Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolation, kultur og differentiering af knoglemarven stromale celler og osteoklast ophav fra mus

Published: January 6, 2018 doi: 10.3791/56750
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

I denne artikel præsenterer vi metoder for at isolere og differentiere knoglemarv stromale celler og hæmatopoietisk stamceller fra mus lange knogler. To forskellige protokoller præsenteres højtydende forskellige cellepopulationer egnet til udvidelse og differentiering af osteoblaster, adipocytter og osteoklaster.

Abstract

Knoglemarven stromale celler (BMSCs) udgør en celle population rutinemæssigt anvendes som en repræsentation af mesenkymale stamceller in vitro-. De bor i knoglemarven hulrum sammen med hæmatopoietisk stamceller (HSCs), som kan give anledning til røde blodlegemer, immun ophav og osteoklaster. Således ekstraktioner af cellepopulationer fra knoglemarven resultater i en meget heterogen blanding af forskellige cellepopulationer, der kan præsentere udfordringer i eksperimentelle design og forvirre data fortolkning. Flere isolation og kultur teknikker er blevet udviklet i laboratorier for at opnå mere eller mindre homogene befolkninger af BMSCs og HSCs invitro. Her præsenterer vi to metoder til isolering af BMSCs og HSCs fra mus lange knogler: en metode, der giver en blandet population af BMSCs og HSCs og en metode, der forsøger at adskille to cellepopulationer baseret på overholdelse. Begge metoder giver celler velegnet til osteogenic og adipogenic differentiering eksperimenter såvel som funktionelle assays.

Introduction

Primære murine BMSCs er almindeligt anvendt som en in vitro- model af mesenkymale stamceller siden deres opdagelse i den tidlige 1980s1. Faktisk, kulturer af plast-tilhænger celler skyllet fra knoglemarven hulrummet af lange knogler opretholde kapacitet skal differentieres i osteoblaster, osteoklaster, chondrocytter eller adipocytter i mange studier2,3, 4 , 5. dog knoglemarven er en unik væv består af mange forskellige cellepopulationer, herunder, men ikke begrænset til, BMSCs, HSCs, endotel og immun celler. Således, isolation og kultur teknikker kan give cellepopulationer med forskellige homogenitet. Ved hjælp af disse teknikker til at teste den potentielle differentiering fra celler kan være udfordrende. For eksempel, når man sammenligner celler fra mus med forskellige genotyper, begyndende med en blandet celle population begrænser fortolkning af data. Omvendt, at opnå homogen populationer af BMSCs og HSCs kan være teknisk vanskeligt og måske ikke som repræsentant for en ex vivo -model.

I vores laboratorium er vi primært interesseret i udnyttelsen af BMSCs på grund af deres potentiale skal differentieres i osteoblaster og osteoklaster adipocytter. Vi præsenterer her, teknikker til BMSCs og HSCs isolation og kultur bruges til at vurdere osteoblastogenesis eller adipogenesis i vitroog kulturer af HSCs til at differentiere i osteoklaster. Én metode bruger en blandet population af knoglemarv celler (BMCs) der indeholder BMSCs og HSCs direkte egnet til adipogenesis, osteoblastogenesis og osteoclastogenesis (kaldet samlede BMCs). Denne metode er en tættere ex vivo repræsentation af heterogenitet fundet blandt cellerne i knoglemarven mikromiljø. En anden metode adskiller tilhænger fra ikke-tilhænger celler i et forsøg på at kultur "renere" populationer af BMSCs og HSCs (kaldet tilhænger BMSCs). Den senere metode tillader cellekultur eksperimenter for at starte med en mere præcis antal BMSCs eller HSCs og reducerer potentiale af komplekse indirekte virkninger af andre cellepopulationer, der forbliver i kulturen. Begge metoder har været tidligere offentliggjort og bruges til at løse forskellige forskning spørgsmål6,7,8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på Maine Medical Center Research Institute.

1. indsamling rør forberedelse

  1. Gøre BMSC Kulturmedier ved at supplere Minimum afgørende Medium α (MEM α) med 10% føtal bovint Serum og 1% af Penicillin/Streptomycin.
  2. Plads 100 µL af BMSC kultur medier i 1,5 mL microcentrifuge rør. 3 knogler vil normalt passer i et enkelt rør så forberede i overensstemmelse hermed.
  3. Skær enderne af 200 µL pipette tips nok, således at de passer i centrifugeglas. Indsæt tips inde i rørene og sikre, at Lågene kan lukke før markedsføring rør på is.
    Bemærk: Alternativt 0,75 mL microcentrifuge rør med enderne cut kan indsættes i 1,5 mL microcentrifuge tube.

2. høst af knogler fra mus

  1. Aflive dyr ved hjælp af CO2 efterfulgt af cervikal dislokation og sprøjte dem med 70% ethanol.
    Bemærk: Sikre, at der anvendes dyr fra samme køn og fortrinsvis på samme alder. Vi bruger rutinemæssigt dyr i alderen 7 til 8 uger. Vi anbefaler, at samle celler fra mindst 3 dyr pr. eksperimentelle grupper at give en bedre repræsentant og reproducerbare celle population.
  2. Placer de aflivede mus på ryggen på en dissekere bord. Bruge pincet til at oprette et telt af huden på maven. Gør et lille snit (omkring 1 cm) ved hjælp af steril dissekere saks. Skrælle huden mod arme og ben og fødder fra snittet for at udsætte den nedre abdomen og benene.
    1. Skåret under anklen fælles at fjerne foden. Skær langs crista crest ved hoften til at adskille lårbenet hovedet fra hofteben. Mens musen er stadig på ryggen, gøre et snit midt i hofteben til at adskille de to iliaca knogler.
  3. Bruger fnugfri klude, Fjern forsigtigt musklen fra lårben, skinneben og iliaca knogler.
    Bemærk: Skære så meget af sener og muskler fra knoglerne som muligt gør rengøring hurtigere og nemmere med en fnugfri klude (fx, kimwipes). Vær forsigtig, når manipulere knogler, som de har tendens til at bryde nemt og deres skrøbelighed kan forhøjes med visse genotyper.
  4. Når alle prøver er blevet dissekeret, placere dem i PBS på is og flytte til en steril kultur hood for de resterende trin i isolation.
    Bemærk: Arbejder aseptisk så vidt muligt vil mindske risikoen for forurening i kulturerne.
  5. Foretage små stykker (ca 1 til 2 mm) i begge proksimale og distale enderne af knoglerne før du placerer dem i de sektioneret tips inden for centrifugeglas.
    Bemærk: Sørg for at skære en tilstrækkelig mængde, så knoglemarv kan være centrifugeres ud; dog pleje skal tages til at undgå at skære for meget som cellepopulationer tendens til at variere baseret på nærhed i marv plads.
  6. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 15 s ved stuetemperatur. Sikre, at alle marv er skyllet og pelleted nederst i 1,5 mL tube mens knoglerne er inde skær (enten 200 µL afpipetteres tip eller 0,75 mL microcentrifuge tube). Når alle marv er indsamlet, skal du fjerne skær med knoglerne fra indsamling rør.
    Bemærk: Hvis alle marv er skyllet, vil knoglerne vises hvide. Men hvis marv stadig i visse knogler, prøv skæring ender igen og centrifugeres.

3. cellesuspension

  1. Ved hjælp af en 25 G nål, trække pellets cellen op og ned langsomt at bryde op klumper og kombinere alle prøver i en enkelt 15 mL konisk slange. Der tilsættes 10 mL af BMSC Kulturmedier pr. 500 µL af prøver.
  2. Placer en 70 µm filter på toppen af en 50 mL konisk slange og passere cellesuspension gennem dette filter for at fjerne mulige knoglerester.

4. plating og kultur af blandet populationer af knoglemarv celler (samlede BMCs)

Bemærk: Celler er kulturperler ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO2.

  1. Beregne antallet af celler og plade dem på 1,0 x 106 celler/cm2 i dyrkningsmedier. Tillad 72 h af blandet kultur for cellerne til at vedhæfte.
    Bemærk: Vi anbefaler fortynding celle suspension 20 x i dyrkningsmedier og fortynding igen i trypan blå før tælle celler ved hjælp af en hemocytometer. For 7 uger gamle mandlige C57Bl6/J mus, vi udbytte rutinemæssigt en cell antal på omkring 50 x 106 celler men alder, køn og stamme kan påvirke celle antallet stærkt.
    Bemærk: En mix befolkning af celler bør vedhæfte nederst i kultur godt.
  2. Efter 72 h, fjerne medier og erstatte det med friske medier. Fortsat ændre medierne hver anden dag og tjek for confluency. Når cellerne kommer til 80-100% confluency, er de klar til differentiering.
    Bemærk: Da denne kultur er blandet med både BMSCs og HSCs, det kan direkte bruges til osteoblastogenesis, adipogenesis samt osteoclastogenesis.

5. plating og kultur af Split befolkning af BMSCs (vedhængende BMSCs)

Bemærk: Celler er kulturperler ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO2.

  1. Plade alle de celler, der opsamlet fra lårben, skinneben og iliaca knogler af en mus i en 10 cm kultur skål (55 cm2 kultur område).
    Bemærk: Når samle 2-3 C57BL/6J mus, vi typisk plade denne 'total' knoglemarv befolkning i et 150 cm2 kolbe.
  2. Efter 48 h af blandingskultur, fjerne kultur medier (som indeholder ikke-tilhænger HSCs). Hvis osteoclastogenesis eksperimenter der skal udføres, indstille denne befolkning af ikke-tilhænger celler til side (Se afsnit 7), hvis ikke, aspirat og kassér disse celler.
  3. Vask plade/kolben med PBS omhyggeligt, ikke forstyrre de tilknyttede celler.
  4. Fjerne PBS og cellerne ved at tilføje 0,25% trypsin og inkubation ved 37 ° C i 1-3 min. dæmpningen af trypsin ved at tilføje celle medier til cellesuspension. På dette tidspunkt, BMSCs, som er nu ophævet, kan tælles (som tidligere udført i trin 4.1) og forgyldt for fremtidige eksperimenter.
  5. Beregne antallet af celler brug for plating. Der centrifugeres kræves mængden af cellesuspension ved 1.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
    Bemærk: Celler er typisk forgyldt baseret på end-point eksperimenter. For eksempel, hvis protein/RNA er at være isolerede plade vi typisk på en højere tæthed (~1.0-2.0 x 106 celler/brønd i 6-godt plade).
  6. Fjern mediet og resuspenderes celle i mængden af kultur medier behov for plating. Plade celler i dyrkningsmedier ifølge eksperimenterne og mulighed at vedhæfte et par dage. Når BMSCs nå confluency, gå videre til at udføre differentiering.

6. differentiering af BMSCs

  1. Osteoblaster
    1. Gøre osteoblastdannelse differentiering medier ved at tilføje 800 µL 1 M β-glycerol phosphat i PBS og 200 µL af 0,5 M ascorbinsyre i PBS til 99 mL af BMSC kultur medier (Se trin 1.1 for sammensætningen af BMSC kultur medier).
      1. Når BMSCs kulturer enten (samlede BMCs fra trin 4.3) eller tilhænger BMSCs fra trin 5.6 er sammenflydende, differentiere dem i osteoblaster ved at skifte kultur medier til osteoblastdannelse differentiering medier.
    2. Erstatte differentiering medierne hver anden dag. Cellerne begynde at producere hvide knuder af mineralisering. Visualisere dem med det blotte øje i bunden af brønden; denne proces kan forekomme inden for et par dage til 3 uger.
      1. For at vurdere osteoblastogenesis, udføre alkalisk fosfatase farvning og/eller Von Kossa farvning på brønde som beskrevet i afsnit 8.
        Bemærk: Ændre medierne omhyggeligt ved at vippe plader i en lille vinkel for at undgå forstyrrelser af cellen éncellelag.
  2. Adipocytter
    1. Lav adipocyt base medier ved at blande sammen 90 mL Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) høje glukose, 10 mL føtalt bovint Serum, 1 mL af Penicillin/Streptomycin, 100 µL 20 mM rosiglitazon og 100 µL af 2 mM Insulin. Hvis det er nødvendigt, skal du gemme dette medie ved 4 ° C for uge under differentiering eksperimentet.
    2. Gøre adipocyt induktion medier ved at tilføje 200 µL af 62.5 mM 3-isobutylacetophenon-1-Methylxanthin (IBMX) og 25 µL 1 mm dexamethason til 25 mL af adipocyt Base medier.
    3. Når BMSCs kulturer enten (samlede BMCs fra trin 4.3) eller tilhænger BMSCs fra trin 5.6 er sammenflydende, ændre medierne til adipocyt induktion medier. Overveje denne dag 0 af differentiering.
    4. Efter 48 h, fjerne medier og opdatere kultur med adipocyt induktion medier.
    5. På dag 4, skifte til adipocyt base medier.
      Bemærk: Lipid dråber kan starte optræder så tidligt som i dag 2 eller dag 4.
    6. På dag 7, observere at celler har akkumuleret maksimale lipid dråber og vise en fænotype svarende til en moden adipocyt. Kultur ikke forbi dette punkt, da det kan medføre celle død/udstationering.

7. differentiering af HSCs i osteoklaster

  1. Gøre osteoklast differentiering medier ved at tilføje 50 µL af 25 µg/mL af Receptor aktivator af NFKB Ligand (RANKL) og 15 µL af 25 µg/mL af makrofag koloni stimulerende faktor (mCSF) til 25 mL af BMSC Kulturmedier.
  2. Når de samlede BMCs (fra trin 4.3) eller ikke-tilhænger celler (fra trin 5.2) er knyttet til brønden, kan kultur medier skiftes til osteoklast differentiering medier. Genopbygge differentiering medierne hver anden dag.
  3. Observere osteoklast kulturer hver dag under et mikroskop ved 10 X forstørrelse. Observere at osteoklaster smelter og danner multinucleated celler, typisk omkring dag 5-7 om differentiering.

8. farvning

  1. Osteoblaster
    Bemærk: For basisk fosfatase (AP) farvning, vi ofte bruge en AP farvning kit (Se Tabel af materialer) Ifølge retningslinjerne.
    1. Udføre AP farvning af efter kit producent retningslinjer.
      1. Opsug medier og skyl celler med PBS. Fix cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i 12 min. ved stuetemperatur.
      2. I mellemtiden gør det AP løsning ved hjælp af reagenser fra AP farvning kit ved at tilføje 500 µL natriumnitrit til 500 µL FRV-basisk opløsning og blandes forsigtigt; Lad det stå i 2 min. tilføje 22,5 mL dH2O og 500 µL Naphthol AS-BI basisk. Bland forsigtigt.
        Forsigtig: PFA er giftigt og skal håndteres med omhu.
      3. Når cellerne er faste, skyl med PBS og tilføje AP løsning til hver brønd (1-2 mL pr. brønd). Dæk med alufolie og lad pletten i 30 min. ved stuetemperatur beskyttet mod lys. Opsug løsningen, vaskes med destilleret vand, og lad pladen til tørre.
    2. Erhverve billeder af farvede kolonier ved hjælp af et kamera for at observere alkalisk fosfatase positive celler.
    3. Du kan også udføre Von Kossa i stedet for basisk fosfatase farvning. For dette, vaske wells grundigt med destilleret vand, som enhver resterende PBS vil bundfald med sølvnitrat.
      1. Fix cellerne med 4% PFA i PBS i 12 min. ved stuetemperatur. Derefter tilføje nok 5% sølvnitratopløsning for at dække brønden og udsættes for stærkt lys i 1 time ved stuetemperatur.
    4. Fjerne sølvnitratopløsning og skylles hver brønd med destilleret vand. Tilføj 5% natrium thiosulfate løsning til cellerne og lad det stå i 3 min.
    5. Opsug natrium thiosulfate og vaskes med destilleret vand. Lad pladen tørre og observere de mineralske indbetaling farves i mørk brun/sort med det blotte øje.
  2. Adipocytter
    1. For olie røde O (ORO) farvning, fastsætte celler ved hjælp af 10% Neutral Buffered Formalin i 1 time ved stuetemperatur.
    2. I mellemtiden gør ORO Stock løsning ved at opløse 0,035 g i 10 mL isopropanol. Dette er tilstrækkeligt til en 6-godt plade. Bland og sendes ved hjælp af et filtrerpapir (pore størrelse 11 µm).
    3. Gøre ORO arbejder løsning ved at fortynde 9 mL ORO stamopløsning med 6 mL destilleret vand. Forlade løsningen på en rocker indtil klar til brug.
    4. Forberede 60% isopropanol i destilleret vand (gøre nok til at dække hver godt).
    5. Når cellerne er faste, fjerne den Fikseringsvæske og vask en gang med destilleret vand. Erstatte vandet med 60% isopropanol løsning for 1 min.
      Bemærk: Tilføj flydende langsomt mens deponering pladen; adipocytter løsne meget nemt.
    6. Fjerne isopropanol og tilføje nok ORO arbejder løsning for at dække alle celler. Inkuber i 15 min på en lav hastighed rocker ved stuetemperatur. Fjerne ORO og vaskes to gange med destilleret vand.
      Bemærk: på dette tidspunkt, ORO-farvede lipid dråber kan visualiseres under mikroskop.
    7. For at kvantificere ORO, destain ORO ved tilsætning af 1 mL 100% isopropanol til hver brønd og vuggende langsomt i 10 min.
    8. I mellemtiden forbereder en fortyndingsrække til at oprette en standardkurve, der er baseret på de følgende 8 standarder ved hjælp af ORO arbejder løsning (2.100 µg/mL) og isopropanol som et fortyndingsmiddel: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 og 0 µg/mL.
    9. Indlæse 200 µL af standarderne og de destained prøver i tre på en plade og læse absorbans på 490 nm.
      1. Bestemme koncentrationen af ORO for hver prøve, baseret på standardkurven.
        Bemærk: Vi anbefaler normalisere koncentration ORO til celle nummer. Celle nummer kan kvantificeres krystalviolet farvning eller DNA maengde.
  3. Osteoklaster
    Bemærk: Når du er klar, vi foreslår farvning osteoklaster for tartrat-resistente syre fosfatase (FÆLDE) ved hjælp af TRAP farvning kit (Se Tabel af materialer).
    1. FÆLDE farvning, lave celler i 30 min. ved stuetemperatur med 2,5% glutaraldehyd i PBS. I mellemtiden gør den FÆLDE løsning ved at blande sammen 50 µL af hurtigt granater Base løsning, 50 µL af natriumnitrit, 4,55 mL destilleret vand, 50 µL af Napthol AS-Biphosphate, 200 µL af acetat løsning og 100 µL tartrat løsning.
    2. Opsug off fiksativ, og skyl celler med PBS to gange før du tilføjer FÆLDE løsning for 1 h ved 37 ° C.
    3. Vaskes med destilleret vand før tælle osteoklaster under et mikroskop (forstørrelse 10 X). TRAP+ celler vises lilla med 3 eller flere kerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oversigt over cellekulturer
To kultur teknikkerne giver mulighed for vurdering af differentiering på en blandet population af BMCs består af BMSCs og HSCs (Total BMCs, figur 1A) eller en befolkning på BMSCs skilt fra HSCs (tilhænger BMSCs, figur 1B). 48 timer efter celler fra marven isoleres og forgyldt (figur 1 c), de hurtigt tillægger undersiden af plast kultur plade og har tendens til at danne en éncellelag. Når cellerne kommer til sammenløbet (fig. 1 d), kan de bruges til differentiering assays.

BMSCs opdeles i osteoblaster
Konfluerende kulturer af BMSCs kan opdeles i osteoblaster ved hjælp af en osteogenic media sammensat af ascorbinsyre og β-glycerol phosphat (figur 2A, B). Efter et par dage af differentiering, osteoblaster begynde at udtrykke alkalisk fosfatase (figur 2 c). Yderligere differentiering vil udløse osteoid matrix produktion og i sidste ende mineralisering af denne matrix (figur 2D). Interessant, vil kun en del af cellerne differentiere sig til osteoblaster in vitro. Faktisk, farvning med krystalviolet (figur 2E) afslører at ikke alle celler express basisk fosfatase eller mineralize pladen.

BMSCs opdeles i adipocytter
Adipogenesis kan blive testet på kulturer af blandet BMCs og på befolkningens mere homogen celle. Som observeret med osteoblastdannelse differentiering, hvorvidt de blandede befolkninger (figur 3A) eller split populationer (figur 3B) er brugt, kun en del af cellerne er adipogenic. Adipocytter vises rundt med flere lipid vacuoles, der kan være farvet i rødt med ORO (figur 3 c). Vores erfaring vises in vitro- adipocytter altid flere vacuolated i modsætning til i vivo hvid adipocytter. Forskelle i genotype eller kultur betingelser kan øge adipogenesis til et punkt hvor adipocytter løsrive og flyde i kultur plade. For at løse dette kan adipogenesis eksperiment stoppes på et tidligere tidspunkt.

HSCs opdeles i osteoklaster
Osteoclastogenesis kan være fremkaldt i kulturer ved at supplere media med mCSF og RANKL. HSCs begynder at smelte hurtigt til at danne multinucleated celler, der plette positive for TRAP (figur 4A). Disse osteoklaster er i stand til at resorbing mineral matrix in vitro- og dermed kan bruges til at vurdere osteoclastic aktivitet (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Skematisk tidslinjen af protokollerne for kultur af BMSCs og HSCs. Forskellige kultur teknikker til at give samlede BMCs bestående af en blandet population af celler (A) eller tilhænger BMSCs (B). Repræsentativt billede af BMSCs kultur isoleret fra C57B6/J mus 48 timer efter deres plating (C), og når de er opdelt fra HSCs (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Billeder af wells af BMSCs kulturer differentieret til osteoblaster. BMSCs før (A) og efter (B) er placeret i osteogenic medier. Osteoblaster kan farves for basisk fosfatase udtryk i pink (C) og mineralske indbetaling i brun (D). Krystalviolet kan anvendes til at repræsentere celle nummer efter differentiering (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder af kulturer af BMSCs opdeles i adipocytter. ORO-farvede adipocytter indhentet fra en blandet population af BMSCs (A) og en split kultur (B) efter 7 dage i adipogenic medier. Billede af en adipocyt farves med ORO (C). Kvantificering af ORO efter 7 dage i adipogenic medier før (D) og efter (E) normalisering til krystalviolet absorbans. Data er præsenteret som middel med fejllinjer repræsenterer standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: HSCs kulturer opdeles i osteoklaster. FÆLDE farvning af osteoklasterne optræder som store lilla-pink multinucleated celler (A). Mineraliseret overflade bejdset i sort af Von Kossa med resorption miner efterladt af osteoklasterne differentieret fra HSCs efter 7 dage (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel præsenteres to metoder til kultur af BMSCs med deres fordele og begrænsninger. Isolere cellerne fra knoglemarven er en relativt ubesværet proces. Men, at opnå en celle population repræsentative mesenkymale stamceller eller osteoclastic ophav kan være udfordrende på grund af de forskellige cellulære miljø i marv hulrum.

Dyrkning helhed af knoglemarven indholdet giver en tæt repræsentation af i vivo mikromiljø. Alligevel isolerer celler fra forskellige grupper af mus (genotyper, behandlinger, aldre, etc.) kan resultere i meget forskellige antal BMSCs eller HSCs på starten af in vitro- eksperiment. Derfor tillade adskiller BMSCs og HSCs og re plating dem en bedre kontrol over celle nummer fra starten af differentiering eksperiment. Dog kan reducere heterogenitet af cellekultur påvirke resultaterne af BMSCs eller HSCs, som begge udskiller faktorer, der påvirker mesenchymale og osteoclastic differentiering. Det er vigtigt at overveje begrænsningerne, når du udformer isolationen og kultur af BMSCs og HSCs.

Væld af cellepopulationer i knoglemarven kan indføre udfordringer i fortolkningen af data. Ud over HSCs og BMSCs indeholder knogle-marv mikromiljø også differentieret immunceller, røde blodlegemer, endotelcellerosv. Disse befolkninger kan forblive i den vedhængende eller ikke-tilhænger fraktion og således kan påvirke de eksperimentelle resultater. Sortering af BMSCs kan være en mulighed for at opnå en "renere" celle population. Faktisk, BMSCs er troede at udtrykke CD34, mens HSCs gør ikke10. Dog blev det også foreslået at manglen CD34 på overfladen af BMSCs kan være resultatet af kultur og en undersøgelse har vist, at en ikke-tilhænger delmængde af CD34+ BMSCs kunne differentiere i osteoblastdannelse, adipocytter og chondrocytter11, 12. derfor, når de overvejer sortering for at isolere BMSCs, en række veldefinerede markører skal være designet på forhånd. Andre hindringer for celle sortering er timingen og omkostninger. Faktisk tilføjer en sortering skridt kunne øge tid af isolation protokol betydeligt samt en betydelig stigning i omkostningerne. I Resumé præsentere sortering celler tekniske udfordringer, der kan reducere udbyttet og kvaliteten af BMSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne afslører, at de har ingen finansielle interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5 mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15 mL conical tube  VWR 89039-668
50 mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70 μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
  3. Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
  4. Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
  5. Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
  6. DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
  7. Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  10. Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
  11. Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
  12. Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 131 Mesenchymal isolation differentiering osteoblastdannelse adipocytter osteoklaster
Isolation, kultur og differentiering af knoglemarven stromale celler og osteoklast ophav fra mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E.,… More

Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter