plasma er vanlig. Følg produsentens instruksjoner for å få god kvalitet belegg.
      Merk: Overtrekket burde være tilstrekkelig nok til å få en stabil spray når vanlige kapillær spenninger (se nedenfor).
  2. Eksempel forberedelse til innfødte massespektrometri
    Merk: Salter, vaskemidler eller store mengder glyserol er ikke kompatible med electrospray ionisering. Derfor utveksles rensing bufferen ved en volatil, vandig buffer. 200 mM ammonium acetate er vanlig. Bruk størrelse utelukkelse spinn kolonner eller ultrafiltrasjon enheter for bufferen utveksling. I noen tilfeller kan komplekse stabilitet eller aktivitet bli påvirket av buffer exchange. Vurdere til masse spectra nøye og kontrollere aktiviteten til komplekset. Legge kofaktorer eller tilsetningsstoffer til analyse bufferen, om nødvendig.
    1. Bruke størrelse utelukkelse spinn kolonner for rask buffer utveksling. Fjerne lagringsplass bufferen ved sentrifugering 1000 x g og 4 ° C i 1 kast flyten gjennom. Vask tre ganger ved å legge 500 µL 200 mM ammonium acetate, etterfulgt av sentrifugering. Laste 20 µL av protein utvalget på kolonnen og sentrifuge på 1000 x g og 4 ° C for 4 min.
      Merk: Konsentrasjonen av proteinet skal 1-10 µM. Fremgangsmåten kan gjentas hvis permanent komponenter fortsatt forstyrre analysen.
    2. Å konsentrere protein prøven og utveksle bufferen i samme eksperiment bruke sentrifugal filtre. Bruk en membran filtrering pore størrelse 50% mindre enn størrelsen på proteiner analysert.
      1. Overføre protein prøven i filtrering enheten og legge 200 mM ammonium acetate. Nedspinning 15.000 x g og kast flyten gjennom. Legge til 200 mM ammonium acetate gjenta sentrifugering. Gjenta dette flere ganger. Følg produsentens instruksjoner for sentrifugering hastighet. Utføre sentrifugering på 4 ° C.
        Forsiktig: Membran proteiner tendens til å føre på membranen av filter enheten.
  3. Masse spectrometric analyse av intakt protein komplekser
    Merk: Det finnes ulike typer masse spektrometre fra ulike produsenter som kan endres for native massespektrometri, f.eks, quadrupole tid-av-fly (Q-ToF) masse spektrometre eller orbitrap masse spektrometre. Protokollen beskrevet nedenfor ble utført på en Q-ToF instrument.
    1. Plassere en gull-belagt kapillær i kapillær holderen og fyll av kapillær med 1-4 µL av protein prøve. Åpne spissen av nålen en TWEEZER.
    2. Koble kapillær holderen med nano-electrospray kilde og Juster kapillær posisjon. Plasser tuppen av av kapillær på 0,5-1,5 cm til kjegle munnstykket. Bruk 80-150 L/h nanoflow gass til å starte spray og justere gass for å opprettholde en stabil spray.
    3. Justere parametere på tune-siden i Q-ToF instrumentet. Typisk Start betingelser: kapillær spenning, 1,50 kV; kjegle spenning, 80 V; RF linsen 1 energi, 80 V; kollisjon energi, 20 V; Aperture 3, 13,6 V. endre parameterne for å få god masse spectra. Start oppkjøpet ved å klikke "kjøpe" og kombinere så mange skanner som mulig å få en god masse spektrum.
      Merk: Vi anbefaler kombinerer minst 100 skanninger.
  4. Tandem massespektrometri av intakt protein komplekser
    1. Få masse spekteret som beskrevet ovenfor (protocol seksjon 3.3). Velg en forløper ion av et protein kompleks.
    2. Endre fra MS til MS-/ MS modus i filen oppkjøpet. Sette MS-/ MS utvalget til forløperen masse.
    3. Starte oppkjøpet på lav kollisjon energi. Kombinere flere skanner (ca 20 skanner) for å bekrefte valg av riktig forløperen masse. Øke kollisjon energien til proteinet dissociates. Å få en god mass spekteret kombinere minst 500 skanninger.
      Merk: Strippet komplekser noen ganger har lav intensitet. Kombinere så mange skanner som mulig kan øke oppløsningen og signal-til-støy forholdet.
  5. I-løsning dissosiasjon av intakt protein komplekser
    Merk: For å få ytterligere innsikt i protein interaksjoner i protein komplekser, i-løsning dissosiasjon kan utføres.
    1. Forberede protein prøven som beskrevet ovenfor (kapittel 3.2). Legge til løsemidler til protein prøven eller endre pH å distansere intakt komplekser i sub komplekser. Typisk løsemidler er metanol, isopropanol og ACN; endre pH i ammonium acetate ved tilsetning av eddiksyre eller ammoniakk løsning. Få masse spectra som beskrevet ovenfor (seksjoner 3.3 og 3.4).
    2. Variere mengden av løsemiddel eller pH området å generere ulike sub komplekser. Vanligvis løsemiddel er 5-50% (siste konsentrasjon) og en typisk pH er 4-9. Start med en lav konsentrasjon av løsemiddel (5%) eller små endringer i pH og skaffe en masse spektrum (se Seksjon 3.3).
    3. Øke løsemiddel eller endre pH gradvis til sub komplekser genereres i løsningen. Få masse spectra å analysere sub komplekser.
  6. Kalibrere data
    Merk: Ervervet masse spectra kalibreres eksternt ved hjelp av Cesium iodide (CsI) løsning.
    1. Oppløse 100 mg CsI i 1 mL vann.
    2. Skaffe en masse spekteret av CsI. Variere kollisjon energi til å få CsI klynger over samme m/z området som proteinet analysert ovenfor.
      FORSIKTIG: CsI raskt precipitates emitter tuppen og forurenser membran. Skaffe bare så mange skanner som nødvendig for å få en tilstrekkelig spektrum. Fjern emitter fra kilden når du er ferdig.
    3. Gjøre en kalibrering fil med ervervet mass spekteret og en CsI-referansefil.
    4. Gjelde ervervet masse spectra kalibrering.
      FORSIKTIG: Kalibrering av masse spectra kan være en permanent endring av rådata. Hvis ikke kalibrert spectra er nødvendig, lage en sikkerhetskopi av filen.
  7. Databehandling og analyse
    Merk: Det finnes mange fritt tilgjengelige programvare-verktøy for dataanalyse til innfødte masse spectra; for eksempel, Massign42 eller UniDec43. Protokollen nedenfor beskriver manuell dataanalyse med hjelp av instrumentet programvare samt bruk av Massign for komplekse eksempler. Denne programvaren er godt egnet for analyse av komplekse masse spectra. Følg instruksjonene gitt online for bruk av programmet (http://massign.chem.ox.ac.uk/).
    1. For dataanalyse, glatt spectra ved å justere utjevning parametere. Centroid spectra ved å justere parametere. Beregne komplekse massene fra to tilstøtende toppene av proteinet ' topp konvolutten å bruke apparatet programvareverktøy.
      Advarsel: For intensiv utjevning kan forårsake tap av data (f.eks, tap av bundet ligander).
    2. For analyse med Massign42, generere en topp liste for masse spekteret. Linearize datapunkter av spekteret og glatt. Bruk forskjellige programvareverktøy til å tilordne protein komplekser, beregne komplekse sammensetning eller simulere komplekse peak konvolutter.

4. kjemisk cross-linking sammen med massespektrometri

Merk: Det er mange cross-linking strategier tilgjengelig. Her beskriver vi bruk av Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), et Amin-reaktive kryss-linker som brukes vanligvis til å studere protein-protein interaksjoner.

  1. Oppløse 1.43 mg BS3 i 100 µL vann å forberede en 25 mM lagerløsning.
    Merk: Andre reagenser som disuccinimidyl suberate (DSS) er ikke vannløselige og er vanligvis oppløst i dimethyl sulfoxide (DMSO). Noen cross-linkers er også tilgjengelig i tunge isotopically-merket former. Innlemmelse av tunge isotoper genererer topp par krysskoblet di-peptider i MS spectra, som hjelper under data evaluering. Når bruker ulikt merket cross-linkers, er lager løsninger begge varianter utarbeidet og blandet 1:1.
    Advarsel: For å unngå av protein komplekser av DMSO, er en svært konsentrert lagerløsning forberedt og fortynnet med vann eller bufferen før cross-linking reaksjonen.
  2. Legge til BS3 proteinet. Bruke varierende mengder BS3 fra 0,5-5 mM å identifisere optimal kryss-linker konsentrasjon. Inkuber reaksjon blandinger ved 25 ° C i 1 time i en thermomixer. Bruk 4-12% gradient gels og utføre SDS-side for å evaluere cross-linking resultater (se figur 2 for eksempel).
    Merk: Optimal konsentrasjon av BS3 nås når høyere molekylvekt protein band, som ikke er synlige i kontrollen ikke-krysskoblet, hentes under SDS side mens enkelt underenheter er fremdeles synlig (figur 2).
  3. Gjenta cross-linking reaksjon med optimal BS3 konsentrasjonen. Inkuber reaksjon blandinger ved 25 ° C i 1 time i en thermomixer.
    Merk: Noen protein komplekser er ikke stabil ved romtemperatur. Cross-linking reaksjonen kan også utføres på is; imidlertid må reaksjonstid justeres.
  4. Slukke cross-linking reaksjonen ved å legge til Amin buffer (f.eks50-100 mM Tris buffer, pH 7.5 siste konsentrasjon) eller utføre etanol nedbør for å fjerne eventuelle gjenværende cross-linking reagens.
    1. Legge til vann eller bufferen reaksjonsblandingen å nå et endelig antall 200 µL. legge til 600 µL iskald etanol og 20 µL 3 M natrium acetate, pH 5.3. Bland godt og ruge på-20 ° C i 2 timer eller over natten.
      Merk: Alternativt proteinene kan være forårsaket ved 80 ° C for 30 min eller i flytende nitrogen.
    2. Nedspinning 16,200 x g og 4 ° C for 30 min. Fjern forsiktig nedbryting.
    3. Vask pellets med 1 mL iskald 80% (v/v) etanol. Nedspinning 16,200 x g og 4 ° C for 30 min. Fjern forsiktig nedbryting. Tørr pellet i et vakuum sentrifuge.
  5. Utføre SDS side av de krysskoblede proteinene. Skjær gel band og fordøye protein i-gel som beskrevet ovenfor (deler 2.1 og 2.2).
    Merk: I-løsning fordøyelsen kan også utføres, men det krever vanligvis ekstra separasjon trinn (f.eks, størrelse utelukkelse kromatografi av fordøyd peptider).
  6. Utføre flytende kromatografi-kombinert massespektrometri som beskrevet ovenfor (avsnitt 2.3). Krysskoblede peptider er vanligvis lav rikelig, gjelder følgende variasjoner for masse spectrometric analyse for å øke analytisk dybdeskarphet krysskoblet prøven.
    1. Bruke lengre graderinger under flytende kromatografi separasjon (f.eks90 min i stedet for 65 min, se ovenfor).
    2. Utelukke dobbelt ladet peptidene fra HCD fragmentering.
      Merk: Dobbelt ladet peptider er vanligvis intra-cross knyttet peptider ("loop peptider" eller "type 1" cross-links).
    3. Når du bruker ulikt merket cross-linking reagenser, bruke alternativet "topp plukke" under analyse, dvs, HCD fragmentering utløses av tilstedeværelsen av topp par definerte masse forskjell i masse spectra.
      Merk: "Topp plukke" alternativet kan ikke være tilgjengelig på hver masse spectrometer.
  7. Bruk pLink programvare18 for identifikasjon av krysskoblet di-peptider. Bruk minimerte databaser for identifikasjon. Typisk søkeparameterne er: instrument spectra, HCD; enzym, trypsin; maks. tapte cleavage nettsteder, 3; variabel modifikasjoner, oksidasjon (metionin) og carbamidomethylation (cystein); kryss-linker, BS3; min. peptid lengde, 4; maks. peptid lengde, 100; min. peptid masse, 400 Da; maks. peptid masse, 10.000 Da; FDR, 1%.
    Merk: Når bruker ulikt merket cross-linkers, masse økningen skyldes linker må konfigureres. Det finnes også andre brukte programvare for krysskobling identifikasjon, f.eks, xQuest17, MassMatrix19eller XlinkX15.
  8. Vurdere resultatene av kvaliteten på fragmentering spectra. Akseptabel spektra av cross-links skal vise ion rekke begge peptider (minst 4 tilstøtende ioner) på en rimelig signal-til-støy-forhold.
    Merk: Når bruker ulikt merket cross-linking reagenser, topp par i MS spectra kan brukes som en ekstra kvalitetskontroll.
  9. Om nødvendig kan du visualisere cross-linking resultatene i protein samhandling nettverk benytter programvareverktøy (f.eksXVis, XiNET). Bruk tomter eller sirkulær tomter for visualisering av protein interaksjoner.
    Merk: Begge verktøy er fritt tilgjengelig på en webserver. Følge detaljerte instruksjoner på respektive nettsteder (https://xvis.genzentrum.lmu.de/ og http://crosslinkviewer.org/).

Representative Results

Strukturelle analysen av proteiner og komplekser de er grunnleggende for å forstå deres funksjon. Massespektrometri bidrar betydelig til strukturelle etterforskningen ved at det kan brukes til nesten alle kompleks rundt uansett størrelse eller prøve heterogenitet. Vi eksemplifiserer protokollen ved hjelp av to godt karakterisert protein komplekser; først, den hetero-dodecamer RvB1/B2 fra C. thermophilum og andre, den hetero-octameric CPS komplekse fra E. coli.

Først identifisert vi protein komponentene i to komplekser. For dette, proteiner var atskilt med SDS-siden (figur 2) og gel band ble kuttet fra gel. Etter-gel fordøyelsen av proteiner, peptid blandingen ble analysert av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri og peptid og fragment massene ble utsatt for databasen søker. Etter denne arbeidsflyten, vi identifisert alle protein underenheter av to komplekser med høy selvtillit, dvset høyt antall peptider med rimelig peptid score ble observert gir høy sekvens dekning for alle protein underenheter (tabell 1 ).

Vi deretter analysert intakt RvB1/B2 kompleks av innfødte massespektrometri (figur 3A). Mass spekteret avslørte to arter, en på ca 8000 m/z og en art på ca 11000-12 000 m/z. Beregnet massene for disse artene tilsvarer hexameric (RvB1)3(RvB2)3 ringen (ca 310 kDa) og dodecameric dobbel-ring (RvB1)6(RvB2)6 (ca 620 kDa). Både topp-serien viser to bestander; Dette kommer fra en blanding av hans-merket og ukodede RvB2 tenkes i komplekser. En krystallstruktur for RvB1/B2 komplekse var tidligere fått36 og viser ordningen med dobbel-ringen (figur 3B). Opprinnelige masse spekteret derfor bekrefter støkiometri av intakt dodecamer og videre avslører en stabil sub kompleks. I tillegg identifiseres med eksisterende populasjoner.

For å identifisere protein samhandling områder i RvB1/B2 komplekset, krysskoblet vi kjemisk renset komplekset med BS3 kryss-linker. Vi først titreres mengden BS3 under cross-linking reaksjonen å bestemme optimale konsentrasjonen. BS3 er Amin-spesifikk og covalently koblinger lysin siden kjeder som N-termini proteiner. Cross-linking reaksjonen ble etterfulgt av SDS-siden (figur 2A). Ikke-krysskoblet komplekset viste både RvB1 og RvB2 underenheter. Å legge til BS3 reaksjonsblandingen forårsaket kovalente kombinasjon av proteiner som resulterer i protein høyere molekylvekt båndene. SDS gel viser at økende mengder BS3 gi høyere mengder krysskoblet arter mens ikke-krysskoblet protein underenheter reduseres. Vi kuttet protein bandene fra gel og fulgte protokollen angitt over, for å identifisere protein samhandling nettsteder. Et eksempel spekteret av en krysskoblet di-peptid vises (Figur 3 c). Spekteret viser y-ion rekke begge peptider bekrefter Samvirkingen protein. Totalt vi fikk 14 protein interaksjoner, inkludert fire cross-links mellom underenheter RvB1 og RvB2 og to cross-links mellom to kopier av RvB2 (tabell 2). Resultatene fra BS3 cross-linking kan visualiseres i et samspill nettverk (figur 3D) viser intra molekylære interaksjoner samt interaksjoner mellom ulike underenheter. Intra molekylær cross-links tyder på at både RvB1 og RvB2 underenheter kaster på en måte at N - og C-terminalen domener er i nærheten. Merk at intra molekylære interaksjoner ikke kan skilles fra Inter molekylære interaksjoner av den samme delenhet i dette tilfellet. Inter molekylær cross-links mellom de to underenheter ble også observert. Av disse kan to Inter molekylær cross-links mellom RvB1 og RvB2 visualiseres i strukturen validere cross-linking tilnærming. De andre Inter molekylær cross-links ligger i fleksible looper som ikke er inkludert i crystal strukturen. Vi har også identifisert to cross-links i RvB2 som inneholder den samme peptid sekvenser. Disse cross-links kan utvetydig være klassifisert som Inter molekylær som de må stammer fra to kopier av samme protein (figur 3D). Vår cross-linking eksperimenter avsløre protein samhandling områder i komplekset, men også i protein tenkes å gi innsikt i deres strukturelle ordning som kan også være bekreftet av den eksisterende krystallstruktur (figur 3B).

Det andre protein komplekset som vi studerte var CPS. Opprinnelige masse spekteret (figur 4A) avslørte tre protein komplekser mellom 6000 og 12 000 m/z. Det største komplekset av 640 kDa tilsvarer intakt hetero-octamer. Mindre komplekser representerer to sub komplekser; dimer av små og store CPS underenheter (160 kDa) og en hetero-tetramer som inneholder to kopier av hver delenhet (320 kDa). Disse sub komplekser levere første innsikt i protein forsamlingen; dvs.de store og små underenheter er i direkte kontakt (som åpenbart av hetero-dimer) og tetramer kan være et produkt av to dimers. For å få mer informasjon om strukturelle ordningen i intakt CPS komplekse, utført vi tandem massespektrometri (MS-/ MS) hetero-octamer og hetero-tetramer. I begge tilfeller, de små delenhet skilt fra den forløper tyder på at den lille delenhet ligger i utkanten av forsamlingen (figur 4B). Faktisk er de små perifere i tilgjengelig krystall struktur (figur 4C)44.

Kjemisk cross-linking bruker BS3 kryss-linker ble også fremført. Med økende mengder, ble kovalente koblingen av CPS underenheter forbedret. Etter fordøyelsen av proteiner og analyse av peptider som beskrevet ovenfor, ble mange protein interaksjoner i den store delenhet og en krysskobling i de små delenhet innhentet (tabell 2). I tillegg ligner RvB1/B2 komplekse, vi fant to Inter molekylær cross-links mellom to kopier av den store CPS delenhet. Disse cross-links sett de to store underenheter mot hverandre på deres C-terminalen sider. I en tidligere studie, identifisert strukturelle massespektrometri og beregningsorientert modellering35, vi tre ekstra samspill i den store delenhet som sannsynligvis stammer fra grensesnittet av to kopier av den store delenhet godkjent av krystallstruktur og fått modellen (figur 4C og tabell 2). Disse interaksjoner kan ordningen av CPS kjernen består av fire store underenheter. Men ble ingen mellom delenhet cross-links mellom små og store underenheter observert. Ved å undersøke de tilgjengelige krystallstruktur (figur 4C), blir det klart at samspillet mellom tetramerisk kjernen av komplekset, bestående av den store delenhet og de eksterne liten underenheter er svært liten, som kan forklare fravær av Inter delenhet interaksjoner. Dette er bekreftet av innfødte massespektrometri som viste at de små delenhet lett dissociates fra intakt komplekser mest sannsynlig skyldes en liten bindende grensesnitt. Likevel tillate protein interaksjoner i CPS komplekse kombinert fra kjemiske cross-linking og innfødt massespektrometri deducing deres strukturelle arrangement (Figur 4 d).

Samlet gir kombinasjonen av innfødte massespektrometri og kjemiske cross-linking kombinert med masse spectrometric identifikasjon av krysskoblet peptider, rekonstituering av strukturelle disponeringen av både eksempel komplekser. Mens kjemiske cross-linking avslørt arrangement av protein underenheter, for eksempel interaksjoner mellom RvB1 og RvB2 eller tetramerisk kjernen av CPS, innfødt massespektrometri levert protein stoichiometries av intakt komplekser og utbredt subcomplexes. Ved CPS, som ingen Inter molekylære interaksjoner mellom de to underenheter kunne observeres av kjemiske cross-linking, foreslår innfødt massespektrometri at hver store delenhet samhandler med en liten delenhet (Figur 4 d). Tandem massespektrometri foreslått eksterne plasseringen av de små delenhet i komplekset og et lite grensesnitt mellom begge underenheter.

Figure 1
Figur 1: arbeidsflyt innfødt massespektrometri og cross-linking. Begge teknikkene gir utfyllende resultater. Mens opprinnelig massespektrometri avslører stoichiometries og samhandling moduler, gir cross-linking innsikt i protein samhandling områder innenfor komplekser. Merk at kjemiske cross-linking bare avslører binære interaksjoner. (A) det første trinnet i native massespektrometri er buffer utveksling en flyktig og vandig buffer filter enheter eller gel filtrering kolonner. Massespektrometri av intakt protein komplekser så avslører sine støkiometri. I tandem massespektrometri eksperimenter, er perifere underenheter atskilt. (B) For kjemiske cross-linking, proteinet er ruges med en cross-linking reagens. Krysskoblede proteiner er deretter fordøyd i peptider som analyseres senere av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: SDS side av krysskoblet RvB1/B2 (A) og CPS (B) komplekser. (A) 2.5 µM RvB1/B2 var lastet per gel kjørefelt. Konsentrasjonen av BS3 var variert. Non-krysskoblet RvB1/B2 viser to protein underenheter på ca 50 kDa. Tillegg av BS3 forårsaket kovalente kombinasjon av protein underenheter som resulterer i protein høyere molekylvekt båndene. Mengden krysskoblet arter er økt med høyere BS3 konsentrasjoner. Optimale cross-linking forhold er markert (rød). (B) 10 µM CPS var lastet per gel kjørefelt. Den store (90 kDa) og små (40 kDa) CPS underenheter hentes. Tillegg av BS3 forårsaket kovalente kombinasjon av protein underenheter som resulterer i protein høyere molekylvekt båndene. Optimale cross-linking forhold er markert (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Native massespektrometri og kjemiske cross-linking av RvB1/B2 komplekse. (A) native mass spekteret avslører to arter av RvB1/B2; på intakt dodecamer (dvs., (RvB1)6(RvB2)6) på ca 11000 til 12.000 m/z og det hexameric ring (RvB1)3(RvB2)3 på ca 8000 m/z. Begge arter viser to bestander som følge av hans-merket og ukodede RvB2. Spekteret er endret fra35. (B) krystall strukturen til RvB1/B2 vises (PDB-ID 4WVY). Vekslende RvB1 og RvB2 danne underenheter to hexameric ringer. (C) fragmentering spekteret av en krysskoblet di-peptid. N-terminus av RvB1 var krysskoblet med K23 av RvB1. y-ion serien ble innhentet for begge peptider (rød og cyan). (D) Intra - og inter - protein interaksjoner innhentet i RvB1/B2 komplekset. Intra-cross-koblinger vises i rødt, inter-cross-links vises i blått. Sett inn viser to Inter molekylær cross-links mellom RvB1 og RvB2 underenheter som kan visualiseres i krystallstruktur (grønn, sett inn). Interaksjoner som kommer fra to RvB2 Kopier vises som blå stiplede linjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Native massespektrometri og kjemiske cross-linking av CPS. (A) native mass spekteret av CPS viser tre komplekser. Hetero-dimer (160 kDa), hetero-tetramer (320 kDa) og hetero-octamer (640 kDa). Spekteret er endret fra35. (B) Tandem massespektrometri av tetramerisk og octameric CPS komplekse avdekket dissosiasjon av små CPS delenhet. (C) krystall oppbygning CPS vises (PDB-ID 1BXR). De store underenheter danner en tetramerisk kjerne og de små underenheter ligger i utkanten av komplekset. Inter molekylær cross-links mellom to kopier av den store delenhet vises (grønn). (D) interaksjoner av store og små CPS underenheter. Innfødt massespektrometri avdekket subcomplexes og antyder en ekstern plassering av små delenhet. Kjemisk cross-links angir arrangementer i tetramerisk kjernen av CPS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: resultater. Proteiner ble identifisert ved flytende kromatografi-kombinert massespektrometri og databasen søke. Protein navnene, tiltredelse nummer, og beskrivelse samt protein masse er gitt. Protein score, antall observert spectra per protein og antall observert peptid sekvenser er oppført. Fem peptidene med høyeste maskot peptider score vises for hver protein delenhet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell 2: Cross-links observert i RvB1/B2 og CPS. Underenheter av komplekser og krysskoblet rester er gitt. Typen krysskobling (intra - eller Inter molekylær) ble avslørt fra overlappende peptid sekvenser eller en tidligere studie35. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Protokoller gis for masse massespektrometri-baserte strukturelle analyser av flere delenhet protein komplekser. De to teknikkene, beskrevet i protokollen, hovedsakelig gir utfyllende resultater og er godt egnet til å få innsikt i de strukturelle ordningene innenfor protein (-ligand) komplekser som er vanskelig å studere av konvensjonelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri gir innsikt i protein stoichiometries samt protein interaksjoner ved å analysere subcomplexes og stabil samhandling moduler. Cross-Linking, derimot, gir informasjon om direkte kontakt nettsteder. Avhengig av kryss-linker brukes, en viss fleksibilitet kan eller bør inkluderes i analysen.

De angitte protokollene er generelt lett å utføre og ikke tidkrevende. Hele protokollen kan utføres innen en uke og kan brukes til nesten alle protein komplekser, selv om en viss proteinet er nødvendig for vellykket analyse. Eksempel forberedelse er enkelt og krever ikke spesielt renset protein komplekser. Men er en vanlig fallgruve forurensning av prøven under eksempel forberedelse for masse massespektrometri-basert protein identifikasjon. Disse forurensing i de fleste tilfeller inkluderer keratins som stammer fra støv, hud og hår. Derfor ekstra forsiktighet som seg hansker og labfrakker, filtrerende egenskaper vandig buffere, og bruker høy renhetsgrad løsemidler bør tas under eksempel forberedelse for masse massespektrometri-basert protein identifikasjon. Andre skadelige proteiner som chaperones er vanligvis introdusert under protein rensing, f.eksved affinitet koder. I disse tilfellene bør protein rensing forbedres, for eksempel ved å øke vask trinnene. I alle fall protein forurensing i utvalget er lett identifiseres under databasen søket ved å utelate taksonomi filteret (dvs.søke mot proteiner fra alle arter). Hvis bare noen peptider er observert (dvs.en lav protein dekning kan hente), selv om tilstrekkelig utvalg er tilgjengelig, kan det være nødvendig å bruke en annen proteinasen under fordøyelsen. Generelt gir Trypsin et tilstrekkelig antall peptider; men i noen tilfeller som membran proteiner eller membran domener av proteiner, antall tryptic cleavage områder reduseres og andre enzymer målretting hydrofobe aminosyrer er et bedre valg.

Når det gjelder instrumentering kreves en spesielt modifisert instrument for native massespektrometri som opprettholder ikke-kovalente interaksjoner under overføring i gassform. Flere apparattyper er innført, inkludert Q-ToF og orbitrap instrumenter. Mens endret Q-ToF masse spektrometre er kommersielt tilgjengelig for opprinnelige massespektrometri siden flere år, sistnevnte ble nylig introdusert og i de fleste tilfeller krever spesialisert endring45. Men anvendelsen av høyoppløselige instrumenter tillatt studere binding av flere ligander og deres kvantifisering46,47 og er lovende for framtidige applikasjoner.

For å identifisere krysskoblet di-peptider av flytende kromatografi-kombinert massespektrometri, brukes standard prosedyrer med noen modifikasjoner. Databasen søket er imidlertid den begrensende faktoren som spesialisert programvare kan sjelden håndtere store databaser, og redusert databaser som inneholder protein underenheter av komplekser kreves. Nyere studier brukt masse massespektrometri-cleavable cross-linkers målretting protein interaksjoner i hele cellen lysates48,49. Bruk av kjemiske cross-linkers som fragmentere tandem massespektrometri eksperimenter hovedsakelig gir lineær peptider (endret av kryss-linker) som kan identifiseres ved ytterligere fragmentering og databasen søker av lineær peptider, og dette reduserer søke tid og beregningsorientert søke plass. Men for å utføre disse eksperimentene, er en ion felle masse analyserer eller en hybrid masse spectrometer med en ion felle nødvendig. Generelt falske positiver er en viktig sak, valideres masse spektra av krysskoblet peptider ofte manuelt av kvaliteten av deres fragment spektra som strekker data analyse tid enormt. Utvikle robust scoring systemer som kan brukes uten ytterligere validering trinnene er derfor potensielle fremtidige anvendelser. En måte å forbedre dataanalyse og redusere antall falske positiver var innføringen av falske oppdagelsen rate beregninger og deres anvendelse til cross-linking datasett50.

Generelt, teknikerne beskrevet her kan suppleres med ytterligere massespektrometri teknikker (f.ekskovalente merking) øke utdataene fra analysen. Andre endringer og forbedringer av protokollene kan enkelt implementeres. Slik unravels sammenlignende cross-linking34 conformational endringer i samlingen protein. Videre utviklingen i native massespektrometri tillater i dag analyse av membran proteiner51,52 og deres samhandling med lipider28,52,53,54 . Ny bebyggelser av høyoppløselige masse spektrometre for native massespektrometri har utvidet programmet og ligand binding, f.eks, binding av lipider membran proteiner, kan nå inkluderes i analysen45, 46. i kombinasjon med beregningsorientert modellering tilnærminger, disse teknikkene kan levere strukturelle modeller av varierende oppløsning55. Hvis ingen krystall strukturer er tilgjengelig for de intakt komplisert eller enkelt underenheter, levere massespektrometri første innsikt i protein interaksjoner og topologien for ukjent komplekset. Avhengig av teknikkene som brukes og resultatene, finnes lav modeller av ukjent komplekset56,57,58. Hvis krystall strukturer eller homologi modeller er tilgjengelige, kan strukturelle informasjonen du mottok fra massespektrometri gi selv nær-innfødt modeller59.

Sammenlignet med andre strukturelle teknikker, massespektrometri har fordelen at det krever lite utvalg beløp, den kan håndtere heterogene prøver og gjelder protein komplekser av ubegrenset størrelse. I tillegg kan massespektrometri etterforskningen av dynamisk protein systemer. Forskjellige populasjoner av protein- eller proteinet som finnes i løsningen er vanligvis analysert sammen og derfor, i motsetning til med andre strukturelle teknikker som krever valg av bestemte befolkningsgrupper, alle konformasjonen opprettholdes under analyse og er assessable i ett eksperiment. Kvantitativ cross-linking tilnærminger ble nylig introdusert34,60,61 og er lovende for framtidige applikasjoner som beskriver conformational endringer under ulike forhold.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker våre kolleger for nyttig diskusjoner. Vi takker også Ilme Schlichting og Karl-Peter Hopfner for å gi protein komplekser. Vi erkjenner finansiering fra det føderale ministeriet for utdanning og forskning (BMBF, sikk program, 03Z22HN22), den europeiske Regional utvikling midler (EFRE, ZS/2016/04/78115) og den MLU Halle-Wittenberg CS og finansiering fra Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) til A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, Consumables
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma Aldrich H4034 buffer
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 pH
Acetonitrile Optima LC/MS Fisher Chemicals A955-1 solvent
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) Millipore i.e. UFC500396 buffer exchange, concentration
Ammonium acetate solution Sigma Aldrich A2706 native MS
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830 in-gel digestion
Ammonium solution Sigma Aldrich 9859 pH
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) Thermo Scientific 21590 cross-linker
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) Thermo Scientific 21595 cross-linker
Caesium iodide Sigma Aldrich 203033 calibration
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 in-gel digestion
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) Harvard Apparatus 30-0038 native MS
Disuccinimidyl suberate (DSS) Thermo Scientific 21655 cross-linker
DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich D5545 in-gel digestion
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D8418 solvent
Ethanol Fisher Chemicals BP2818 solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Instant Blue Coomassie staining solution expedeon ISB1L staining solution for gel electrophoresis
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) life technologies NP0323BOX gel electrophoresis
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 In-gel digestion
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Micro BioSpin 6 columns BioRad 732-6222 buffer exchange
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005 running buffer, gel electrophoresis
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) invitrogen NP0007 sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis
NuPAGE MES SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE MOPS SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) invitrogen NP0004 reducing Agent for gel electrophoresis
PBS - phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 buffer
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker invitrogen LC5925 prestained Protein Marker for gel electrophoresis
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889 ethanol precipitation
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma Aldrich 252859 buffer
Trypsin Sigma Aldrich TRYPSEQ-RO (11418475001) in-gel digestion
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) Sartorius i.e. VS0101 buffer exchange, concentration
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge Thermo Scientific 75002425
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 Sutter Instruments P-1000
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell Invitrogen EI0001
Gold Coater Quorum Q150R S Quorum Technologies Ltd. Q150RS
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T Heidolph Instruments 544-41200-00
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade Waters (Micromass) -
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) Thermo Scientific 164570
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) Thermo Scientific 164213
scalpel Fisher Scientifc 10463989
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge Thermo Scientific SPD121DP-230
Thermomixer C Eppendorf 5382000015
Tweezers AA Sigma Aldrich Z680184-1EA
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath VWR 142-0084
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) Thermo Scientific 0726030+
Name Company Catalog Number Comments
Software, Software Tools, Database search
Mascot www.matrixscience.com
Massign http://massign.chem.ox.ac.uk
MassLynx Micromass
MassMatrix Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)
MaxQuant Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)
pLink Yang, B. Nat Methods 9 (2012)
pXtract conversion tool http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html
UniDec Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)
XCalibur Thermo Scientific
XiNET http://crosslinkviewer.org
XLinkX Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)
xQuest Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)
Xvis https://xvis.genzentrum.lmu.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, I. D. Timeline: the march of structural biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 377-381 (2002).
  2. Liko, I., Allison, T. M., Hopper, J. T., Robinson, C. V. Mass spectrometry guided structural biology. Curr Opin Struct Biol. 40, 136-144 (2016).
  3. Robinson, C. V. From molecular chaperones to membrane motors: through the lens of a mass spectrometrist. Biochem Soc Trans. 45 (1), 251-260 (2017).
  4. Lossl, P., van de Waterbeemd, M., Heck, A. J. The diverse and expanding role of mass spectrometry in structural and molecular biology. EMBO J. 35 (24), 2634-2657 (2016).
  5. Wang, L., Chance, M. R. Protein Footprinting Comes of Age: Mass Spectrometry for Biophysical Structure Assessment. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 706-716 (2017).
  6. Steen, H., Mann, M. The ABC's (and XYZ's) of peptide sequencing. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (9), 699-711 (2004).
  7. Olsen, J. V., Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).
  8. Schmidt, C., Robinson, C. V. Dynamic protein ligand interactions--insights from MS. FEBS J. 281 (8), 1950-1964 (2014).
  9. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: what is it and what can it tell us? Anal Bioanal Chem. 397 (3), 967-972 (2010).
  10. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  11. Leitner, A., Lindner, W. Current chemical tagging strategies for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 813 (1-2), 1-26 (2004).
  12. Leitner, A., Lindner, W. Chemistry meets proteomics: the use of chemical tagging reactions for MS-based proteomics. Proteomics. 6 (20), 5418-5434 (2006).
  13. Kiselar, J. G., Chance, M. R. Future directions of structural mass spectrometry using hydroxyl radical footprinting. J Mass Spectrom. 45 (12), 1373-1382 (2010).
  14. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chem Rev. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  15. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  16. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  17. Rinner, O., et al. Identification of cross-linked peptides from large sequence databases. Nat Methods. 5 (4), 315-318 (2008).
  18. Yang, B., et al. Identification of cross-linked peptides from complex samples. Nat Methods. 9 (9), 904-906 (2012).
  19. Xu, H., Hsu, P. H., Zhang, L., Tsai, M. D., Freitas, M. A. Database search algorithm for identification of intact cross-links in proteins and peptides using tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3384-3393 (2010).
  20. Leitner, A., Faini, M., Stengel, F., Aebersold, R. Crosslinking and Mass Spectrometry: An Integrated Technology to Understand the Structure and Function of Molecular Machines. Trends Biochem Sci. 41 (1), 20-32 (2016).
  21. Heck, A. J. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).
  22. Sharon, M., Robinson, C. V. The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes. Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).
  23. Goth, M., Pagel, K. Ion mobility-mass spectrometry as a tool to investigate protein-ligand interactions. Anal Bioanal Chem. , (2017).
  24. Uetrecht, C., Rose, R. J., van Duijn, E., Lorenzen, K., Heck, A. J. Ion mobility mass spectrometry of proteins and protein assemblies. Chem Soc Rev. 39 (5), 1633-1655 (2010).
  25. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).
  26. Sobott, F., Hernandez, H., McCammon, M. G., Tito, M. A., Robinson, C. V. A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies. Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).
  27. Rostom, A. A., et al. Detection and selective dissociation of intact ribosomes in a mass spectrometer. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5185-5190 (2000).
  28. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  29. Uetrecht, C., et al. High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).
  30. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Rep. 11 (5), 759-769 (2015).
  31. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. The joining of the Hsp90 and Hsp70 chaperone cycles yields transient interactions and stable intermediates: insights from mass spectrometry. Oncotarget. 6 (21), 18276-18281 (2015).
  32. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Sci Rep. 7, 44068 (2017).
  33. Schmidt, C., et al. Comparative cross-linking and mass spectrometry of an intact F-type ATPase suggest a role for phosphorylation. Nat Commun. 4, 1985 (2013).
  34. Schmidt, C., Robinson, C. V. A comparative cross-linking strategy to probe conformational changes in protein complexes. Nat Protoc. 9 (9), 2224-2236 (2014).
  35. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Anal Chem. 89 (3), 1459-1468 (2017).
  36. Lakomek, K., Stoehr, G., Tosi, A., Schmailzl, M., Hopfner, K. P. Structural basis for dodecameric assembly states and conformational plasticity of the full-length AAA+ ATPases Rvb1 · Rvb2. Structure. 23 (3), 483-495 (2015).
  37. Mareya, S. M., Raushel, F. M. A molecular wedge for triggering the amidotransferase activity of carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 33 (10), 2945-2950 (1994).
  38. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).
  39. Olsen, J. V., et al. Parts per million mass accuracy on an Orbitrap mass spectrometer via lock mass injection into a C-trap. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 2010-2021 (2005).
  40. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  41. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J Vis Exp. (40), (2010).
  42. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Anal Chem. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  43. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Anal Chem. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  44. Thoden, J. B., Wesenberg, G., Raushel, F. M., Holden, H. M. Carbamoyl phosphate synthetase: closure of the B-domain as a result of nucleotide binding. Biochemistry. 38 (8), 2347-2357 (1999).
  45. Rose, R. J., Damoc, E., Denisov, E., Makarov, A., Heck, A. J. High-sensitivity Orbitrap mass analysis of intact macromolecular assemblies. Nat Methods. 9 (11), 1084-1086 (2012).
  46. Gault, J., et al. High-resolution mass spectrometry of small molecules bound to membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 333-336 (2016).
  47. Mehmood, S., et al. Mass spectrometry captures off-target drug binding and provides mechanistic insights into the human metalloprotease ZMPSTE24. Nat Chem. 8 (12), 1152-1158 (2016).
  48. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  49. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).
  50. Walzthoeni, T., et al. False discovery rate estimation for cross-linked peptides identified by mass spectrometry. Nat Methods. 9 (9), 901-903 (2012).
  51. Barrera, N. P., Di Bartolo, N., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles protect membrane complexes from solution to vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  52. Barrera, N. P., et al. Mass spectrometry of membrane transporters reveals subunit stoichiometry and interactions. Nat Methods. 6 (8), 585-587 (2009).
  53. Laganowsky, A., et al. Membrane proteins bind lipids selectively to modulate their structure and function. Nature. 510 (7503), 172-175 (2014).
  54. Marcoux, J., et al. Mass spectrometry reveals synergistic effects of nucleotides, lipids, and drugs binding to a multidrug resistance efflux pump. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9704-9709 (2013).
  55. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. J Proteomics. , (2017).
  56. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  57. Pukala, T. L., et al. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).
  58. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chem Biol. 22 (1), 117-128 (2015).
  59. Politis, A., et al. A mass spectrometry-based hybrid method for structural modeling of protein complexes. Nat Methods. 11 (4), 403-406 (2014).
  60. Fischer, L., Chen, Z. A., Rappsilber, J. Quantitative cross-linking/mass spectrometry using isotope-labelled cross-linkers. J Proteomics. 88, 120-128 (2013).
  61. Yu, C., et al. Developing a Multiplexed Quantitative Cross-Linking Mass Spectrometry Platform for Comparative Structural Analysis of Protein Complexes. Anal Chem. 88 (20), 10301-10308 (2016).

Tags

Biokjemi problemet 129 massespektrometri cross-linking innfødt massespektrometri protein komplekser protein interaksjoner protein støkiometri protein nettverk dataanalyse
Kombinere kjemisk Cross-linking og massespektrometri av intakt Protein komplekser å studere arkitektur multi delenhet Protein samlinger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S.,… More

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S., Kostmann, S., Politis, A., Schmidt, C. Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies. J. Vis. Exp. (129), e56747, doi:10.3791/56747 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter