Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Att kombinera kemisk Cross-linking och masspektrometri av intakt proteinkomplex att studera arkitekturen av flera subenhet Protein församlingar

Published: November 28, 2017 doi: 10.3791/56747
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Interdisciplinary research center HALOmem, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Chemistry, Kings College London
* These authors contributed equally

Summary

Arkitekturen av proteinkomplex är avgörande för deras funktion. Kombinera olika massa spektrometriska tekniker visat kraftfull att studera deras församlingen. Vi tillhandahåller protokoll för kemiska cross-linking och infödda masspektrometri och visar hur dessa kompletterande tekniker hjälpa till att belysa arkitekturen av flera subenhet protein församlingar.

Abstract

Proteiner interagerar med deras ligander till formuläret aktiva och dynamiska sammansättningar som utför olika cellulära funktioner. Belysa dessa interaktioner är därför grundläggande för förståelsen av cellulära processer. Men många proteinkomplex är dynamiska sammansättningar och kan inte nås av konventionella strukturella tekniker. Masspektrometri bidrar till strukturella undersökningen av dessa församlingar, och särskilt kombinationen av olika massa spektrometriska tekniker ger värdefulla insikter i deras strukturella arrangemang.

I den här artikeln beskriver vi ansökan och kombination av två kompletterande massa spektrometriska tekniker, nämligen kemiska cross-linking tillsammans med masspektrometri och infödda masspektrometri. Kemiska tvärbindningsmedel innebär kovalent sammanlänkningen av aminosyror i närheten med hjälp av kemiska reagenser. Efter uppslutning med proteaser, tvärbunden di-peptider identifieras av masspektrometri och protein interaktioner webbplatser är avtäckt. Infödda masspektrometri är däremot analysen av intakt protein församlingar i gasfas av en masspektrometer. Det avslöjar protein stoichiometries samt protein och ligand interaktioner. Båda teknikerna levererar därför kompletterande information om strukturen på protein-ligand sammansättningar och deras kombination visat sig vara kraftfulla i tidigare studier.

Introduction

Strukturella undersökningen av protein aggregat har blivit särskilt viktigt för förståelsen av cellulära processer. Följaktligen har många, tekniker utvecklats och förbättrats i strukturbiologi1. Dessa tekniker är dock ibland begränsade sin ansökan på grund av storlek, flexibilitet eller heterogenitet av proteinkomplex under utredning. Masspektrometri kan ta itu med dessa utmaningar och därför växte fram som ett kraftfullt verktyg i strukturbiologi2,3,4,5. Den största fördelen med masspektrometri, är dock förmågan att otvetydigt identifiera proteiner även i komplexa och heterogena blandningar6. För detta ändamål proteiner rötas oftast med endoproteinases och den resulterande peptid blandningen separeras genom vätskekromatografi och direkt elueras in masspektrometer. Peptid massan bestäms därefter och föregångare joner väljs för ytterligare fragmentering av peptiderna. Proteiner är sedan identifierade genom forskande peptid och motsvarande fragment massorna mot en känd databas. Detta förfarande inte bara tillåter identifiering av peptider/proteiner men också deras post-translationella modifieringar som orsakar en massa förskjutning av föregångare peptiderna och fragment jonerna bär den ändring7. Några av de många teknikerna i strukturella masspektrometri bygger på denna princip4,8. Till exempel fot märkning tekniker såsom väte deuterium exchange9,10, kemisk märkning strategier11,12, eller hydroxyl radikala utskrift13,14 , ge insikter i ytan tillgängligheten av proteiner under vissa förutsättningar.

En annan teknik är (kemisk) cross-linking med kovalenta sammanlänkningen av aminosyror i närheten genom deras funktionella grupper. För detta är kemiska reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyror sysselsatta15,16. Efter bryggbindningen, proteinerna är vanligtvis hydrolyseras med proteaser och tvärbunden di-peptider analyseras av flytande kopplade kromatografi masspektrometri. Identifiering av bryggbindningen produkter av databasen söka, men kräver användning av specialiserad programvara som sammanfogar peptid sekvenser av olika proteiner och olika regioner17,18,19. Användning av kemiska cross-linkers har fördelen att den kan användas till nästan varje protein komplex av intresse och inte kräver införlivande av UV-activatable aminosyror, som bara kan uppnås när uttrycker proteinet av intresse i värdceller. Som sådan, cross-linking är ett mångsidigt verktyg och användes framgångsrikt i många strukturella studier även stora protein aggregat20.

Masspektrometri av intakt proteinkomplex (kallas ibland ”inhemska” masspektrometri), å andra sidan, innebär analys av intakta proteiner och proteinkomplex utan hydrolys i peptider. Det avslöjar sammansättning, heterogenitet, stökiometri, topologi och subunit interaktioner protein komplex21,22. I kombination med ion rörlighet gör infödda masspektrometri ytterligare bestämning av deras konformation23,24. Detta gör det ett kraftfullt verktyg för strukturella utredning av proteinkomplex som är svåra att bedöma av konventionella strukturella tekniker. Infödda masspektrometri kräver dock analys buffertar som upprätthåller icke-kovalenta proteininteraktioner under elektrospray jonisering. Detta uppnås vanligen med hjälp av vattenhaltigt, flyktiga buffertar såsom ammonium acetat25. Ändringar av instrumentet är dessutom nödvändiga för att förhindra dissociation under överföringen till gasfas av masspektrometer26. Tillämpas på detta sätt, analyserades många (stor) proteinkomplex. Imponerande exempel är studier av intakt ribosomer27, ATP syntaser28eller virus29.

Kombinationen av infödda masspektrometri och cross-linking visat sig särskilt framgångsrik i tidigare studier. Exempelvis stoichiometries av förkläde komplex, inklusive en oväntad Hsp70 dimer, kunde erhållas från masspektrometri experiment av intakt proteinkomplex, medan kemiska cross-linking avslöjade arrangemangen av proteinerna i den församlingar30,31. I en annan studie studerades effekterna av post-translationella modifieringar på en intakt ATP synthase komplexa. Infödda masspektrometri finns insikter i protein komplex stabiliteten i närvaro eller frånvaro av fosforylering eller acetylering32,33. En jämförande tvärbindande strategi34 avslöjade sedan konfirmerande förändringar av protein komplex på olika villkor.

Här ger vi protokollen för protein identifiering av masspektrometri (kemisk) cross-linking och infödda masspektrometri, inklusive dataanalys och tolkning (figur 1). Kombinationen av kompletterande resultat från dessa metoder med hjälp av två välkarakteriserad proteinkomplex är påvisad35. Våra protokoll kan tillämpas på någon protein församling som kan renas vid vissa renhet och koncentration. Metoden är i vissa fall begränsas av dataanalys av cross-linking data, dvs, storleken på databasen anställd, som bestämmer tid och det krävs Sök. Dessutom manuell validering av identifierade tvärbindningar krävs ofta och ytterligare minskar produktionen. Infödda masspektrometri begränsas främst av provet kvaliteten, t.ex., buffertar och addukter används under rening och möjligheten för att utbyta dem av vattenfasen och flyktiga buffertar. Proteinkomplex som renas för strukturanalys vanligtvis har dock den kvalitet som krävs för framgångsrik analys med våra protokoll.

Protocol

1. rening av proteinkomplex

  1. Förbereda proteinkomplex som enligt optimerad standardprotokoll.
    Obs: Protokollet framgår här med RvB1/B2 komplexa från Chaetomium thermophilum och den carbamoyl fosfat syntas (CPS) från Escherichia coli. RvB1/B2 och CPS var renat som beskrivs36,37. Varje protein komplex kräver en individuell rening-protokollet. Justera protokollet. Amine-gratis buffertar såsom fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syra (HEPES) bör användas för kemiska cross-linking. Byt ut bufferten under reningen om möjligt.
    FÖRSIKTIGHET: Gäller inte några metoder eller reagenser som stör den infödda församlingen av protein komplex.

2. mass Spectrometry-baserade Protein identifiering

  1. Gelelektrofores
    Obs: Det finns olika gel system och varje laboratorium använder sin egen inställning. Anpassa enligt gel system. Bär handskar och labbrock i hela protokollet som keratins är bland de vanligaste föroreningarna i massa spektrometriska analys.
    1. Gälla 7,5 µL 4 x provet buffert och 3 µL 10 x reduktionsmedel (slutlig koncentration 50 mM Ditiotreitol (DTT)) 20 µL protein provet. Använd 10 µM CPS eller 2,5 µM RvB1/B2. Snurra ner för 1 min på 16 200 × g och värme i 10 min vid 70 ° C.
      Obs: När olika gel system med justera krävs volymer och uppvärmning temperatur.
    2. Förbereda en 4-12% toning gel elektrofores. Späd det rinnande buffert 20 gånger med vatten och fyll elektrofores kammaren. Använd 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES) buffert för proteiner av mindre molekylvikt (2-200 kDa) och 3-(N-morpholino) propanesulfonic syra (moppar) buffert för större proteiner (14-200 kDa). Lägg till 0,5 mL antioxidant i den inre kammaren.
      Obs: När olika gel system med förbereda rinnande buffert och gelen enligt tillverkarens protokollen.
    3. Ladda en passande protein markör (pre betsad, ofärgade, olika molekylära storlekar) i det första hålet och läsa in protein proverna i den resterande hålrummen.
    4. Separat proteiner för 35 min (MES) eller 50 min (moppar) på 200 V.
      Obs: Justera elektrofores gånger och spänning för olika gel system.
    5. För att färga banden protein, överföra gelen i en gel färgning box och täck gelen med en vattenbaserad Coomassie färgning lösning. Inkubera över natten och i rumstemperatur på en horisontell gel shaker.
    6. Avfärga gelen genom att ersätta färglösningen med vatten. Upprepa detta flera gånger (ca 3 - 5 gånger) tills gel bakgrunden visas tydligt.
  2. I-gel matsmältningen
    Obs: För att undvika kontaminering, Använd HPLC grade lösningsmedel i hela protokollet matsmältningen och för alla följande steg (dvs., massa spektrometriska analys). Förbereda alla lösningar före användning och filtratet vatten och hjorthornssalt.
    1. Klipp banden protein som visualiseras av blå Coomassie fläcken från gelen med en skalpell. Banden protein i små bitar ca 1 mm × 1 mm. skär försiktigt och skölj skalpell med vatten mellan olika protein band. Tvätta banden gel med vatten och acetonitril (ACN).
    2. Minska disulphide obligationer med DTT, Alkylatbensin cystein rester med iodoacetamide och smälta proteiner med trypsin som tidigare beskrivits38; vanligtvis används en enzym: protein förhållandet 1:20 till 1: 100. Använda 100 mM hjorthornssalt under matsmältningen protokollet.
    3. Extrahera peptider i två steg.
      1. Först Inkubera gel bitar med hjorthornssalt och ACN, och samla peptid-innehållande supernatanten. För det andra, inkubera gel bitar med 5% (v/v) myrsyra och ACN. Inkubera i 15 min vid varje steg. Kombinera båda supernatanterna. Torka de extraherade peptiderna genom avdunstning av lösningsmedel i en vakuum centrifug.
        Obs: Torkade peptider kan förvaras vid-20 ° C under flera månader.
  3. Flytande kopplade kromatografi masspektrometri
    1. Lös upp de torkade peptiderna i 2% ACN/0.1% myrsyra. Lös peptiderna i ett ultraljudsbehandling bad för 2-3 min och spinn ner i en centrifug på 16 200 x g för 30 min. Transfer proverna till autosampler injektionsflaskor.
      Obs: Justera volymen enligt mängden protein. För väl färgade Coomassie band använder vi 20 µL.
    2. Injicera 5 µL av provet till nano-LC-MS/MS-systemet med autosampler. Ladda peptid blandningen på en C18 före kolonn med omvänd fas (C18, 150 µm I.D., 2 cm, 5 µm porstorlek) att avsalta och koncentrera peptiderna online.
    3. Använda 0,1% (v/v) myrsyra som mobil fas A och 80% ACN/0.1% (v/v) myrsyra som mobil fas B. separat peptiderna på en omvänd fas C18 Analyskolonn (C18, 75 µm I.D., 50 cm, 3 µm porstorlek) använda en gradient av 4-80% B (innehållande 0,1% myrsyra) 300 nL / min över 65 min.
      Obs: En nanospray ion källa används för att överföra eluerade peptider till masspektrometer.
    4. Användningsförhållanden (typisk) MS: spraya spänning av 1.6 kV; Kapillär temperatur över 250 ° C; normaliserade kollision energi av 30. Driva masspektrometer i data-beroende läge.
    5. Förvärva MS spektra i massa analysatorn (t.ex., orbitrap) (m/z 350−1, 600) med en upplösning på 70.000 och ett Automatisk gain kontroll mål på 3 x 10-6. Välj 20 av de mest intensiva jonerna för HCD fragmentering på en automatisk gain kontroll mål 1 x 105. Dynamiskt valt exkludera tidigare joner för 30 s. Undanta ensamma laddade joner samt joner med okänd laddning.
      Obs: Intern kalibrering av masspektra utfördes med hjälp av lås massa alternativ39.
  4. Databas sökning
    Obs: Det finns olika programvara för databas sökning. MaxQuant40, till exempel, är fritt tillgängliga.
    1. Konvertera .raw-filer till .mgf-filer med hjälp av en pXtract konverteringsverktyg (http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html).
    2. Utföra databas sökning med typiska sökparametrar: databas, swissprot; peptid massan tolerans, 10 ppm. fragmentet massa tolerans, 0,5 Da; enzym, trypsin; missade klyvning platser, 2; variabel modifieringar, carbamidomethylation (cystein) och oxidation (metionin).
      Obs: Ändra sökparametrarna enligt experimentella inställningarna.
    3. Inspektera databas sökresultatet. Utvärdera den protein poäng, antal peptider identifieras, peptid noter och massa noggrannhet; sekvens täckning returnerar protein täckningen identifieras.
      Obs: Varje sökmotor har sin individuella räknandet algoritm. Utvärdera peptiden poängsystem av kvaliteten på tandem mass spektra observerats. De viktigaste signalerna en bra spektrum bör Visa (komplett) ion serie att verifiera den identifierad peptiden. Peptid Poäng är oftast sannolikhetsbaserad, dvspeptid Poäng är ett mått för hur sannolikt sekvensen identifierad peptid matchar det erhållna spektrumet. Den protein-poängen är vanligtvis härrör från peptid noter och används för att rangordna ett protein i en lista över identifierade proteiner.

3. masspektrometri av intakt proteinkomplex (Native masspektrometri)

  1. Beredning av guld-belagd sändare för elektrospray jonisering
    1. Använd en mikropipett avdragare för att förbereda nanoflow sändare från glas kapillärer som tidigare beskrivits25,41. Använda Borsilikat kapillärer med en inre diameter på 0.78 mm.
      Obs: Genom att ändra parametrarna för nålen att dra, tip form och storlek kan ändras och justeras för provet. Kapillärer med olika inre diameter och väggtjocklek är tillgängliga.
    2. Täck glas kapillärer med elektriskt ledande material (t.ex., guld eller palladium); användning av en fräsande bestrykare genererar en guld plasma är vanligt. Följ tillverkarens instruktioner för att få bra kvalitet beläggning.
      Obs: Beläggningen bör vara tillräcklig för att få en stabil spray när gemensamma kapillär påläggs (se nedan).
  2. Provberedning för infödda masspektrometri
    Obs: Salter, rengöringsmedel eller stora mängder av glycerol är inte kompatibla med elektrospray jonisering. Rening bufferten är därför utbytta flyktiga, vattenhaltigt buffert. 200 mM ammoniumacetat används ofta. Använd storlek utslagning spin kolumner eller ultrafiltrering enheter för buffert utbyte. I vissa fall kan komplexa stabilitet eller aktivitet påverkas av buffert exchange. Utvärdera masspektra noggrant och kolla aktiviteten av anläggningen. Tillsätt kofaktorer eller tillsatser till analys bufferten, om det behövs.
    1. Använd storlek utslagning spin kolumner för snabb buffert utbyte. Ta bort lagring bufferten genom centrifugering vid 1 000 x g och 4 ° C i 1 min. kasta flödet genom. Tvätta tre gånger genom att lägga till 500 µL 200 mM ammoniumacetat, följt av centrifugering. Ladda 20 µL av protein provet på kolumn och centrifugera vid 1 000 x g och 4 ° C under 4 minuter.
      Obs: Koncentrationen av protein komplex bör vara 1-10 µM. Proceduren kan upprepas om icke-flyktiga komponenter fortfarande störa analysen.
    2. För att koncentrera protein provet och utbyta bufferten i samma experiment använda centrifugal filter. Använd en filtrering membran porstorlek storlek 50% mindre än storleken på de proteiner som analyseras.
      1. Överför protein provet i filtrering enheten och tillsätt 200 mM ammoniumacetat. Snurra ner på 15 000 x g och kasta flödet genom. Lägga till 200 mM ammoniumacetat och upprepa centrifugeringen. Upprepa detta flera gånger. Följ tillverkarens instruktioner för centrifugeringsvarvtal. Utföra centrifugeringen vid 4 ° C.
        Varning: Membranproteiner tenderar att fällningen på membranet i enhetens filter.
  3. Massa spektrometriska analys av intakt proteinkomplex
    Obs: Det finns olika typer av masspektrometrar från olika tillverkare som kan ändras för infödda masspektrometri, t.ex., quadrupole time-of-flight (Q-ToF) masspektrometrar eller orbitrap masspektrometrar. Protokollet beskrivs nedan utfördes på en Q-ToF instrument.
    1. Placera en guld-belagd kapillär i kapillär hållaren och fyll kapillären med 1-4 µL av protein provet. Öppna spetsen på nålen med en pincett.
    2. Anslut kapillär innehavaren med nano-elektrospray källan och justera kapillär position. Placera spetsen på kapillären på 0,5-1,5 cm till konen öppningen. Använd 80-150 L/h nanoflow gas för att initiera spray och justera gasflöden för att upprätthålla en stabil spray.
    3. Justera parametrar tune-sidan i Q-ToF instrumentet. Typisk start villkor är: kapillär spänning, 1,50 kV; Cone spänning, 80 V; RF-lins 1 energi, 80 V; kollision energi, 20 V; Aperture 3, 13,6 V. ändra dessa parametrar för att få bra masspektrum. Starta förvärvet genom att klicka på knappen ”förvärva” och kombinera så många sökningar som möjligt att få en bra masspektrum.
      Obs: Vi rekommenderar att kombinera minst 100 skanningar.
  4. Tandem masspektrometri av intakt proteinkomplex
    1. Förvärva masspektrum som beskrivs ovan (avsnitt 3.3 protocol). Välja en föregångare ion av ett proteinkomplex.
    2. Ändra från MS MS/MS bokstäver i filen förvärv. Ange MS/MS föregångaren massa.
    3. Starta förvärvet på låg kollision energi. Kombinera flera skanningar (ungefärligt 20 skanningar) för att bekräfta val av rätt precursoren massa. Öka den kollision energin tills protein komplex dissocierar. För att få en bra masspektrum kombinera minst 500 skanningar.
      Obs: Avskalade komplex ibland har låg intensitet. Att kombinera så många sökningar som möjligt öka upplösning och signal-brus-förhållandet.
  5. I-lösning dissociation av intakt proteinkomplex
    Obs: För att få ytterligare inblick i proteininteraktioner inom proteinkomplex, i-lösning dissociation kan utföras.
    1. Förbereda protein provet som beskrivs ovan (avsnitt 3.2). Tillsätt lösningsmedel protein eller ändra pH för att dissociera intakt komplex i sub komplex. Typiska lösningsmedel är metanol, isopropanol och ACN; ändra pH ammoniumacetat genom tillsats av ättiksyra eller ammoniaklösning. Förvärva masspektra som beskrivs ovan (avsnitt 3.3 och 3.4).
    2. Variera mängden lösningsmedel eller det pH-området att generera olika sub komplex. Normalt mängden lösningsmedel är 5-50% (slutliga koncentration) och en typisk pH-intervall är 4-9. Börja med en låg koncentration av lösningsmedel (5%) eller små förändringar i pH och förvärva masspektrum (se avsnitt 3.3).
    3. Öka mängden lösningsmedel eller ändra pH stegvis tills sub komplex genereras i lösning. Förvärva masspektra för att analysera sub komplex.
  6. Kalibrera data
    Obs: Förvärvade masspektrum är kalibrerade externt med hjälp av Cesium jodid (CsI) lösning.
    1. Lös 100 mg CsI i 1 mL vatten.
    2. Förvärva masspektrum CSI. Variera kollision energi för att få CsI kluster över samma m/z intervall som protein komplex analyseras ovan.
      FÖRSIKTIGHET: CsI snabbt påskyndar emitter spets och förorenar konen. Förvärva bara så många File som krävs för att få en tillräcklig spektrum. Ta bort sändaren från källan när du är klar.
    3. Göra en kalibrering fil med den förvärvade masspektrum och en CsI referensfil.
    4. Gälla förvärvade masspektra kalibrering.
      Varning: Kalibrering av masspektra kan vara en permanent förändring av rådata. Om icke-kalibrerad spectra behövs, göra en säkerhetskopia av filen.
  7. Databearbetning och analys
    Obs: Det finns många fritt tillgängliga programvaruverktyg för dataanalys av infödda masspektra; till exempel, Massign42 eller UniDec43. Protokollet nedan beskrivs manuell dataanalys med hjälp av instrumentet programvara samt användning av Massign för komplexa prover. Denna programvara är väl lämpad för analys av komplexa masspektrum. Följ instruktionerna som tillhandahålls online för användning av programmet (http://massign.chem.ox.ac.uk/).
    1. För analys av data, len spectra genom att justera utslätande parametrar. Centroiden spectra genom att justera parametrar. Beräkna komplexa massorna från två intilliggande toppar av protein komplex ' peak kuvert med hjälp av instrumentet mjukvaruverktyg.
      Varning: Alltför intensiv utjämning kan orsaka förlust av data (t.ex., förlust av destinerade ligands).
    2. För analys med Massign42, generera en topp lista för massa spectrum. Linjär datapunkter av spektrumet och smidig. Använda de olika programvaruverktyg för att tilldela proteinkomplex, beräkna komplex sammansättning eller simulera komplexa peak kuvert.

4. kemisk cross-linking tillsammans med masspektrometri

Obs: Det finns många tvärbindande strategier tillgängliga. Här, beskriver vi användningen av Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), en amine-reaktivt cross-linker som vanligtvis används för att studera protein-protein interaktioner.

  1. Lös 1,43 mg BS3 i 100 µL vatten att förbereda en 25 mM stamlösning.
    Obs: Andra reagenser som disuccinimidyl suberate (DSS) är inte vattenlösligt och löses vanligtvis i dimetyl sulfoxid (DMSO). Vissa cross-linkers finns också i tunga isotopically-märkt former. Införlivandet av tunga stabila isotoper genererar topp par av tvärbunden di-peptider i MS spectra, som hjälper till under resultatutvärdering. När använda differentially märkt cross-linkers, bereds stamlösningar av båda varianterna och blandade 1:1.
    FÖRSIKTIGHET: För att undvika dissociationen av proteinkomplex av DMSO, en starkt koncentrerad stamlösning bereds och späds med vatten eller buffert före tvärbindande reaktionen.
  2. Lägga till BS3 protein komplex. Använda olika mängder BS3 varierar mellan 0,5-5 mM att identifiera optimala cross-linker koncentration. Inkubera reaktion blandningar vid 25 ° C för 1 h i en thermomixer. Använd 4-12% lutning geler och utföra SDS-PAGE för att utvärdera tvärbindande resultat (se figur 2 för ett exempel).
    Obs: Optimala koncentrationen av BS3 nås när högre molekylvikt protein band, som inte är synliga i de icke-kors-länkade kontrollen, erhålls under SDS-PAGE medan enda subenheter är fortfarande synliga (figur 2).
  3. Upprepa tvärbindande reaktionen med den optimala BS3 koncentrationen. Inkubera reaktion blandningar vid 25 ° C för 1 h i en thermomixer.
    Obs: Vissa proteinkomplex inte är stabila i rumstemperatur. Tvärbindande reaktionen kan också utföras på is; reaktionstiden behöver dock justeras.
  4. Släcka tvärbindande reaktionen genom att lägga till amine buffert (t.ex., 50-100 mM Tris buffert, pH 7.5, slutlig koncentration) eller utföra etanol nederbörd för att ta bort eventuella kvarvarande tvärbindande reagens.
    1. Tillsätt vatten eller buffert att reaktionsblandningen att nå en slutlig volym av 200 µL. lägga till 600 µL iskall etanol och 20 µL 3 M natriumacetat, pH 5.3. Blanda väl och inkubera vid-20 ° C under 2 timmar eller över natten.
      Obs: Alternativt proteinerna kan utlösas vid 80 ° C i 30 min eller i flytande kväve.
    2. Snurra ner vid 16 200 x g och 4 ° C i 30 min. Ta försiktigt bort supernatanten.
    3. Tvätta pelleten med 1 mL iskallt 80% (v/v) etanol. Snurra ner vid 16 200 x g och 4 ° C i 30 min. Ta försiktigt bort supernatanten. Torka pelleten i en vakuum centrifug.
  5. Utföra SDS-PAGE av tvärbunden proteiner. Klipp banden gel och smälta protein i-gelen som beskrivs ovan (avsnitt 2.1 och 2.2).
    Obs: I-lösning matsmältningen kan också utföras, dock krävs vanligtvis det ytterligare separation steg (t.ex., storlek utslagning kromatografi av smält peptiderna).
  6. Utför flytande kopplade kromatografi masspektrometri som beskrivs ovan (avsnitt 2.3). Som tvärbunden peptider är oftast låg rikligt, tillämpas följande variationer på massa spektrometriska analysen att öka analytiskt djup av tvärbunden provet.
    1. Använda längre stigningar under vätskekromatografi separation (t.ex.90 min i stället för 65 min, se ovan).
    2. Utesluta de dubbelt laddade peptiderna från HCD fragmentering.
      Obs: Dubbelt laddade peptider är vanligtvis mellan-Cross-Country länkade peptider (”loop peptider” eller ”typ 1” tvärbindningar).
    3. När du använder differentially märkta tvärbindande reagenser, använda alternativet ”peak-picking” under analys, dvs, HCD fragmentering utlöses av närvaron av topp par definierade samlasskillnaden i masspektrum.
      Obs: ”Peak-picking” alternativet kanske inte är tillgängliga på varje masspektrometer.
  7. Använda pLink programvara18 för identifiering av tvärbunden di-peptider. Använda minimerade databaser för identifiering. Typiska sökparametrar är: instrument spectra, HCD; enzym, trypsin; Max. missade klyvning platser, 3; variabel modifieringar, oxidation (metionin) och carbamidomethylation (cystein); Cross-Linker, BS3; min. peptid längd, 4; Max. peptid längd, 100; min. peptid massan, 400 Da; Max. peptid massan, 10.000 Da; FDR, 1%.
    Obs: När använda differentially märkt cross-linkers, massa ökningen orsakas av länkaren behöver konfigureras. Det finns också andra vanligt förekommande programvara för korslänk identifiering, t.ex., xQuest17, MassMatrix19eller XlinkX15.
  8. Utvärdera databas sökresultaten av kvaliteten på fragmentering spectra. Godtagbar spektra av tvärbindningar bör Visa ion serie med båda peptider (minst 4 angränsande joner) på en rimlig signal-brus-förhållande.
    Obs: När använda differentially märkt tvärbindande reagenser, topp par i MS spectra kan användas som en ytterligare kvalitetskontroll.
  9. Om så krävs, visualisera tvärbindande resultaten i protein interaktion nätverk med hjälp av verktyg (t.ex., XVis, XiNET). Användning bar tomter eller cirkulär tomter för visualisering av proteininteraktioner.
    Obs: Båda programvaruverktyg är fritt tillgängliga på en webbserver. Detaljerade instruktionerna på respektive webbplatser (https://xvis.genzentrum.lmu.de/ och http://crosslinkviewer.org/).

Representative Results

Den strukturella analysen av proteiner och komplexen bildar de är grundläggande för att förstå deras funktion. Masspektrometri bidrar avsevärt till den strukturella undersökningen i att det kan tillämpas på nästan varje komplex av intresse oavsett storlek eller prova heterogenitet. Vi exemplifiera protokollet med hjälp av två välkarakteriserad proteinkomplex; första, hetero-dodecamer RvB1/B2 från C. thermophilum och andra, hetero-octameric CPS komplexa från E. coli.

Det första identifierat vi protein komponenterna i de två komplex. För detta, proteinerna var åtskilda av SDS-PAGE (figur 2) och gel banden klipptes från gelen. När i-gel matsmältningen av proteiner, peptid blandningen analyserades av flytande kopplade kromatografi masspektrometri peptid och fragment massorna utsattes för databas sökning. Efter detta arbetsflöde, vi identifierat alla proteinsubenheter av de två komplex med högt förtroende, dvs., observerades ett stort antal peptider med rimliga peptid poäng ger hög sekvens täckning för alla proteinsubenheter (tabell 1 ).

Vi analyserade sedan intakt RvB1/B2 komplex av infödda masspektrometri (figur 3A). Masspektrum avslöjade två arter, en på ungefär 8 000 m/z och en annan art på cirka 11.000-12.000 m/z. Beräknade massorna för dessa arter motsvarar hexameric (RvB1)3(RvB2)3 ringen (cirka 310 kDa) och den dodecameric dubbel-ring (RvB1)6(RvB2)6 (cirka 620 kDa). Både topp-serien visar två populationer; dessa kommer från en blandning av hans-taggade och otaggade RvB2 subenheter i komplexen. En kristallstruktur för RvB1/B2 komplexa erhölls tidigare36 och visar ordningen av dubbel-ringen (figur 3B). Den infödda masspektrum bekräftar därför stökiometri av den intakta dodecamer och dessutom avslöjar ett stabilt komplex i sub. Dessutom identifieras samexisterande populationer.

För att identifiera protein interaktion platser i RvB1/B2 komplex, tvärbunden vi kemiskt renade komplexet med BS3 cross-linker. Vi titreras först mängden BS3 under tvärbindande reaktionen att bestämma den optimala koncentrationen. BS3 är amine-specifika och kovalent länkar lysin sida kedjor samt N-termini av proteiner. Tvärbindande reaktionen följdes av SDS-PAGE (figur 2A). Icke-kors-länkade anläggningen visade både RvB1 och RvB2 subenheter. Att lägga till BS3 reaktionsblandningen orsakade kovalent sammanlänkningen av de proteiner som resulterar i protein band på högre molekylvikt. SDS gelen visar att ökande mängder BS3 ger högre belopp av tvärbunden arter medan icke-kors-länkade proteinsubenheter reduceras. Vi har sedan skär banden protein från gelen och följt protokollet som anges ovan för att identifiera protein interaktion platser. En exempel spektrum av en tvärbunden di-peptid visas (figur 3 c). Spektrumet visar y-ion serie båda peptider som bekräftar detta protein samspel. Totalt har vi fått 14 proteininteraktioner, inklusive fyra tvärbindningar mellan subenheter RvB1 och RvB2 och två tvärbindningar mellan två kopior av RvB2 (tabell 2). Resultaten från BS3 cross-linking visualiseras i en interaktion nätverk (figur 3D) visar inom molekylära interaktioner samt interaktioner mellan olika subenheter. Inom molekylär tvärbindningar föreslår att både RvB1 och RvB2 subenheter vik i sätt att N - och C-terminal domäner finns i närheten. Observera att inom molekylära interaktioner inte kan särskiljas från Inter molekylära interaktioner av den samma subenheten i detta fall. Mellan molekylär tvärbindningar mellan de två subunitsna observerades också. Av dessa kan två mellan molekylär tvärbindningar mellan RvB1 och RvB2 visualiseras i strukturen validera metoden tvärbindande. De andra mellan molekylär tvärbindningar ligger i flexibla slingor som inte ingår i kristallstrukturen. Vi har även identifierat två tvärbindningar i RvB2 som innehåller samma peptid sekvenser. Dessa tvärbindningar kan entydigt klassas som mellan molekylär som de måste härröra från två kopior av samma protein (figur 3D). Våra tvärbindande experiment avslöja protein interaktion platser inom komplex men också inom de proteinsubenheter ger insikter i deras strukturella arrangemang som kunde också bekräftas av befintliga kristallstrukturen (figur 3B).

Den andra protein komplex som vi studerat var CPS. Den infödda masspektrum (figur 4A) avslöjade tre proteinkomplex mellan 6 000 och 12 000 m/z. Den största komplexet av 640 kDa motsvarar den intakt hetero-octamer. De mindre komplex representerar två sub komplex; dimeren av små och stora CPS subunitsna (160 kDa) och en hetero-tetramer som innehåller två kopior av varje subenhet (320 kDa). Dessa sub komplex leverera första inblick i församlingens protein; dvs, stora och små subunitsna är i direkt kontakt (som avslöjades av den hetero-dimeren) och tetramer kan vara en produkt av två dimerer. För att få mer information om den strukturella arrangemanget i intakt CPS komplex, utfört vi tandem masspektrometri (MS/MS) av den hetero-octamer och den hetero-tetramer. I båda fallen den små subuniten skiljas från den föregångare tyder på att den små subuniten ligger i peripheryen av församlingen (figur 4B). Den små subuniten faktiskt perifer i den tillgängliga kristall struktur (figur 4 c)44.

Kemiska cross-linking med den BS3 cross-linker utfördes också. Med ökande mängder, stärktes kovalent sammanlänkningen av CPS subunitsna. Efter matsmältningen av proteiner och analys av peptiderna som beskrivs ovan, erhölls många proteininteraktioner inom den stora subenheten och en korslänk i den små subuniten (tabell 2). Dessutom liknar RvB1/B2 komplex, Vi hittade två mellan molekylär tvärbindningar mellan två kopior av den stora CPS-subenheten. Dessa tvärbindningar placera två stora subunitsna inför varandra på högkant C-terminal. I en tidigare studie, identifierat att kombinera strukturella masspektrometri och datormodellering35, vi tre ytterligare interaktioner i den stora subuniten som troligen härstammar från gränssnittet för två kopior av den stora subuniten valideras av kristallstrukturen och erhållna modellen (figur 4 c och tabell 2). Dessa interaktioner kan arrangemanget av CPS kärnan komplex bestående av fyra stora subenheter. Dock observerades inga Inter subenhet tvärbindningar mellan lilla och de stora subenheter. Genom att inspektera tillgängliga kristallstrukturen (figur 4 c), blir det uppenbart att interaktion ytan mellan tetrameriskt kärnan av anläggningen, som består av den stora subenheten och perifera små subunitsna är mycket liten, vilket kan förklara avsaknad av Inter subenhet interaktioner. Detta bekräftas av infödda masspektrometri som visade att den små subuniten separerar lätt från de intakta komplex troligen på grund av en liten bindande gränssnitt. Dock tillåta proteininteraktioner i CPS komplex kombination från kemiska cross-linking och infödda masspektrometri härleda deras strukturella arrangemang (figur 4 d).

Kombinationen av infödda masspektrometri och kemiska cross-linking tillsammans med massa spektrometriska identifiering av tvärbunden peptider, sammantaget och tillåter beredning av strukturella arrangemang av båda exempel komplex. Medan kemiska cross-linking avslöjade arrangemang av proteinsubenheter, till exempel samspelet mellan RvB1 och RvB2 eller inom tetrameriskt kärnan i CPS, infödda masspektrometri levereras protein stoichiometries av intakt komplex och förhärskande subcomplexes. När det gäller CPS, för vilka inga mellan molekylära interaktioner mellan de två subunitsna kan observeras av kemiska bryggbindningen, föreslår infödda masspektrometri att varje stora subenheten interagerar med en liten subunit (figur 4 d). Tandem mass spectrometry föreslog den små subuniten i anläggningen och en liten gränssnitt mellan båda subunits perifera läge.

Figure 1
Figur 1: arbetsflöde för infödda masspektrometri och cross-linking. Båda teknikerna levererar kompletterande resultat. Medan infödda masspektrometri avslöjar stoichiometries och interaktion moduler, ger cross-linking insikter i protein interaktion webbsidor i komplexen. Observera att kemiska cross-linking endast avslöjar binära interaktioner. (A) det första steget i native masspektrometri är buffert utbyte till en flyktig och vattenhaltiga buffert med filterenheter eller gel filtrering kolumner. Masspektrometri av intakt proteinkomplex sedan avslöjar deras stökiometri. I tandem mass spectrometry experiment dissocieras perifera subenheter. (B) för kemiska bryggbindningen, protein komplex inkuberas med en korslänkande reagens. Tvärbunden proteinerna rötas sedan till peptider som därefter analyseras av flytande kopplade kromatografi masspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: SDS-PAGE av tvärbunden RvB1/B2 (A) och CPS b komplex. (A) 2,5 µM RvB1/B2 lastades per gel körfält. Koncentrationen av BS3 varierades. Icke-kors-länkade RvB1/B2 visar de två proteinsubenheter på cirka 50 kDa. Tillägg av BS3 orsakade kovalent sammanlänkningen av de proteinsubenheter resulterar i protein band på högre molekylvikt. Tvärbunden arter är ökat med högre BS3 koncentrationer. Optimala tvärbindande förhållanden är markerade (röd). (B) 10 µM CPS lastades per gel körfält. Den stora (90 kDa) och små (40 kDa) CPS subenheter erhålls. Tillägg av BS3 orsakade kovalent sammanlänkningen av de proteinsubenheter resulterar i protein band på högre molekylvikt. Optimala tvärbindande förhållanden är markerade (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Native masspektrometri och kemiska cross-linking av RvB1/B2 komplexa. (A) den infödda masspektrum avslöjar två arter av RvB1/B2; den intakta dodecamer (dvs., (RvB1)6(RvB2)6) vid cirka 11 000 och 12 000 m/z och hexameric ring (RvB1)3(RvB2)3 på ungefär 8 000 m/z. Båda arterna Visa två populationer som härrör från hans-taggade och otaggade RvB2. Spektrumet har ändrats från35. (B), kristallen strukturerar av RvB1/B2 visas (PDB-ID 4WVY). Subenheter omväxlande RvB1 och RvB2 och bildar två hexameric ringar. (C) fragmentering spektrum av en tvärbunden di-peptid. N-terminalen av RvB1 var tvärbunden med K23 av RvB1. y-ion serie erhölls för båda peptider (rött och cyan). (D) Intra - och inter - protein interaktioner erhålls i RvB1/B2 komplex. Mellan-Cross-Country-länkar visas i rött, inter-cross-links visas i blått. Skäret visar två mellan molekylär tvärbindningar mellan RvB1 och RvB2 subenheter som kan visualiseras i kristallstrukturen (grön, infoga). Interaktioner som härstammar från två RvB2 kopior visas som blå streckade linjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Native masspektrometri och kemiska cross-linking av CPS. (A) den infödda masspektrum av CPS visar tre komplex. Den hetero-dimeren (160 kDa), hetero-tetramer (320 kDa) och den hetero-octamer (640 kDa). Spektrumet har ändrats från35. (B) Tandem masspektrometri av tetrameriskt och octameric CPS komplexa avslöjade dissociation av den små subuniten CPS. (C), kristallen strukturerar av CPS visas (PDB-ID 1BXR). De stora subenheter utgör ett tetrameriskt kärna och små subunitsna ligger i peripheryen av anläggningen. Mellan molekylär tvärbindningar mellan två kopior av den stora subuniten visas (grön). (D) interaktioner mellan stora och små CPS subunitsna. Infödda masspektrometri visade subcomplexes och föreslår ett perifert läge av den små subuniten. Kemiska tvärbindningar ange åtgärder i tetrameriskt kärna av CPS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: databasen sökresultat. Proteinerna identifierades av flytande kopplade kromatografi masspektrometri och databas sökning. Protein namnen, anslutningen nummer, samt beskrivning och protein massa ges. Den protein poängen, antal observerade spektra per protein och antalet observerade peptid sekvenser listas. De fem peptiderna med högsta maskot peptider poängen listas för varje protein delenhet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Tabell 2: tvärbindningar observerats i RvB1/B2 och CPS. Subunitsna av komplexen och tvärbunden rester ges. Typ av korslänk (intra - eller mellan molekylär) avslöjades från överlappande peptid sekvenser eller en tidigare studie35. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Protokoll finns för mass spectrometry-baserade strukturanalys av flera subenhet proteinkomplex. Två metoder, som beskrivs i protokollet, mestadels leverera kompletterande resultat och är väl lämpade att få insikter i de strukturella arrangemangen inom protein (-ligand) komplex som är svåra att studera genom konventionella strukturella tekniker. Infödda masspektrometri levererar insikter i protein stoichiometries samt proteininteraktioner genom att analysera subcomplexes och stabil interaktion moduler. Bryggbindningen, däremot, ger information på direkt kontakt webbplatser. Beroende på den cross-linker används, en viss flexibilitet kan eller bör ingå i analysen.

De medföljande protokoll är i allmänhet lätt att utföra och inte tidskrävande. Hela protokollet kan utföras inom en vecka och kan tillämpas på nästan alla proteinkomplex, även om en viss mängd protein komplex krävs för framgångsrika analysen. Provberedning är enkel och kräver inte speciellt renat proteinkomplex. En vanlig fallgrop är dock kontaminering av provet under provberedning för mass spectrometry-baserade protein identifiering. Dessa föroreningar i de flesta fall inkluderar keratins som påbörjar från damm, hud eller hår. Därför extra vård som bär handskar och lab rockar, filtrerande aqueous buffertar, och med hjälp av hög renhet lösningsmedel bör tas under provberedning för mass spectrometry-baserade protein identifiering. Andra kontaminerande proteiner såsom chaperones införs oftast under protein rening, t.ex., när du använder affinitet taggar. I dessa fall bör protein rening förbättras, exempelvis genom att öka tvätt steg. I varje fall protein föroreningar i provet lätt identifieras under databas sökningen genom att utelämna filtret taxonomi (dvssöka mot proteiner från alla arter). Om bara några peptider observeras (dvs.en låg protein täckning kunde erhållas), trots att tillräckliga exempel finns, det kan vara nödvändigt att använda en annan proteinas under matsmältningen. I allmänhet ger Trypsin ett tillräckligt antal peptider; dock i vissa fall såsom membranproteiner eller membran domäner av proteiner, antalet tryptic klyvning platser minskas och andra enzymer som inriktning hydrofoba aminosyror är ett bättre val.

När det gäller instrumentering krävs ett särskilt modifierade instrument för infödda masspektrometri som upprätthåller icke-kovalenta interaktioner under överföringen in i gas-fas. Flera typer av mätinstrument har införts, inklusive Q-ToF och orbitrap instrument. Medan modifierade Q-ToF masspektrometrar finns kommersiellt tillgängliga för infödda masspektrometri sedan flera år, den senare endast nyligen introducerade och i de flesta fall kräver specialiserade ändring45. Dock tillämpningen av högupplösta instrument får studera bindningen av flera ligander och deras kvantifiering46,47 och är lovande för kommande ansökningar.

För att identifiera tvärbunden di-peptider av flytande kopplade kromatografi masspektrometri, kan standardförfaranden med några ändringar tillämpas. Databas sökningen är dock den begränsande faktorn som specialiserad programvara kan sällan ta itu med stora databaser och minskad databaser som innehåller protein subunitsna av komplexen krävs. Nyligen genomförda studier används mass spectrometry-cleavable cross-linkers inriktning proteininteraktioner i hela cellen lysates48,49. Användning av kemiska cross-linkers som fragment i tandem mass spectrometry experiment mestadels ger linjär peptider (modifierad av cross-linker), som kan identifieras genom ytterligare fragmentering och databas sökning av linjära peptider, och detta minskar Söktid och computational Sök rum. För att utföra dessa experiment, krävs en massa ion trap-analysator eller en hybrid masspektrometer med en ion trap dock. I allmänhet, eftersom falskt positiva resultat är en viktig fråga, verifieras masspektra av tvärbunden peptider ofta manuellt av kvaliteten på deras fragment spektra som sträcker sig data analys tid enormt. Utveckla robusta scoring system som kan tillämpas utan ytterligare åtgärder för validering är därför potentiella framtida tillämpningar. Ett sätt att förbättra dataanalys och att minska antalet falskt positiva var införandet av falsk upptäckten beräkningar och deras tillämpning på cross-linking datauppsättningar50.

I allmänhet, de tekniker som beskrivs här kan kompletteras med ytterligare masspektrometri tekniker (t.ex., kovalent märkning) att öka produktionen från analysen. Andra ändringar och förbättringar av protokollen kan enkelt implementeras. Som sådan unravels jämförande tvärbindande34 konfirmerande förändringar i sammansättningen protein. Ytterligare utveckling i native masspektrometri tillåter numera analys av membranet proteiner51,52 och deras interaktioner med lipider28,52,53,54 . Ny utveckling av högupplösta masspektrometrar för infödda masspektrometri har utvidgat tillämpningen och ligand bindande, t.ex., bindande av lipider till membranproteiner, kan nu tas med i analys45, 46. i kombination med datormodellering metoder, dessa tekniker kan leverera strukturella modeller av varierande upplösning55. Om ingen kristallstrukturer finns för intakt komplex eller enda subunitsna, kan masspektrometri leverera första insikter proteininteraktioner och okänd komplex topologi. Beroende på de tekniker som används och de resultat som erhållits, kan lågupplösta modeller av okänd komplexet erhållas56,57,58. Om kristallen strukturerar eller homologi modeller finns tillgängliga, kan strukturell information från masspektrometri ge även nära-native modeller59.

I jämförelse med andra strukturella tekniker, masspektrometri har fördelen att det kräver låg prov belopp, det kan hantera heterogena prover och är tillämplig på proteinkomplex av obegränsad storlek. Dessutom kan masspektrometri utredningen av dynamiska protein system. Olika populationer av protein eller proteinkomplex som finns i lösningen analyseras vanligen tillsammans och därför, till skillnad från med andra strukturella tekniker som kräver urval av vissa populationer, alla konformationer bibehålls under analys och är taxeras i ett experiment. Kvantitativa tvärbindande metoder var nyligen införda34,60,61 och är lovande för framtida tillämpningar som beskriver konfirmerande förändringar under olika förhållanden.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar våra kolleger för bra diskussioner. Vi tackar också Ilme Schlichting och Karl-Peter Hopfner för att tillhandahålla proteinkomplex. Vi erkänner finansiering från det federala departement för utbildning och forskning (BMBF, ZIK programme, 03Z22HN22), Europeiska regionala utvecklingsfonden (EFRE, ZS/2016/04/78115) och den MLU Halle-Wittenberg att C.S. och finansiering från Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) till A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, Consumables
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma Aldrich H4034 buffer
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 pH
Acetonitrile Optima LC/MS Fisher Chemicals A955-1 solvent
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) Millipore i.e. UFC500396 buffer exchange, concentration
Ammonium acetate solution Sigma Aldrich A2706 native MS
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830 in-gel digestion
Ammonium solution Sigma Aldrich 9859 pH
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) Thermo Scientific 21590 cross-linker
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) Thermo Scientific 21595 cross-linker
Caesium iodide Sigma Aldrich 203033 calibration
Calcium chloride Sigma Aldrich C5670 in-gel digestion
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) Harvard Apparatus 30-0038 native MS
Disuccinimidyl suberate (DSS) Thermo Scientific 21655 cross-linker
DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich D5545 in-gel digestion
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D8418 solvent
Ethanol Fisher Chemicals BP2818 solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Instant Blue Coomassie staining solution expedeon ISB1L staining solution for gel electrophoresis
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) life technologies NP0323BOX gel electrophoresis
Iodoacetamide Sigma Aldrich I1149 In-gel digestion
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Micro BioSpin 6 columns BioRad 732-6222 buffer exchange
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005 running buffer, gel electrophoresis
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) invitrogen NP0007 sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis
NuPAGE MES SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE MOPS SDS Running buffer life technologies NP0001 gel electrophoresis
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) invitrogen NP0004 reducing Agent for gel electrophoresis
PBS - phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 buffer
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker invitrogen LC5925 prestained Protein Marker for gel electrophoresis
Sodium acetate Sigma Aldrich S2889 ethanol precipitation
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma Aldrich 252859 buffer
Trypsin Sigma Aldrich TRYPSEQ-RO (11418475001) in-gel digestion
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) Sartorius i.e. VS0101 buffer exchange, concentration
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge Thermo Scientific 75002425
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 Sutter Instruments P-1000
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell Invitrogen EI0001
Gold Coater Quorum Q150R S Quorum Technologies Ltd. Q150RS
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T Heidolph Instruments 544-41200-00
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade Waters (Micromass) -
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) Thermo Scientific 164570
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) Thermo Scientific 164213
scalpel Fisher Scientifc 10463989
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge Thermo Scientific SPD121DP-230
Thermomixer C Eppendorf 5382000015
Tweezers AA Sigma Aldrich Z680184-1EA
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath VWR 142-0084
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) Thermo Scientific 0726030+
Name Company Catalog Number Comments
Software, Software Tools, Database search
Mascot www.matrixscience.com
Massign http://massign.chem.ox.ac.uk
MassLynx Micromass
MassMatrix Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)
MaxQuant Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)
pLink Yang, B. Nat Methods 9 (2012)
pXtract conversion tool http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html
UniDec Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)
XCalibur Thermo Scientific
XiNET http://crosslinkviewer.org
XLinkX Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)
xQuest Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)
Xvis https://xvis.genzentrum.lmu.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, I. D. Timeline: the march of structural biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 377-381 (2002).
  2. Liko, I., Allison, T. M., Hopper, J. T., Robinson, C. V. Mass spectrometry guided structural biology. Curr Opin Struct Biol. 40, 136-144 (2016).
  3. Robinson, C. V. From molecular chaperones to membrane motors: through the lens of a mass spectrometrist. Biochem Soc Trans. 45 (1), 251-260 (2017).
  4. Lossl, P., van de Waterbeemd, M., Heck, A. J. The diverse and expanding role of mass spectrometry in structural and molecular biology. EMBO J. 35 (24), 2634-2657 (2016).
  5. Wang, L., Chance, M. R. Protein Footprinting Comes of Age: Mass Spectrometry for Biophysical Structure Assessment. Mol Cell Proteomics. 16 (5), 706-716 (2017).
  6. Steen, H., Mann, M. The ABC's (and XYZ's) of peptide sequencing. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (9), 699-711 (2004).
  7. Olsen, J. V., Mann, M. Status of large-scale analysis of post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3444-3452 (2013).
  8. Schmidt, C., Robinson, C. V. Dynamic protein ligand interactions--insights from MS. FEBS J. 281 (8), 1950-1964 (2014).
  9. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: what is it and what can it tell us? Anal Bioanal Chem. 397 (3), 967-972 (2010).
  10. Zhang, Z., Smith, D. L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci. 2 (4), 522-531 (1993).
  11. Leitner, A., Lindner, W. Current chemical tagging strategies for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 813 (1-2), 1-26 (2004).
  12. Leitner, A., Lindner, W. Chemistry meets proteomics: the use of chemical tagging reactions for MS-based proteomics. Proteomics. 6 (20), 5418-5434 (2006).
  13. Kiselar, J. G., Chance, M. R. Future directions of structural mass spectrometry using hydroxyl radical footprinting. J Mass Spectrom. 45 (12), 1373-1382 (2010).
  14. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chem Rev. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  15. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  16. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  17. Rinner, O., et al. Identification of cross-linked peptides from large sequence databases. Nat Methods. 5 (4), 315-318 (2008).
  18. Yang, B., et al. Identification of cross-linked peptides from complex samples. Nat Methods. 9 (9), 904-906 (2012).
  19. Xu, H., Hsu, P. H., Zhang, L., Tsai, M. D., Freitas, M. A. Database search algorithm for identification of intact cross-links in proteins and peptides using tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 9 (7), 3384-3393 (2010).
  20. Leitner, A., Faini, M., Stengel, F., Aebersold, R. Crosslinking and Mass Spectrometry: An Integrated Technology to Understand the Structure and Function of Molecular Machines. Trends Biochem Sci. 41 (1), 20-32 (2016).
  21. Heck, A. J. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).
  22. Sharon, M., Robinson, C. V. The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes. Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).
  23. Goth, M., Pagel, K. Ion mobility-mass spectrometry as a tool to investigate protein-ligand interactions. Anal Bioanal Chem. , (2017).
  24. Uetrecht, C., Rose, R. J., van Duijn, E., Lorenzen, K., Heck, A. J. Ion mobility mass spectrometry of proteins and protein assemblies. Chem Soc Rev. 39 (5), 1633-1655 (2010).
  25. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).
  26. Sobott, F., Hernandez, H., McCammon, M. G., Tito, M. A., Robinson, C. V. A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies. Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).
  27. Rostom, A. A., et al. Detection and selective dissociation of intact ribosomes in a mass spectrometer. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5185-5190 (2000).
  28. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  29. Uetrecht, C., et al. High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).
  30. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Rep. 11 (5), 759-769 (2015).
  31. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. The joining of the Hsp90 and Hsp70 chaperone cycles yields transient interactions and stable intermediates: insights from mass spectrometry. Oncotarget. 6 (21), 18276-18281 (2015).
  32. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Sci Rep. 7, 44068 (2017).
  33. Schmidt, C., et al. Comparative cross-linking and mass spectrometry of an intact F-type ATPase suggest a role for phosphorylation. Nat Commun. 4, 1985 (2013).
  34. Schmidt, C., Robinson, C. V. A comparative cross-linking strategy to probe conformational changes in protein complexes. Nat Protoc. 9 (9), 2224-2236 (2014).
  35. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Anal Chem. 89 (3), 1459-1468 (2017).
  36. Lakomek, K., Stoehr, G., Tosi, A., Schmailzl, M., Hopfner, K. P. Structural basis for dodecameric assembly states and conformational plasticity of the full-length AAA+ ATPases Rvb1 · Rvb2. Structure. 23 (3), 483-495 (2015).
  37. Mareya, S. M., Raushel, F. M. A molecular wedge for triggering the amidotransferase activity of carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 33 (10), 2945-2950 (1994).
  38. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).
  39. Olsen, J. V., et al. Parts per million mass accuracy on an Orbitrap mass spectrometer via lock mass injection into a C-trap. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 2010-2021 (2005).
  40. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  41. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. J Vis Exp. (40), (2010).
  42. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Anal Chem. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  43. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Anal Chem. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  44. Thoden, J. B., Wesenberg, G., Raushel, F. M., Holden, H. M. Carbamoyl phosphate synthetase: closure of the B-domain as a result of nucleotide binding. Biochemistry. 38 (8), 2347-2357 (1999).
  45. Rose, R. J., Damoc, E., Denisov, E., Makarov, A., Heck, A. J. High-sensitivity Orbitrap mass analysis of intact macromolecular assemblies. Nat Methods. 9 (11), 1084-1086 (2012).
  46. Gault, J., et al. High-resolution mass spectrometry of small molecules bound to membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 333-336 (2016).
  47. Mehmood, S., et al. Mass spectrometry captures off-target drug binding and provides mechanistic insights into the human metalloprotease ZMPSTE24. Nat Chem. 8 (12), 1152-1158 (2016).
  48. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  49. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).
  50. Walzthoeni, T., et al. False discovery rate estimation for cross-linked peptides identified by mass spectrometry. Nat Methods. 9 (9), 901-903 (2012).
  51. Barrera, N. P., Di Bartolo, N., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles protect membrane complexes from solution to vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  52. Barrera, N. P., et al. Mass spectrometry of membrane transporters reveals subunit stoichiometry and interactions. Nat Methods. 6 (8), 585-587 (2009).
  53. Laganowsky, A., et al. Membrane proteins bind lipids selectively to modulate their structure and function. Nature. 510 (7503), 172-175 (2014).
  54. Marcoux, J., et al. Mass spectrometry reveals synergistic effects of nucleotides, lipids, and drugs binding to a multidrug resistance efflux pump. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9704-9709 (2013).
  55. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. J Proteomics. , (2017).
  56. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  57. Pukala, T. L., et al. Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements. Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).
  58. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chem Biol. 22 (1), 117-128 (2015).
  59. Politis, A., et al. A mass spectrometry-based hybrid method for structural modeling of protein complexes. Nat Methods. 11 (4), 403-406 (2014).
  60. Fischer, L., Chen, Z. A., Rappsilber, J. Quantitative cross-linking/mass spectrometry using isotope-labelled cross-linkers. J Proteomics. 88, 120-128 (2013).
  61. Yu, C., et al. Developing a Multiplexed Quantitative Cross-Linking Mass Spectrometry Platform for Comparative Structural Analysis of Protein Complexes. Anal Chem. 88 (20), 10301-10308 (2016).

Tags

Biokemi frågan 129 masspektrometri tvärbindningsmedel infödda masspektrometri proteinkomplex proteininteraktioner protein stökiometri protein nätverk dataanalys
Att kombinera kemisk Cross-linking och masspektrometri av intakt proteinkomplex att studera arkitekturen av flera subenhet Protein församlingar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S.,… More

Haupt, C., Hofmann, T., Wittig, S., Kostmann, S., Politis, A., Schmidt, C. Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies. J. Vis. Exp. (129), e56747, doi:10.3791/56747 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter